J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 39(1), 47~53(21) DOI: 1.3746/jkfn.21.39.1.47 제주전통된장으로부터세포외효소분비능이우수한미생물의분리및특성 오유성 1 박지은 1 오현정 1 김정현 2 오명철 3 오창경 3 오영주 4 임상빈 1,5 1 제주대학교생명과학기술혁신센터, 2 제주관광대학관광외식조리계열 3 제주산업정보대학관광호텔조리과, 4 제주한라대학호텔조리과 5 제주대학교식품생명공학과 Isolation and Characteristics of Microorganisms Producing Extracellular Enzymes from Jeju Traditional Fermented Soybean Paste (Doenjang) YouSung Oh 1, JiEun Park 1, HyunJeong Oh 1, Jung Hyon Kim 2, MyungCheol Oh 3, ChangKyung Oh 3, YoungJu Oh 4, and SangBin Lim 1,5 1 Biotechnology Regional Innovation Center, Jeju National University, Jeju 69756, Korea 2 Dept. of Tourism & Food Service Cuisine, Cheju Tourism College, Jeju 69791, Korea 3 Dept. of Tourism Hotel Culinary Arts, Jeju College of Technology, Jeju 69714, Korea 4 Dept. of Hotel Culinary Arts, Jeju Halla College, Jeju 6978, Korea 5 Dept. of Food Bioengineering, Jeju National University, Jeju 69756, Korea Abstract Bacteria strains with high activities of extracellular enzymes (protease, fibrinolytic enzyme, amylase, cellulase, and lipase) were isolated from Jeju traditional fermented soybean paste (Doenjang), and characterized by 16S rrna gene sequence analysis and physiological properties. Protease activities were higher in JR14, JR19, JR25, JR32, JR38, JR47, and JR64 than Bacillus subtilis KCCM 1227 (standard strain). Amylase activities were shown in JR6, JR25, JR38, JR56 and JR81, while not in KCCM1227. Cellulase activities were higher in JR6, JR14, JR48, and JR65 than those of other isolated strains and KCCM 1227 whereas lipase activities were the higher in JR14 and JR48. Thrombolytic activity in JR19 with high hemolysis activity were 192% compared with that of plasmin as a positive control. Zymogram analysis indicated that the thrombolytic active strains had 4~5 bands in the molecular weight range of 25~75 kda. Gene sequence analysis of rrna revealed that the isolated stains had 99% homology with Bacillus species, and the thrombolytic active stain JR19 was B. stratosphericus 41KF2a T. Key words: Jeju traditional Doenjang, extracellular enzyme, Bacillus species 서론콩발효식품은콩에함유되어있는우수한단백질, 지방등이다양한미생물의작용에의해몸에흡수되기쉬운형태로전환되어질병을예방하거나면역능력을향상시키는것으로알려져있다 (1,2). 특히전통된장은제조공정중메주를건조시키는과정에서수많은미생물이성장하게되어, 된장의숙성과정에서당질은단당류로분해되고단백질은저분자의펩타이드와아미노산으로분해되는데일부아미노산은된장특유향기성분의주원인으로알려져있다. 된장숙성에관여하는주요미생물로는 Bacillus licheniformis, B. pumilis, B. subtilis 등이보고되고있다 (3,4). 