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윤희 금
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1 사상체질의학회지 2010;22(4):65-76 J of Sasang Constitutional Medicine Vol. 22, No. 4, 2010: 荊防導赤散이급성코카인투여로인해유도된흰쥐의행동량과 c-fos 발현에미치는영향 서지용 최애련 구덕모 Abstract 대구한의대학교한의학과사상체질과 Effect of Hyeongbangdojeok-san on Acute Cocaine-induced Behavioral Effect and Immediate Early Gene Expression in Rats. Ji-Yong Seo, Ae-Ryun Choi, Deok-Mo Koo Dept. of Sasang Constitutional Medicine, college of Oriental Medicine, Deagu Haany Univ. 1. Objectives The present study was designed to investigate the effect of Soyangin Hyeongbangdojeok-san(HBDJS) on acute cocaine-induced behavior effect and gene expression in the rat brain. 2. Methods Experimental animals were composed of saline(sal), cocaine(coc), HBDJS + COC, HBDJS + SAL group. Rats received HBDJS(100, 200 mg/kg, p.o.) 1 h prior to cocaine hydrochloride(20 mg/kg, i.p.) treatment respectively. After cocaine injection, locomotor activity and rearing were measured in a rectangular container equipped with a video camera above the center of the floor for 60 min. In addiction, c-fos expression in the rat brain was detected using immunohistochemistry 2 h after cocaine injection. And the effect of HBDJS on acute cocaine-induced perk, pelk, pcreb upstream of c-fos expression was detected using western blotting and immunohistochemistry 15 min after cocaine challenge. 3. Results The present results show that HBDJS at dose of 200 mg/kg attenuated cocaine-induced both locomotor activity and rearing. Also HBDJS at dose of 200 mg/kg significantly decreased c-fos expression in the rat brain(nucleus accumebns and striatum). However HBDJS at dose of 200 mg/kg have no effect on cocaine-induced perk, pcreb, pelk-1 expression. HBDJS is c-fos expression through ERK-independent pathway. 4. Conclusions. These results suggest that HBDJS may be effective in suppressing the reinforcing effects of cocaine. Key Words : Hyeongbangdojeok-san, Cocaine, Locomotor activity, c-fos, Nucleus accumbens 1) 접수일 2010 년 08 월 13 일 ; 심사일 2010 년 08 월 13 일 ; 승인일 2010 년 08 월 27 일 교신저자 : 구덕모포항시남구대잠동 대구한의대학교부속포항한방병원사상체질의학과교실 Tel : Fax : dolee@dhu.ac.kr

2 66 사상체질의학회지 2010;22(4):65-76 荊防導赤散이급성코카인투여로인해유도된흰쥐의행동량과 c-fos 발현에미치는영향 Ⅰ. 緖論 급속한경제성장과과학문명의발달에따라현대인들의잇따른스트레스로인해약물남용이늘고있으며, 이러한약물남용은동서양을막론하고전세계적인사회문제로대두되고있다. 코카인이나모르핀, 암페타민등의향정신성약물들은각성과쾌감을주는강력한중추신경계흥분제로써이들약물을투여하게되면신경화학적 신경생리학적인변화가일어나며, 약물투여를또하고싶은갈망 (craving) 이생겨정신적의존성이생기게된다. 또한이약물의반복적인사용은환상, 망각, 도취감등정신적독성증상이생기게된다. 이런향정신성약물중코카인은 Erythrozylon coca라는식물의잎으로부터얻는 alkaloid 성분으로, 간접적인도파민 (Dopamine, DA) 수용체효능제로작용한다 1, 2. 코카인은 DA 신경을자극하는약물로이 DA 신경은복측피개영역 (ventral tegmental area, VTA) 으로부터측좌핵 (nucleus accumbens, NAC), 선조체 (striatum) 와전두엽 (prefrontal cortex, PFC) 으로 DA 신경을분사하며, 이를 mesocorticolimbic DA system 이라한다 3, 4. 급성코카인투여로인해분비된 DA은후시냅스의 D1- 과 D2 DA 수용체의경로를통하여초기유전자인 c-fos의발현을유도함이알려져있다 5. 