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大韓本草學會誌제 26 권제 2 호 (211 년 6 월 ) Kor. J. Herbology 211;26(2):75-81 黃芩이 LPS 로유발된 Raw 264.7 Cells 의염증인자에미치는영향 윤석빈, 한효상, 이영종 경원대학교한의과대학본초학교실 Effect of Scutellariae Radix Extract on the Proinflammatory Mediators in Raw 264.7 Cells Induced by LPS Seok-Bin Yoon, Hyo-Sang Han, Young-Jong Lee Dept. of Herbology, College of Oriental Medicine, Kyungwon University Seongnam 461-71, Korea ABSTRACT Objectives:This study aims at examining the anti-inflammatory effects of Scutellariae Radix extract. Methods:Scutellariae Radix was hot water extracted to make the samples(sr) for the experiment. Their effects were examined on the increase of cell viability in mouse macrophage Raw 264.7 cells, the creation of nitric oxide(no) in lipopolysaccharide(lps)-induced Raw 264.7 cells, and the creation of cytokines of interleukin(il)-1 β and others. Results:The results of the experiment are as follows. 1. The MTT assay was carried out to check the cellular toxicity of the water extract of Scutellariae Radix. The results were found no significant toxicity caused to macrophages by the water extract of Scutellariae Radix. 2. The water extract of Scutellariae Radix significantly restricted the increase of NO in the LPS-induced macrophages after 24-hour culture. 3. The water extract of Scutellariae Radix significantly restricted the creation of IL-6, IL-1, IL-12p4, IL-17, interferon-inducible protein(ip)-1, keratinocyte-derived chemokine(kc), and vascular endothelial growth factor(vegf) in the LPS-induced macrophages at the concentration of 25 μg /ml or higher. Conclusion:The samples(sr) of hot water extract of Scutellariae Radix caused no significant cellular toxicity to macrophages and significantly restricted the creation of NO, IL-6, IL-1, IL-12p4, IL-17, IP-1, KC, and VEGF in the LPS-induced macrophages at 25 μg /ml or higher, thus demonstrating significant anti-inflammatory effects. Key words:scutellariae Radix, macrophage, cytokine, nitric oxide. 서론 黃芩은 神農本草經 1) 中品에 黃芩, 味苦平. 主諸熱, 黃疸, 腸澼, 泄利, 逐水, 下血閉, 惡瘡疽蝕, 火瘍. 一名腐腸. 生川谷. 이라고처음收載되었으며, 淸熱瀉火, 燥濕解毒, 止血, 安胎의효능이있어肺熱咳嗽, 熱病高熱神昏, 肝火頭痛, 目赤腫痛, 濕熱黃疸, 瀉痢, 熱淋, 吐衄, 崩漏, 胎熱不安, 癰腫疔瘡등을치료하는약물로사용되고있다 2). 黃芩의기원으로 대한약전 3) 에 속썩은풀 Scutellaria baicalensis Georgi( 꿀풀과 Labiatae) 의뿌리로서그대로또는주피를제거한것이다. 라고수재되어있으며, 중국약전 4), 북한약전 5), 일본약국방 6) 도모두같은식물을기원으로하고있다. 黃芩의성분으로는 flavonoid 계화합물로서 3여종이분리되어있는데, baicalein, biacalin, chrysin, oroxylin-a, oroxylin-α-7-o-glucuronide, wogomin, wogonoside, wogonin glucuronide, neo-baicalein, koganebananin, 5,7, 2',6'-tetrahydroxyflavone, skullcapflavone, dihydrobaicalin 교신저자 : 이영종. 경기도성남시수정구복정동산 65 경원대학교한의과대학본초학교실. Tel:31-75-5415. E-mail:garak@kyungwon.ac.kr. 접수 :211년 5월 11일 수정 :211년 6월 8일 채택 :211년 6월 1일

