(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2014년04월01일 (11) 등록번호 10-1379708 (24) 등록일자 2014년03월25일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 1/20 (2006.01) A01N 63/02 (2006.01) (21) 출원번호 10-2012-0013124 (22) 출원일자 2012 년 02 월 09 일 심사청구일자 2012 년 02 월 09 일 (65) 공개번호 10-2013-0091855 (43) 공개일자 2013 년 08 월 20 일 (56) 선행기술조사문헌 KR100535912 B1* KR1020120004856 A* KR1020020072813 A KR100257452 B1 * 는심사관에의하여인용된문헌 (73) 특허권자 전남대학교산학협력단 광주광역시북구용봉로 77 (72) 발명자 이향범 광주서구하남대로 710 번길 20, 501 동 803 호 ( 동천동, 우미린아파트 ) 정제용 광주남구대남대로 171 번길 23, 1 동 306 호 ( 주월동, 장미아파트 ) 박윤경 전남장성군남면마흥길 45, (74) 대리인 박창희, 김종관, 권오식 전체청구항수 : 총 7 항심사관 : 김지연 (54) 발명의명칭바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3, 이를함유하는식물병방제용조성물및식물병방제방법 (57) 요약 본발명은고추에서내생세균으로분리된신규한바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3, 이를함유하는식물병방제용조성물및식물병방제방법에관한것으로, 상기본발명에따른신규한바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 균주, 이의배양액또는배양액추출물을식물체에살포하거나관주처리함으로써다양한식물병을생물학적으로방제할수있으며, 여러작물에동시에적용가능할뿐아니라한작물에서도여러병해에대하여효과를동시에발휘할수있어, 작물의상품성및생산성을증대시킬수있는효과가있다. 대표도 - 도 4-1 -
이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 111095031SB010 부처명 농림수산식품부 연구사업명 생명산업기술개발사업 연구과제명 천연항생펩타이드발굴및산업적적용 기여율 1/1 주관기관 전남대학교 연구기간 2011.11.10 ~ 2014.11.09-2 -
특허청구의범위청구항 1 삭제청구항 2 바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3( 기탁번호 :KCTC 11971BP), 이의배양액또는배양액추출물을포함하는벼깨씨무늬병, 중국단풍흰가루병및백일홍흰가루병으로이루어진군으로부터선택되는 1종이상의식물병방제용조성물. 청구항 3 삭제청구항 4 제 2항에있어서, 상기식물병이바이포라리스오리재 (Bipolaris oryzae), 중국단풍흰가루병 (Sawadaea nankinensis) 및백일홍흰가루병 (Golovinomyces cichoracearum) 로이루어진군으로부터선택되는 1종이상의식물병원성미생물에의해발생하는것을특징으로하는, 식물병방제용조성물. 청구항 5 제 2항에있어서, 상기배양액추출물이 C 1-4 알코올, 헥산, 아세톤, 클로로포름및에틸아세테이트로부터선택된유기용매를단독으로사용하거나 2종이상을순차적으로사용하여배양액을추출함으로써수득되는것을특징으로하는, 식물병방제용조성물. 청구항 6 삭제청구항 7 삭제청구항 8 식물종자를바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3( 기탁번호 :KCTC 11971BP) 배양액또는배양여과액에침지처리하는단계를포함하는벼깨씨무늬병, 중국단풍흰가루병및백일홍흰가루병으로이루어진군으로부터선택되는 1종이상의식물병원성곰팡이생육억제또는식물발아촉진방법. 청구항 9 제 8항에있어서, 상기식물은고추, 벼, 중국단풍및백일홍으로이루어진군으로부터선택되는 1종이상인것을특징으로하는방법. 청구항 10 바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3( 기탁번호 :KCTC 11971BP), 이의배양액또는배양액추출물을파종전침지처리또는관주처리하는단계를포함하는벼깨씨무늬병, 중국단풍흰가루병및백일홍흰가루병으로이루어진군으로부터선택되는 1종이상의식물병원성미생물을방제하는방제방법. - 3 -
청구항 11 삭제청구항 12 제 10항에있어서, 상기방제방법은침지처리또는관주처리시바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML- CAP3( 기탁번호 :KCTC 11971BP) 의농도가 1 10 3 cfu/ ml내지 1 10 12 cfu/ ml인것을특징으로하는방제방법. 명세서 [0001] 기술분야 본발명은고추에서내생세균으로분리된신규한바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3, 이를함유하는식물병 방제용조성물및식물병방제방법에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] 배경기술근대과학의산물인농약과비료는농업생산성을증대하여인류를기아로부터해방시키는데크게기여하여왔다. 하지만최근에합성농약과비료의긍정적인측면보다는농약과비료의오남용및잔류에따른인 축독성및환경오염등의부정적인측면에대한사회적관심이크게증가하고있고, 인간의삶의질을중요시하는웰빙시대가도래하면서합성농약사용을줄이거나농약을사용하지않고작물을재배한친환경농산물에대한수요가증가하고있다. 또한, 농민의입장에서도수입자유화로가격이저렴한국외농산물이많이수입되고있어그대안으로단위면적당소득이높은유기농재배를선호함에따라친환경농산물재배면적이점차증가하고있다. 그러나, 실제포장에서친환경농법으로작물을재배할경우식물병을방제하지않고농산물을수확하기는매우어렵다. 연구에따르면작물보호제를사용하지않고농산물을재배할경우, 복숭아와사과는각각 100% 와 97% 의손실이있고, 오이, 양배추, 토마토등의채소는 39 내지 63% 의수확량감소가있었다. 