(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 31/70 (2006.01) A61K 36/258 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) A61P 13/12 (2006.01) (21) 출원번호 10-2013-0136547( 분할 ) (22) 출원일자 2013 년 11 월 11 일 심사청구일자 2013 년 11 월 11 일 (62) 원출원특허 10-2012-0031828 원출원일자 심사청구일자 (30) 우선권주장 2012 년 03 월 28 일 2012 년 03 월 28 일 1020120003091 2012 년 01 월 10 일대한민국 (KR) (11) 공개번호 10-2013-0125746 (43) 공개일자 2013년11월19일 (71) 출원인 한국과학기술연구원 서울특별시성북구화랑로 14 길 5 ( 하월곡동 ) (72) 발명자 강기성 대전광역시서구가장동 23-12 김수남 강원도강릉시교 1 동현대 2 차아파트 205-206 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 리앤목특허법인 전체청구항수 : 총 10 항 (54) 발명의명칭파낙스속식물추출물의마이얄형갈색화반응생성물을포함하는신장질환의예방, 개선또는치료용조성물 (57) 요약 본발명은진세노사이드 Re, 진세노사이드 Re 를포함하는파낙스속식물추출물, 또는글루코스를아미노산과함께 100 ~ 130 에서 0.5 ~ 12 시간반응시켜얻어진마이얄형갈색화반응생성물을유효성분으로포함하는신장질환의예방, 개선또는치료용조성물을제공한다. 대표도 - 도 3-1 -
(72) 발명자 함정엽 서울특별시관악구봉천 9 동벽산블루밍아파트 105-601 이우정 경기도성남시분당구서현동시범단지한양아파트 310-1303 야마베노리꼬 강원도강릉시대전동 290 번지 KIST 강릉분원기숙사 317 호 이지환 강원도강릉시연곡면영진리삼우아파트 215 호 - 2 -
특허청구의범위청구항 1 진세노사이드-유래당을아미노산과함께 100 ~ 130 에서반응시켜얻어진마이얄형갈색화반응생성물을유효성분으로포함하는신장질환의예방또는치료용약학조성물. 청구항 2 진세노사이드-유래당을아미노산과함께 100 ~ 130 에서반응시켜얻어진마이얄형갈색화반응생성물을유효성분으로포함하는신장질환의예방또는개선용건강기능식품용조성물. 청구항 3 제1항또는제2항에있어서, 상기아미노산은글리신 (glycine), 알라닌 (Alanine), 시스테인 (Cysteine), 아스파르트산 (Aspartic acid), 글루탐산 (Glutamic acid), 페닐알라닌 (Phenylalanine), 히스티딘 (Histidine), 이소루신 (Isoleucine), 리신 (Lysine), 류신 (Leucine), 메티오닌 (Methionine), 아스파라긴 (Asparagine), 프롤린 (Proline), 글루타민 (Glutamine), 아르기닌 (Arginine), 세린 (Serine), 트레오닌 (Threonine), 셀레노시스테인 (Selenocysteine), 발린 (Valine), 트립토판 (Tryptophan), 티로신 (Tyrosine), 또는이들의조합인조성물. 청구항 4 제3항에있어서, 상기아미노산은글리신 (glycine), 알라닌 (Alanine), 류신 (Leucine), 세린 (Serine), 또는이들의조합인조성물. 청구항 5 제1항또는제2항에있어서, 상기진세노사이드-유래당은글루코스, 아라비노스 (arabinose), 자이로스 (Xylose), 또는이들의조합인조성물. 청구항 6 제1항또는제2항에있어서, 상기신장질환은신장염, 신우염, 신증후군, 신장암, 급성신우신염, 만성신우신염, 신장결핵, 요로감염증, 요로결석, 요관결석, 급성신부전, 만성신부전, 당뇨병성신증, 만성사구체신염, 급성진행성신염, 네프로제증후군, 소상사구체경화증, 막성신증, 또는막성증식성사구체신염인조성물. 