또한초기유전자인 c-fos의상위단계에발현되는전사인자중 extracellular signal-regulated kinase(erk), camp response element binding protein(creb), ElK-1 등이있는데, 최근연구들에의하면코카인또는암페타민등을처리하였을때측좌핵과선조체에서이들전사조절인자들의발현이증가됨을알수있으며 6-8, 이들인자들의 activation 에의해 c-fos가발현된다 9. 소양인荊防導赤散은表陰之氣가내려오지못하고熱邪의막힘을받아서일어나는脾受寒表寒病證중少陽傷風證, 傷寒病表邪深結之病, 結胸證, 頭痛, 胸膈煩燥證을치료하는처방이다 10. 또한荊防導赤散은진통소염이뇨효과 11 와항스트레스효과 12 가있는것으로알려져있다. 이와같은형방도적산의주치증과연구결과는현대인의스트레스로인한약물남용의중독증상들과유사한면이있고, 뇌활동과관련된병증과스트레스 로인한신경정신질환에효과적이라고사료되어본연구에착수하게되었다. 본연구는급성코카인투여에의한보행성활동량, 상동적행동량과뇌의측좌핵과선조체에서의 c-fos 발현에대한荊防導赤散의효과를확인하자고한다. Ⅱ. 재료및方法 1. 재료 1) 동물실험동물은 효창사이언스로부터구입한웅성 Sprague-Dawley계흰쥐 ( g) 를사용하였으며, 구입후각 cage당 2마리씩넣어, 7일동안실험실환경 ( 온도 : 21±2, 습도 : 55-65%, light-dark cycle: 12h) 에적응시켰다. 적응기간동안물과사료를자유로이섭취하도록하였으며, 실험시작전실험과정동안의스트레스를최소화하기위해서 3일동안 handling하였다. 2) 한약제의제조구성약재들은대원약업사에서구입하였으며, 처방은 東醫壽世保元 10 少陽人病證論 에기재된荊防導赤散으로, 물 1500ml, 100 에서 2시간동안끓인후여과하여감압농축기 (EYELA Co., Japan) 로농축한후동결건조기 (EYELA Co. Japan) 로분말건조하였다. 건조하여얻은荊防導赤散 g을얻었다 (Table 1). 3) 시약실험에필요한 cocaine hydrochloride는 삼응산업에서구입하였으며, 면역조직화학실험, western blotting에쓰이는 paraformaldehyde(pfa), bovine serum albumin(bsa), 3,3 -Diaminobenzidine(DAB), 30% Hydrogen peroxide, Sodium azide, Sucrose는 sigma사제품을사용하였으며, Permount(Toluene solution, Fisher scientific), PBS(GIBCO, ph7.2) 는 라이프사이언스를통해구입하였다. 또한 anti-rabbit IgG conjugated hourse-radish peroxidase, c-fos, antibody는 Santa cruz사제품을구입하여사용하였다. 또한, phospho-erk, phospho-elk-1, phospho-creb antibody는 Cell signaling사제품을구입

3 서지용외사상체질의학회지 2010;22(4): Table 1. Composition of Hyeongbangdojeok-san(HBDJS) Composition of Hyeongbangdojeok-san (HBDJS) Herbal Name Scientific Name Amount(g) 생지황 ( 生地黃 ) Rehmmannia glutinosa(gaertner)liboschtz 12 목통 ( 木通 ) Scrophularia buergeriana 8 현삼 ( 玄蔘 ) Platycodon granflorum(jacq)a.dc. 6 과루인 ( 瓜蔞仁 ) Anthriscus sylvestris Hoffm. 6 전호 ( 前胡 ) Angelica koreana L. 4 강활 ( 羌活 ) Aralia contientalis 4 독활 ( 獨活 ) Schizonepeta tenuifolia var. japonica 4 형개 ( 荊芥 ) Saposhnikovia divaricata Schiskin: 4 방풍 ( 防風 ) Ledebouriella seseloides (HOFFM.) WOLFF 4 Total 52 하여사용하였다. 2. 실험방법 1) 행동량측정실험동물의보행성활동량과상동적행동량에대한행동학적변화의측정은 videotracking을이용하여 Ethovision program(noldus Information Technology BV, Wageningen, Netherlands) 으로분석하였다. 행동량은가로, 세로, 높이가각각 40ⅹ40ⅹ45 cm로만들어진검은색의아크릴상자안에넣어실험동물의움직임을상자위에설치된 digital camera를사용하여 videotracking 방법으로측정하였다. 실험절차는실험동물의몸무게를측정한후, 6개의활동량측정상자에개별적으로넣어 1시간동안의적응시간을거친다음, 1시간동안동물의안정시의행동량을측정하였다. 그후, 생리식염수및 HBDJS(100, 200 mg/kg) 을 2ml /kg 기준으로경구투여하여, 약물이충분히몸안에서흡수되도록 1 시간동안둔다. 경구투여 1 시간후, 코카인 (20 mg/kg) 를복강주사한후, 1시간동안보행성활동량과 rearing을측정하였다. 생리식염수및 HBDJS가투여된지 1시간후에코카인을복강주사한것은코카인우선투여시실험동물의 handling이힘들어지기때문이다. 2) 면역조직화학법 c-fos 발현을보기위해서실험동물에게코카인투여 1시간전생리식염수및 HBDJS(200 mg/kg) 을각각 경구투여한후, 코카인 20 mg/kg를복강주사하고, 1시간후에 sodium pentobarbital(80 mg/kg, i.p.) 으로마취시킨후, phosphate buffer(0.1 M PBS) 로준비한 4% paraformaldehyde(pfa) 용액 500ml을심장의좌심실을통해 arota로관류하였다. 고정이끝난쥐는뇌를꺼내어고정액인 4% PFA로 10% sucrose를만들어 2시간동안후고정시키고, 20% sucrose가함유된 phosphate buffered saline(pbs) 에넣어 4 에서 overnight시켰다. 