RESEARCH ARTICLE 인간진피섬유아세포에서 Nobiletin 이 Mitogen-Activated Protein Kinases 를통한 Matrix-Metalloprotease 1 발현조절에미치는영향 차화준 1, 김영주 2 * 1 건국대학교한국피부임상과학연구소, 2 오산대학교뷰티디자인계열 Mitogen-Activated Protein Kinases Mediated Regulation of Matrix- Metalloprotease 1 by Nobiletin in Human Dermal Fibroblasts Hwa Jun Cha 1, Young-Joo Kim 2 * 1 Korea Institute for Skin and Clinical Sciences, Konkuk University 2 Division of Beauty Design, Osan University Abstract Nobiletin is widely used for the treatment of cancer and inflammation disorder. In neurocytes and melanocytes, nobiletin exposure induced dendrite formation. Recently, nobiletin is suggested as a new whitening agent. However, in dermis, effects of nobiletin are not understood currently. Therefore, it is important to determine how nobiletin exerts its therapeutic action and its effect on the anti-wrinkle. To determine whether MMP1 gene expression is regulated by nobiletin, we measured MMP1 mrna expression in nobiletein-treated human dermal fibroblasts (HDFs). And we showed that transactivation activity of TPA responsive element (TRE) which is a major regulation promoter element and mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity which main regulator of AP-1 complex. As shown results, nobiletin was decrease expression level of MMP1 mrna in oxidative-stressed HDFs. In addition, nobiletin repressed MAPK phosphorylation and transcriptional activity of AP-1 complex in oxidative-stressed HDFs. Therefore, nobiletin protects oxidative-stress through repressing MAPK phosphorylation and transcriptional activity of AP-1 complex. In addition, these results suggest that nobiletin is a potential cosmetic ingredient repressed antiaging and anti-wrinkle in skin. Keywords: Nobiletin, Human dermal fibroblasts, Matrix-metalloprotease 1 Nobiletin 는감귤과같은 citirus 계열에다량함유되어있는 bioflavonoid 중하나로, 화학적구조식은 C 21 H 22 O 8 이고분자 량은 402.39 이다 (Gua et al., 2012). Nobiletin 은항바이러스, 항암그리고항염활성을가지고있는것으로알려져있으며, 특 히위암세포주에서세포증식억제효과와 apoptosis 를유발하 *Corresponding author: Young-Joo Kim, Division of Beauty Design, Osan University, 45 Cheonghak-ro, Osan-si, Gyeonggido, Republic of Korea Tel.: +82 31 370 2846, Fax: +82 31 370 2845 E-mail: blue@osan.ac.kr Received November 6, 2014; Revised December 19, 2014; Accepted December 23, 2014; Published December 30, 2014 는것으로밝혀졌다 (Gua et al., 2012; Suzuki et al., 2005; Yoshimizu et al., 2004). 또한 nobiletin은 reactive oxygen species (ROS) 또는염증반응으로부터피부를보호하는역할을하고, 염증지표인자인 prostaglandin E2의생성과 COX-2 의단백질발현을억제하는것으로알려져있다 (Suzuki et al., 2005; Morwood & Lappas, 2014). 또한신경세포에서 nobiletin는 ERK/PKA/cAMP의신호전달경로를활성화시키고, 이를통해 CREB의전사활성을높여신경돌기의성장을유도하는유전자의발현을증가시킨다 (Kawahara et al., 2013). 또한 nobiletin이세포내 camp 증가를유도하는것으로알려져있기때문에멜라닌생합성과정과흑색종의세포분화의척도가되는수상돌기의생성과연관될가능성도제시되고있다 (Yoon et al., 2007). MAP kinase 는여러가지외부자극에의해세포의성장, 사 www.kosac.or.kr 939