76 大韓本草學會誌 Vol. 26, No. 2, 211 등이있으며 7,8) sterol 류로는 β-sitosterol, campesterol, stigmasterol 등이함유되어있다 8). 또한당류로서 sucrose 및 D-glucose 등이함유되어있고 8), 그외 14종의아미노산, 정유등이있다 7). 약리작용으로김등 9) 은황금의열수추출물이병원성세균에미치는항균효과를보고하였고, 이등 1) 은염증성장질환에서면역조절기능을보고하였으며, 이등 11) 은항암효과를보고하였고, 조등 12) 은항산화효과를보고하였고, 김등 13) 은혈중지질강하작용을보고하였으며, 박등 14) 은항알레르기천식작용을보고하였고, 이등 15) 은간보호기능을보고하였다. 이러한연구보고는黃芩의효능인淸熱瀉火, 燥濕解毒 2) 이염증및면역과밀접한관련이되어있음을알수있으며, 특히최근에는면역매개물질인 cytokine 의염증및면역반응조절기능에관한연구가활발히진행되고있는데, 대식세포에서분비되는염증매개인자들 (proinflammatory mediators) 에대한黃芩의항염효과를충분히검토할필요가있다고사료된다. 이에저자는본연구에서黃芩을열수추출하여제조한시료 (SR=Scutellariae Radix) 를대상으로 mouse macrophage Raw 264.7 cells의 cell viability와 lipopolysaccharide(lps) 로유발된 Raw 264.7 cells의 nitric oxide(no) 생성증가, 그리고 interleukin(il)-1β, IL-6, IL-17, keratinocyte-derived chemokine(kc) 등의 cytokine 생성증가에미치는영향을측정하여유의한결과를얻었기에보고하는바이다. 1. 재료 실험 1) 약재실험에사용된黃芩 (Scutellariae Radix; Root of Scutellaria baicalensis Georgi) 은전남화순에서재배한것을 28년 5월에구입하였으며, 경원대학교한의과대학본초학교실에서기원을감정하였다 (NO; 28-5-21). 모든약재는실험전에초음파세척기 (Branson, USA) 를이용하여불순물을제거하고실험에사용하였다. 2) Cell line 실험에사용된대식세포는 mouse macrophage(raw 264.7 cells) 이며한국세포주은행 (KCLB, Korea) 에서구입하였다. 3) 시약및기기 (1) 시약본실험을위해서 ethyl alcohol(samchun Chemical, Korea), DMSO(Sigma, USA), DMEM(Sigma, USA), 1 PBS(Sigma, USA), EDTA(Sigma, USA), isopropanol(sigma, USA), trypsin-edta(sigma, USA), Bio-Plex cytokine assay kit(bio-rad, USA), Procarta cytokine assay kit(panomics, USA) 등이사용되었다. (2) 기기본실험에사용된기기는 CO 2 incubator(nuaire, USA), rotary vacuum evaporator(eyela, Japan), air compressor (Tamiya, Japan), homogenizer(omni, USA), research microscope(becton dickinson, USA), refrigerated centrifuge(hanil, Korea), high-speed microcentrifuge (Zyrogrn, Korea), personal microcentrifuge(mylab, Korea), fume hood(hanil, Korea), clean bench(jeio thec, Korea), ultrasonic cleaner(branson, USA), microplate reader 68(Bio-Rad, USA), vortex mixer(vision Scientific Co, Korea), multi-channel pipette(bio-rad, USA), water bath(saehan Co, Korea), ice-maker(vision Scientific Co, Korea), bio-plex 2(Bio-Rad, USA), vacuum filtration system (Millipore, USA), micromixer Mx2(FINEPCR, Korea), thermo micromixer(finepcr, Korea), thermo bath (FINEPCR, Korea), liquid nitrogen tank(chart/mve, USA), deep freezer(ilshin Lab Co, Korea), vacuum freezing drier(eyela, Japan) 등이다. 2. 방법 1) 黃芩추출물제조黃芩 5 g을정확하게중량을측정한뒤환류추출기에 1 차증류수 2, ml와함께넣은뒤탕액이끓는시점으로부터 2 시간동안가열하여추출한다음추출액을 filter paper(advantec No.2, Japan) 로감압여과한여과액을 rotary vacuum evaporator 를이용하여농축액을얻었다. 이농축액을동결건조기를이용하여건조한분말을시료로사용하였다. 동결건조추출물은 16.2 g을얻었으며, 수율은 32.4% 였다. 2) 세포배양 Raw 264.7 cells은 37, 5% CO 2 조건에서 1% FBS, penicillin(1 U/mL), streptomycin(1 μg /ml) 이첨가된 DMEM 배지로배양되었다. Cells은 75 cm 2 flask(falcon, USA) 에서충분히증식된후배양 3 일간격으로배양세포표면을 phosphate buffered saline(pbs) 용액으로씻어준후 5 ml flask 당 1 ml의.25% trypsin-edta용액을넣고실온에서 1 분간처리한다음 trypsin 용액을버리고 3 7 에서 5 분간보관하여세포를탈착하여계대배양하였다. 탈착된세포는 1% FBS가첨가된 DMEM 배양액 1 ml에부유시킨다음새로운배양용기 (5 ml culture flask) 에옮겨 1 : 2의 split ratio로 CO 2 배양기 (37, 5% CO 2) 에서배양하였다. 3) 세포독성검사 (cytotoxicity assay) 준비된시료가 Raw 264.7 cells에나타내는세포독성유발효과를알아보기위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay 16-17) 를실시하였다. 96 well plate에 1 1 4 cells/well의 cell을 1 μl씩넣고 37, 5% CO 2 incubator 에서 24 시간동안배양한후배지를버리고배양세포표면을 phosphate