그러므로, 친환경농산물생산을위해서는합성농약을대신할수있는, 효과가우수한생물농약이필요하다. 생물농약에는미생물을이용하여식물병, 해충및잡초를방제하는미생물농약과, 식물혹은미생물이생산하는천연물을이용하는생화학농약이있다. 미생물농약의경우, 제품의대량생산및제제화가어렵고, 제품의보존안정성이낮아화학농약과같이표준화, 규격화, 유통용이성이확보되지않아시장이크게확대되지않고있다. 그리고, 미생물농약을실제포장에사용하였을경우, 처리한후미생물이상당한양으로증식한후에야식물병을방제할수있으므로속효성있게식물병을방제할수없는어려움이있다. 또한, 적용병해의스펙트럼이좁아서작물에발생하는다른식물병을방제하기위하여여러생물농약을처리해야하므로현실적으로농민에게경제적인부담이되고있다. 한편, 토양근권에주로존재하는바실러스속세균은써펙틴, 이튜린등의항균활성을나타내는다양한 2차대사산물을생산하고, 열등의불리한환경에서저항성인내생포자를형성하는특징을가지는그람양성세균이다. 또한, 몇가지종을제외하고는바실러스속균주는대부분이인 축독성에대해안전하므로근래에는이를이용하여생물적방제제를개발하는연구가많이수행되고있다. 우리나라에서도바실러스속미생물중잿빛곰팡이병방제용균주로서바실러스아밀로리쿼페이션스 LP03 균주 ( 대한민국특허제 0807403호 ) 와바실러스아트로페어스 CNU05-1 균주 ( 대한민국특허제 0773091호 ), 식물병방제용바실러스서브틸리스 KCCM10639 또는 KCCM10640 균주 ( 대한민국특허제 0767437호 ) 등이등록된바있다. 상기와같은바실러스속의균주로서항진균활성을보이는미생물방제제는다수가공개되어있으나, 다양한식물병을효과적으로방제할수있는생물농약은아직정착되지않은실정이어서새로운생물적방제제의개발이요구되고있다. 선행기술문헌 특허문헌 - 4 -
[0008] ( 특허문헌 0001) KR 10-0773091 B1 2007.10.29 ( 특허문헌 0002) KR 10-0767437 B1 2007.10.09 ( 특허문헌 0003) KR 10-0807403 B1 2008.02.19 발명의내용 [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] 해결하려는과제이에본발명자들은, 고추의잎과줄기로부터분리한식물내생균인바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3을식물종자에침지하거나관주처리함으로써다양한식물병을생물학적으로방제할수있으며, 또한식물병원성진균에대한포자발아저해및곰팡이의생육억제효과뿐아니라동시에우수한식물발아촉진효과가있음을확인하고본발명을완성하였다. 본발명의목적은다양한식물병원균에대한우수한방제활성을가지는신규한바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3 및이의배양액또는이의배양액추출물의생산방법을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은상기바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3 의배양액추출물을이용한식물병원성진균에대한생물검정법을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은상기바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3 및이의배양액또는배양액추출물을포함하는식물병방제용조성물을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은상기바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3 및이의배양액또는배양액추출물을이용하여식물병원성미생물또는병원성미생물을방제하는방법을제공하는것이다. [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] 과제의해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명은식물병원균에대한방제활성을가지는, 바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3( 기탁번호 :KCTC 11971BP) 을제공한다. 이하본발명을상세히설명한다. 본발명에따른바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3은고추의잎과줄기로부터분리된식물내생균으로, 상기균주의 16S rdna의염기서열을분석한결과, 바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) 와가까운근연과계를가지는것을확인할수있었다. 상기신규한균주를바실러스아밀로리퀴피시언스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3라명명하고, 상기바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 균주를 2011년 6월 28일자로대한민국특허균주기탁기관인한국생명공학연구소내미생물자원센터에기탁하여기탁번호KCTC 11971BP를부여받았다. 도 1 및도 2를참조한다. 본발명은바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3 및이의배양액도는이의배양액추출물의생산방법을제공한다. 본발명의바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3은 LB 배지 (Luria-Bertani, DifcoTM, USA), YMB 배지 (Yeast Malt Broth, yeast extract 3g, malt extract 3g, peptone 5g, dextrose 10g, distilled water 1000ml), 감자한천배지 (Potato Dextrose Agar, DifcoTM, USA) 등세균생장을위한일반적인배지에서배양될수있다. 또한, 배양 ph는 4 내지 6, 배양시간은 24 내지 48시간으로하는것이좋으며, 보다바람직하게 48시간이내로하는것이좋다. 또한, 통상일반세균들이 30 내지 40 정도의비교적고온에서잘생장하고온도가낮아지면잘자라지못하는반면, 본발명에따른바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3의생장온도는 20 내지 35 에서도잘배양되는특징으로, 주요식물병의발병적온이 20 내지 25 인점을고려할때식물병방제를위한생물적방제제로서큰장점이있다. 본발명에따른바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3은세균생장을위한일반 - 5 -