멸, 분화등에관여하고, 대표적으로 extracellular signalregulated kinase (ERK), c-jun N-terminal kinase (JNK/ SAPK), p38 kinase로구성되어있다 (Roux & Blenis, 2004; Kyriaskis & Avruch, 2012; Weston & Davis, 2002). 이러한 MAP kinase는전사인자들을인산화함으로써다양한유전자의발현을조절한다 (Krifka et al., 2012; Chen et al., 2013). 특히 JNK는주요한 MAP kinase family 중하나로대부분의세포에서주요한신호전달단백질로사용되고있다 (Kook et al., 1985; Endo et al., 2009). 이러한 JNK는자외선또는 reactive oxygen species (ROS) 같은 stress에의해서급격하게 Matrix-Metalloprotease 1 (MMP1) 의발현이증가하는현상에주된역할을하는것으로알려져있다 (Poulalhon et al., 2006; Westermarch et al., 1998). 이러한 MMP1의증가는자외선또는 ROS에의해서활성화된 JNK가 AP-1 complex 의주요 factor인 c-jun 인사화를통하여 AP-1의전사활성을증가시키고, 이에따라그표적유전자인 MMP1의발현이증가되는것으로알려져있다. 때문에 JNK의활성증가에따른 MMP1의발현증가는피부에 collagen matrix를파괴하여피부의탄력을떨어뜨리고, 주름발생의원인이된다 (Dasqupra et al., 2010). 따라서본연구에서는감귤의주요성분인 nobiletin의인간진피섬유아세포에서 MMP1의발현변화에미치는영향을확인하고이러한기전에 MAPK activity가관여함을확인함으로써항주름원료로서의가능성을확인하고자한다. 후 5 mg/ml MTT 용액 (Sigma, USA) 을 10 μl넣고 4 h 동안빛을차단한상태로 37 에반응하여 MTT가환원되도록하였다. 반응후상층에배양액을제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO; Biopure, Canada) 100 μl를첨가하여형성된 MTT formazan을녹인후, plate reader (Bio-Rad, USA) 로 595 nm의파장에서흡광도를측정하였다. 3. cdna 합성및 qrt-pcr 각각의조건에서 Trizol (Invitrogen, USA) 에의해서추출된 RNA 2 μg을 2 μg의 oligo dt와함께 94 에서 5 min 간 denaturation 시켰다. Denaturation 후 2X reverse transcriptase mix (Enzynomics, Korea) 를첨가하여 37 로 1 h 반응시켜 cdna를합성하였다. 합성된 cdna는 0.2 μ M primers, 50 mm KCl, 20 mm Tris/HCl ph8.4, 0.8 mm dntp, 0.5 U Extaq DNA polymerase, 3 mm MgCl 2, 1X SYBR green(invitrogen) 조건에서 LinegeneK (BioER, China) 을이용하여 qrt-pcr을수행하였다. MMP1의 primer는 MMP1 forward primer, 5 -CTTTCTGGAAGGGCAAGGAC-3 ; MMP1 reverse primer, 5 -TTGCCTCCCATCATTCTTCA-3 을사용하였으며, β-actin는 β-actin forward primer, 5 -CGACAGGATGCAGAAGGAG-3 ; β-actin reverse primer, 5 -ACATCTGCTGGAAGGTGGA-3 를사용하였다. Normalization은 β-actin을이용하여정량하였고, 55-94 까지 melting curve를측정하여 PCR product의정확도를확인하였다. 1. 세포배양및시료인간진피섬유아세포는 Lonza사 (USA) 에서구매하여사용하였으며, 세포배양액은 Dulbeco s Modified Eagle s Medium (DMEM; Gibco, USA) 에 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco), 10% penicillin (100 unit/ml) 과 streptomycin (100 μg/ml) 를첨가하여사용하였다. 배양조건은 37, 95% 습도, 5% CO 2 incubator에서배양하였으며, 3-15세대사이의세포를실험에사용하였다. Nobiletin은 Sigma Aldrich (USA) 에서구매하여사용하였으며실험에사용된 primer는 Bionics사 (Korea) 에서구매하였다. 2. MTT assay 세포생존율을알아보기위해 MTT 분석을실시하였다. 