黃芩이 LPS 로유발된 Raw 264.7 Cells 의염증인자에미치는영향 77 buffered saline(1 PBS) 용액으로씻어주었다. 같은양의배지와 PBS에녹인시료 SR(25, 5, 1, 2 μg /ml) 을각 well에처리하고 24 시간동안배양하였다. 배양이끝난후 PBS에녹인 1 mg /ml MTT(Sigma, USA) 를 1 μl씩각 well에처리하여알루미늄호일로차광시킨후 2 시간동안같은조건에서배양하였다. 배양액을모두제거한후 DMSO를 1 μl처리하고 37 에서 2 시간방치후 microplate reader(molecular Devices, USA) 를이용하여 54 nm에서흡광도를측정하였다. Cell viability는다음공식으로계산되었다. Cell viability(%) = AT / AC 1 AC : absorbance of control AT : absorbance of tested extract solution. 4) Nitric oxide 생성측정 Weissman 등 18) 의방법을참조하여다음과같이실험하였다. LPS를단독처리 (1 μg /ml) 하거나혹은다양한농도의시료 (25, 5, 1, 2 μg /ml) 와함께배지에담아각 well에처리하고 24, 48 시간동안 37, 5% CO 2 incubator에서배양한후세포배양상등액 1 μl을채취하여여기에그리스시약 1 μl을혼합하여 15 분동안반응시킨후 microplate reader(bio-rad, USA) 를이용하여 54 nm에서흡광도를측정하였다. 세포의 nitric oxide 생성은다음공식으로계산하였다. Productions of Nitric oxide(%) = AT / AC 1 AC : absorbance of control AT : absorbance of tested extract solution. 5) Cytokine 생성측정면역단백질분비와관련된시료의영향을알아보기위해 Politch 등 19-2) 을참조하여다음과같이실험을시행하였다. 96 well plate에 1 1 5 cells/ml의 cell을 1 μl씩넣고 37, 5% CO 2 incubator 에서 24 시간동안배양한후배지를버리고배양세포표면을 1 PBS 용액으로씻어준뒤각 well에 LPS를단독처리 (1 μg /ml) 하거나혹은다양한농도의시료 (25, 5, 1, 2 μg /ml) 와함께배지에담아처리하고 24 시간동안배양하였다. 배양이끝나면상등액 (cell culture supernatant) 을채취하여 filter plate(96 well type) 에미리준비되어있던 antibody-conjugated capture beads와결합시켰다. 결합된 capture beads가담긴 filter plate의각 well을 15 ul의 wash buffer로세척하고, 세척이끝난뒤각 well에 detection antibody 를추가한후 3 분간배양하였으며, 배양이끝나면 wash buffer로 3회세척한뒤각 well에 streptavidin-pe를분주하고상온에서 3 ~5 rpm의조건으로 3 분간진동배양 (shaking) 하였다. 배양이끝나면 wash buffer로 3회세척한뒤각 well에 12 ul의 reading buffer를분주하고상온에서 3~5 rpm 의조건으로 5 분간진동배양 (shaking) 한후 Bio-Plex array reader(bio-plex 2) 을이용, 측정코자하는 cytokine 의양을조사 비교하였다. 3. 통계처리 본실험에서얻은결과에대해서는평균치 ± 표준오차 (mean ± SEM) 로나타내었으며, 대조군과각실험군과의평균의차이는 Student's t-test 로분석하여 p-value값이.5 미만일때통계적으로유의한차이가있는것으로판정하였다. 1. 세포생존율 성적 SR이대식세포의세포생존율에미치는영향을비교하였다. 24 시간처리한결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서유의한감소는없었다 (Fig. 1). Cell Viability (% of normal) 125 1 75 5 25 25 5 1 2 Fig. 1. Effect of SR on cell viability in Raw 264.7 cells for 24 hrs. incubation. SR:Water extract of Scutellariae Radix. Cells were incubated for 24 hrs. Results are represented as mean±sem of the three independent experiments. Normal:Not treated with SR. represents P <.5 compared to the normal. 2. NO 생성증가에대한영향 SR이 LPS로유발된마우스대식세포의 NO 생성증가에미치는영향을비교하였다. 24 시간동안처리한결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 NO 생성증가를유의하게억제시켰다 (Fig. 2). NO production (% of control) 125 1 75 5 25 - - 25 5 1 2 Fig. 2. Effect of SR on NO production in Raw 264.7 cells for 24 hrs. incubation with LPS. SR:Water extract of Scutellariae Radix. Cells treated with SR. Control:Treated with LPS (1 ug/ml) only. represents P <.5 compared to the control. 3. IL-6 생성증가에대한영향 SR이 LPS로유발된마우스대식세포의 IL-6 생성증가에미치는영향을비교하였다. 24 시간동안처리한결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 IL-6 생성증가를유의하게억제시켰다 (Fig. 3).