청구항 7 제1항또는제2항에있어서, 상기신장질환은항암제에의해유발된신장질환인조성물. 청구항 8 제7항에있어서, 상기항암제는백금항암제인조성물. 청구항 9 제1항에있어서, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 유제, 시럽제, 액제, 에어로졸, 엑스제, 주사제, 경피투여제, 또는좌제의형태인조성물. 청구항 10 제2항에있어서, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 유제, 시럽제, 액제, 에어로졸, 엑스제, 차, 젤리, 또는음료의형태인조성물. 명세서 [0001] 기술분야 본발명은신장질환의예방, 개선또는치료용조성물에관한것으로, 보다구체적으로는파낙스속식물추출물 - 3 -
의마이얄형갈색화반응생성물을활성성분으로서포함하는신장질환의예방, 개선또는치료용조성물에관한 것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] 배경기술신장은인체에서뇨 ( 尿 ) 를통한노폐물배설을담당하는중요한배설기관이다. 여러가지의약품이나환경오염물질이신장에대한독성을나타내며, 신장독성을일으키는대표적인약물로는아스피린, 인도메타신등의비스테로이드성해열진통소염제, 퓨로마이신, 다우노마이신, 시클로포스파미드, 페니실라민, 아드리아마이신, 씨스플라틴등의항암제, 면역억제제, 아미카신, 겐타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 시소마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신등의아미노글라이코사이드계항생제, 세팔로스포린계항생제, 이미페넴, 멜로페넴등카바페넴계항생제, 카드뮴, 납, 수은, 크롬등의중금속및무기ㅇ유기중금속화합물, 클로로포름, D-세린, 설폰아미드, 2-브로모에틸렌, 하이드로브로마이드등의화합물또는오카라톡신, 시트리닌과같은곰팡이독소등이있다. 이러한여러가지의약품이나환경오염물질에의한신장독성의발현에는프리라디칼 (Free radical) 에의한산화적손상과아울러생체내의항산화방어체계 (antioxidant defense system) 의기능저하로인한산화적스트레스가주원인으로여겨지고있다. 이러한산화적스트레스에의해발생되는신장질환으로는신장염, 신우염, 신증후군, 신장암, 급성신우신염, 만성신우신염, 신장결핵, 요로감염증, 요로결석, 요관결석, 급성신부전, 만성신부전, 당뇨병성신증, 만성사구체신염, 급성진행성신염, 네프로제증후군, 소상사구체경화증, 막성신증, 또는막성증식성사구체신염등이있으며, 이에한정되는것은아니다. 따라서, 상기질병의예방또는치료를위해서프리라디칼의생성으로인한산화적손상을줄이고생체내항산화활성계를증진시킴으로써산화적스트레스를개선할수있는합성항산화제가많이제안되어있으나, 안정성에대한문제로식품과천연물에서유래되는항산화제의중요성이부각되고있다. 이를위해산화적신장손상과정의예방에있어서프리라티칼소거능을가진천연물유래의항산화제를이용한연구가많이제시되고있다 ( 비특허문헌 1, 2). 그러나현재까지이러한신장독성유발물질에의한신장독성을효과적으로예방또는치료할수있는천연물유래의항산화제개발은미흡한실정이다. 인삼 (Panax ginseng) 은식물분류학상파낙스 (Panax) 속오가피과 (Araliaceae) 에속하는다년생식물로서, 인삼과유사한효능을갖는파낙스속식물로는화기삼 (Panax quinquefolia), 전칠삼 ( 삼칠, Panax notoginseng), 죽절삼 (Panax japonica), 삼엽삼 (Panax trifolia), 히말라야삼 (Panax pseudoginseng), 베트남삼 (Panax vietnamensis) 등이있다. 이러한파낙스속식물에는다른식물과는달리담마란 (dammarane) 골격에 1-4개의당이결합되어있는담마란계사포닌을공통으로함유하고있다. 