현대인은과거와다른식습관에따라혈액순환장애에의한심혈관계질환을비롯한여러가지성인병의발병률이 높아져사회문제로대두되고있다. 우리나라국민의주요사망원인인심혈관질환은식품에의해 1차적으로예방되거나 2차적으로발병기간을연장할수있다고알려지고있다 (5). 우리나라의된장및청국장을비롯하여일본의 miso 및 natto, 중국의 douche, 인도네시아의 tempeh 등콩발효식품에서혈전용해활성, 항산화, 혈압강하, 동맥경화저해등기능성에대한연구가활발하게이루어지고있다 (68). 특히발효미생물에의해생성되는혈전용해효소는혈액순환계질환의여러요인들중에주요한원인으로알려지고있는혈전현상에적용될수있다. 혈전은혈류중의 fibrinogen이활성화된 thrombin에의해 fibrin으로전환되어불용성의중합체를형성함으로써생성되므로 fibrin의용해를담당하고있는 plasmin의생성을증가시키면혈전의용해가부작용없이쉽게이루어질수 Corresponding author. Email: sblim@jejunu.ac.kr Phone: 82647543617, Fax: 8264755361
48 오유성 박지은 오현정 김정현 오명철 오창경 오영주 임상빈 있다. 혈전용해에는 plasminogen activator(streptokinase, urokinase, single chain prourokinase, tissue plasminogen activator) 가주로사용되는데, 이들의사용은부작용, 작용시간의제한및경제성등많은문제점을가지고있다 (9). 전통된장의기능성성분으로는콩에함유되어있는주요영양성분인단백질, 지방외에식이섬유, 인지질, isoflavones, saponins 등이알려져있으며, 이들기능성성분과우수균주를활용하여기능성된장개발에관한연구가이루어지고있다 (1). 또한콩으로만든전통발효식품이나, 콩가수분해물에서유래된여러종류의펩타이드들이항종양, 혈압강하, 혈청콜레스테롤강하활성을갖는신기능성식품소재로서응용될수있는가능성이제기되고있다 (1113). 제주전통된장은제주지역의식문화및식생활에서아주중요한부분을차지하지만제주전통된장에대한연구로는 isoflavones의함량및된장품질특성 (14,15) 외에발효미생물또는그기능적측면에대한체계적인연구는미흡한실정이다. 따라서본연구에서는제주에서전통방식으로제조하여판매하고있는업체의된장을수거하여미생물을순수분리하였으며, 분리된미생물의 protease, fibrinolytic enzyme, amylase, cellulase, lipase 등세포외효소분비능을측정하였다. 또한세포외효소분비능이우수한균주의생화학적특성및계통수를분석하여제주전통된장의발효과정에서유용한효소생산에관여하는미생물을선발하여제주전통된장제조방법의체계화및과학화의기초자료를제공하고자하였다. 재료및방법시료된장은제주도에서전통적인방법으로제조판매하고있는 4개업체로부터수거하여사용하였다. 균주의분리된장으로부터 protease, amylase, cellulase, lipase의분비능이우수한균주는다음과같이분리하였다. 즉, 생리식염수 9 ml에시료 1 g를넣어교반기로 12시간진탕하여정치시킨후상등액을취하여표준희석법으로희석하고, 희석액을각각의기질이 1 μl 첨가된 nutrient agar(na) 배지에평판도말하여 35 o C에서 24시간배양한후투명환 (clear zone) 을나타내는균주를 1차선별하였다. 세포외효소분비능측정 Protease 분비능은 2% skim milk를첨가한 NA 배지에균주를접종하여 35 o C에서 48시간배양하고집락주위의투명환을관찰하였다. Amylase 분비능은 2% soluble starch를첨가한 NA 배지에균주를접종하여 35 o C에서 48시간배양한후 iodine으로염색하여 starch 분해활성을측정하였다. Cellulase 분비능은 2% carboxymethyl cellulose을 NA 배지에첨가하여평판배지를만들고균주를접종하여 35 o C에서 48시간배양한후.1% congo red로 3분간염색하고 1 M NaCl 용액으로세척하여집락주위의투명환을관찰하였다. Lipase 분비능은 1% tributyrin을첨가한 NA 배지에균주를접종하고 35 o C에서 48시간배양한후균주위의투명환을관찰하였다. 혈전용해활성및 hemolysis 활성측정 세포외효소분비능측정실험을통하여 protease 활성이우수한균주를선발한후, Astrup과 Mullerttz의방법 (16) 을약간변형하여 fibrinogen을.3% 가되도록인산완충용액 (.1 M, ph 7.4) 에용해시키고평판에부은후 2% agarose 용액을동량첨가하여혼합하였다. 여기에 thrombin(sigma Co., St. Louis, MO, USA) 을 1 μl 첨가하여실온에서고화시키고지름 5 mm 정도의구멍을뚫은후균배양액 25 μl을분주하여 35 o C에서 48시간반응시켰다. 양성대조구로는 plasmin(1. U/mL Sigma Co.) 을사용하였고, 음성대조구로는 NA 배지를사용하였다. 