적인배지에탄소원, 질소원또는이들의혼합물을더포함하여배양될수있다. 상기탄소원은수크로오즈 (sucrose), 덱스트로오즈 (dextrose), 락토오즈 (lactose), 만니톨 (mannitol), 수용성전분 (soluble starch) 및솔비톨 (sorbitol) 로이루어진군중에서선택된 1종이상인것을사용할수있으며, 첨가되는양은바람직하게 0.05 내지 1.0 중량 %(w/v) 를첨가될수있다. 특히상기탄소원으로는수용성전분을사용하는것이균주의생장및항진균활성을높이기에바람직하다. [0021] 또한상기질소원은배양균에질소를공급할수있는모든물질이가능하며, 예컨대, 질산나트륨 (NaNO 3 ), 질산 암모늄 (NH 4 NO 3 ), 황산암모늄 ((NH 4 ) 2 SO 4 ), 맥아추출물 (Malt extract), 펩톤 (Peptone) 및트립톤 (Tryptone) 으로이 루어진군중에서선택된 1 종이상인것을사용할수있으며, 첨가되는양은바람직하게 0.05 내지 1.0 중량 %(w/v) 로첨가될수있다. [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] 보다상세하게는상기탄소원을함유하는배지내에, 질소원으로는맥아추출물과펩톤을첨가하는것이바람직하다. 배지내바람직한질소원의함량은 0.05 내지 1.0 중량 %(w/v) 이며, 더욱바람직하게는 0.5 내지 1.0 중량 % 로첨가한다. 만약배지내탄소원또는질소원의함량이상기범위보다많을경우타영양물질의결핍이생길수있으며, 상기범위보다적을경우탄소원또는질소원의별도공급으로인한균주의생장상승효과가미미하게된다. 또한, 상기세균생장을위한일반적인배지즉, LB의배지를이용할경우 LB 배지의농도즉, 1% 또는 2.4% 에탄소원과질소원을첨가함에있어서는균주의생장에는크게영향을미치지않아, 균주를배양하는과정에서적은양의배지를이용할수있어생산비용을절감할수있는장점도있다. 도 8 및도 9를참조한다. 본발명은바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3 및이의배양액또는배양액추출물을포함하는식물병방제용조성물을제공한다. 또한, 본발명에따른바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3은오이, 참깨, 고추, 토마토, 딸기, 벼, 보리, 밀및잔디등작물에대하여전혀병원성을나타내지않으므로생물적방제제로이용이가능하다. 보다상세하게는바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3( 기탁번호 :KCTC 11971BP), 이의배양액또는배양액추출물을포함하는식물병방제용조성물은고추역병 ( 병원균 : Phytophthora capsici), 고추탄저병 ( 병원균 : Colletotrichum gloeosporioides), 고추세균성점무늬병 ( 병원균 : Xanthomonas campestris), 벼도열병 ( 병원균 : Magnaporthe grisea), 벼깨씨무늬병 (Bipolaris oryzae), 안개초시들음병 (Fusarium proliferatum), 토마토역병 ( 병원균 : Phytophthora infestans), 토마토잿빛곰팡이병 ( 병원균 : Botrytis cinerea) 으로이루어진군으로부터선택되는 1종이상인식물병에대하여방제효과를나타내며, 이들중특히고추탄저병, 벼도열병, 토마토잿빛곰팡이병등의식물병을효과적으로방제하는것을확인할수있었다. 본발명에따른바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3( 기탁번호 :KCTC 11971BP) 균주자체, 이의배양물또는배양물의추출물을포함하는조성물을식물이생장하고있는환경 ( 예 : 토양, 물 ) 또는성장중인식물표면에식물병을억제할수있는양으로살포또는관주처리함으로써다양한식물병을생물학적으로방제할수있다. 또한, 식물종자를바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3( 기탁번호 :KCTC 11971BP) 배양액또는배양여과액에침지처리함으로써식물병원성곰팡이생육억제또는식물발아촉진할수있다. 상기식물은오이, 참깨, 고추, 토마토, 딸기, 벼, 보리및잔디로이루어진군으로부터선택되는 1종이상의종자에사용할수있으며, 이는결국합성비료의사용을줄일수있는효과를제공한다. 상기배양물은균주의배양시생체고분자물질을더함유할수있다. 상기생체고분자물질은액상수화제형제조시제형화를위한전달매체로사용되며, 투명하면서도약흔을남기지않고적절한점성을유지할수있도록하는것으로, 밀기울, 오트밀, 쌀겨, 대두박및옥수수가루로구성된군으로선택된 1종이상의것을사용할수있다. 이때바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 균주를접종한후배양시첨가되는생체고분자물질은대두박이바람직하다. 또한, 필요에따라, 농약분야에서통상적으로사용되는담체와혼합하고분말, 펠렛, 과립또는용액등으로제형화하여식물병방제용조성물로서사용할수있다. 상기담체로는물, 화이트카본, 카올린등을사용할수 - 6 -