특히인삼에함량이높은사포닌은진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg1, Re 등이며, 이러한사포닌성분들은다양한약효를나타내는데그구조에따라약효의종류와강도가매우다르다. 상기파낙스속식물의담마란계사포닌은프로토파낙사디올 (Protopanaxadiol) 또는프로토파낙사트리올 (Protopanaxatriol) 을모핵으로가지며, 도 1에나타낸바와같이분류될수있다. 고온고압의열처리가공법 ( 수치, 修治 ) 을적용하여담마란계사포닌의변환에의한인삼의약효를증가시키기위한방법이연구되어왔다. 대표적으로, 박등은인삼을고온에서가열처리함으로써진세노사이드 Rb1 및 Rb2 에대한 Rg3, Rg5의비율이높아진가공인삼추출물을개발하였다 ( 특허문헌 1). 프로토파낙사디올계진세노사이드인 Rb1과 Rb2는열처리가공에의해도 2에나타낸바와같이 20번위치에서글리코실잔기의이탈에의해입체적이성체인 20(S)-Rg3와 20(R)-Rg3이생성되며, 이어서 20번위치에서탈수반응이일어나 Rg5와 Rk1이생성되는것으로알려져있다 ( 비특허문헌 3, 4). 이러한가공과정에서원래인삼을비롯한파낙스속식물에주로함유되어있는사포닌성분인진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd가원래인삼에는없는진세노사이드 Rg3, Rg5, Rk1 으로변하고또한여러가지새로운약효성분이생성되어항산화작용, 항암작용, 혈액순환개선작용등이매우강화되는것으로알려져있다 ( 비특허문헌 5, 6). 인삼을 110~180 에서 0.5 ~ 20시간가열한가공인삼으로부터얻어진추출물은진세노사이드 Rg3, Rg5, Rk1를주성분으로서함유하며, 그추출물이신장독성억제활성이있는것으로밝혀졌다 ( 특허문헌 2). 또한, 가공인삼추출물에미량포함된진세노사이드 Rk3, Rh4, 담마란진세노사이드의아글리콘에해당하는 PD (Panaxadiol), PT(Panaxatriol), PPD(protopanaxadiol), PPT(protopanaxatriol), DHPPD(Dehydroprotopanaxadiol)-I, DHPPD(dehydroprotopanaxadiol)-II, DHPPT (Dehydroproto panaxatriol)-i, DHPPT(Dehydroprotopanaxatriol)- II가신장질환의예방또는치료에효과가있는것으로연구되었다 ( 특허문헌 3). - 4 -
[0009] 이와같이, 인삼의사포닌성분에대한신장보호활성연구가많이이루어져왔으나, 충분히효과적인성분의 개발은미흡한실정이며, 보다효과적인신장질환의예방또는치료활성을갖는약물의개발이지속적으로필요 하다. 선행기술문헌 [0010] 특허문헌 ( 특허문헌 0001) 1. 미국특허등록제 5776460 호 ( 특허문헌 0002) 2. 한국특허등록제 0337471 호 ( 특허문헌 0003) 3. 한국특허등록제 0828192 호 [0011] 비특허문헌 ( 비특허문헌 0001) 1. Ramkumar et al., Food Chem. Toxicol., 47(10), pp2516-2521, 2009 ( 비특허문헌 0002) 2. Kumarappan et al., Ren. Fail., 30(3), pp307-322, 2008 ( 비특허문헌 0003) 3. Kang et al., Biol. Pharm. Bull., 30(4), pp724-728, 2007 ( 비특허문헌 0004) 4. Lee et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 18(16), pp4515-4520, 2008 ( 비특허문헌 0005) 5. Kim WY et al., J. Nat. Prod., 63(12), pp1702-1704, 2000 ( 비특허문헌 0006) 6. Kwon SW et al., J. Chromatogr A., 921(2), pp335-339, 2001 발명의내용 [0012] [0013] [0014] 해결하려는과제이에본발명자들은효과적인신장질환의예방또는치료활성을갖는약물의개발을위해연구한결과, 인삼을비롯한파낙스속식물의추출물또는특정진세노사이드를아미노산과함께고온에서반응시켜얻어지는마이얄형갈색화반응생성물이높은항산화활성및신장세포보호활성을갖는다는것을밝혀내어, 본발명을완성하게되었다. 