혈전용해활성 (%)= 시료의용해영역 1 plasmin 의용해영역 한편, hemolysis 활성은혈전용해활성이우수한균주를 sheep blood agar plate에 spot하여 35 o C에서 24~48시간배양하고용혈된환의생성을확인하여측정하였다. Zymogram 측정 1% polyacrylamide gel에 gelatin을첨가하여최종농도가.1 mg/ml이되도록하였다. 균배양액 2 μl에 sample buffer{1% SDS, 5% glycerol, 25 mm TrisHCl(pH 6.8),.1% bromophenol blue} 를혼합하여 gel에 loading하고전기영동하였다. Gel을 2.5% Triton X1에서 2분간 2회세척하고다시증류수로 2분간 2회세척하였다. 세척된 gel 은 reaction buffer{1 M Tris(pH 7.5), 1 M CaCl 2, 5 M NaCl,.2 mm ZnCl 2, 25% TX1,.2% NaN 3} 에넣어 37 o C에서 16시간반응시킨후 Comassie blue R25으로 1시간염색하고 5% 메탄올과 1% 빙초산으로탈색하였다. 분리균주의특성및 16s rrna 유전자염기서열분석 분리균주의생리적특성은 API 5CHB, API 2E(Biomereux Inc., Marcy I'Etoile, France) 로측정하였는데, 선택된지시약이포함된 kit medium에접종하고 strip에분주하여 24시간과 48시간경과후 API analytical profile index로분석하였다. 그리고 16S rdna를증폭하기위해 universal PCR primer 27F(5'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG3') 와 1522R(5'AAG GAG GTG ATC MRC CGC A3') 을사용하였다. PCR 조건은다양한농도 (1~1 ng) 의 DNA를주형으로사용하고 2.5 U Taq polymerase,.2 μm primers, 2 μm dntps와 1배의반응용액 (1 mm
제주전통된장으로부터세포외효소분비능이우수한미생물의분리및특성 49 TrisHCl, 4 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2, 5 μg ml1 BSA, ph 8.3) 을첨가하고최종부피를 5 μl로하여 95 o C에서 5분간반응시키고, 95 o C에서 1분, 55 o C에서 1분및 72 o C에서 1분반응을 33회수행한후, 최종적으로 72 o C에서 1분간반응시켰다. 1% agarose gel에서전기영동으로 DNA 증폭산물을확인하고 1.5 kbp의 16S rdna 증폭산물을 QIAEXⅡ gel extraction kit(qiagen, Hilden, Germany) 를사용하여정제하였다. 정제된증폭산물의유전자염기서열은 BigDye Cycle sequencing kit와 ABI 31 Genetic analyzer(pe Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 를사용하여분석하였다. 분석된염기서열은 NCBI GenBank database (http://ncbi.nlm.nih. gov) 의염기서열과비교하여계통분류학적유연관계를분석한후 PHYLIP package v. 3.6(7) 을이용하여 kimura 2parameter distance model(13) 과 neighborjoining method에의해염기서열간의유전적거리와 phylogenetic tree를추론하였으며각각의 branch의 bootstrap 값은 1,회의재구성된자료로부터새로운 tree 를작성하여계산하였다. 결과및고찰된장으로부터세포외효소분비능이우수한균주의선발된장은발효과정에서다양한미생물에의하여 protease, amylase, cellulase, lipase 등이분비되어콩에함유되어있는단백질, 올리고다당류, isoflavones, 지질등이소화되기쉬운형태의아미노산, 유리당, isoflavones aglycon, 지방산등으로분해되어항산화, 혈전용해등의기능을갖는 2차산물이생성된다 (4,11,12). 제주전통된장으로부터표준희석법을이용하여 1 여종의균주를선발하고세포외효소분비능이우수한균주 12종을선발하였다. 선발된균주중 JR14, JR19, JR25, JR32, JR38, JR47, JR64의 7종은 2% skim milk를첨가한 nutrient agar(na) 배지에서 Bacillus subtilis KCCM1227보다 clear zone이더크게형성되어 protease 분비능이우수함을확인할수있었다. 그리고 amylase 분비능은표준균주 KCCM1227에서는활성을보이지않았으나 JR6, JR81에서는활성이우수하였다 (Table 1). Cellulose는미생물에의해분해되어이용되는데, 곰팡이및세균등에의하여분비되는 cellulase 성분으로는 endo1,4 βdglucanase, exo1,4βdglucanase, βglucosidase 가있으며, 콩발효과정에서는 βglucosidase에의하여 isoflavones 배당체가 aglycon으로전환되어항산화등의기능을나타내는것으로알려져있다 (11). 