96 well plate에 3 10 3 개의인간진피섬유아세포를용액부피의 10% FBS를함유한 DMEM에 24 h 동안배양하였다. 여기에각각의실험조건별로처리후다시 24 h 배양을하였다. 이 4. Luciferase assay Reporter plasmid (pgl-tre, 1 μg) 와 normalization plasmid (pcmv-β-gal, 0.2 μg) 을 Hilymix (Dojindo, Japan) 를이용하여인간진피섬유아세포에형질주입하였다. 형질주입후 24 h 동안배양하고 resveratrol을처리하였다. Resveratrol 처리후 24 h 배양한뒤세포를수확하여 1X luciferase lysis buffer (Promega, USA) 100 μl에넣고세포를용해시켰다. 이를 4 에서 10 min간방치하고 4, 12000 rpm으로 10 min간원심분리하였다. 원심분리후상층액을분리하여 luciferase assay에사용하였다. Luciferase assay는 luciferase reagent (Promega) 을이용하여수행하였고, Luminometer (Veritas, USA) 을이용하여발광정도를측정하였다. Normalinzation 은 β-galatosidase 의활성을 O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) assay로측정하여 luciferase assay값을보정하였다. 5. Western blotting 인간진피섬유아세포를 60 mm 배양접시에 5 10 5 개접종하여 24 h 배양후, 각각의조건을처리하고다시 24 h 배양하였 940 www.kosac.or.kr
Nobiletin 이 MMP1 발현에미치는영향 # * * Figure 1. Cytotoxicity of nobiletin in HDFs. Figure 2. The effect of nobiletin on MMP1 mrna expression in HDFs. 다. 배양된세포를수확하여 PBS로 2회수세하고, RIPA buffer (50 mm Tris-Cl (ph 7.5), 150 mm NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, protease inhibitor) 로용해하였다. Bradford용액 (Bio-Rad, USA) 를이용하여단백질정량을하였고, 동량의단백질을 10% SDS-PAGE gel을이용하여분리하였다. 분리된단백질을 nitroellulose membrane (Whatman, UK) 으로 transfer후 5% skim milk buffer에서 1 h blocking을하였다. Anti-p38 (Santacruz, USA), Anti-p-p38, JNK, p-jnk, ERK, p-erk (Cell Signalling, USA), β-actin (Sigma, USA) 을 1차항체로사용하고, 각각의항체에따라 goat anti-mouse (Cell Signaling) 을 2차항체로사용하였으며, Supersignal Westpico (Pierce, USA) 을이용하여발광시키고필름 (AGFA, Japan) 을통해발광정도를측정하였다. 6. 통계처리 Student t-test방법을이용하여실험결과간의통계적유의성을판단하였다. 또한 p<.05의값을유의성있다고판단하였다. 1. Nobiletin의세포독성확인인간진피섬유아세포에 nobiletin을 0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 μm로 24 h 처리후 cell viability를측정한결과 25 μm부터농도가증가할수록농도의존적으로세포사멸이일어나는것을확인하였고, 400 μm의 nobiletin을처리하였을때 19.67% viability가유의적으로감소함을확인하였다 (Figure 1). 때문에 nobiletin의이후실험에서는 10% 미만의통계적으로유의하지않게 viability감소를가지는 100 μm nobiletin을이용하여추후실험을진행하였다. 2. Nobiletin에의한 MMP1 발현변화인간진피섬유아세포에 600 μm H 2 O 2 를처리하여 MMP1 의발현은유발시키고, nobiletin을 100 μm의농도로 24 h 처리하였다. 이후세포를수확하여추출한 RNA를대상으로제작한 cdna를이용하여각각의실험군에서의 MMP1 발현변화를 qrt-pcr로확인하였다. 실험결과 MMP1 mrna의발현은 600 μm H 2 O 2 에의해서대조군에비하여 2.93배유발되고, 유발된 MMP1 mrna는 100 μm nobiletin에의해서다시발현이 1.27배로줄어듦을확인하였다 (Figure 2). 3. Nobiletin에의한 TPA Responsive Element (TRE) 의전사활성변화 Nobiletin은 H 2 O 2 에의해서증가된 MMP1의 mrna를조절하기때문에 H 2 O 2 처리시에 MMP1의발현을주로조절하는 AP-1 complex의전사활성에 nobiletin이영향을미치는지를확인하기위해서 AP-1의 DNA binding site인 TRE를통해서전사활성을확인하였다 (Risse et al., 1989; Park et al., 2003). 