2~3일보관후, 뇌를급속냉동한후, cryotome(leica, Biosystems, Nussloch, Germany) 으로 - 25 상태에서 30 um의크기로 coronal section하여 1X PBS에30% ethylene glycol, 20% glycerol 첨가한 cryoprotectant solution 넣어 - 20 에보관하였다. 그후실험진행시조직을 PBS로 10분씩세번반복하여씻고, 1% Triton X-100에 10분담궈세포막의지질을제거하는과정을거친후, 다시 PBS로 10분씩세번반복하여씻었다. 3% BSA/PBS용액으로 blocking한후, c-fos expression을보기위하여 0.1% BSA/PBS에 1차 rabbit anti-fos antibody(1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 를 1:2000으로희석하여 4 에서 20시간반응시킨후, 그다음날 PBS로 10분씩 3번반복씻었다. Endogenous peroxidase를막기위해 0.1% H2O2solution 에 5분간둔후 PBS로씻었으며, 그후실온에서 2시간동안 biotinylated secondary antibody(1:1000 polycolonal goat anti-rabbit IgG; Santa Cruz) 에반응시켰으며 PBS 로 10분씩 3번세척후, 실온에서 1시간동안 Vextastain Elite ABC Kit(Vector) 에담궈반응시켰다. PBS로세척

4 68 사상체질의학회지 2010;22(4):65-76 荊防導赤散이급성코카인투여로인해유도된흰쥐의행동량과 c-fos 발현에미치는영향 후, 발색제인 DAB(Diaminobenzidine) 로발색시켰으며발색이끝난조직은 gelatin coated slide에얹어서실온에서건조시킨후, 50, 70, % 에탄올에담궈 dehydrate시켰다. 그리고나서 xylene에넣어투명화시킨다음 permonut로봉입하였으며, digital camera(icam3000) 가부착된 LABOMED light microscopes(labo America Inc., Fremont, CA, USA) 현미경을이용하여 c-fos protein expression을관찰하였다. 그리고 c-fos 상위단계의신호전달체계을규명하기위하여 HBDJS 200 mg/kg를경구투여하고 1 시간뒤코카인을복강주사한후 15분이되는시점에동물을마취하여 ERK, ElK-1, CREB인산화반응에대한효과를보기위하여 perfusion하였다. Phospho-ERK1/2 (Cell signaling 1:500 dilution), phospho-elk-1(cell signaling, 1:2000 dilution), phospho-creb(cell singling, 1:250 dilution) 에대한발현은 c-fos 발현확인과정과동일한방법으로실험하였다. X-100, 2mM EDTA, 1mM EGTA와 protein inhibitor가포함된 lysis buffer를넣어분쇄한후 12,000 rpm에서 20분동안원심분리한후상층액을취하였다. 그후 Bradford assay법으로단백질을정량한후 10% SDS-polyacrylamide gel electrophorysis(10% acrylamide/0.3% N,N -methylenebisacryalamideresolvinggel) 에 ERK, phospho-erk 을전기영동시킨후 PVDF membrane(millipore Crop., Bedford, MA, USA) 으로 65V에서 1 h 동안 transfer 시킨후 5% skim milk /TBST에서 1 h동안 blocking하였다. Blocking후 primary antibody(1:1000 ERK, Santa cruz; 1:1000 phospho-erk, Santa cruz; 1:1000, GAPDH, Santa cruz) 를 4 에서 24 h 반응시켰으며, 그후 TBST로 10분씩 3번세척후 secondary antibody(1:1000 antirabbit-hrp, Santa cruz) 를상온에서 1 h 동안반응시킨후, TBST로 10min씩 3번세척후 ECL(enhanced chemiluminesence, Amersham Biosciences, UK) 로확인하였다. 3) Western blotting HBDJS 200 mg/kg군의 c-fos 상위신호전달체계를알아보기위하여코카인투여 15시간후 sodium pentobarbital(80 mg/kg, i.p.) 로마취시킨후빠른시간내에뇌를적출하여 isopentane(- 40, Junsei) 에담궈급속냉동시킨후드라이아이스위슬라이드에서 1mm두께로잘라선조체 (striatum) 를분리해내었다. 분리해낸조직은 50 mm Tris(pH 7.5), 150mM NaCl, 1% Triton 3. 통계처리모든실험결과에대한통계분석은 SPSS 11.0프로그램을사용하였으며데이터는평균값 ± S.E.M으로표시하였다. 사후검정은 Tukey test를통해검정하였으며, p값이 0.05 이하의경우통계적으로유의성이있다고판정하였다 Locomotor activity 300 Rearing Distance (mean/60 min) ## Frequency (mean/ 60 min) ## 0 SAL 0 SAL SAL COC SAL COC Figure. 1. Locomotor activity and rearing responses in Sparague-Dawley rats treated injection of saline(sal) or cocaine(coc). Results are shown as mean ± S.E.M of the travelled distance (locomotor activity) and frequency(rearing). SAL treatment group, n=4; COC treatment group, n=8. ##p<0.01 SAL treatment group vs. COC treatment group.