제주전통된장에서분리한균주의 cellulase의분비능은 JR6, JR14, JR48, JR65 균주가표준균주 KCCM1227보다우수함을알수있었으며, lipase 분비능은 JR14와 JR48가우수하였다 (Table 1). 콩에다량함유되어있는지방 ( 약 2%) 은된장의발효과정에서미생물이분비하는 lipase의작용에의하여다양한지 Table 1. Activities of extracellular enzymes from strains isolated from Jeju traditional Doenjang Strains JR6 JR14 JR19 JR25 JR32 JR38 JR47 JR48 JR56 JR64 JR65 JR81 KCCM1227 Clear zone Amylase Cellulase Lipase Protease : not shown, :.3 mm 이하, :.31~.5 mm, :.51~.8 mm. 방산을생성하는데, Oh 등 (17) 에의하면필수지방산인 linoleic acid가 61.5~62.2% 의함량을보인다고보고하였다. 혈전용해활성측정 Protease활성이표준균주보다높은균주 7종중 (Table 1), 활성이우수한 JR19, JR32, JR47과 JR64 균주의혈전용해활성을측정하기위하여 nutrient broth에서 15시간배양한후원심분리하고상등액을조효소액으로사용하여 fibrin plate에서혈전용해활성을측정하였으며 (Fig. 1), plasmin (1. U/mL) 과 nutrient broth를각각 positive와 negative control로측정하였다. Plasmin은.45 unit에서.5 unit으로증가할수록 fibrin plate 용해환의면적이증가하였다 (data not shown). 선발된 4개의균주와 KCCM1227 균주의 protease 활성은비슷하였으나 (Fig. 1A), fibrin 용해활성은 positive control인 plasmin의용해영역 (3.25 mg) 에비하여 JR19가 192% 로 6.25 mg의 fibrin을용해시켰으며, JR47, JR64와 JR32가 77% 와 61% 의용해활성을나타내었다 (Fig. 1B & Table 2). 지금까지우리나라를비롯하여중국, 태국등의콩을이용한전통발효식품에서혈전용해및면역활성등다양한기능이밝혀지고있는데 (182), 중국의전통식품인 Douchi Fig. 1. Protease (A) and fibrinolytic activity (B) of the strains isolated from Jeju traditional Doenjang. 1: JR19, 2: JR32, 3: JR47, 4: JR64, 5: KCCM1227, 6: plasmin as positive control, 7: nutrient broth as negative control.
5 오유성 박지은 오현정 김정현 오명철 오창경 오영주 임상빈 Table 2. Fibrinolytic activities of the culture supernatants from the strains isolated from Jeju traditional Doenjang Sample Nutrient broth Plasmin KCCM1227 JR19 JR32 JR47 JR64 Clear zone (cm 2 ) 1.33 4.91.5.79.5 Degraded fibrin (mg) 3.25 6.25 2 2.5 2 Fibrinolytic activity (%) 1 192 61 77 61 Fig. 2. Hemolysis activity of the strains isolated from Jeju traditional Doenjang. 1: JR19, 2: JR32, 3: JR47, 4: JR64, 5: KCCM1227. 에서혈전용해능이우수한 B. subtilis DC33이보고되어있고 (21), 태국의콩전통발효식품에서분리한 B. licheniformis와 B. subtilis 등이알레르기를감소시킨다는보고가있다 (6). Hemolysis 활성을갖는균주확인 제주전통된장에서혈전용해능이우수한균주의 sheep blood agar plate에서 hemolysis를측정한결과 (Fig. 2), 혈전용해능이가장우수한 JR19가가장높은 hemolysis 활성을나타내었다. Gabriela와 Jaroslava(22) 는 B. subtilis에서분리한물질인 surfactin이강력한항균, 항바이러스, 항염증및항혈전효과가있는것으로보고하였다. 따라서제주전통된장에서분리한균주인 JR19도 surfactin으로서의가능성이있을것으로추정되었다. 혈전용해활성을갖는균주의 zymography Matrix metalloproteinases(mmps) 의여러분자들은세포의혈전용해시스템과관련이있다고알려져있는데 (23), 제주전통된장에서분리한혈전용해능이높은균주인 JR19, JR32, JR47, JR64가 gelatin을이용함을알수있었다 (Table 3). 