따라서, 본발명의목적은파낙스속식물의추출물또는특정진세노사이드의마이얄형갈색화반응생성물을포함하는신장질환의예방또는치료용약학조성물을제공하는것이다. 따라서, 본발명의다른목적은파낙스속식물의추출물또는특정진세노사이드의마이얄형갈색화반응생성물을포함하는신장질환의예방또는개선용건강기능식품용조성물을제공하는것이다. [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] 과제의해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명의일측면은진세노사이드 Re, 진세노사이드 Re를포함하는파낙스속식물추출물, 또는진세노사이드-유래당을아미노산과함께 100 ~ 130 에서반응시켜얻어진마이얄형갈색화반응생성물을유효성분으로포함하는신장질환의예방또는치료용약학조성물을제공한다. 본발명의다른일측면은진세노사이드 Re, 진세노사이드 Re를포함하는파낙스속식물추출물, 또는진세노사이드-유래당을아미노산과함께 100 ~ 130 에서반응시켜얻어진마이얄형갈색화반응생성물을유효성분으로포함하는신장질환의예방또는개선용건강기능식품용조성물을제공한다. 이하, 본발명을보다상세하게설명한다. 본발명에서사용되는모든기술용어는, 달리정의되지않는이상, 본발명의관련분야에서통상의당업자가일반적으로이해하는바와같은의미로사용된다. 또한, 본명세서에는바람직한방법이나시료가기재되나, - 5 -
이와유사하거나동등한것들도본발명의범주에포함된다. 본명세서에참고문헌으로기재되는모든간행물 의내용은전체가본명세서에참고로통합된다. [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] 본발명자들은신장질환의예방, 개선또는치료에효과적인약물을발굴하기위해인삼의성분에대해연구한결과, 인삼의열처리가공중생성되는갈색화반응생성물이신장독성에대한보호활성이있음을규명하게되었다. 구체적으로는, 파낙스속식물추출물에함유되어있는진세노사이드 Re를아미노산과함께고온에서소정의시간동안반응시켜얻어진마이얄형갈색화반응생성물에대해 DPPH(α-α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) 라디칼소거활성을측정한결과활성산소소거능력이현저히우수한것으로나타났을뿐만아니라, 라디칼생성제인 AAPH(2,2'-Azobis(1-aminopropane)dihydrochloride) 로유도된신장독성에대해신장상피세포의손상을억제하는활성이현저히우수한것으로나타났다. 뿐만아니라, 상기진세노사이드의열처리가공중이탈되는당을아미노산과함께고온에서소정의시간동안반응시켜얻어진마이얄형갈색화반응생성물또한, 상기마이얄형갈색화반응생성물과마찬가지로활성산소제거능력및신장상피세포손상억제활성을갖는것으로확인되었다. 따라서, 본발명은일측면에있어서, 진세노사이드 Re, 진세노사이드 Re를포함하는파낙스속식물추출물, 또는진세노사이드-유래당을아미노산과함께 100 ~ 130 에서반응시켜얻어진마이얄형갈색화반응생성물을유효성분으로포함하는신장질환의예방또는치료용약학조성물을제공한다. 본발명은다른일측면에있어서, 진세노사이드 Re, 진세노사이드 Re를포함하는파낙스속식물추출물, 또는진세노사이드-유래당을아미노산과함께 100 ~ 130 에서반응시켜얻어진마이얄형갈색화반응생성물을유효성분으로포함하는신장질환의예방또는개선용건강기능식품용조성물을제공한다. 본발명에서정의되는건강기능식품은 2008년개정된건강기능식품에관한법률을통하여새롭게정의된인체에대한기능성및안전성이충분하게확립되어식품의약품안전청식약청고시제2008-72호에규정된건강기능식품기능성원료인정에관한규정에수재된건강기능식품임을의미한다. 이하에서는, 상기본발명에따른약학조성물및건강기능식품용조성물을포괄하여 " 본발명에따른조성물 " 이라고도한다. 