5 서지용외사상체질의학회지 2010;22(4): Ⅲ. 結果 1. 보행성활동량과상동적행동량차이본연구에서먼저보행성활동량및상동적행동량이코카인에의해서증가하는지를알아보고위해생리식염수를경구투여하고, 한시간뒤생리식염수또는코카인 20 mg/kg를복강주사한후한시간동안의행동량을측정하였다. 그결과보행성활동량에서는정상군 (SAL) 은 ±420.34cm, 대조군 (COC) 은 ± cm, 상동적행동량에서는정상군은 10.00±7.74, 대조군은 ±37.62로나타났다. 그결과코카인에의해보행성활동량과상동적행동량이유의하게증가됨을알수있었다 (Figure. 1). 2. 행동변화량에대한 HBDJS 의효과급성코카인에의해증가한행동량에대한 HBDJS 의효과를알아보기위하여생리식염수또는 HBDJS(100, 200 mg/kg) 경구투여하고, 한시간뒤생리식염수또는코카인 20 mg/kg를복강주사한후다시한시간동안의행동량을측정하였다. 그결과보행성활동량의결과는정상군 (SAL) 은 ±420.34cm, 대조군 (COC) 은 ± cm, HBDJS 100 mg/kg 투여군은 ± cm, HBDJS 200 mg/kg 투여군은 ± cm 움직였으며, HBDJS 200 mg/kg 투여군에서유의적으로보행성활동량이감소했음을알수있었고, 60분동안의움직인거리를 10분단위로확인한결과각시간대별로대조군에비해감소됨을알수있었다 (Figure. 2-A, B). 그리 A B C Frequency (mean/ 60 min) ## Rearing * D Frequency (Mean) 100 SAL COC HBDJS 100 mg/kg 80 HBDJS 200 mg/kg # ## # # SAL SAL HBDJS (mg/kg) COC Time (min) Figure. 2. Effect of HBDJS on locomotor activity and rearing response in Sparague-Dawley rats treated a single saline or cocaine injection.(a, C) Total travelled distance and rearing.(b, D) Time interval in each 10 min. Results are shown as mean±s.e.m of the travelled distance (locomotor activity) and frequency(rearing). SAL treatment group, n=4; COC treatment group, n=8; HBDJS 100 mg/kg treatment group, n=4; HBDJS 200 mg/kg treatment group, n=6. ##p<0.01 SAL treatment group vs. COC treatment group. *p<0.05 COC treatment group vs. HBDJS 200 mg/kg treatment group.

6 70 사상체질의학회지 2010;22(4):65-76 荊防導赤散이급성코카인투여로인해유도된흰쥐의행동량과 c-fos 발현에미치는영향 Figure. 3. Effect of HBDJS on locomotor activity and rearing responses in Sparague-Dawley rats treated injection of saline. Results are shown as mean ± S.E.M of the travelled distance(locomotor activity) and frequency(rearing). SAL treatment group, n=4; HBDJS 200 mg/kg alone treatment group, n=3 고상동적행동량의결과, 정상군은 10.00±7.74, 대조군은 ±37.62로나타났는데반해, HBDJS 100 mg/kg 투여군은190.25±42.72, HBDJS 200 mg/kg 투여군은 87.83±32.10으로나타났으며, HBDJS 200 mg/kg 투여군은대조군에비해상동적행동량이유의하게감소하였으며, 10분단위로확인한결과각시간대별로대조군에비해감소됨을알수있었다 (Figure. 2-C, D). 그결과 HBDJS은코카인에의해유도된보행성활동량과상동적행동량에대한행동적변화를유의적으로감소시키는효과가있음을알수있었다. 4. c-fos 발현에대한측좌핵과선조체에서의 HBDJS의효과급성코카인투여시행동적변화와함께유전자의발현도변화가일어나게된다. 면역조직화학법을이용하여측좌핵과선조체에서의 HBDJS에의한 c-fos 발현을조사하였다. 