있으며, 상기배양물은액체배양물또는고체배양물일수있다. [0032] 또한, 상기균주배양물의추출물은유기용매로의추출을통해얻을수있는데, 바람직하게는 C 1-4 알코올, 헥산, 아세톤, 클로로포름및에틸아세테이트로부터선택된유기용매를단독으로사용하거나 2 종이상을순차적 으로사용하여추출을수행할수있다. [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] 보다상세하게는바실러스아밀로리쿼파시엔스 EML-CAP3 균주배양물을원심분리하여얻어진상등액에에틸아세테이트, 클로로포름에서하나이상선택된추출용매를이용하여추출된추출액이며, 바람직하게, 상기상등액에에틸아세테이트로분배추출하였으며, 수용액층은다시동일부피로에틸아세테이트로분배추출함으로써수득될수있다. 상기추출시, 상등액과동일부피의추출용매를혼합하는것이바람직하다. 본발명은슬라이드글라스상에바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3( 기탁번호 :KCTC 11971BP) 배양여과액및식물병원성진균의포자 (oidium) 를점적하는단계 ; 및상기슬라이드글라스를포화습도가유지된페트리플레이트에옮겨시간대별로식물병원성진균의포자발아저해율을조사하는단계 ; 를포함하는것을특징으로하는식물병원성진균에대한생물검정법을제공한다. 상기식물병원성진균은흰가루병균인것을특징으로한다. 본발명에따른생물검정법은통상의다른항균검정법보다시간적그리고비용적인면에서매우효과적이며, 검정의대상인배양체의매우낮은농도에서매우민감하게반응하는것을확인할수있어, 검정하고자하는활성물질또는배양체의양이낮을때상기생물검정법이매우유용하고농도의존적으로저해활성을보여고속스크리닝기술 (HTS) 에유용하게이용할수있는장점이있다. 본발명은바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3( 기탁번호 :KCTC 11971BP), 이의배양액또는배양액추출물을파종전침지처리또는관주처리하는단계를포함하는식물병원성미생물또는병원성미생물을방제하는방제방법을제공한다. 본발명에있어서, 상기식물병원성미생물은파이토프소라캡사이시 (Phytophthora capsici), 콜렉토트리쿰글로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides), 크산토모나스캄페스트리스 (Xanthomonas campestris), 피리큘라리아그리세아 (Pyricularia grisea), 바이포라리스오리재 (Bipolaris oryzae), 푸사리움프롤리페라툼 (Fusarium proliferatum), 파이토프쏘라인페스탄스 (Phytophthora infestans) 및보트리티스시네리아 (Botrytis cinerea) 로이루어진군으로부터선택되는 1종이상이며, 상기병원성미생물은에셰리키아콜리 (Escherichia coli) 또는스타필로코쿠스아우레우스 (Staphyloccocus aureus) 인것을특징으로한다. 상기방제방법은본발명의바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3( 기탁번호 :KCTC 11971BP), 이의배양액또는배양액추출물을침지처리또는관주처리시 1 10 3 cfu/ ml내지 1 10 12 cfu/ ml의농도로균주가포함된현탁액을처리하는것을특징으로한다. 구체적인방법으로본발명에따른바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3( 기탁번호 :KCTC 11971BP), 이의배양액또는배양액추출물은토양, 작물의잎, 줄기, 꽃또는열매에살포하는것으로, 물에상기조성물을희석하여사용할수있으며, 본발명의미생물균주의항균활성을더하기위하여엽면살포제또는관주살포제등을더포함할수있다. 또한, 살포시기는식물병원균이발병ㆍ증식하기전예방적으로미리처리하는것이방제효과를더욱상승시킬수있다. [0042] [0043] 발명의효과본발명에따른바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 균주는우리나라에서자생하는미생물로서경제적인대체효과가크고, 탄저병을포함한다양한식물병을야기하는병원균에대해강한항균활성을가지고있으며환경친화적으로방제할수있다. 또한, 본발명에따른바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 균주는미생물의이용에따른경제적인대체효과가크고고성능을가지고있어작물의상품성및생산성을증대시킬수있는효과가있다. [0044] 도면의간단한설명 도 1 은본발명에따른신규한바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3(KCTC 11971BP) 의 16S rdna 의염기서열을나타낸것이고, - 7 -
도 2는본발명에따른신규한바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3(KCTC 11971BP) 의 16S rdna를통한계통학적위치를확인한결과이며 ( 계통수는 Bacillus atrophaeus JCM 9070 및 Bacillus licheniformis DSM 13 균주를외집단으로사용하였으며 scale bar는뉴클레오티드당 0.01 substitutions을나타냄 ), 도 3은본발명에따른신규한바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3(KCTC 11971BP) 의배양사진 (A) 및이를전자현미경 (Scanning electron micrograph) 으로관찰한사진 (B) 을보여주는것이고, 도 4는본발명에따른신규한바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3(KCTC 11971BP) 의다양한식물병원균에대한억제활성효과를확인한결과이며, 도 5는본발명에따른신규한바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3(KCTC 11971BP) 의배양시배지및온도에따른생장곡선을나타낸것이고, (A: LB 배지, B: YMB 배지, C: PDB 배지 ) 도 6은본발명에따른신규한바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3(KCTC 11971BP) 의배양시 ph에따른생장곡선을나타낸것이며, 도 7은본발명에따른신규한바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3(KCTC 11971BP) 의배양시탄소원 (A) 과질소원 (B) 에따른생장곡선을나타낸것이고, 도 