상기본발명에따른조성물이유효성분으로서포함하는마이얄형갈색화반응생성물은진세노사이드 Re, 진세노사이드 Re를포함하는파낙스속식물추출물, 또는진세노사이드-유래당을아미노산과함께 100 ~ 130 에서반응시킴으로써얻어질수있다. 상기반응은구체적으로는약 0.5 ~ 12 시간, 더욱구체적으로는약 2 내지 6 시간, 더더욱구체적으로는약 3 내지 5동안수행할수있다. 상기반응의생성물은그대로사용될수도있으나, 바람직하게는약 40 내지 80, 더욱바람직하게는 50 내지 70 에서건조한건조물또는동결건조물로서함유될수도있다. 마이얄형갈색화반응생성물 (Maillard browning reaction product) 이란환원당과아미노산이고온에서반응하여환원당의카보닐기가아미노산의친핵성아미노기와반응하여갈색을띠는복합체혼합물을형성하는과정을의미하는것으로서, 당해기술분야에널리공지되어있다. 본발명에따른조성물에서유효성분으로함유되는마이얄형갈색화반응생성물은진세노사이드 Re, 진세노사이드 Re를포함하는파낙스속식물추출물, 또는진세노사이드-유래당을아미노산과함께약 100 ~ 130 에서반응시킴으로써얻어질수있다. 구체적으로는약 0.5 ~ 12시간동안반응시킴으로써얻어질수있다. 상기마이얄형갈색화반응생성물의원료인진세노사이드 Re는하기화학식 1의구조를갖는다. 화학식 1 [0028] - 6 -
[0029] 상기진세노사이드 Re는당해기술분야공지된임의의방법에따라얻어질수있고, 그제조방법은특별히한정되는것은아니다. 진세노사이드 Re는파낙스속식물추출물로부터당해기술분야에공지된임의의방법에따라분리될수도있으며, 자연계에존재하는담마란화합물을출발물질로하여반합성에의해얻어질수도있다. 예를들어, 진세노사이드 Re를함유하는것으로알려져있는파낙스속식물을약 50 내지 200, 바람직하게는약 120 에서 30분내지 10시간, 바람직하게는약 3 시간동안가열한후저급알콜또는그혼합물로이루어진군으로부터선택되는용매, 바람직하게는 CH 3 OH을넣고환류추출하여여과하는조작을 1회이상, 바람직하게는 3회실시하고여액을합해감압농축하여 CH 3 OH 추출물을수득한다음, 그 CH 3 OH 추출물을감압하에서용매를건조시키고잔사를물에현탁시켜 CH 2 Cl 2 와수포화 n-buoh을차례로사용하여 CH 2 Cl 2 분획, 수포화 n-buoh 분획그리고 H 2 O 분획으로나눈다음, 얻어진수포화 n-buoh 분획을크로마토그래피함으로써수득할수있다. 상기수포화 n-buoh 분획을건조하여물, 에탄올, 또는이들의혼합용매를전개용매로사용하여컬럼크로마토그래피로진세노사이드 Re 함유분획만을분취하고, 진세노사이드 Re의함량이 50% 이상인분획물을수집및농축한다. 이때크로마토그래피를반복수행하면진세노사이드 Re의함량을더욱높일수있으며, 함량이높아진분획을적절한용매계, 예를들면물, 저급알콜, 저급케톤, 클로로포름또는이들의혼합용매와같은용매계에서결정화시키면순수한진세노사이드 Re를수득할수있다. [0030] [0031] 상기마이얄형갈색화반응생성물의원료인상기진세노사이드 Re를포함하는파낙스속식물추출물은진세노사이드 Re를포함하기만하면특별히제한되는것은아니다. 상기식물추출물은진세노사이드 Re를포함하는임의의파낙스속식물로부터얻어질수있으며, 당해기술분야에공지된임의의방법에따라제조될수있다. 이러한파낙스속식물로는인삼 (Panax ginseng), 화기삼 (Panax quinquefolia), 전칠삼 (Panax notoginseng), 죽절삼 (Panax japonica), 삼엽삼 (Panax trifolia), 히말라야삼 (Panax pseudoginseng), 베트남삼 (Panax vietnamensis), 또는이들의조합이이용될수있으나, 이에한정되는것은아니다. 바람직하게는인삼이사용될수있다. 상기진세노사이드 Re를포함하는파낙스속식물추출물은조추출물일수도있으며추가적인용매분획이나크로마토그래피에의해정제된정제물일수도있다. 