따라서각각의균주배양액을 zymography한결과, 25~ 75 kda 사이에서 4~5개의밴드가확인되었다 (Fig. 3). Jeong 등 (24) 도청국장에서분리한 B. subtilis CH35에서분비되는혈전용해효소는 63, 47, 29, 2 kda 등적어도 4개의분자를 SDSPAGE와 zymography로확인한바있다. MMPs 중에서 MMP2는 gelatinasea로잠재적인형태는 7, 65 kda를, 활성형은 61, 58 kda의분자량을가지며 fibronectin type II에관여한다고알려져있으며, MMP9는 gelatinaseb로잠재적형태는 94 kda와활성형의 83 kda 의분자량을갖는것으로보고되어있다 (23). 따라서제주전통된장에서분리한 JR19는 fibrin plate에서가장높은활 Fig. 3. Zymogram of SDSPAGE the strains isolated from Jeju traditional Doenjang. 1: JR19, 2: JR32, 3: JR47, 4: JR64, 5: KCCM1227. 성을보였으며, zymography한결과 65~75 kda의분자량에서강한활성을나타내는것으로보아 MMP2의활성과관련이있을것으로추정된다. 앞으로 MMPs와제주전통된장에서분리된균주배양액의혈전용해활성과의관계에대한보다깊은연구가이루어져야할것으로사료된다. 분리균주의동정 제주전통된장으로부터세포외효소분비능이우수한균주 7종을동정하기위하여형태학적특성과 API 2E 및 API 5CH을이용하여생리 생화학적특성을측정하였다. 분리된균주는공통적으로 gram 양성이었고포자를형성하며, 길이가 2.~5.4 μm, 폭이 1.~1.8 μm의간균으로나타냈다 (data not shown). Oxidase, catalase와 gelatin에의한가수분해는양성반응으로나타났으며, nitrate 환원, indole 생성, citrate 이용, H 2S 생성, acetoin 생성, 그리고 arginine dihydrolase, lysine decarboxylase, ornithinedecarboxylase, urease와 typtophane deaminase의활성반응은모두음성으로나타났다 (data not shown). 그리고 βgalactosidase 반응은 JR19 균주에서만양성으로나타났으며, VP test는 JR25, JR47 그리고 JR64 균주에서양성반응으로나타났다. 분리된균주의탄소원이용성을분석한결과 glycerol, Larabinose, Dribose, Dglucose, Dfructose, Dmannose, methylα Dglucopyranoside, esculin ferric citrate, salicin, Dcellobiose, Dsaccharose, Dtrehalose를공통적으로이용함을알수있었다 (Table 3). 특히 JR19 균주는분리된다른균주와는달리 Dgalactose와 Nacetylglucosamine를이용하고 inositol과 Dmaltose를이용하지않음을알수있었다 (Table 3). 또한 API analytical profile index를분석한결과, JR48과 JR64 균주를제외한분리균주대부분이 98.% 이상의신뢰도를보이는 Bacillus 속의이종으로분석되었다 (Table 4).
제주전통된장으로부터세포외효소분비능이우수한미생물의분리및특성 51 Table 3. Biochemical utilization of the strains isolated from Jeju traditional Doenjang Substrate JR19 JR32 JR47 JR64 JR25 JR48 JR81 Gelatin Glycerol Erythritol Darabinose Larabinose Dribose Dxylose Lxylose Dadonitol Methylβ Dxylopyranoside Dgalactose Dglucose Dfructose Dmannose Lsorbose Lrhamnose Dulcitol Inositol Dmannitol Dsorbitol Methylα Dmannopyranoside Methylα Dglucopyranoside Nacetylglucosamine Amygdalin Arbutin Esculin ferric citrate Salicin Dcellobiose Dmaltose Dlactose (bovine origin) Dmelibiose Dsaccharose (sucrose) Dtrehalose Inulin Dmelezitose Draffinose Amidon (starch) Glycogen Xylitol Gentiobiose Dturanose Dlyxose Dtagatose Dfucose Lfucose Darabitol Larabitol Potassium gluconate Potassium 2ketogluconate Potassium 5ketogluconate ± ± ± : positive, : negative. 