인간진피섬유아세포에 600 μm H 2 O 2 를처리하여 TRE 의전사활성을유발시키고, nobiletin을 100 μm의농도로 24 h 처리하였다. 이후세포를수확하여추출한 cell lysate를이용하여각각의실험군에서의 TRE의전사활성변화를 luciferase assay로확인하였다. 실험결과 TRE의전사활성은 600 μm H 2 O 2 에의해서대조군에비하여 170.31% 로유발되고, 유발된 TRE의전사활성은 100 μm nobiletin에의해서다시그활성이 112.11% 로줄어듦을확인하였다 (Figure 2). 때문에 nobiletin 은 AP-1 complex의전사활성조절을통해서 MMP1의발현을감소시키는것을확인하였다 (Figure 3). 4. Nobiletin에의한 MAPKs 활성변화이러한 AP-1의활성조절은대표적으로 MAPK에의해서조절되고, JNK는 AP-1 complex의주요한구성단백질인 c-jun www.kosac.or.kr 941
* Nobiletin (100 μm) H 2O 2 (600 μm) - - + + - + - + # p-erk p-jnk p-p38 Figure 3. The effect of nobiletin on transctivation activity of AP-1 in HDFs. β-actin ERK 에 phosphorylation을하여서 AP-1의전사활성을감소시키는것으로알려져있고, ERK는 c-fos발현을조절하고 c-jun의인산화를통해서활성을조절하는것으로알려져있다 (Leppä et al., 1998; Karin, 1995). 마지막으로 p38은 Sap-1a에인산화를통해서 AP-1 complex의주요구성단백질인 c-fos의발현을증가시키고, 이를통해서 AP-1의전사활성을조절하는것으로알려져있다 (Zarubin & Han, 2005). 때문에 nobiletin에의해서 MAPK 의활성변화를확인하였다. 인간진피섬유아세포에 600 μm H 2 O 2 를처리하여 JNK, ERK, p38의인산화를유발시키고, nobiletin을 100 μm의농도로 24 h 처리하였다 (Figure 4). 이후세포를수확하여추출한 cell lysate를이용하여각각의실험군에서의 JNK, ERK, p38의인산화정도를확인함으로써각각의 MAPK의활성을확인하였다. 실험결과 JNK, ERK, p38의인산화는 600 μm H 2 O 2 에의해서대조군에비하여인산화가모두증가한것으로확인되었고, 유발된 JNK, ERK, p38의인산화는 100 μm nobiletin에의해서다시 MAPK의인산화가줄어듦을확인하였다 (Figure 2). 때문에 nobiletin에의해서 MAPK 의활성을감소시키는것을알수있다. 이러한 nobelitin에의한 MAPK의활성변화는 MMP1의조절을유도함을확인할수있다. 특히, nobiletin은 oxidative stress에의해서활성화되는대표적인 MAPK인 JNK를조절하는것외에 ERK, p38의활성을조절함으로써 MMP1의 expression을조절하는것을확인할수있다. 또한유사하게최근연구에따르면 nobelitin에 p38의활성을조절하여서 MMP9의발현을조절한다는보고있다 (Kim et al., 2014). 이러한결과들을종합해볼때 nobiletin은 MAPK의활성을조절하여서 AP-1의전사활성을조절하고이를통해 oxidative stress에의해서증가된 MMP1의발현을감소시키는것으로확인하였고, 이를통해 nobiletin이항주름또는항노화화장품원료로서의가능성을제시하였다. JNK P38 Figure 4. The effect of nobiletin on MAPK phosphorylation in HDFs. Nobiletin 는감귤과같은 citirus 계열에다량함유되어있는 bioflavonoid 중하나로이미감귤추출물은피부의노화를억 제하는것으로알려져있다. 때문에감귤의가장대표적인활 성성분인 nobiletin 의항노화또는항주름효과를확인하고자 본실험을하였다. 인간진피섬유아세포에독성이없는범위에 서 nobiletin 을처리한결과산화적스트레스에의한 MMP1 의 발현증가를다시본래의상대로화복시키는것을확인하였다. 또한산화적스트레스에서 MMP1 의발현을조절한다고알려 져있는전사인사인 AP-1 complex 의전사활성을측정해본결 과산화적스트레스에의해서증가하였던 AP-1 의전사활성이 nobiletin 에의해서유의적으로감소하는것을확인할수있었 다. 때문에 nobiletin 은 AP-1 의전사활성을조절하여 MMP1 의발현을변화시킬수있는세포외기질조절물질임을알수 있었다. 또한 AP-1 의주요한조절인자로알려져있는 MAPK 의활성을측정해본결과 JNK, p38, ERK 를모두감소시켜 MAPK 를통해서 AP-1 의전사활성과 MMP1 의발현을조절하 는것을확인하였다. 이를종합해볼때 nobiletin 은인간진피섬 유아세포에서 MAPK 의활성을감소시키고, 이를통해서 AP-1 의전사활성을억제하여산화적스트레스에의해서인간진피섬 유아세포에서 MMP1 의발현이증가되었을때발현을감소시키 는효능을가진다. 또한일반적으로자외선, 오염물질, 미생물 같은외부스트레스에반응하여피부세포의산화적스트레스가 증가하고진피층에 MMPs 가생성이되어진피에세포외기질을 942 www.kosac.or.kr