따라서, 진세노사이드 Re를포함하는임의의파낙스속식물의물, C 1 -C 4 알콜, 또는이들의혼합물의조추출물 ; 그조추출물의 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, n-부탄올또는이들의혼합물의용매분획물 ; 또는그용매분획물의정제물일수있다. 상기물, C 1 -C 4 알콜, 또는이들의혼합물의조추출물은바람직하게는메탄올또는에탄올의조추출물이며, 추출시용매를식물분량의약 5 내지 15배첨가하여추출하는것이바람직하며, 약 10 배첨가하여추출하는것이더욱바람직하나이에한정하지않는다. 상기용매를가한후가열추출, 초음파추출, 환류추출등의통상의방법으로추출할수있으며, 바람직하게는초음파추출이이용될수있으나, 이에한정하지않는다. 추출시용매의온도는약 40 ~ 100 인것이바람직하며, 약 80 인것이더욱바람직하나이에한정하지않는다. 또한, 추출시간은약 2 ~ 4 시간이바람직하며, 약 3 시간이더욱바람직하나이에한정되지않는다. 아울러, 추출회수는 1 내지 5 회인것이바람직하며, 3 회반복추출하는것이더욱바람직하나이에한정되는것은아니다. 이러한방법에의하여얻어진조추출물을상기진세노사이드 Re를포함하는파낙스속식물추출물로서사용할수도있으나, 추가적으로상기조추출물을추가적으로유기용매로추출한용매분획물이이용될수도있다. 상기유기용매분획물은상기조추출물을메틸렌클로라이드, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 또는이들의혼합물등으로추출한분획물일수있으나, 이에한정되지않는다. [0032] 상기유기용매분획물을더욱정제한정제물을상기진세노사이드 Re를포함하는파낙스속식물추출물로서사용할수도있으며, 예를들어칼럼크로마토그래피에의해진세노사이드 Re를더욱정제할수있다. 상기컬럼크로마토그래피로서예를들어실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄 (Toyopearl) 및 XAD 수지로이루어진군으로부터선택된충진제를이용한컬럼크로마토그래피를수행하여, 상기진세노사이드 Re를분리및정제할수있다. 상기컬럼크로마토그래피는필요에따라적절한충진제를선택하여수차례실시할수있다. [0033] 상기마이얄형갈색화반응생성물의원료인진세노사이드 - 유래당은파낙스속식물중에함유된진세노사이드 의열처리에의해이탈되는당을의미한다. 구체적으로는, 도 1 에개시된진세노사이드의 R 3 에위치하는당일 수있으며, 예를들어글루코스 (glucose), 아라비노스 (arabinose), 자이로스 (Xylose), 또는이들의조합이있으 나이에한정되는것은아니며, 바람직하게는진세노사이드 Re 에서이탈된글루코스이다. 예를들어, 진세노사 - 7 -
이드 Re는 100 ~ 130 에서약 0.5 시간이상열처리가공시 20번위치의글루코스가이탈되는것으로알려져있다. 다른진세노사이드로부터당을이탈시키는방법은당해기술분야에공지된임의의방법에따라이루어질수있다. 이러한진세노사이드-유래당을아미노산과함께 100 ~ 130 에서약 0.5 ~ 12 시간동안반응시켜마이얄형갈색화반응이이루어지면, 항산화활성및신장세포보호활성이현저히우수해지는것으로나타났다. [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] 상기마이얄형갈색화반응생성물의원료인아미노산은마이얄형갈색화반응이이루어질수있는것으로알려진임의의아미노산이사용될수있으며, 예를들어글리신 (glycine), 알라닌 (Alanine), 시스테인 (Cysteine), 아스파르트산 (Aspartic acid), 글루탐산 (Glutamic acid), 페닐알라닌 (Phenylalanine), 히스티딘 (Histidine), 이소루신 (Isoleucine), 리신 (Lysine), 류신 (Leucine), 메티오닌 (Methionine), 아스파라긴 (Asparagine), 프롤린 (Proline), 글루타민 (Glutamine), 아르기닌 (Arginine), 세린 (Serine), 트레오닌 (Threonine), 셀레노시스테인 (Selenocysteine), 발린 (Valine), 트립토판 (Tryptophan), 티로신 (Tyrosine), 또는이들의조합이이용될수있으나, 이에한정되는것은아니다. 