RESEARCH ARTICLE 상엽추출물의항산화활성및 3T3-L1 세포에서지방축적억제효과 박은아 1, 송지혜 2, 김교남 2, 김혜옥 3 * 1 부경대학교간호학과, 2 경남대학교식품생명학과, 3 경남대학교간호학과 Anti-oxidant and Anti-obese Effects of Mulberry (Morus alba L.) Leaf Extract in 3T3-L1 Cells Euna Park 1, Ji-Hye Song 2, Gyo-Nam Kim 2, Hae Ok Kim 3 * 1 Department of Nursing, Pykyong National University 2 Department of Food Science and Biotechnology, Kyungnam University 3 Department of Nursing, Kyungnam University Abstract Recently, numerous studies reported that excessive generation of ROS stimulated expression of adipogenesis transcription factors, such as C/EBPα, β, and PPARγ in 3T3-L1 cells. Therefore, effective scavenging of ROS could be regarded as strategy for anti-adipogenic effect through suppression of adipogenesis transcription factors. In this study, we examined the anti-oxidant and anti-adipogenic effects of mulberry (Morus alba L.) leaf extract (MLE). MLE was prepared by boiling water extraction method at 121 C for 15 min. DPPH radical scavenging activity of MLE was significantly increased to 3.48%, 8.28%, 16.63%, and 25.84% between 100 and 1,000 μg/ml. The MLE treatment for 24 h did not affect to the cell viability of confluent 3T3-L1 preadipocytes at concnetrations of 10, 50, 100, 200, 400, and 800 μg/ml. Thus, nontoxic concentration rages of MLE were treated during adipogenesis period (Day -2 to 6) from preadipocytes into adipocytes in 3T3-L1 cells. Intracellular lipid accumulation in MLE-treated 3T3-L1 adipocytes (Day 6) were quantitatively judged by ORO staining and a number of lipid droplet and size were observed using microscopy. Inhibitory activity of lipid accumulation by MLE treatment in 3T3-L1 adipocytes was significantly increased 19.52%, 16.98%, and 32.48% at 200, 400, and 800 μg/ml, respectively. The size and a number of lipid droplet in 3T3-L1 adipocytes were observed to dose-dependently decrease by MLE treatment. The mrna expression levels of C/EBPα, β and PPARγ were decreased at 10 and 100 μg/ml in MLE-treated 3T3-L1 adipocytes compared with adipocytes. These results showed that antioxidant activity of MLE was contributed to anti-obesity effect by inhibition of intracellular lipid accumulation through suppression of adipogenesis transcription factors, such as C/EBPα, β, and PPARγ. Therefore, MLE is expected to utilize as anti-oxidant and anti-obesity cosmetic