된장으로부터분리한균주들의 16s rrna 유전자염기서열을이용하여상동성분석을수행한결과, 분리된균주의계통적유사도는 Bacillus 속과대부분 99% 의높은유사도를보였다 (Table 4). 특히혈전용해능이우수한 JR19 균주는 B. stratosphericus 41KF2a T, B. altitudinis 41KF2b T 그리고 B. aerophilus 28K T 와 99.8%, B. pumilus DSM 27 T 와는 99.5% 의유사성을나타내었다. Lipase 분비능이우수한 JR48 균주는 B. licheniformis ATCC 1458T 및 B. aerius 24K T 와는 99.3% 의유사성을보였고, B. sonorensis NRRL B23154 T 와는 99.2% 의유사성을보였다. 다른분리균주들은 B. subtilis 와 99.5% 의유사성을보였고, B. amyloliquefaciens 와는 99.3% 의유사성을나타내었다 (Fig. 4). 또한분리된균주들의계통학적유연관계를알아보기위하여 16S rrna 유전자의염기서열을기초로하여 Bacillus 속의표준종들과의유연관계를조사한결과, JR19 균주는 B. altitudinis 41KF2b T, B. stratosphericus 41KF2a T 그리
52 오유성 박지은 오현정 김정현 오명철 오창경 오영주 임상빈 Table 4. Identification of the isolated strains from Jeju traditional Doenjang using an API 5CHBkit and 16S rrna gene sequence % ID Strains Significant taxa API 5CHB 16S rrna sequence JR19 Bacillus stratosphericus B. pumilus 99.9 99.8 99.5 JR25 B. subtilis/b. amyloliquefaciens 99.9 99.2/99.2 JR32 B. subtilis/b. amyloliquefaciens 99.9 99.5/99.4 JR47 B. subtilis/b. amyloliquefaciens 99.9 99.5/99.4 JR48 B. licheniformis B. pumilus 38.5 53.5 99.3 96.1 JR64 B. subtilis/b. amyloliquefaciens B. licheniformis 87.1 12.8 99.4/99.5 97.7 JR81 B. subtilis/b. amyloliquefaciens 98.4 99.5/99.6 고 B. aerophilus 28K와가장가까운관계를보여주었고, JR48 균주는 B. sonorensis NRRL B23154 T, B. licheniformis ATCC 1458 T 그리고 B. aerius 24K T 와그룹을형성하고있음을보여주었다. 다른분리균주는 B. subtilis NBRC 13719 T, B. amyloliquefaciens ATCC 2335 T 그리고 B. mojavensis IFO 15718 T 와같은그룹에속하는것으로나타났다 (Fig. 4). 상기의형태및생리생화학적특성을조사한결과와 16S rrna 유전자의염기서열분석을바탕으로 분리된균주들은 Bacillus 속에속하는종으로나타났다. 본연구에서제주전통된장의발효과정에 Bacillus속미생물의관여가필수적으로요구됨을알수있었으며, protease, amylase, cellulase, lipase 분비능이우수한균주를된장의제조공정에활용하면제주전통된장의품질과학화에기여할수있을것으로사료된다. 또한 JR19는 fibrinolytic enzyme를강하게분비하므로활용할만한가치가있을것으로추정된다. 요약제주전통된장으로부터세포외효소 (protease, fibrinolytic enzyme, amylase, cellulase, lipase) 분비능이우수한세균을분리한후 16S rrna 유전자분석과생리적특성을분석하여균주를확인하고자하였다. Protease 분비능은 JR14, JR19, JR25, JR32, JR38, JR47과 JR64가표준균주인 Bacillus subtilis KCCM1227보다활성이높았다. Amylase 분비능은 JR6, JR25, JR38, JR56, JR81에서나타난반면표준균주인 KCCM1227에서는나타나지않았다. Cellulase 분비능은 JR6, JR14, JR48과 JR65가다른분리균주또는표준균주보다높았으며, lipase 분비능은 JR14와 JR48이높았 Fig. 4. Phylogenetic tree based on 16S rdna sequences showing the positions of the strains producing extracellular enzymes isolated from Jeju traditional Doenjang.