그결과측좌핵과선조체모두에서코카인에의한 c-fos 발현이월등하게증가한것을확인하였으며, HBDJS 200 mg/kg 투여시코카인에의해증가된 c-fos발현이감소한것을알수있었다 (Figure. 4). 3. HBDJS 단독투여시의행동량본연구에서 HBDJS 단독투여시보행성활동량이나상동적행동량에어떠한영향을미치는지에대해알아보기위하여생리식염수또는약물 (200 mg/kg) 의경구투여한시간후, 생리식염수를복강주사하고한시간동안의행동량을측정하였다. 그결과보행성활동량의경우정상군 (SAL) 군은 ± cm, HBDJS 군은 ±515.43cm로비슷한양상을보였다. 상동적행동량의경구도정상군의경우, 10.00±7.74, HBDJS 군은 7.67±5.67 로약간의차이는있으나유의하지는않았다. 이상의결과로보아 HBDJS은정상상태에서의행동적변화에는영향을미치지않은것으로확인되었다 (Figure. 3). 5. ERK, Elk-1, CREB 인산화대한 HBDJS 의효과 c-fos 발현을매개하는상위신호전달전사인자인 ERK, Elk-1, CREB 의인산화에 HBDJS이어떠한영향을미치는지를확인하기위하여 western blotting와면역조직화학법을이용하여실험하였다. 그결과, 측좌핵에서는 perk, pcreb, pelk-1 모두정상군 (SAL) 군에비해대조군 (COC) 에서는다증가하였지만, HBDJS투여군은그효력을발휘하지못하고대조군과비슷한결과를나타내었다. 선조체에서도 perk, pcreb, pelk-1 모두정상군 (SAL) 군에비해대조군 (COC) 에서는다증가하였지만, HBDJS투여군은그효력을발휘하지못하고대조군보다더활성화된결과를나타내었다. 이로보아 HBDJS은코카인투여후 15분때에

서지용외사상체질의학회지 2010;22(4):65-76 71 Figure. 4. Effect of HBDJS on acute cocaine-induced c-fos expression in the nucleus accumbens shell and striatum.

o.) plus cocaine treatment(n=3). Figure. 5. Effect of HBDJS on acute cocaine induced perk1/2, pcreb, pelk-1 responses in the nucleus accumbens and striatum.

7 서지용외사상체질의학회지 2010;22(4): Figure. 4. Effect of HBDJS on acute cocaine-induced c-fos expression in the nucleus accumbens shell and striatum. Photomicrographs(left:4X, right:10x) of c-fos immunoreactive nuclei in coronal sections of nucleus accumbens 1.6 mm anterior to bregma after cocaine treatment(20 mg/kg, i.p.)(n=3) or HBDJS (200 mg/kg, p.o.) plus cocaine treatment(n=3). Figure. 5. Effect of HBDJS on acute cocaine induced perk1/2, pcreb, pelk-1 responses in the nucleus accumbens and striatum. Photomicrographs(10X) of perk1/2, pcreb, pelk-1 immunoreactive nuclei in coronal sections of nucleus accumbens 1.6 ~1.2 mm anterior to bregma after cocaine treatment (20 mg/kg,, i.p.)(n=3) or HBDJS (200 mg/kg, p.o.) plus cocaine treatment (n=3). 발현되는 perk, pcreb, pelk-1 발현에는영향을미치지않음을알수있다 (Figure. 5). Ⅳ. 考察 세계보건기구 (WHO) 에서는약물남용을 한번사용하기시작하면자꾸사용하고싶은충동을느끼고 ( 의존성 ), 사용할때마다양을늘리지않으면효과가없으며 ( 내성 ), 사용을중지하면온몸에견디기힘든이상을일으키며 ( 금단증상 ), 개인에게한정되지않고사회에도해를끼치는물질 ( 사회적피해 ) 로규정하고있다 13, 14. 약물남용으로인한약물중독은정신적인질환으로심리현상중의하나인보상 (reward) 을담당하는대뇌변연계의기능이약물에의하여비정상적으