material. Keywords: Mulberry leaf, Morus alba L., Anti-oxidant, Anti-obesity, 3T3-L1 cells 체내에서끊임없이진행되는대사과정들에서산화 환원반 응에의해발생되는 reactive oxygen species (ROS) 는신호전 달매개체로서긍정적인역할을하지만, 다양한외인성및내인성요인들로인한과도한 ROS 발생은인체의항산화항상성을파괴시킴으로서산화적스트레스를유발하고이에기인한노화, 당뇨, 비만, 암등을비롯한각종질병의주요원인으로서 *Corresponding author: Hae Ok Kim, Department of Nursing, Kyungnam University, Kyungnamdaehak-ro, Masanhappo-gu, Changwon-si, Gyeongsangnam-do 631-701, Republic of Korea Tel.: +82 55 249 6346, Fax: +82 505 999 2140, E-mail: hok503@hanmail.net Received December 11, 2014; Revised December 11, 2014; Accepted February 4, 2015; Published February 28, 2015 www.kosac.or.kr 19
보고되고있다 ( 전형주등, 2014; 윤보라등, 2012). 인체의지방세포는에너지항상성유지및지질대사와관련하여중요한역할을수행한다. 하지만사회적 경제적발달로인한식습관의변화는에너지섭취와소비의불균형을초래하여지방세포의비대 (hypertrophy) 와과형성 (hyperplasia) 을유도함으로서체내지방의과잉축적을통해대사성질환인비만을발생시킨다 ( 이혜숙등, 2010). 2013년도세계보건기구 (World health organization; WHO) 의보고에따르면매년 260만명이비만에기인해사망하고있으며, 2010년전세계약 10억명의비만인구는 2015년에는 15억명으로급격히증가할것으로예상하였다 ( 박정애등, 2013; 이미라등, 2014). WHO 의보고와유사하게, 2012년보건복지부의국민건강영양조사에따르면우리나라만 19세이상비만유병률 ( 체질량지수 25 이상 ) 은 1998년 26.0% 대비 2012년 32.4% 로매년지속적으로증가하고있는것으로보고되었다. 비만은당뇨, 고혈압, 고지혈증, 관절염, 심장병, 뇌졸중, 동맥경화, 지방간등각종대사성질환, 심혈관계질환및암발생의직간접적인발병원인으로작용하는것으로밝혀졌으며, 외형적인변화에기인한비만은육체적 정신적문제또한발생시킴으로서개인의삶을질에도부정적인영향을미치는것으로나타났다 ( 박종배등, 2011). 최근연구에따르면, ROS의발생과지방축적이밀접한관련이있는것으로보고되고있다. 지방세포분화과정에서지방합성과관련된대사경로중 hexose monophosphate (HMP) shunt는 G6PDH에의하여지방합성에반드시필요로하는 nicotinamide adenin dinucleotide phosphate (NADPH) 를생성한다. 생성된 NADPH는 NADPH oxidase (NOX) 에의하여 NADP+ 로전환되며, 이때세포내에서 superoxide와같은 ROS를발생시킨다고보고되었다 ( 최혜영등, 2014). 또한지방세포에서과도한 ROS의생성은전지방세포에서지방세포로의분화를촉진시키거나지방세포주변에위치한대식세포를자극하여또다른 ROS 생성을유도하여비만의주요원인으로서작용한다고알려져있다 ( 최혜영등, 2014; Gummersbach et al., 2009). 따라서효과적인항비만소재탐색을위해지질축적억제효능과더불어 ROS 소거에대한항산화활성을함께평가하는것은중요하다. 뽕나무는뽕나무과 (Moracceae), 뽕나무속 (Morus) 에속하는식물로열대지방부터온대지역에널리분포하고있다 ( 주민정등, 2009). 뽕나무의어린가지나뿌리, 열매, 잎등은민간에서전통적인약용재료로사용되어왔으며다양한생리활성이보고되었다 ( 이완주등, 2003; 박주헌등 2012; 전예숙등, 2011). 상엽물추출물처리는인슐린이처리된지방세포에서 glucose의소비를농도의존적으로증가시킴으로서항당뇨소재로서의가능성을나타냈다 (Attila et al., 2013). 또한상엽 에탄올추출물에서분리해낸 (2S)-4 -hydroxy-7-methoxy- 8-prenylflavan, 2,7 -Dihydroxy-4 -methoxy-8- prenylflavan, brosimine B, 2,4 -dihyeroxy-7 -methoxy- 8-prenylflavan 등을비롯한 flavane 유도체들은 3T3-L1 전지방세포의분화와증식을억제하여항비만활성을나타내는것으로보고되었다 (Yongyu et al., 2014). 이밖에도상엽메탄올추출물은다량의 quercetin과 kaempferol을함유하고있으며 lymphocytes에서 H 2 O 2 에의한 DNA 손상을감소시키고 human aortic endothelial 세포에서세포부착과염증반응을억제시키는것으로보고되었다 (Chao et al., 2013). 