78 大韓本草學會誌 Vol. 26, No. 2, 211 IL-6 production 125 1 75 5 25 - - 25 5 1 2 Fig. 3. Effect of SR on IL-6 production in Raw 264.7 cells treated with LPS. SR:Water extract of Scutellariae Radix. Cells were incubated for 24 hrs. Results are represented as mean±sem of the three independent experiments. Normal:Not treated with SR. Control:Treated with LPS (1 ug/ml) only. represents P <.5 compared to the control. 4. IL-1 생성증가에대한영향 SR이 LPS로유발된마우스대식세포의 IL-1 생성증가에미치는영향을비교하였다. 24 시간동안처리한결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 IL-1 생성증가를유의하게억제시켰다 (Fig. 4). IL-1 production 1 75 5 25 - - 25 5 1 2 Fig. 4. Effect of SR on IL-1 production in Raw 264.7 cells treated with SR. Control:Treated with LPS (1 ug/ml) only. represents P <.5 compared to the control. 5. IL-12p4 생성증가에대한영향 SR이 LPS로유발된마우스대식세포의 IL-12p4 생성증가에미치는영향을비교하였다. 24 시간동안처리한결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 IL-12p4 생성증가를유의하게억제시켰다 (Fig. 5). IL-12p4 production 25 2 15 1 5 - - 25 5 1 2 Fig. 5. Effect of SR on IL-12p4 production in Raw 264.7 cells treated with SR. Control:Treated with LPS (1 ug/ml) only. represents P <.5 compared to the control. 6. IL-17 생성증가에대한영향 SR 이 LPS 로유발된마우스대식세포의 IL-17 생성증가에미치는영향을비교하였다. 24 시간동안처리한결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS 에의한 IL-17 생성증가를유의하게억제시켰다 (Fig. 6). IL-17 production 8 7 6 5 4 3 2 1 - - 25 5 1 2 Fig. 6. Effect of SR on IL-17 production in Raw 264.7 cells treated with SR. Control:Treated with LPS (1 ug/ml) only. represents P <.5 compared to the control. 7. IP-1 생성증가에대한영향 SR 이 LPS 로유발된마우스대식세포의 interferoninducible protein(ip)-1 생성증가에미치는영향을비교하였다. 24 시간동안처리한결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS 에의한 IP-1 생성증가를유의하게억제시켰다 (Fig. 7). IP-1 production 6 5 4 3 2 1 - - 25 5 1 2 Fig. 7. Effect of SR on IP-1 production in Raw 264.7 cells treated with SR. Control:Treated with LPS (1 ug/ml) only. represents P <.5 compared to the control. 8. KC 생성증가에대한영향 SR 이 LPS 로유발된마우스대식세포의 KC 생성증가에미치는영향을비교하였다. 24 시간동안처리한결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS 에의한 KC 생성증가를유의하게억제시켰다 (Fig. 8). KC production 4 3 2 1 - - 25 5 1 2 Fig. 8. Effect of SR on KC production in Raw 264.7 cells treated with LPS. SR:Water extract of Scutellariae Radix. Cells were incubated for 24 hrs. Results are represented as mean±sem of the three independent experiments. Normal:Not treated with SR. Control:Treated with LPS (1 ug/ml) only. represents P <.5 compared to the control.