8은본발명에따른신규한바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3(KCTC 11971BP) 의배양시기본배지및탄소원과질소원의조성에따른생장곡선을나타낸것이며, 도 9는본발명에따른신규한바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3(KCTC 11971BP) 의배양시기본배지및탄소원과질소원의조성에따른 OD(Optical density) 와 CFU(colony forming units) 를비교한생장곡선을나타낸것이고, 도 10은본발명에따른신규한바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3(KCTC 11971BP) 의배양물분리과정을나타낸모식도이며, 도 11은본발명에따른신규한바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3(KCTC 11971BP) 균배양체의에틸아세테이트추출물로도열병균 (A) 과항생제저항성균주인포도상구균 (B) 에대한항균활성을나타낸것이고, 도 12는본발명에따른신규한바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3(KCTC 11971BP) 여과액의흰가루병균에대한포자발아억제효과를확인한결과이며, 도 13은본발명에따른신규한바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3(KCTC 11971BP) 배양액의벼종자상발생하는곰팡이의생육억제효과를확인한결과이다. (A: 증류수, B: 스포탁 31.25 ppm 첨가, C: LB 50배희석, D: LB 100배희석, E: 바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 배양체 50배희석, F: 바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 배양체 100배희석 ) [0045] [0046] 발명을실시하기위한구체적인내용이하, 하기실시예에의하여본발명을더욱상세하게설명하고자한다. 하지만, 본발명은하기실시예에의해한정되는것은아니며, 본발명의사상과범위내에서여러가지변형또는수정할수있음은이분야에서당업자에게는명백한것이다. 이때, 사용되는기술용어및과학용어에있어서다른정의가없다면, 이발명이속하는기술분야에서통상의지식을가진자가통상적으로이해하고있는의미를가지며, 하기의설명및첨부도면에서본발명의요지를불필요하게흐릴수있는공지기능및구성에대한설명은생략한다. [0047] [0048] [ 실시예 1] 바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 의분리및동정 (1) 균주의분리 - 8 -
[0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] 고추 (Capsicum annuum L.) 의잎과줄기는 2008년 11월 ( 겨울 ) 부터 2010년 10월 ( 가을 ) 까지전라남도나주시남평읍지역에서수집하였다. 고추의잎과줄기를 4 에보관 24시간이내로사용하여식물내생균주를분리하였고, 그방법은다음과같다. 잎의경우한잎당 1 cm2 ( 가로 1 cm 세로 1 cm) 크기로자른 4조각을 2% NaOCl에 1분간침지하여표면살균한후멸균수로 3회세척하고물기를제거하였다. 분리방법은 Direct plating method와 Dilution plating method 로나누어실시하였다. 먼저 Dilution plating method의경우, 표면살균된잎들을 1.5 ml eppendorf tube에넣고 1:1(g : ml ) 비율로하여마쇄하였다. 마쇄후원액과 10배희석액 100 μl씩취하여 PDA(Potato dextrose agar, Difco, USA) 배지에분주한후도말하였다. Direct plating method는표면살균된잎 3조각씩 PDA배지에치상하였다. 줄기는길이 1 cm 크기로자른 3 조각을같은방법으로표면살균하고, Direct plating method과 Dilution plating method로각각수행하였다. 각각의배지를 23 에서 14일동안다연실배양기 (HT-103-4, Hanbaek, Seoul, Korea) 에배양하면서세균의 CFU(Colony forming unit) 를측정하고, LB agar(luria-bertani, Difco, USA) 배지에옮겨순수분리하였다. 상기의순수분리된균주의보존을위해 20% 글리세롤 (glycerol) 이들어있는 1.5 ml eppendorf tube에분취하여냉동보관 (-80 ) 하면서필요한실험에사용되었다. 그결과, 하기표 1에서확인할수있듯이, 고추의잎과줄기로부터분리된균주중에서육안관찰, 형태및증식양상이서로구별되어지는 216가지의순수분리된내생세균을분리할수있었다. [0055] [0056] [0057] 또한, 탄저병을야기하는탄저병균 (Colletotrichum gloeosporioides) EML-CG01을포함한다양한식물병원균에대한길항균주를선발하기위하여 25 에서 7일간탄저병균 (Colletotrichum gloeosporioides) 을배양한후, 멸균한 8 mm borer로구멍을뚫어감자한천배지의가운데에올려놓았다. 32 에서 24시간동안 150 rpm으로진탕배양한균주의배양액을병원균과 2 cm 떨어진위치에획선을그은후, 25 에서 7일간배양하여생육저지환을측정하였다. 생장이양호하고탄저병균 (Colletotrichum gloeosporioides) 에대하여가장높은항균활성을가지는균주를선별하여최종적으로선별하였고, 이를 EML-CAP3이라명명하였다. 상기선별된 EML-CAP3 균주의생장곡선은 35 온도에서 24시간배양째생장이양호하였으나 24시간을기점으로생장은저조하였고, 온도가낮은 25 에서도생장이저조한것을도 5에서확인할수있었다. 