이러한상엽의다양한생리활성은무기성분, 아미노산, 그리고 rutin, quercetin, quercitrin, isoquercitrin 과 alkaloid 성분을비롯한 flavonoid에기인된것이라보고되었으며, 상엽의 1-deoxynojirimycin (1-DNJ) 는 α-glucosidase 저해를통해혈당상승을억제를하는것으로알려져있다 ( 김은정등, 2009). 또한상엽은항산화효능을바탕으로기능성소재로서활용하여발효상엽차 ( 이상일등, 2013), 상엽가루머핀 ( 이혜연등, 2011), 상엽분말첨가두부 ( 김애정등, 2006), 상엽분말천연팩및비누 ( 송화경등, 2012) 와같은다양한형태로의활용가능성을확인한연구들이보고되고있다. 현재까지유기용매를이용한상엽추출물및함유된성분들의다양한생리활성과그활용방안에대한연구는많이보고되어지고있지만상엽물추출물의항산화및항비만효능과관련한기능성미용식품소재로서가능성에대한연구는아직까지도미비한실정이다. 본연구에서는상엽추출물의 DPPH 라디컬소거활성을측정하여항산화효능을평가하였다. 또한 3T3-L1 전지방세포에서상엽추출물의세포독성을 MTT 분석법에의해확인한후 3T3-L1 전지방세포에서지방세포의분화기간동안상엽추출물에의한세포내지방축적억제활성을평가하였다. 이러한결과들을바탕으로상엽추출물의미용기능식품소재로서활용가능성에대해고찰하였다. 1. 실험재료본실험에사용된상엽은 비아이지 (Daejeon, Korea) 에서제공받아사용하였다. Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM), penicillin-streptomycin, phosphatebuffered saline (PBS) 는 WELGENE Inc. (Daegu, Korea) 에서구입하였다. Fetal bovine serum (FBS) 은 GE Healthcare Bio-Sciences Co. (Piscataway, NJ, USA) 에서, bovine calf serum (BCS) 은 WELGENE Inc. (Daegu, Korea) 에서구입하여사용하였다. Oil Red O (ORO), 3-isobutyl- 20 www.kosac.or.kr
상엽추출물의항산화및항비만활성 1-methylxanthine (IBMX), dexamethasone, insulin, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 11-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), 그리고 chloroform은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 에서구입하여사용하였다. Formaldehyde는 Bio Basic Inc. (Markham, ON, Canada) 에서구입하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO), isopropanol은 Junsei (Tokyo, Japan) 에서구입하여사용하였다. Trizol은 Life Technologies, Inc.(Grand Island, NY, USA) 에서구입하여사용하였다. AccuPower R Cycle Script RT PreMix와각각의 primer들은 Bioneer (Daejeon, Korea) 에서구입하였으며, PCR PreMix (i-taq) 는 intron BIOTECHNOLOGY (Seongnam, Korea) 에서구입하여사용하였다. 2. 상엽추출물의제조분쇄된상엽 1.6 kg에 16 L의증류수를가하여잘섞어준뒤 autoclave를이용하여 121 에서 15 min 동안열수추출하였다. 상엽추출물은 Whatman No.1 여과지로여과한뒤동결건조하여 20 에서보관하며이후분석에사용하였다. 3. 상엽추출물의 DPPH 라디컬소거활성 DPPH 라디컬소거능은 Chen et al. (1998) 의방법을일부변형하여측정하였다. Ethanol에용해시킨 200 μm의 DPPH 용액 190 μl에 DMSO에용해시킨 10, 50, 100, 200, 500 그리고 1,000 μg/ml 농도의상엽추출물 10 μl를넣어잘혼합하였다. 혼합시킨용액을 30 min 동안상온에서반응시킨후 ELISA reader (Tecan, Mannedorf, Switzerland) 를사용하여 517 nm에서흡광도를측정하였다. 대조군은상엽추출물대신 10 μl의 DMSO를첨가하였으며 DPPH 라디컬소거활성은아래의방법으로계산하였다. DPPH 라디컬소거능 (%) = (1-A/B) 100 A: 상엽추출물처리군의흡광도 B: 대조군의흡광도 4. 3T3-L1 세포배양및분화 3T3-L1 전지방세포는 Korea Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea) 에서분양받아사용하였다. 