바람직하게는, 글리신 (glycine), 알라닌 (Alanine), 류신 (Leucine), 세린 (Serine), 또는이들의조합이이용될수있으나, 이에한정되는것은아니다. 상기아미노산의함량은상기마이얄형갈색화반응이충분히이루어질수있는양으로사용될수있으며, 예를들어진세노사이드혹은글루코스중량의 10% 내지 200% 의비율로반응시킬수있다. 상기본발명에따른조성물이유효성분으로함유하는마이얄형갈색화반응생성물은, 열처리가공에의해진세노사이드 Re가변환되어진세노사이드 Rg2, Rg6, F4를함유하는것으로확인되었다 ( 실험예 1). 열처리가공에의한갈색화반응동안프로토파낙사트리올계진세노사이드인 Re는도 3의반응과같은방식으로 20번위치에서글리코실잔기가이탈되어 Rg2가생성되고이어서 20번탄소위치에서탈수반응이일어나 Rg6와 F4이생성되는것으로추정된다. 또한, 상기이탈된글루코스는아미노산과반응하여마이얄형갈색화반응이일어나게된다. 이러한마이얄형갈색화반응에의한진세노사이드 Re의변환을도 3에도식적으로나타내었다. 도 3은본발명의일구현예에따라진세노사이드 Re를마이얄형갈색화반응을수행시진세노사이드 Re의화학구조의변환및분리된글루코스의갈색화반응의결과물을도시한것이다. 상기본발명의일구현예에따른조성물이함유하는진세노사이드 Re 또는진세노사이드 Re 유래글루코스의마이얄형갈색화반응생성물에대해 DPPH 라디칼소거활성을측정하였으며, 라디칼생성제인 AAPH로유도된신장독성에대해신장상피세포의손상을억제하는정도를평가하였다. DPPH(α-α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) 라디칼소거효과시험에서 DPPH는안정한자유라디칼로서그것의비공유전자로인해 517nm 부근에서최대흡수치를나타내며, 전자또는수소를받으면 517nm부근에서흡광도가감소하게되므로, 이러한흡광도감소율을측정함으로서항산화활성및활성산소를비롯한다른라디칼에대한소거활성을평가할수있다 (Hatano et al., Chem. Pharm. Bull., 38(5), pp1224-1229, 1990). 신장세포인 LLC-PK1 세포주는산화적손상을받기쉬우며, 라디칼생성제인 AAPH (2,2'-Azobis(1- aminopropane)dihydrochloride) 는산소분자와매우빠른속도로결합하여퍼옥실라디칼 (Peroxyl radical) 의생성과지질과산화를유발하여세포독성을일으킨다 (Miki et al., Arch. Biochem. Biophy., 258(2), 373-380, 1987). 이러한 AAPH를이용한 LLC-PK1세포주의산화적손상을이용하여신장보호활성을평가할수있다. 상기 DPPH 라디칼소거활성및 AAPH로유도된신장독성억제효과를평가한결과, 진세노사이드 Re 또는진세노사이드 Re 유래글루코스를본발명의일구현예에따라얻어진마이얄형갈색화반응생성물은진세노사이드 Re를단순히고온에서반응시킨생성물이나진세노사이드 Re의글리신과의혼합물에비해활성산소소거능력이현저히우수한것으로나타났을뿐만아니라 ( 실험예 2), 라디칼생성제인 AAPH로유도된신장독성에대해신장상피세포의손상을억제하는활성이현저히우수한것으로나타났다 ( 실험예 3). 따라서, 상기본발명에따른조성물은산화적스트레스가주원인이되어발생되는신장질환의예방, 개선또는치료에효과가있음이자명하다. 이러한신장질환은당해기술분야에산화적스트레스또는그에의한세포손상으로발생되는것으로알려진임의의신장질환일수있으며, 예를들어신장염, 신우염, 신증후군, 신장암, 급성신우신염, 만성신우신염, 신장결핵, 요로감염증, 요로결석, 요관결석, 급성신부전, 만성신부전, 당뇨병성신증, 만성사구체신염, 급성진행성신염, 네프로제증후군, 소상사구체경화증, 막성신증, 또는막성증식성사구체신염등이있지만, 이에한정되는것은아니다. 상기본발명의일구현예에따른조성물이함유하는진세노사이드 Re 유래글루코스의마이얄형갈색화반응생성물에대해항암제에의해유발된신장독성을억제하는정도를소변중의단백질양및혈액중의크레아티닌양을측정함으로써평가하였다. 그결과, 시스플라틴을글루코스및류신의마이얄형갈색화반응생성물과 - 8 -