黃芩이 LPS 로유발된 Raw 264.7 Cells 의염증인자에미치는영향 79 9. VEGF 생성증가에대한영향 SR이 LPS로유발된마우스대식세포의 vascular endothelial growth factor(vegf) 생성증가에미치는영향을비교하였다. 24 시간동안처리한결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 VEGF 생성증가를유의하게억제시켰다 (Fig. 9). VEGF production 25 2 15 1 5 - - 25 5 1 2 Fig. 9. Effect of SR on VEGF production in Raw 264.7 cells treated with SR. Control:Treated with LPS (1 ug/ml) only. represents P <.5 compared to the control. 고찰 黃芩은 神農本草經 1) 中品에 黃芩, 味苦平. 主諸熱黃疸, 腸澼, 泄利, 逐水, 下血閉, 惡瘡疽蝕, 火瘍. 一名腐腸. 生川谷. 이라고처음收載되었으며, 大觀本草 21) 에 療痰熱, 胃中熱, 小腹絞, 消穀, 利小腸, 女子血閉, 淋露下血, 小兒腹痛 이라하였고, 本草綱目 22) 에는 宿芩乃舊根, 多中空, 外黃內黑, 卽今所謂片芩, 故又有腐腸, 妬婦諸名. 妬婦心黯, 故以比之. 子芩乃新根, 多內實, 卽今所謂條芩. 이라하여宿芩과子芩으로분류하였다. 性은寒하고, 味는苦하며淸熱瀉火, 燥濕解毒, 止血, 安胎의효능이있어肺熱咳嗽, 熱病高熱神昏, 肝火頭痛, 目赤腫痛, 濕熱黃疸, 瀉痢, 熱淋, 吐衄, 崩漏, 胎熱不安, 癰腫疔瘡등을치료하는약물로사용되고있다 2). 黃芩의주성분은 flavonoid 계화합물로 baicalein, baicalin, chrysin, oroxylin-a, oroxylin-α-7-oglucuronide, wogonin, wogonoside, skullcapflavone, dihydrobaicalin 7) 과그외에 wogonin glucuronide, neo-baicalein, koganebananin 등이있으며, sterol 류로서 β-sitosterol, campesterol, stigmasterol 등이함유되어있고, 또한당류로서 sucrose 및 D-glucose 등이함유되어있는것 8) 으로알려졌다. 약리작용으로항균효과 9), 염증성장질환에서면역조절기능 1), 항암효과 11), 항산화효과 12), 혈중지질강하작용 13), 항알레르기천식작용 14), 간보호기능 15) 을보고하였다. 이와같은약리작용에대한연구를살펴볼때, 황금은특히면역매개인자들의조절을통하여항염증, 항산화, 항알레르기등의다양한효능이있는것으로보인다. 그러나황금의약리중대표적인항염효과에대해각각의질환별해당면역매개인자들에대한연구는보고되었으나황금물추출물을이용하여다양한염증매개인자들에대한연구는부족한것으로판단되었다. 이에본연구에서는黃芩을열수추출하여제조 한시료 (SR) 를대상으로 Raw 264.7 cells의 cell viability 와 LPS로유발된 Raw 264.7 cells의 NO 생성증가, 그리고 cytokines(il-1β, IL-6, IL-17, KC 등 ) 의생성증가에미치는영향을측정, 조사함으로써黃芩의항염증효과를살펴보고자하였다. 염증은국소손상또는외상을입었을때에일어나는복합반응으로, 상처를유발하는자극에대한방어기전으로발적, 발열, 종창, 동통, 기능상실등의증상이나타나며 23) 여기에는각종 cytokines 와 protein 의관여는물론 prostaglandin E 2, lysosomal enzyme, free radical 등다양한면역계세포와매개물질들이관여하고있다 24). 외부자극원중의하나인 LPS는그람음성균의세포표면을구성하는물질로서대식세포와같은염증성세포의활성을증대시키고이로인해활성화된대식세포는선천면역뿐만아니라적응면역등에관여하는것으로알려져있다 25). 본연구에서는한국세포주은행 (KCLB, Korea) 으로부터분양받은 Raw 264.7 cells에 SR을 25, 5, 1, 2 μg /ml의농도로처리한뒤에 24 시간동안 37 에서배양한후, 세포의증식을 MTT assay을이용하여확인한결과 25 μg /ml 이상의농도에서 Normal군에비하여 SR이 Raw 264.7 cells에유의한세포증식률감소를일으키지않았으며이는 SR이대식세포에유의한세포독성을유발하지않는다는것으로볼수있다 (Fig. 1). 