3T3-L1 전지방세포는 10% BCS과 100 unit/ml의 penicillin-streptomycin 이포함된 DMEM 배지를사용하여 37, 5% CO 2 환경에서 2-3일주기로배지를교체해주면서배양되었다. 3T3-L1 전지방세포에서지방세포로의분화와상엽추출물의처리과정은 Figure 2와같다. 3T3-L1 전지방세포가 confluent된상태 (Day -2) 가된 2일후 (Day 0) 분화유도배지 (Differentiation medium; DM) 로교체하였다. 분화유도배지는 DMEM 배지에 10% FBS와 100 unit/ml의 penicillin-streptomycin을포함시킨후 500 μm의 IBMX, 5.2 μm의 DEX, 167 nm의 insulin 을추가하였으며 Day 0에서 Day 2까지 48 h 동안사용하였다. 분화유도후배지 (Post-differentiation medium; Post-DM) 는 DMEM 배지에 10% FBS와 100 unit/ml의 penicillinstreptomycin이포함시킨후 167 nm의 insulin만추가하여 Day 2에서 Day 4까지사용하였다. 이후 DMEM 배지에 10% FBS와 100 unit/ml의 penicillin-streptomycin을포함시킨후 Day 4에서 Day 6까지사용하였으며 Day 6에지방세포분화를종료하였다. 5. 3T3-L1 전지방세포에서상엽추출물의독성평가 Confluent된상태의 3T3-L1 전지방세포에서상엽추출물의세포독성을 MTT 분석법을이용하여평가하였다. MTT reagent는 2 mg/ml의농도로 PBS에용해시킨후 10% BCS 와 100 unit/ml의 penicillin-streptomycin이포함된 DMEM 배지에 200 μg/ml의농도로희석시킨뒤사용하였다. 상엽추출물은 confluent 상태의 3T3-L1 전지방세포에 10, 50, 100, 200, 400 그리고 800 μg/ml의농도로 24 h 동안처리하였다. 상엽추출물을처리한배지를제거한후희석시킨 200 μg/ml의 MTT reagent를포함한 DMEM 배지를처리하여 37, 5% CO 2 가유지되는 incubator에서 1 h 동안배양하였다. 반응이끝난후 MTT reagent를포함한배지를완전히제거한후 DMSO 300 μl를첨가하여세포내에생성된보라색의 formazan을용해시켰다. 용해된 formazan을 96-well plate에 100 μl씩옮겨넣은후 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 을이용하여 570 nm에서흡광도를측정하였다. 처리하지않은 3T3-L1 전지방세포의흡광도를대조군으로하여세포생존율을계산 (% of control) 하여상엽추출물의세포독성을평가하였다. 6. 상엽추출물의 3T3-L1 세포내지방축적억제활성상엽추출물에의한분화된 3T3-L1 지방세포내의지방축적량을 ORO 염색법을이용하여정량분석하였다. 상엽추출물은 10, 50, 100, 200, 400 그리고 800 μg/ml의농도로 Day -2에서 Day 6까지 confluent 상태의 3T3-L1 전지방세포에서지방세포로분화된전기간동안처리되었다. ORO 염색은분화가완료된 Day 6에실시하였다. 분화종료후 3T3- L1 지방세포에 PBS 0.5 ml를넣어씻어준뒤 3.7% (v/v) 의 formaldehyde를처리하여 30 min 동안실온에서고정시켰다. 그후증류수를이용해씻어준뒤물기를완전히제거한후 3 mg/ml ORO를 15 min 동안실온에서처리하여염색하였다. 염색후증류수를사용해헹구어준후 DMSO을가하여세포내지방에염색된 ORO를녹여준뒤 96 well plate에 100 μl/ www.kosac.or.kr 21
Figure 1. Scheme of 3T3-L1 differentiation and MLE treatment. MLE: Mulberry leaf extract, DM: Differentiation medium consist of FBS-DMEM, IBMX (500 μm), dexamethasone (5.2 μm), and insulin (167 nm), Post-DM: Post-differentiation medium consist of FBS-DMEM and insulin (167 nm). well 씩옮긴후 microplate reader 를이용하여 510 nm 에서 흡광도를측정하였다. 상엽추출물을처리하지않은분화된지 방세포를대조군으로하여 lipid accumulation (% of control) 을계산하여상엽추출물의지방축적억제활성을평가하였다. 7. 