8 72 사상체질의학회지 2010;22(4):65-76 荊防導赤散이급성코카인투여로인해유도된흰쥐의행동량과 c-fos 발현에미치는영향 로과활성화되고, 이현상들이뇌속에각인되어병적인상태에이르게된것으로말할수있다. 최근의약물남용은청소년여성약물남용자의증가로인해세계적으로심각한정신질환중의하나로서, 중독성약물에대한치료제의개발이시급한현실이며, 이러한약물중독의해결책으로여러가지사회정책및치료, 재활을위한프로그램이이루어지고있지만, 근본적인치료대책으로서한계점을가지고있다. 중독성약물중의하나인코카인은 DA 신경말단에서도파민운반체 (DA transport) 와결합해 DA의 reuptake( 재흡수 ) 를막음으로써측좌핵과선조체시냅스틈새 (synaptic cleft) 에서의 DA 농도를증가시킨다 3, 4. 증가된 DA에의해신경활성이증가하여보행성활동량이나 15, 16 상동적인행동량 (rearing) 을증가시키며 17, 6-hydroxydopamine(6-DHDA) 로 NAC를손상시키거나 DA receptor antagonist를전처리함으로써 mesolimbic DA system에의한 motor response에영향을줌을알수있다 18, 19. 급성코카인투여로인해분비된 DA은후시냅스의 D1- 과 D2 DA 수용체의경로를통하여초기유전자인 c-fos의발현을유도함이알려져있다 5. Fos family protein은 AP-1(activator protein-1) 부위에결합하는 AP-1 transcription factor complex형태로의 jun family와 heterodimer를이루고있다 20. 이들 Fos family protein들은많은종류의중독성약물들의급성투여후신속또는일시적으로유도되며, 투여후수시간이내에다시원상태로되돌아오게된다 21. 또한초기유전자인 c-fos의상위단계에발현되는전사인자중 extracellular signal-regulated kinase(erk), camp response element binding protein(creb), ElK-1 등이있는데, 최근연구들에의하면코카인또는암페타민등을처리하였을때측좌핵과선조체에서이들전사조절인자들의발현이증가됨을알수있으며 6-8, 이들인자들의 activation에의해 c-fos가발현된다 9. 李濟馬는 東醫壽世保元 22 醫源論 에서 古之醫師不知心之愛惡所慾喜怒哀樂偏着者爲病而但知脾胃水穀風寒暑濕觸犯者爲病故 라하여性情의偏急과心慾이病의原因임을말하였고, 臟腑論 에서는 肺脾肝腎之用正直中和則津液膏油充也偏徛過不及則津液膏油爍也 라하여性情의狀態를正直中和하는것이 治病의原理임를밝히고있는데, 이와같이四象醫學은心身醫學의側面을많이가지고있으며治心治病의精神을바탕에두고있다. 荊防導赤散은소양인의腎局陰氣가熱邪에둘러싸이고脾局陰氣는熱邪에막혀서腎局방향으로下降하지못하고등성마루에凝聚된病인脾受寒表寒病중에口苦咽乾胸脇滿或往來寒熱의少陽傷風證, 傷寒病頭痛腦强寒熱往來耳聾胸滿의表邪深結之病, 太陽病으로부터少陽傷風證으로轉變한頭痛, 胸膈煩燥證을치료하는대표적인處方이다. 또한少陽病證의심화된병증인熱實結胸證, 즉心下痞硬痛乾嘔短氣水入則吐의증세가나타날때에荊防導赤散을사용하였다 22. 荊防導赤散의처방구성을살펴보면, 生地黃木通玄蔘瓜蔞仁前胡羌活獨活荊芥防風등으로구성되어있는데, 生地黃은胸臆間에鬱滯된火의氣運을瀉하는데주력함으로써胃의鬱熱이제거되어消食進食시키고, 木通은降心火淸肺熱함으로써기화작용이순행하여血을化生한다. 前胡와瓜蔞仁으로火絳而痰消하여上部가막힌痰滿胸脅中痞症狀을치료한다. 玄蔘은淸肺金하여 滋陰하게하며, 羌活과獨活은下焦膀胱之邪를 驅逐하며, 荊芥防風은胸膈과頭目의火를발산시킨다 최 11 는荊防導赤散의진통, 소염, 이뇨효과에대해유의한결과를얻어보고하였으며, 이 12 는荊防導赤散이스트레스로인한우울등의증상을완화시키는효과가있음을보고하였다. 이와같은보고와형방도적산의주치증은현대인의스트레스로인한약물남용의중독증상들과유사한면이있고, 뇌활동과관련된병증과스트레스로인한신경정신질환에효과적이라고사료되어본연구에착수하게되었다. 이전연구들에의하면, In vivo 미세투석법 (microdialysis) 를이용한실험에서약물중독과관련있는뇌의측좌핵과선조체에서코카인또는 methamphetamine 투여로인한 DA의농도는생리식염수투여군에비해현저하게증가하였다 3, 25, 26. 이는또한보행성활동량의증가를보임으로써, 생화학적인측면인 DA과행동학적인측면인보행성활동량과상동적행동중의하나인 rearing이상관관계가있음을보여주는실험적인