또한상기선별된 EML-CAP3 균주를전자현미경으로관찰한결과, 도 3에서도확인할수있듯이, 그람양성의긴막대모양으로포자를형성하였으며형성된집락은원형으로표면은매끈한광택을나타내었다. [0058] [0059] [0060] [0061] (2) 균주의분자계통학적분석상기 (1) 에서선별분리된균주의최종동정을위하여염기서열분석을수행하였다. EML-CAP3 균주의 DNA를분리한후 16S rdna의염기서열분석을위하여 27f(5'-AGA GTT TGA TCM GGC TCA G-3') 및 1492r(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3') 인 2개의올리고뉴클레오티드를프라이머로이용하여중합효소연쇄반응 (PCR) 법을실시하였으며, 이과정은 95 에서 1분간열변성 (denaturation), 53 에서 40초간결합 (annealing), 72 에서 1분간신장 (extention) 하는조건에서효소적인방법으로상기 DNA를증폭시켰다. 상기증폭된 DNA는순수정제후염기서열 ( 도 1) 을분석하였다. EzTaxon(Chun et al., 2007) 을이용한표준균주와의염기서열비교분석결과, 도 2에서확인할수있듯이바실러스아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) 와가까운근연관계를가지고있음을확인할수있었고, 바실러스아밀로리쿼페이션스 EML- CAP3 균주 (Bacillus amyloliquefaciens EML-CAP3) 로명명하였다. 상기바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 균주는 2011년 6월 28일자로대한민국특허균주기탁기관인한국 - 9 -
생명공학연구소내미생물자원센터에기탁하여기탁번호 KCTC 11971BP 를부여받았다. [0062] [0063] [0064] [ 실시예 2] 바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3의식물병원균에대한항균활성조사상기선별된바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3을이용하여하기식물병원균에대한항균활성을조사하였다. 식물병원균은고추역병균 (Phytophthora capsici EML-PHC01), 고추탄저병균 (Colletotrichum gloeosporioides EML-CG01), 벼도열병균 (Pyricularia grisea EML-PGR01), 벼깨씨무늬병균 (Bipolaris oryzae EML-ORY15), 안개초시들음병균 (Fusarium proliferatum EMLGYP2) 을사용하여하기표 2에서결과를나타내었다. [0065] [0066] [0067] 상기표 2의결과및도 4의결과에서도확인할수있듯이, 바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3은고추역병균, 고추탄저병균, 벼도열병균, 벼깨씨무늬병균, 안개초시들음병균모두에대하여항균활성이있었으며특히, 고추탄저병및벼도열병에대하여우수한항균활성을가짐을확인할수있었다. 상기의결과는나아가바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3가고추역병, 고추탄저병, 벼도열병, 벼깨씨무늬병, 안개초시들음병에대한방제효과를가짐을확인한결과이기도하다. [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] [0074] [0075] [ 실시예 3] 바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3의대량생산방법 (1) 배양적특성조사상기바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3의배양적특성을조사하였다. 배지로는 LB 배지 (Luria-Bertani, DifcoTM, USA), YMB 배지 (Yeast Malt Broth, yeast extract 3g, malt extract 3g, peptone 5g, dextrose 10g, distilled water 1000 ml ), 감자한천배지 (Potato Dextrose Agar, DifcoTM, USA) 를 121 에서 15분간고압멸균하여사용하였다. 전배양은활성균주의단일콜로니를 LB 배양액에접종하고 32 에서 24시간 150 rpm으로진탕배양하여준비하였다. 제조된배양액에전배양액 0.2% 를접종한후, 배양온도를 25, 27, 30, 32, 35 로하여 150 rpm으로 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120시간동안진탕배양하고 Microplate reader(bio-tek Powerwave XS, US) 로 660 nm에서의흡광도 (OD; optical density) 를측정하였다. 그결과도 5에서도확인할수있듯이배지는 YMB 배지에서, 온도는 35 의온도의조건에서균주의생장이우수함을확인할수있었다. 또한, 바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3의초기 ph 변화에따른영향을조사하고자기본배지인 2.4% LB에 ph를 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9로조정하여각시간별로흡광도를측정하였다. 그결과도 6에서도확인할수있듯이, ph 4 내지 6의조건에서균주의생장이우수한것을확인할수있었다. 또한, 바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3의탄소원및질소원의이용성을조사하였다. 탄소원으로는수크로오즈 (sucrose), 덱스트로오즈 (dextrose), 락토오즈 (lactose), 만니톨 (mannitol), 수용성전분 (soluble starch) 및솔비톨 (sorbitol) 등을사용하였고, 질소원으로는질산나트륨 (NaNO 3 ), 질산암모늄 (NH 4 NO 3 ), 황산암모늄 ((NH 4 ) 2 SO 4 ), 맥아추출물 (Malt extract), 펩톤 (Peptone) 및트립톤 (Tryptone) 등의질소원 - 10 -