3T3-L1 세포의지방구의수및크기관찰 분화된 3T3-L1 지방세포의지방구 (lipid droplets) 의수 와크기는현미경을통해관찰하였다. ORO 를이용한정량적 분석에서의처리방법과동일하게 3T3-L1 전지방세포는 10, 50, 100, 200, 400 그리고 800 μg/ml 의상엽추출물을 Day 2 에서 Day 6 까지전기간동안처리하였다. 분화된 3T3- L1 지방세포를 Day 6 에 3.7% (v/v) 의 formaldehyde 를이 용해실온에서 30 min 동안고정시키고 ORO 염색을실시하 였다. ORO 에의해염색된지방구의수와지방크기는현미경 (Korealabtech KI-400; Seongnam, Korea) 을통해서이미지 를관찰하였다. 8. 상엽추출물에의한 C/EBPα, β 그리고 PPARγ 발현수준확인 상엽추출물 10, 100 μg/ml 을 figure 1 과같이처리하였 을때 3T3-L1 전지방세포에서지방세포로의분화과정에대 표적인전사인자로알려진 C/EBPα, β 그리고 PPARγ 의발 현정도를 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 방법을이용하여확인하였다. 분화된 3T3-L1 지 방세포를 Day 6 에 TRIzol R 500 μl 를이용하여 total RNA 를 추출한후 chloroform 을 100 μl 넣고 3 min 동안상온에정 치한뒤 17,000 rpm 에서 20 min 동안원심분리하여상층액 을분리하였다. 분리된상층액에 isopropanol 250 μl 를넣 고 10 min 간상온에한번더정치시킨다음 17,000 rpm 에 서 15 min 동안원심분리하여 RNA 를분리한후정량하였다. AccuPower R Cycle Script RT PreMix kit (Bioneer, Daejeon, Figure 2. Scavenging activity of MLE against DPPH radicals. Corresponding letters indicate significant differences in MLE treatment by Duncan s test (p<.05). Korea) 를이용하여 cdna 를합성하였다. 합성된 cdna 는 각각의 primer 와함께 Maxime PCR PreMix kit (i-taq) (intron, Seongnam, Korea) 를이용하여 30cycle 수준으로 thermal cycler (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) 에서 PCR 을수행하였다. 사용된각각의 primer sequences 는다음과 같다. C/EBPα 는 F: 5 -CCAGAGGATGGTTTCGGGTC-3, R: 5 -TCCCCAACACCTAAGTCCCT-3, C/ EBPβ 는 F: 5 -GCAAGAGCCGCGACAAG-3. R: 5 -GGCTCGGGCAGCTGCTT-3, PPARγ 는 F: 5 -CCATTCTGGCCCACCAACTT, R: 5 -CCTTCTCGGCCTGTCGATCC-3, GAPDH 는 F: 5 -TGATGGGTGTGAACCACGAG-3, R: 5 -AAGTCGCAGGAGACAACCTG-3 이다. PCR 을수행한후 1.5% (w/v) agarose gel 에전기영동하여 mrna 유전자발 현수준을 ChemiDocTMXRS+ imaging system (Bio-Rad, Richmond, CA,USA) 을이용하여분석하였다. 9. 통계분석 모든데이터는평균 ± 표준편차로표현하였으며, 데이터의 통계처리는 Statistical Package for Social Science (SPSS; Chicago, IL, USA) 를이용하여분석하였다. 각항목은일원배 치분산분석 (one-way ANOVA) 을시행하였으며, Duncan s test 는신뢰수준 p<.05 에서평균값들에대한유의성을검증하 였다. 또한 Student s t-test 방법에의하여각구간의유의성 차이를검증하였다 (**p<.01, and ***p<.001). 1. 상엽추출물의항산화활성 상엽추출물의항산화활성을 DPPH 라디컬소거법을통해 22 www.kosac.or.kr
상엽추출물의항산화및항비만활성 Figure 3. Effect of MLE treatemnt on the viability of 3T3-L1 preadipocytes. Corresponding letters indicate significant differences between control and MLE treatment by Student s t-test. 확인하였다. 상엽추출물은 100, 200, 500 그리고 1,000 μg/ ml 농도에서농도의존적으로 DPPH 라디컬소거활성을나타 냈다 (Figure 1). 상엽추출물은 10, 50 그리고 100 μg/ml 농 도에서각각 2.24%, 2.66% 그리고 3.48% 의 DPPH 라디컬소 거활성으로유의적차이를나타내지않았으나 100, 200, 500 그리고 1,000 μg/ml 의농도에서각각 3.48% 8.28%, 16.63% 그리고 25.84% 로 DPPH 라디컬소거활성은유의적이며농 도의존적으로증가하였다. 