Nobiletin 이 MMP1 발현에미치는영향 파괴하여피부의탄력도가떨어지고주름이발생하는노화가일어나게되는데, nobiletin을적용하였을때노화발생의주요기전을억제할수있기때문에항노화또는항주름의효능을가지는화장품원료로서활용이가능하다는것을보여주는것이라할수있다. 감사의글이논문은 2014년도오산대학교교내학술비지원에의해서수행됨. Chen LC, Chueh TC, Tuan YF, Chen CC, Chien CC, Lee HY, Chen SC. Activation of MAPK pathways and downstream transcription factors in 2-aminobiphenyl-induced apoptosis. Environ. Toxicol., doi: 10.1002/tox.21886, 2013. [Epub ahead of print] Dasgupta J, Kar S, Liu R, Joseph J, Kalyanaraman B, Remington SJ, Chen C, Melendez JA. Reactive oxygen species control senescence-associated matrix metalloproteinase-1 through c-jun-n-terminal kinase. J. Cell Physiol., 225: 52-62, 2010. Endo H, Watanabe T, Sugioka Y, Niioka M, Inagaki Y, Okazaki I. Activation of two distinct MAPK pathways governs constitutive expression of matrix metalloproteinase-1 in human pancreatic cancer cell lines. Int. J. Oncol., 35: 1237-1245, 2009. Guo S, Qiu P, Xu G, Wu X, Dong P, Yang G, Zheng J, McClements DJ, Xiao H. Synergistic antiinflammatory effects of nobiletin and sulforaphane in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cells. J. Agric, Food Chem., 60: 2157-2164, 2012. Karin M. The regulation of AP-1 activity by mitogenactivated protein kinases. J. Biol. Chem., 270: 16483-16486, 1995. Kawahata I, Yoshida M, Sun W, Nakajima A, Lai Y, Osaka N, Matsuzaki K, Yokosuka A, Mimaki Y, Naganuma A, Tomioka Y, Yamakuni T. Potent activity of nobiletin-rich Citrus reticulata peel extract to facilitate camp/pka/erk/creb signaling associated with learning and memory in cultured hippocampal neurons: identification of the substances responsible for the pharmacological action. J. Neural. Transm., 120: 1397-1409, 2013. Kim HJ, Yonezawa T, Teruya T, Woo JT, Cha BY. Nobiletin, a polymethoxy flavonoid, reduced endothelin-1 plus SCF-induced pigmentation in human melanocytes. Photochem. Photobiol., doi: 10.1111/php.12400, 2014. [Epub ahead of print] Kim JJ, Korm S, Kim WS, Kim OS, Lee JS, Min HG, Chin YW, Cha HJ. Nobiletin suppresses MMP-9 expression through modulation of p38 MAPK activity in human dermal fibrobalsts. Biol. Pharm. Bull., 37: 158-163, 2014. Kook SH, Jang YS, Lee JC. Involvement of JNK-AP-1 and ERK-NF-κB signaling in tension-stimulated expression of type I collagen and MMP-1 in human periodontal ligament fibroblasts. J. Appl. Physiol., 111: 1575-1583, 2011. Krifka S, Hiller KA, Bolay C, Petzel C, Spagnuolo G, Reichl FX, Schmalz G, Schweikl H. Function of MAPK and downstream transcription factors in monomerinduced apoptosis. Biomaterials., 33: 740-750, 2012. Kyriakis JM, Avruch J. Mammalian MAPK signal transduction pathways