9 서지용외사상체질의학회지 2010;22(4): 증거를제시하였고 26-28, 반복적으로도파민 D1 수용체효능제인 SKF-38393를투여한경우, 보행성활동량이증가하였으며 29, 도파민의길항물질인 SCH 23390을투여한결과, 코카인에의한보행성활동량과 rearing 모두줄어들었다 28, 29. 본연구의결과, 급성코카인투여시보행성활동량과 rearing 모두정상군에비해유의적으로증가됨을확인할수있었다. 그러나 HBDJS과코카인을같이투여한군에서는 HBDJS 200 mg/kg를투여한군에서보행성활동량과 rearing이유의적으로감소하였다. 또한, 본연구에서는코카인투여로인한행동적변화를매개하는신경유전적기전을살펴보기위하여면역조직화학적방법을이용하여 proto-oncoprotein인 c-fos 단백의발현정도를통해신경의활성도를측정하였다. 최근의연구들을보면코카인투여로인하여측핵및선조체등의도파민성신경세포의투사부위에서신경활성의지표라고알려진 immediate early gene c-fos발현이증가되었다는보고가있으며 30, 반복적으로도파민 D1 수용체효능제인 SKF-38393를투여한경우신경활성도의지표인 c-fos의발현이증가되었다 31. 본실험에서 HBDJS의경우측좌핵과선조체모두에서대조군에비해확연하게감소됨을확인하였다. HBDJS 200 mg/kg는 locomotor activity, rearing, c-fos expression 모두에서효과가있는것으로확인된것을바탕으로 c-fos상위단계의 signal에는어떠한영향을미치는지를알아보기위하여 western blotting과면역조직화학법을이용하여 ERK, ElK-1, CREB의인산화반응을확인하였다. Mitogen activated protein kinase(mek) 의 downstream인 extracellular signal-regulated kinase(erk) 는 protein serine/threonine kinase로 neuronal plasticity에중요한역할을수행하며 32, 세포외자극과 cell proliferation, differentiation에대한특징적인반응을나타내며, 이전연구들에의하면, 급성또는만성코카인투여시측좌핵과선조체에서 ERK phosphorylation 을유도한다 인산화된 ERK는결국핵내로이동하여 c-fos promoter상에서 ElK-1과 CREB의조절을통하여 gene expression을통제하게되는데급성또는만성코카인투여시설치류의측좌핵과선조체에서 CREB의인산화가일어나며 36, 이로인해 c-fos발현에도영향을미친다. 본연구결과, 코카인을투여한군의측좌핵과선조체에서 perk, pcreb, pelk-1 모두인산화가증가하였으며, 이는코카인또는암페타민에의해 mesolimbic DA system에서증가한다는이전연구들과동일한결과를나타내었다 8. 그러나, HBDJS 200 mg/kg를투여한군은 ERK, ElK-1, CREB phosphorylation을차단하지못하는것으로나타났다. 이는첫째, 약물의투여경로, 약물의농도, 약물의투여기간에따라행동학적변화나세포내분자들의발현이달라질수도있다. 둘째, HBDJS은 ERK pathway가아닌어떤다른기전을통하여 c-fos발현에직접적으로작용하는것으로생각할수있다. 여기에는 ERK의상위단계에는 mitogen activated kinase(mek) 가있다. 그리고 ERK activation inhibitor인 SL327를투여한후코카인을처치하였을때 mice의선조체에서 ERK phosphorylation이차단되고, 이는 ElK-1 phosphorylation과 c-fos expression도차단한다 37. HBDJS은이 MEK를 activation 시켜 EKR, ElK-1, CREB pathway를거치지않고직접적으로 c-fos 발현에영향을미쳐 HBDJS 200 mg/kg 투여군의측좌핵과선조체모두에서 c-fos 발현이감소시켰을가능성이있다. 본연구에서확인해보지는않았지만, 코카인에의한 JNK(c-Jun N-terminal kinase), p38 activation이직접적으로 c-fos 발현에영향을미치지않나생각되어진다. 또한약물의투여경로나투여농도, 투여기간의적절치못한실험디자인때문에 c-fos 발현은감소시켰지만, EKR, ElK-1, CREB phosphoryration을차단하지못했을가능성도있다. 이는차후지속적인연구를통해밝혀야할것으로사료된다. 이상의실험결과로볼때소양인의처방중, HBDJS 은보행성활동량, 상동적행동중 rearing과신경활성지표인 c-fos 발현을감소시키며, 이는코카인중독에대한치료제로서의가능성을제시한다. Ⅴ. 結論 본연구에서는약물중독과관련하여흰쥐에급성코카인투여시유발되는보행성활동량, 상동적행동량과중독과관련된뇌의중뇌변연계인측좌핵과선조체에서의 c-fos의발현에대한형방도적산의효과를검토하여다음과같은결론을얻었다.