기보고한연구에서본상엽추출물 은 quercetin (0.03 mg/g), quercetin-3-β-d-glucose (1.25 mg/g), quercetin-3-o-glucose-6"-acetate (0.13 mg/g), rutin (0.09 mg/g) 등과같은 flavonol 을함유하고있으며, 이 러한물질들은 in vitro 수준에서의 peroxyl 과 hydroxyl 라디 컬소거활성을증가시켰으며, 세포내증가된산화적스트레스 를감소시켰다 (Kim et al., 2011). 최진호등은상엽을메탄올 을이용하여추출물한뒤 sprague dawley (SD) rat 에투여하 여간장조직의산소라디컬생성을효과적으로억제하였으며 Mn-SOD 및 Cu, Zn-SOD 등활성산소제거효소들의활성을 증가시킨것을확인하였다. 따라서상엽추출물의 DPPH 라디 컬소거활성은상엽에함유된다양한 flavonol 성분들에의해 서나타내는것이라할수있다. 2. 상엽추출물의세포독성 항산화활성을나타내는상엽추출물이 3T3-L1 지방세 포내에서효과적으로지방축적을억제하는지평가하기위 해서먼저 3T3-L1 세포에서의독성을평가하였다. 상엽추 출물의세포독성을평가하기위해 MTT 분석법을이용하였으 며, confluent 상태가된 3T3-L1 전지방세포에상엽추출물 을 10, 50, 100, 200, 400, 그리고 800 μg/ml 의농도로 24 h 처리하여세포생존률을측정하였다. 상엽추출물은처리 하지않은대조군의세포생존률과비교하여각각 100.71%, Figure 4. Inhibitory effect of intracellular lipid accumulation by MLE treatment in 3T3-L1 adipocytes. 3T3-L1 cells were differentiate to adipocytes in the presence or absence of MLE and it was stained with ORO. The level of lipid accumulation in 3T3-L1 adipocytes was quantified at 510 nm. Corresponding letters indicate significant differences between control and MLE treatment by Student s t-test (**p<.01 and ***p<.001). 101.48%, 108.41%, 94.75%, 92.24%, 그리고 95.49% 의세포 생존율을나타냈다 (Figure 3). 상엽추출물은 3T3-L1 전지방 세포의생존률에유의적인영향을미치지않았다. 따라서이후 지방세포내의지방축적억제활성을확인하는실험에서 10-800 μg/ml 농도범위의상엽추출물을사용하였다. 3. 상엽추출물에의한 3T3-L1 지방세포내에서의지방축적억 제활성 상엽추출물에의한지방축적억제활성은 3T3-L1 지방세포 모델을이용하여평가하였다. 상엽추출물을세포독성결과를 바탕으로 10-800 μg/ml 의세포생존율에영향을미치지않는 농도범위에서 Day-2 에서 Day6 까지전기간동안처리한후 ORO 염색법을이용하여결과를확인하였다. 지방세포로분화 를유도한대조군에서는다량의지방이축적되었으며이를기 준으로상엽추출물을처리한 3T3-L1 지방세포내의지방축 적은농도의존적으로감소하였다. 3T3-L1 지방세포내축적 된지방을정량적으로분석한결과 200, 400, 그리고 800 μg/ ml 상엽추출물을처리하였을때대조군에비해각각 19.52%, 16.98% 그리고 32.48% 로지방축적량을유의적으로감소시킨 것으로나타냈다 (Figure 4). 또한현미경을이용하여 3T3-L1 지방세포내축적된지방구숫자와크기를관찰한결과전지방 세포에서는지방구가관찰되지않았으나분화를유도시킨지 방세포대조군은다량의지방구가발견되었다. 상엽추출물을 10-800 μg/ml 농도범위로처리하였을때 ORO 에의해염색 된지방구와크기는 Figure 4 의정량적분석결과와동일하게 200 μg/ml 의농도에서부터감소되는것이관찰되었다 (Figure 5). Hatia S 등에의하면 24 개의주요식이 polyphenols 들 www.kosac.or.kr 23