activated by stress and inflammation: a 10-year update. Physiol. Rev., 92: 689-737, 2012. Leppä S, Saffrich R, Ansorge W, Bohmann D. Differential regulation of c-jun by ERK and JNK during PC12 cell differentiation. EMBO J., 17: 4404-4413, 1998. Morwood CJ, Lappas M. The citrus flavone nobiletin reduces pro-inflammatory and pro-labour mediators in fetal membranes and myometrium: implications for preterm birth. PLoS One., 9: e108390, 2014. Poulalhon N, Farge D, Roos N, Tacheau C, Neuzillet C, Michel L, Mauviel A, Verrecchia F. Modulation of collagen and MMP-1 gene expression in fibroblasts by the immunosuppressive drug rapamycin. A direct role as an antifibrotic agent? J. Biol. Chem., 281: 33045-33052, 2006. Risse G, Jooss K, Neuberg M, Brüller HJ, Müller R. Asymmetrical recognition of the palindromic AP1 binding site (TRE) by Fos protein complexes. EMBO J., 8: 3825-3832, 1989. Roux PP, Blenis J. ERK and p38 MAPK-activated protein kinases: a family of protein kinases with diverse www.kosac.or.kr 943
biological functions. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 68: 320-344, 2004. Suzuki M, Sasaki K, Yoshizaki F, Oguchi K, Fujisawa M, Cyong JC. Anti-hepatitis C virus effect of citrus unshiu peel and its active ingredient nobiletin. Am. J. Chin. Med., 33: 87-94, 2005. Westermarck J, Holmström T, Ahonen M, Eriksson JE, Kähäri VM. Enhancement of fibroblast collagenase-1 (MMP-1) gene expression by tumor promoter okadaic acid is mediated by stress-activated protein kinases Jun N-terminal kinase and p38. Matrix Biol., 17: 547-557, 1998. Weston CR, Davis RJ. The JNK signal transduction pathway. Curr. Opin. Cell Biol., 19: 142-149, 2007. Yoshimizu N, Otani Y, Saikawa Y, Kubota T, Yoshida M, Furukawa T, Kumai K, Kameyama K, Fujii M, Yano M, Sato T, Ito A, Kitajima M. Anti-tumour effects of nobiletin, a citrus flavonoid, on gastric cancer include: antiproliferative effects, induction of apoptosis and cell cycle deregulation. Aliment. Pharmacol. Ther., 20 Suppl 1: 95-101, 2004. Yoon HS, Lee SR, Ko HC, Choi SY, Park JG, Kim JK, Kim SJ. Involvement of extracellular signal-regulated kinase in nobiletin-induced melanogenesis in murine B16/F10 melanoma cells. Biosci. Biotechnol. Biochem., 71: 1781-1784, 2007. Zarubin T, Han J. Activation and signaling of the p38 MAP kinase pathway. Cell Res., 15: 11-18, 2005. Park KK, Jung E, Chon SK, Seo M, Kim HW, Park T. Finding of TRE (TPA responsive element) in the sequence of human taurine transporter promoter. Adv. Exp. Med. Biol., 526: 159-166, 2003. 944 www.kosac.or.kr