10 74 사상체질의학회지 2010;22(4):65-76 荊防導赤散이급성코카인투여로인해유도된흰쥐의행동량과 c-fos 발현에미치는영향 1. 보행성활동량측정결과, 대조군 (COC) 은정상군 (SAL) 에비해보행성활동량이 19배정도증가하였으며, 형방도적산을 100, 200 mg/kg 를경구투여한후, 코카인을처치한군에서의결과형방도적산 200 mg/kg에서유의하게보행성활동량이감소하였다. 2. 상동적행동량의결과또한정상군에비해대조군이 21배정도증가하였으며, 형방도적산100, 200 mg/kg를투여한군에서는형방도적산 200 mg/kg투여군에서대조군에비해유의하게감소되었다. 3. 형방도적산 200 mg/kg를단독투여했을때의행동량들을측정한결과, 단독투여는보행성활동량과상동적행동량에별다른영향을미치지않았다. 4. 형방도적산 200 mg/kg를투여한후의측좌핵과선조체의서의초기유전자인 c-fos의발현을확인한결과측좌핵과선조체모두에서대조군에비해 c-fos의발현이감소되었다. 5. c-fos 상위단계의전사인자에대한효과를알아보기위해서 perk, pcreb, pelk-1 반응을알아본결과측핵과선조체두곳모두에서대조군과비슷하게발현되었으며, ERK, CREB, Elk-1의인산화는차단하지못하였다. 이들결과로보아, 형방도적산은코카인에의한 reinforcing effect를억제하는효과가있음을알수있었다. Ⅵ. 參考文獻 1. Koob G.F. Drugs of abuse: anatomy, pharmacology and function of reward pathways. Trends Pharmacol Sci. 1992;13: Di Chiara. G & A Imperato. Drugs abused by humans preferentially increase synaptic dopamine concentrations in the mesolimbic system of freely moving rats. Proc. Natl Acad Sci USA. 1988;85: Jang EY, Choe ES, Hwang M, Kim SC, Lee JR, Kim SG, et al. Isoliquiritigenin suppresses cocaine-induced extracellular dopamine release in rat brain through GABA(B) receptor. Eur J Pharmacol. 2008;587(1-3): Steketee JD, Kalivas PW. Sensitization to psychostimulants and stress after injection of pertussis toxin into the A10 dopamine region. J Pharmacol Exp Ther. 1991;259(2): Nathalie thiriet, Dominique Aunis and Jean zwiller. c-fos and egr-1 immediate-early gene induction by cocaine and cocaethylene in rat brain: a comparative study. Ann NY Acad Sci. 2000;914: Konradi C, Cole RL, Heckers S, Hyman SE. Amphetamine regulates gene expression in rat striatum via transcription factor CREB. J Neurosci. 1994;14: Vanhoutte P, Barnier JV, Guibert B, Pages C, Besson MJ, Hipskine RA. et al. Glutamate induces phosphorylation of Elk-1 and CREB, along with c-fos activation, via an extracellular signal-regulated kinase dependent pathway in brain slices. Moi Cell Biol. 1999;19: Adams DH, Hanson GR, Keefe KA. Psychostimulats activate p42/p44 MAPK in dorsal and ventral striatum. Soc Neurosci Abstr. 2001;27: Sun WL, Zhou L, Hazim R, Quinones-Jenab V, Jenab S. Effect of acute cocaine on ERK and DARPP-32 phosphorylation pathways in the caudate-putamen of Fisher rats. Brain Research. 2007;1178: Lee Je-Ma. Donguisusebowon. Seoul:ShinilMunhwasa. 1963:63.(Korean) 11. 최병일. 소양인형방도적산의효능에관한실험적연구. 사상체질의학회지. 1990;2(1): Lee SY. Choi AR, Ha JH, Lee JH, Kim PJ, Goo DM. An Experimental Study on the Anti-stress Effect by Soyangin Hyeongbangdojeok-san and Yanggyeoksanhwatang. J of Sasang Constitut Med. 2008;20(3): (Korean) 13. 김대근, 신태용, 염정열, 은재순. 마약과약물남용. 서울 : 북스힐. 1999: American Psychiatric Association. Diagnostic and statistical manual of mental disorders. 4th ed. Washington DC:American Psychiatric press. 1994: Weiss F, Hurd YL, Ungerstedt U, Markou A, Plotsky

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12 76 사상체질의학회지 2010;22(4):65-76 荊防導赤散이급성코카인투여로인해유도된흰쥐의행동량과 c-fos 발현에미치는영향 36. Self DW, Genova LM, Hope BT, Barnhart WJ, Spencer JJ, Nestler EJ. Involvement of camp-dependent protein kinase in the nucleus accumbens in cocaine self-administration and relapse of cocaine-seeking behavior. J Neurosci. 1998;18(5): Valjent E. Corvol JC. Pages C. Besson MJ. Maldonado R. Caboche J. Involvement of the extracellular signal-regulated kinase cascade for cocaine-rewarding properties. The Journal of Neuroscience. 2000;20(23):

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