제주전통된장으로부터세포외효소분비능이우수한미생물의분리및특성 53 다. 혈전용해활성은 positive control인 plasmin의용해영역에비하여 JR19가 192% 로가장높았고, hemolysis 활성도높았다. 혈전용해능이있는균주인 JR19, JR32, JR47, JR64 의배양액을 zymography한결과, 25~75 kda 사이에서 4~ 5개의밴드가확인되었다. 된장으로부터분리한균주들의 16s rrna 유전자염기서열을분석한결과모두 Bacillus species와 99% 의상동성을나타내었으며, 혈전용해능이가장우수한 JR19는 B. stratosphericus 41KF2a T 와거의일치하였다. 감사의글 본연구는 29년도제주특별자치도의제주형발효식품산업육성클러스터사업을제주대학교생명과학기술혁신센터 ( 제주대 RIC) 에서수행한연구결과의일부로, 이에감사드립니다. 문 1. Yoshikatsu M, Mitsuo Y. 28. Traditional healthful fermented products of Japan. J Ind Microbiol Biotechnol 35: 791798. 2. Susumu M, Hitomi Y, Toshiko K, Tomoyuki S, Ryohei FT, Ikuko N. 28. Immunomodulatory effect of halophilic lactic acid bacterium Tetragenococcus halophilus Th221 from soy sauce moromi grown in highsalt medium. Int J Food Microbiol 121: 245252. 3. Kwon HY, Ryu HY, Kwon CS, Lee SH, Sohn HY. 27. Optimization of culture conditions of Bacillus pumilis JB1 for Chungkookjang fermentation in soybean boilingwaste liquor medium. Kor J Microbiol Biotechnol 35: 3439. 4. Yoo SK, Cho WH, Kang SM, Lee SH. 1999. Isolation and identification of microorganisms in Korean traditional soybean paste and soybean sauce. Kor J Appl Microbiol Biotechnol 27: 113117. 5. Feldeisen SE, Tucker KL. 27. Nutritional strategies in the prevention and treatment of metabolic syndrome. Appl Physiol Nutr Metab 32: 466. 6. Phromraksa P, Nagano H, Boonmars T, Kamboonruang C. 28. Identification of proteolytic bacteria from Thai traditional fermented food and their allergenic reducing potentials. J Food Sci 73: 189195. 7. Kim SB, Lee DW, Cheigh CI, Cheo EA, Lee SJ, Hong YH, Choi HJ, Pyun YR. 26. Purification and characterization of a fibrinolytic subtilisinlike protease of Bacillus subtilis TP6 from an Indonesian fermented soybean, Tempeh. J Ind Microbiol Biotechnol 33: 436444. 8. Deepak V, Kalishwaralal K, Ramkumarpandian S, Venkatesh BS, Senthilkumar SR. 28. Optimization of media composition for nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology. Biores Technol 99: 8178174. 헌 9. Ro YM. 1998. How important is the mode of thrombolytic agents administration for optimal thrombolysis?comments on the results of double bolus urokinase regimen in thrombolysis in myocardial infarction in Korea (TIMIKO) multicenter trial. Kor Circul J 28: 16611663. 1. Omura K, Hitosugi M, Zhu X, Ikeda M, Maeda H, Tokudome S. 25. A new derived protein from Bacillus subtilis natto with both antithrombotic and fibrinolytic effects. J Pharmacol Sci 99: 247251. 