을사용하였고, 상기탄소원과질소원를 1% LB 배지에각각 1% 씩첨가하고, 각시간별로흡광도를측정하였다. [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] 그결과도 7에서도확인할수있듯이, 탄소원의경우수용성전분, 질소원은맥아추출물과펩톤에서균주의생장이우수한것을확인할수있었다. 또한, 기본배지의농도에따른균주의생장차이를확인하기위해기본배지인 LB를 1% 와 2.4% 를준비하였고, 시간별로흡광도와 CFU를측정하였다. 그결과, 도 8에서도확인할수있듯이탄소원과질소원을첨가하지않았을때에는 LB 배지의농도가 1% 보다 2.4% 에서생장이양호한것을확인할수있었다. 상기기본배지 (1% LB) 와활성균주의최적탄소원, 질소원을조합하였을때의흡광도와 CFU차이를확인하기위하여기본배지에실험결과얻어진활성균주의최적탄소원과질소원을각각 1% 씩첨가하여시간별로흡광도와 CFU 를측정하였고, 그결과도 8 및도 9에서도확인할수있듯이, 탄소원과질소원을첨가하지않았을때에는 LB 배지의농도가 1% 보다 2.4% 에서생장이양호하였으나탄소원과질소원을첨가하였을때에는기본배지농도에따른균주의생장은큰차이가없는것을확인할수있었다. 상기의결과로부터바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3의대량배양은 YMB 배지 ( 또는 LB 배지 ) 에탄소원으로는수용성전분, 질소원으로는맥아추출물또는펩톤을첨가하여 ph 4 내지 6의배지의조건으로제조하여사용하는것이바람직하고, 균주의접종후 35 의온도에서 24시간동안배양함으로써생장이우수한균주를대량생산할수있음을확인하였다. [0081] [0082] [0083] [0084] [ 실시예 4] 바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3의흰가루병원균의포자발아억제효과조사바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3은다양한흰가루병원균에대한포자발아저해율을조사하기위하여하기실험을수행하였다. 바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 균주를 LB 배지에접종한후, 32 에서 120 rpm으로 24시간배양하고, 배양액을원심분리하여균체를제거하고 0.1 μm크기의 syringe filter(pall corporation, USA) 로여과하여배양여과액을수득하였다. 슬라이드글라스위에 50배, 100배로희석한상기수득한배양여과액을한방울씩떨어뜨리고, 흰가루병이발생한중국단풍 (Acer buergerianum), 사철나무 (Euonymus japonica), 배롱나무 (Lagerstroemia indica), 백일홍 (Zinnia elegans), 졸가시나무 (Quercus phillyraeoides), 피망 (Capsicum annuum L. var. angulosum) 의잎들을수집하여흰가루병원균의포자를가볍게털어서올려놓은후, 포화습도상태인페트리플레이트에넣어 24시간후에광학현미경을통하여포자의발아율을측정하여하기표 3에나타내었다. [0085] [0086] 그결과, 상기표 3 및도 12 에서도확인할수있듯이, 증류수처리구에서중국단풍흰가루병원균의발아율은 27.26± 4.90(100% 기준 ) 이었으나바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 을 50 배희석한처리구에서는 19.99% 의 - 11 -
발아율을나타내는것을확인할수있어, 대조구 ( 증류수상에서의발아율 ) 를 100% 로산정할경우 5 배정도즉, 포자발아저해율이 80% 임을확인할수있었다. [0087] [0088] [0089] [0090] 상기의결과는바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3은다양한진균병방제에효과를있으며, 특히다양한흰가루병균에대해서우수한저해효과를보여흰가루병방제제로서개발될수있음을보여주는것이다. 또한, 상기결과로부터바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3의흰가루병원균에대한균배양체의활성을 slide 배양법으로측정하였다. 이는바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 배양여과액을증류수에다양한희석배율로섞고, 상기희석배양여과액을슬라이드글라스에떨어트린후, 그위에흰가루병원균의포자 (oidium) 를점적하고다음으로, 포화습도가유지된페트리플레이트에옮겨시간대별로흰가루병원균의포자발아저해율을조사하였다. 그결과통상의다른항균검정법보다시간적그리고비용적인면에서매우효과적이었으며, 중국단풍흰가루병원균이외에도다른흰가루병원균의포자를사용할경우에도비슷한결과를보여확대적용할수있음을확인할수있었다. 또한, 검정의대상인배양체의매우낮은농도에서매우민감하게반응하는것을확인할수있어, 검정하고자하는활성물질또는배양체의양이낮을때상기생물검정법이매우유용하고농도의존적으로저해활성을보여고속스크리닝기술 (HTS) 에유용하게이용할수있는장점이있다. [0091] [0092] [0093] [ 실시예 5] 생체고분자물질첨가에따른항균활성상기바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 균주를이용하여제재개발을하기위해, 배지내다양한생체고분자물질을첨가하여배양한후그에따른배양균주의항균활성및생균수의변화를조사하였다. 3차증류수 50 중량 % 에주성분 ( 생체고분자물질 ) 으로밀기울, 오트밀, 쌀겨, 대두박, 옥수수가루를각각 10 중량 % 를혼합하여배지를제조하고, 121, 1기압의조건에서 15분간멸균처리한후무균상태에서 1 ml의바실러 스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3(1 10 6 CFU 농도 ) 을접종하고 32 교반배양기에서정치배양하였다. [0094] 상기정치배양후생균수를측정하기위하여최종 20 일간배양후각각의고체배지에서 1 g 씩취하여 9 ml 의 멸균증류수에넣어 10 5, 10 6, 10 7, 10 8 배까지희석하여 LB 배지에도말하고 32 에서 2 일간배양한후형성된콜 로니를통해생균수 (CFU, colony forming unit) 를디지털콜로니카운터 (KT0074A, Kastech, Korea) 를이용하여 측정하였다. [0095] [0096] 상기고체배지에서 1 g씩취하고 10 ml의멸균증류수를넣어고체배지가잘풀리도록교반하여 1500 rpm에서 15분동안원심분리한후상등액 50 μl를원형여과지 (paper disc, 직경 8 mm) 에올려놓고, 25 에서 7일간배양한후생육저지환을측정하여도열병균에대한항균활성을평가하였다. 