일반적으로 NO는병리적인원인에의한과도한염증상태에서 NO는혈관투과성, 부종등의염증반응을촉진시킬뿐만아니라염증매개체의생합성을촉진하여염증을심화시키는것으로알려져있다 26). SR이 LPS로유발된마우스대식세포의 NO 생성증가에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 NO 생성증가를유의하게억제시켰다 (Fig. 2). 이와같이 SR이 LPS에의해유발된대식세포의 NO 생성증가를억제함은 SR이 NO 과잉에의한염증악화를억제할수있는효능이있음을의미한다. IL-6는림프계세포와골수성림프계세포에서생성되며감염이나손상등에의한급성반응을보이며면역에관여하는세포의성장과분화에관여한다 27). SR이 LPS로유발된마우스대식세포의 IL-6 생성증가에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과에서는 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 IL-6 생성증가를유의하게억제시켰다 (Fig. 3). IL-1은중요한면역조절 cytokine 으로면역억제, 항염증반응및 B 림프구자극특성을포함하는광범위한생화학적인작용범위를갖고있다 28). SR이 LPS로유발된마우스대식세포의 IL-1 생성증가에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과에서는 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 IL-1 생성증가를유의하게억제시켰다 (Fig. 4). IL-12 는대식세포와 dendritic cell에서생물학적으로 inactive form인 IL-12p4 과 active form인 IL-12p7 의두가지가분비된다 29). 최근의연구에서 IL-12p4 이수용체경쟁을통하여 IL-12p7 의생물학적작용을길항할수있다는것이관찰되었다 3). SR이 LPS로유발된마우스대식세포의 IL-12p4 생성증가에미치는영향을비교하기위해 24 시간동

8 大韓本草學會誌 Vol. 26, No. 2, 211 안처리한결과에서는 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS 에의한 IL-12p4 생성증가를유의하게억제시켰다 (Fig. 5). IL-17 은결합조직세포에작용하는 memory T-cell-derived cytokine으로, 염증매개인자의생산을촉진시키는경향이있다 31). SR이 LPS로유발된마우스대식세포의 IL-17 생성증가에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과에서는 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 IL-17 생성증가를유의하게억제시켰다 (Fig. 6). IP-1은다양한호흡기염증반응에서호중구와단핵구의화학주성에직접적으로관여하는것으로알려져있다 32). SR 이 LPS로유발된마우스대식세포의 IP-1 생성증가에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과에서는 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 IP-1 생성증가를유의하게억제시켰다 (Fig. 7). KC는주로조직세포 (endothelial cell, fibroblast), 거핵세포 (megakaryocyte) 및활성화된단핵구 (monocyte) 에의해생성되고, 급성염증반응의매개자로서다른 cytokine 보다먼저나타나우선적으로호중구 (neutophil) 에작용한다 33). SR이 LPS로유발된마우스대식세포의 KC 생성증가에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과에서는 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 KC 생성증가를유의하게억제시켰다 (Fig. 8). VEGF는주요한성장인자로서혈관내피세포에서발현되는매우특이한유사분열촉진인자이다. 초기단계의모세혈관생성시가장주요하게고려되는것이 VEGF 자극으로인한혈관의투과성이다 34). SR이 LPS로유발된마우스대식세포의 VEGF 생성증가에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과에서는 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 VEGF 생성증가를유의하게억제시켰다 (Fig. 9). 