Figure 5. Observation of size and a number of lipid droplets in 3T3-L1 adipocytes treated with MLE. The 3T3-L1 cells were stained with ORO and microscopy analysis was performed at Day 6. MLE: Mulberry leaf extract, Pre: Preadipocytes. 중 quercetin 과 epicatechin 등을포함한 flavonoid 물질들이 3T3-L1 전지방세포에서 H 2 O 2 에의해유도된산화적스트레 스를억제함으로서항비만효과를나타내는것으로보고하였다 (Hatia et al., 2014). 또한 Ahn 등에의하면 quercetin 은 3T3- L1 지방세포에서 5 -AMP-activated protein kinase (AMPK) 와 mitogen-activated protein kinases (MAPK) 신호전달체 계의조절을통해세포사멸을유도함으로서항비만효과를나 타내는것으로보고하였다 (Ahn el al., 2008). 김순경등은 85% 메탄올로추출한상엽추출물을유전적으로비만이유도된 Zucker rat 에 3 주간경구투여함으로서대조군에대비 10% 의 체중감소효과를보였으며중성지질과총콜레스테롤등이유의 적으로감소된것을보고하였다. 따라서상엽추출물은함유된 flavonoid 물질들에의한항산화활성을통해 3T3-L1 전지방 세포에서지방세포로의분화과정에증가되는지방축적을억제 함으로서항비만효과를나타낼수있는것으로생각된다. 4. 상엽추출물에의한 3T3-L1 지방세포내에서의 C/EBPα, β 와 PPARγ 발현 상엽추출물은 3T3-L1 세포의지방축적을효과적으로억제 한다는것을확인할수있었으므로 adipogenesis 를조절하는 데관여하는주요전사인자로알려진 C/EBPα, β 그리고 PPAR γ 의발현에어떠한영향을미치는지 RT-PCR 방법을이용하 여추가적으로분석하였다. 분화된 3T3-L1 지방세포에서는 전지방세포에비해 C/EBPα, β 그리고 PPARγ 의발현이현저 하게증가되었다. 그러나상엽추출물을 10 그리고 100 μg/ ml 로처리하였을때 adipogenesis 조절에관여하는주요전 사인자인 C/EBPα, β 그리고 PPARγ 의발현은감소된것을확 인하였다 (Figure 6). 선행연구결과들에의하면 adipogenesis 에서초기과정은 C/EBPβ 와 C/EBPσ 의발현이증가되며이들 에의해이후에 C/EBPα 와 PPARγ 의발현또한증가됨으로서 진행되는것으로보고되었다 (Ntambi et al., 2000; 최용민등, 2010). 또한 Park HS 등은상엽 ethyl acetate 추출물이 3T3- Figure 6. The mrna expression levels of C/EBPα, β, and PPARγ in MLE-treated 3T3-L1 adipocytes (Day 6). The mrna expression levels of C/EBPα, β, PPARγ, and GAPDH in 3T3-L1 adipocytes were analyzed by RT-PCR. GAPDH was used as a control in RT-PCR analysis. MLE: Mulberry leaf extract, Pre: Preadipocytes. L1 지방세포에서 PPARγ 와 C/EBPα 의발현을억제시킴으로서 세포내에서의지방축적을감소시킨것으로보고하였다 (Park et al., 2013). 그러므로본연구에서제조된상엽추출물또한 adipogenesis 과정에기여하는주요전사인자인 C/EBPα, β 그 리고 PPARγ 의발현을억제함으로써지방세포내에서의지방축 적을억제한다는것을보여주는결과이다. Ⅳ 본연구에서는건조된상엽을분쇄하여열수추출방법으로추 출한뒤상엽추출물의항산화활성및지방세포내의지방축 적억제활성을평가하고자하였다. 상엽추출물의항산화활성 을평가하기위해 DPPH 라디컬소거활성을확인한결과 10-1,000 μg/ml 농도에서농도의존적으로증가된 DPPH 라디 컬소거활성을나타냈다. Confluent 상태의 3T3-L1 전지방세 포에서상엽추출물의세포독성을 MTT 분석법으로평가한결 과 10-800 μg/ml 의농도범위에서세포독성을나타내지않았 다. 따라서독성을나타내지않는농도범위내의상엽추출물을 3T3-L1 전지방세포에서지방세포로분화시키는전기간동안 처리한후 ORO 염색법을통해정량적으로세포내지방축적억 제활성을평가하고현미경을통해이미지분석을하였다. 상엽 추출물은대조군인분화된지방세포내의지방량에비해농도 의존적으로세포내지방축적량을정량적으로감소시키는것으 로나타났으며, 이러한결과는현미경을이용한이미지분석에 의해서도일치하게관찰되었다. 이와더불어상엽추출물에의 한전지방세포에서지방세포로의분화과정중주요전사인자 로알려진 C/EBPα, β 그리고 PPARγ 의발현수준을 RT-PCR 방법으로분석하였다. 분화된지방세포에서의 C/EBPα, β 그리 24 www.kosac.or.kr