그결과하기표 4에서보는바와같이밀기울, 쌀겨, 오트밀, 옥수수배지배지를주성분으로배양할경우도열병균에대한항균활성이중도의항균활성을나타냄을알수있었으며, 대두박배지는다른주성분에비해다소낮은항균활성을나타내는것을확인할수있었다. [0097] [0098] 또한, 기본배지및생체고분자물질의조성을달리하여배양된바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 의생균 - 12 -
수는하기표 5 에확인할수있듯이, 바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 을대두박을배지를주성분으로첨 가하여배양할경우가생균수가밀기울을주성분으로한경우보다생균수가적게는 10 배이상많게는 30 배 ( 평균 20 배 ) 이상증가되는것을확인할수있었다. [0099] [0100] [0101] [0102] [ 실시예 6] 바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 추출물의식물병원성미생물및병원성미생물에대한항균활성을조사상기바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3을포함하는식물병방제용조성물은하기의방법으로제조하였다. 우선, 바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3의추출물은도 10의방법으로제조하였다. 보다상세히바실러스 아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3을 LB 배지에접종 (1 10 6 ) 하여 32 에서 120 rpm으로 48시간동안진탕배양하였다. 상기배양액은 6,000 rpm에서 15분간원심분리하여균체를제거하고, 회수한상등액은동일부피의클로로포름 (CHCl 3, OCI, 67-66-3) 과에틸아세테이트 (EtOAc, OCI, 141-78-6) 로각각 2회분배추출하였다. 회수한유기용매층은농축기 (N-100, Tokyo Rikakikai Co., Ltd) 로감압농축한후항균활성시험을위한조추출물로사용하였다. [0103] [0104] 상기방법으로추출된바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3의추출물을이용하여식물병원성미생물또는병원성미생물에대한항균활성을조사하였다. 상기식물병원성미생물은벼도열병균 (Pyricularia grisea EML-PGR01), 채소반점세균병균 (Xanthomonas campestris) 을사용하였고, 병원성미생물로는대장균 (Escherichia coli) 및약제다제내성의포도상구균 (Staphyloccocus aureus) 을사용하였다. [0105] [0106] 그결과상기표 6 및도 11 에서도확인할수있듯이, 에틸아세테이트 (EtOAc) 층및클로로포름 (CHCl 3 ) 층을회 수하여얻은방제용조성물이식물병원성미생물뿐아니라병원성미생물에대해항균활성이높고활성범위또 - 13 -
한넓어, 바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3, 이의배양액및배양액의추출물모두는상기병원성미생물 의방제에유용하게이용될수있음을확인할수있었다. [0107] [0108] [0109] [0110] [ 실시예 7] 바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3의식물병원성곰팡이생육억제및식물발아촉진효과조사상기바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3의식물병원성곰팡이생육억제및식물발아촉진효과를조사하였다. 벼종자상에서발생된곰팡이를억제하는효과를확인하기위하여 LB broth에 32 에서 120 rpm으로 24시간배양하고배양액을원심분리하여균체를제거한후, 0.1 μm크기의 syringe filter(pall corporation, USA) 로여과하여배양여액을수득하였다. 벼종자를바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3의배양액 ( 원액, 희석액 ) 과배양여과액 ( 원액, 희석액 ) 에각각 24시간동안침지시킨후앰피실린 (Ampicillin), 네오마이신 (Neomycin), 스트렙토마이신 (Streptomycin) 등의항생제를첨가한배지와습실처리된고체페트리플레이트에각각벼종자 10개씩치상하여, 배양시발생하는곰팡이의수와종자의발아수를측정하였다. 대조구로는멸균수와배양액인 LB 원액, 희석액을사용하였고, 양성대조군 (positive control) 으로는종자소독에많이사용되는스포탁 (prochloraz 25%, Bayer) 을사용하였으며동일한조건으로실시하였다. [0111] [0112] 그결과상기표 7 및도 13 에서도확인할수있듯이, 벼종자의침지처리시바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 배양액및배양여과액을 100 배희석하여사용하더라도대조구에비하여우수한곰팡이의생육을억제 하는효과뿐아니라벼의발아촉진에도효과가있음을확인할수있었다. [0113] 상기의결과는바실러스아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 배양액및배양여과액은식물병원성곰팡이의생육억제 - 14 -
뿐아니라식물발아촉진에효과적임을확인한결과이기도하다. [0114] 수탁번호 기탁기관명 : 한국생명공학연구원 수탁번호 : KCTC11971BP 수탁일자 : 20110628 도면 도면 1-15 -
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