이와같이 SR이 LPS에의해유발된대식세포의각종 cytokine 의생성증가를유의하게억제하는것은 SR이대식세포의 cytokine 과다배출로인한염증질환악화, 예를들면 IL-12p4과 IL-17의증가로인한류마티스성관절염악화 VEGF 증가로인한자궁내막증유발 KC와 IP-1의증가로인한호흡기염증악화 IL-1 증가로인한전신성홍반성낭창악화 IL-6 증가로인한패혈증악화등을완화할수있는항염효능이있음을의미한다. 이상의결과, 黃芩을열수추출하여제조한시료 SR은대식세포에유의한세포독성을유발하지않으면서 LPS로유발된대식세포의 NO, IL-6, IL-1, IL-12p4, IL-17, IP-1, KC, VEGF의생성증가를 25 μg /ml 이상의농도에서유의하게억제하는등유의한항염효능을가지고있는것으로나타났다. 앞으로黃芩발효추출물을이용한대식세포연관면역질환치료제로의개발을위하여더욱많은연구가필요할것으로사료된다. 결론 黃芩 (Scutellariae Radix) 의항염효능을연구하고자黃芩을열수추출하여제조한시료 (SR) 를대상으로 Raw 264.7 cells 의 cell viability 와 LPS로유발된 Raw 264.7 cells의 NO 생성증가, IL-1β, IL-6, IL-17, KC 등의 cytokine 생성증가 에미치는영향을측정하여다음과같은결론을얻었다. 1. 黃芩물추출물의세포독성을확인하기위해 MTT assay를수행한결과黃芩물추출물은대식세포에유의한독성을유발하지않았다. 2. 黃芩물추출물은 24시간의배양에서 LPS로유발된대식세포의 NO 생성증가를유의하게억제시켰다. 3. 黃芩물추출물은 LPS에의해서유발된대식세포의 IL-6, IL-1, IL-12p4, IL-17, IP-1, KC, VEGF 생성량을 25 μg /ml 이상의농도에서유의하게억제시켰다. 이상의결과, 黃芩을열수추출하여제조한시료 SR은대식세포에유의한세포독성을유발하지않으면서 LPS로유발된대식세포의 NO, IL-6, IL-1, IL-12p4, IL-17, IP-1, KC, VEGF의생성증가를 25 μg /ml 이상의농도에서유의하게억제하는등유의한항염효능을가지고있는것으로나타났다. 감사의글 이논문은 211년도경원대학교연구비지원을받았기에감사드립니다. 참고문헌 1. Sun XY, Sun FY. Shen nong ben cao jing. Beijing:Kexue jishu wenxian chuban she. 1996:64. 2. Guojia zhong yiyao guanli ju Zhonghua bencao bian wei hui. Zhonghua bencao. Shanghai:Shanghai kexue jishu chuban she. 1999:(7)2-1. 3. Korean Food and Drug Adminstration Notification 27-89. The Korean Pharmacopoeia. 27:993-4. 4. Guojia yaodian weiyuanhui. The Chinese Pharmacopoeia. Beijing:Huaxue gongye chuban she. 25:211-2. 5. The DPRK Pharmacology Committee. The DPRK Pharmacopoeia. Pyungyang:Medicine Science pulisher. 23:454-5. 6. Ministry of Health, labour and Welfare. The Japanese Pharmacopoeia. Tokyo:Kabushiki YakuJiNippō-sha. 25:1183. 7. Kim HC. The Pharmacology of Medicinal Herbs. Seoul: Jibmundang. 28:129-33. 8. Herbal Pharmacology Compilation Committee. Herbal Pharmacology. Seoul: Shinil Books. 29:239-43. 9. Kim EN, Paek JY, Kim YH, Han MD. Antibacterial Activities of a Aqueous Extract form Scutellaria baicalensis against Pathogenic Bacteria. Journal of Natural Sciences of Soonchunhyang University.