상엽추출물의항산화및항비만활성 고 PPARγ의발현수준은전지방세포에비해현저히증가하였으나 10-100 μg/ml의상엽추출물을 Day -2에서 Day 6까지처리하였을때이들의발현량을감소시키는것으로나타냈다. 이러한결과는상엽추출물은 adipogenesis에서주요전사인자들로알려진 C/EBPα, β 그리고 PPARγ의발현을억제시킴에따라지방세포내에서의지방축적을억제할수있다는가능성을보여준다. 따라서본연구결과는상엽추출물이항산화제로서다양한산화적스트레스를억제할수있는가능성과체내지방축적억제에기여하는항비만식품소재로서의가능성을보여준결과로생각된다. 추후상엽추출물에의한세포내에서의항산화활성과이를통한지방축적억제와관련된기전에대한연구가추가적으로필요할것으로생각된다. 이상의연구결과는상엽추출물에의한산화적스트레스억제및세포내지방축적억제를통해기능성항산화및항비만소재로활용될수있는가능성을보여주었으며향후이를활용한화장품및미용기능식품개발에기초자료로서유용히사용될수있을것으로사료된다. 김애정, 김명환, 정건섭. 뽕잎분말첨가두부섭취가비만중년여성의혈청지질, 칼슘, 칼슘 / 인비율및납수준변화에미친영향. 한국식품과학회지, 38: 432-437, 2006. 김애정, 김선여, 최미경, 김명환, 한명륜, 정건섭. 뽕잎분말이고콜레스테롤식이투여흰쥐의지질대사에미친영향. 한국식품과학회지, 37: 636-641, 2005. 김은정, 김계엽, 김영민, 최경호, 장성주. 고지방식이로유도된비만백서에서뽕잎추출물의항비만효과. 동의생리병리학회지, 23: 831-836, 2009. 김순경, 김선여, 김휘준, 김애정. 뽕잎추출물이 Zucker rat의체지방축적에미치는효과. 한국식품영양과학회지, 30: 516-520, 2001. 박정애, 진경숙, 이지영, 권현주, 김병우. 통초 희렴추출물의항산화 항비만활성및혼합물의항비만시너지효과. 한국미생물생명공학회지, 41: 341-349, 2013. 박주헌, 이경원, 성기승, 김성수, 조경동, 이복희, 한찬규. 뽕잎및꾸지뽕잎첨가식이가 Streptozotocin 유발당뇨쥐의혈당관련바이오마커에미치는영향. 한국미생물생명공학회지, 41: 341-349, 2012. 박종배, 이혜숙, 황석연, 홍승복, 김희동, 윤치영. 복합생약추출물이고지방식이를급여한쥐의비만억제에미치는영향. 대한피부미용학회지, 9: 25-34, 2011. 송화정, 권소영, 임윤숙, 김애정. 뽕잎분말이함유된천연팩 및비누가성인남자의피부개선에미치는효과. 대한피부미용학회지, 10: 911-919, 2012. 윤보라, 조봉제, 이효구, 김대중, 이성갑, 홍희도, 김경탁, 조장원, 최현선, 이부용, 이옥환. 쓴메밀및단메밀에탄올추출물의항산화및지방세포분화억제효과. 한국식품저장유통학회지, 19: 123-130, 2012. 이미라, 오득실, 위안진, 윤병선, 장순애, 성창근. 표고버섯이고지방식이로유도한비만흰쥐에미치는항비만효과. 한국식품영양과학회지, 2: 194-199, 2014. 이상일, 이예경, 이인애, 최종근, 김순동, 서주원. Monascus pilosus 발효뽕잎차가고지방식이마우스의체중과간조직항산화계효소활성에미치는영향. 한국식품영양학회지, 26: 66-77, 2013. 이혜숙, 황석연. MYC 추출물이고지방식이를급여한 Zucker rats의콜레스테롤저하및비만억제에미치는영향. 대한피부미용학회지, 8: 71-80, 2010. 이혜연, 정현아, 김동한, 권후자, 이명희, 김안나, 박찬성, 양경미, 배현주. 뽕잎항산화능및뽕잎가루머핀의품질특성. 한국식품조리과학회지, 27: 27-34, 2011. 전예숙, 김미원. 뽕잎추출물의항산화효과와항산화성분분리및동정에관한연구. 한국식품영양학회지, 24: 94-100, 2011. 전형주, 권혜진. 명월초의항산화효과및화장품과식품의융합소재로서기능성평가. 대한피부미용학회지, 16: 499-507, 2014. 주민정, 권중호, 김현구. 용매에따른뽕잎과오디의생리활성효과. 한국식품저장유통학회지, 16: 442-448, 2009. 최용민, 이선미, 김영화, 전건욱, 성지혜, 정헌상, 이준수. 포도씨탈지박추출물처리가 3T3-L1 Preadipocyte 내지방생성에미치는영향. 한국식품영양과학회지, 39: 927-931, 2010. 최진호, 김대익, 박수현, 김정민, 백영호, 이희삼, 류강선. 간장조직의활성산소및그제거효소에미치는뽕잎추출물의영향. 한국생명과학회지, 10: 504-510, 2000. 최혜영, 김건희. 참산부추 (Allium sacculiferum Max.) 메탄올추출물의지방세포내 ROS 생성및지질축적억제효능. 한국식품영양과학회지, 43: 822-828, 2014. Ahn JY, Lee HJ, Kim SN, Park JH, Ha TY. The antiobesity effect of quercetin is mediated by the AMPK and MAPK signaling pathways. Biochem. Bioph. Res. Co., 373: 545-549, 2008. Attila H, Katalin V, Balazs Danko, Zoltan K, Edit W, Anasztasia H, Istvan Z, Tusty-Jiuan H. In vitro anti-diabetic activity and chemical characterization of www.kosac.or.kr 25
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