11. Ra KS, Oh SH, Kim JM, Suh HJ. 24. Isolation of fibrinolytic enzyme and βglucosidase producing strains from Doenjang and optimum conditions of enzyme production. J Korean Soc Food Sci Nutr 33: 439442. 12. Ryu BH. 23. Development of functional Doenjang for antioxidative and fibrinolytic activity. Kor J Life Sci 13: 559568. 13. Hyun KW, Lee JS, Ham JH, Choi SY. 25. Isolation and identification of microorganism with potent fibrinolytic activity from Korean traditional Doenjang. Kor J Microbiol Biotechnol 33: 2428. 14. Shin GM. 24. Studies on quality characteristics of the traditional Doenjangs in Jeju. MS Thesis. Jeju National University, Jeju, Korea. 15. Hyun GT, Koh SH, Chun CB, Lee CH. 24. Studies on the contents of isoflavone in traditional soybean paste and soybeans in Jejudo. Report of J.I.H.E. 15: 4566. 16. Astrup T, Mullerttz S. 1952. The fibrin method for estimating of fibrinolytic activity. Arch Biochem Biophys 4: 346351. 17. Oh HJ, Lim JH, Lee JY, Jeon BS, Kang HY, Oh YS, Oh YJ, Lim SB. 29. Quality characteristics of Jeju traditional Doenjang. Kor J Cul Res 15: 29838. 18. Choi NS, Chung DM, Han YJ, Kim SH, Song JJ. 29. Purification and Characterization of a subtilisin D5, a fibrinolytic enzyme of Bacillus amyloliquefaciens DJ5 isolated from Doenjang. Korean J Food Sci Technol 18: 555. 19. Kim DH, Song HP, Kim JO, Byun MW. 24. A correlation between fibrinolytic activity and microflora in Korean fermented soybean products. J Korean Soc Food Sci Nutr 33: 4146. 2. Lee SK, Bae DH, Kwon TJ, Lee SB, Lee HH, Park JH, Heo S, Johnson MG. 21. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. KDO13 isolated from soybean paste. J Microbiol Biotechnol 11: 845852. 21. Wang CT, Ji BP, Li B, Nout R, Li PL, Ji H, Chen LF. 26. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme of Bacillus subtilis DC33, isolated from Chinese traditional Douchi. J Ind Microbiol Biotechnol 33: 75758. 22. Gabriela S, Jaroslava S. 28. Review of surfactin chemical properties and potential applications. Cent Eur J Med 3: 123133. 23. Lijnen HR. 22. Matrix metalloproteinases and cellular fibrinolytic activity. Biochem (Moscow) 67: 9298. 24. Jeong SJ, Kwon GH, Chun J, Kim JS, Park CS, Kwon DY, Kim JH. 27. Cloning of fibrinolytic enzyme gen from Bacillus subtilis isolated from Cheonggukjang and its expression in proteasedeficient Bacillus subtilis strains. J Microbiol Biotechnol 17: 118123. (29 년 1 월 14 일접수 ; 29 년 12 월 8 일채택 )