黃芩이 LPS 로유발된 Raw 264.7 Cells 의염증인자에미치는영향 81 28;14(1):11-8. 1. Lee SH, Lim BO, Choue RW. Immunoregulatory Effects of Water Extracts of Scutellariae Radix in DSS-Induced Inflammatory Bowel Disease Animal Model. The Korean Journal of Nutrition. 24;37(6):431-9. 11. Lee YY, You KH, Kim SY, Ahn BZ. Augmentation of the Cytotoxic Effects of Anticancer Drugs by (±)-ar-turmerone and Extracts of the Lithosperma and Scutellaria Roots against Human Leukemia Cell Lines. Yakhak Hoeji. 24; 37(6):431-9. 12. Cho SU, Oh WW. Anti-Oxidative Effects of Scutellariae Radix. Kor. J. Herbology. 25; 2(3):67-74. 13. Kim KS, Cha MH, Lee SW, Yoon YS. A Study on the Inhibitory Effects of Scutellariae Radix on Fat Accumulation. Korean Journal Of Oriental Medicine. 23;9(2):45-54. 14. Park GB, Park YC. Effect of Scutellariae Radix extract on immune cells in OVA-induced asthmatic mice Lung tissue. College of Oriental Medicine, Daejeon University. 25;14(1):35-42. 15. In SL, Kang KL, Choue RW. Beneficial Effects of Water Extracts of Scutellariae Radix on Immune Function in Mice Fed Alcohol. J Korean Soc Food Sci Nutr. 26;35(5):536-42. 16. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983;65:55-63. 17. Ferrari M, Fornasiero MC, Isetta AM. MTT colorimetric assay for testing macrophage cytotoxic activity in vitro. J Immunol Methods. 199;131:165-72. 18. Weissman BA, Gross SS. Measurement of NO and NO synthase. Current Protocols in Neuroscience. 21;7:13. 19. Politch JA, Tucker L, Bowman FP, Anderson DJ. Concentrations and significance of cytokines and other immunologic factors in semen of healthy fertile men. Hum Reprod. 27;22(11):2928-35. 2. Lee KS, Chung JH, Lee KH, Shin MJ, Oh BH, Hong CH. Bioplex analysis of plasma cytokines in Alzheimer's disease and mild cognitive impairment. Immunol Lett. 28;121(2):15-9. 21. Tang SW. Da guan ben cao. Hefei:An wei kexue jishu chuban she. 22:277-8. 22. Lee SJ. Bon cho kang mok. Seoul:komoonsa. 1973:453-5. 23. Kindt TJ, Goldsby RA, Osborne BA. Kuby Immunology. Seoul:epublic. 28:6, 315-41. 24. Yun HJ, Heo SK, Lee YT, Park WH, Park SD. Anti-inflammatory Effect of Evodia Officinalis DODE in Mouse Macrophage and Human Vascular Endotherial Cells. Kor J Herbology. 28;23(1) L 29-38. 25. Willeaume V, Kruys V, Mijatovic T, Huez G. Tumor necrosis factor-alpha production induced by viruses and by lipopolysaccharides in macrophages: similarities and differences. J Inflamm. 1995-1996;46(1): 1-12. 26.Ryu JH, Ahn H, Kim JY, Kim YK. Inhibitory activity of plant extracts on nitric oxide synthesis in LPS-actived macrophage. Phytother Res. 23;17(5):485-9. 27. Kishimoto T, Akira S, Taga T. Interleukin-6 and its receptor: a paradigm for cytokines. Science. 1992 Oct;258(582):593-7. 28. Moore KW, O Garra A, Malefyt RW, Vieira P, Mosmann TR. Interleukin-1. Annu Rev Immunol. 1993;11:165-9. 29.Wolf SF, Temple PA, Kobayashi M, Young D, Dicig M, Lowe L, Dzialo R, Fitz L, Ferenz C, Hewick RM. Cloning of cdna for natural killer cell stimulatory factor, a heterodimeric cytokine with multiple biologic effects on T and natural killer cells. J Immunol. 1991;146(9):374-81. 3. Chen L, Chen D, Block E, O Donnell M, Kufe DW, Clinton SK. Eradication of murine bladder carcinoma by intratumor injection of a bicistronic adenoviral vector carrying cdnas for the IL-12 heterodimer and its inhibition by the IL-12p4 subunit homodimer. J Immunol. 1997;159:351-9. 31. Lin WW, Karin M. A cytokine-mediated link between innate immunity, inflammation, and cancer. J Clin Invest. 27;117(5): 1175-83. 32. Zeng X, Moore TA, Newstead MW, Deng JC, Lukacs NW, Standiford TJ. IP-1 mediates selective mononuclear cell accumulation and activation in response to intrapulmonary transgenic expression and during adenovirus -induced pulmonary inflammation. J Interferon Cytokine Res. 25;25(2):13-12. 33. Conti P, Boucher W, Letourneau R, Feliciani C, Reale M, Barbacane RC, Vlagopoulos P, Bruneau G, Thibault J, Theoharides TC. Monocyte chemotactic protein-1 provokes mast cell aggregation and [3H]5HT release. Immunology. 1995;86(3):434 4. 34. Bruggen N, Thibodeaux H, Palmer JT, Lee WP, Fu L, Cairns B, Tumas D, Gerlai R, Williams SP, van Lookeren Campagne M, Ferrara N. VEGF antagonism reduces edema formation and tissue damage after ischemia/reperfusion injury in the mouse brain. J Clin Invest. 1999;14(11):613-2.