함께투여한군의소변중단백질양은시스플라틴투여군에비하여약 70% 감소하여정상군의농도를나타내는것을확인하였으며, 크레아티닌혈액농도는시스플라틴투여군에비하여 25% 감소한것으로확인하였다. 상기결과에따르면, 진세노사이드 Re 유래글루코스의마이얄형갈색화반응생성물은항암제시스플라틴에의해유도된신장기능의감소를효과적으로개선함을알수있었으며, 이런결과들은마이얄형갈변화반응생성물이항암제에의해유도된신장손상을보호해줄수있다는것을의미한다. [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] 따라서, 상기본발명에따른조성물은항암제의투여가주원인이되어발생되는신장질환의예방, 개선또는치료에효과가있음이자명하다. 상기항암제는메토트렉세이트 (MTX), 5-플루오로우라실 (5-FU), 6-머캅토퓨린 (6-MP), 또는 6-티오구아닌 (6-TG) 을포함한항대사성항암제 ; 독소루비신, 도노루비신과같은안트라사이클린계항생제, 또는블레오마이신을포함한항생제성항암제 ; 탁솔또는온코빈 (oncovin) 을포함한마이크로튜블인히비터 ; 프레드시솔론을포함한스테로이드계항암제 ; 백금항암제또는질소머스타드계를포함한알킬화제항암제등이있으나, 이에한정되는것은아니다. 일구현예에따르면, 상기항암제는백금항암제이며, 백금항암제로는시스플라틴, 카르보플라틴등이있으나, 이에한정되는것은아니다. 상기신장질환은당해기술분야에항암제에의한부작용으로서발생되는것으로알려진임의의신장질환일수있으며, 예를들어신장염, 신우염, 신증후군, 신장암, 급성신우신염, 만성신우신염, 신장결핵, 요로감염증, 요로결석, 요관결석, 급성신부전, 만성신부전, 당뇨병성신증, 만성사구체신염, 급성진행성신염, 네프로제증후군, 소상사구체경화증, 막성신증, 또는막성증식성사구체신염등이있지만, 이에한정되는것은아니다. 상기본발명에따른약학조성물은당해기술분야에공지되어있는통상적인약제학적제형으로제제화될수있다. 상기약제학적제형은경구투여제제, 주사제, 좌제, 경피투여제제, 및경비투여제제를포함하지만, 이에한정되지않는임의의제형으로제제화되어투여될수도있으나, 바람직하게는액제, 유제, 현탁제, 엑스제, 또는시럽제와같은액상제제및산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 또는환제와같은고형제제를포함한경구투여용제형으로제제화될수있다. 상기각각의제형으로제제화시, 각각의제형의제조에필요한약제학적으로허용가능한부형제또는첨가제를부가하여제조할수있다. 대표적으로경구투여용고형제제로제제화시상기부형제로서희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및방부제중에서 1 종이상을선택하여사용할수있다. 상기부형제는약제학적으로허용가능한것은모두가능하며, 구체적으로희석제로는유당, 옥수수전분, 대두유, 미정질셀룰로오스, 또는만니톨, 활택제로는스테아린산마그네슘또는탈크, 결합제로는폴리비닐피롤리돈또는히드록시프로필셀룰로오스가바람직하다. 또한, 붕해제로는카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는크로스포비돈이바람직하다. 경구투여용액상제제로제제화시흔히사용되는단순희석제인물, 리퀴드파라핀이외에여러가지부형제, 예를들면습윤제, 감미제, 방향제및보존제등이포함될수있다. 상기감미제로는백당, 과당, 솔비톨, 또는아스파탐, 안정제로는카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 백납, 또는잔탄검, 보존제로는파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는솔빈산칼륨이바람직하다. 또한, 고형및액상경구제제의첨가제로는향료, 비타민류, 및항산화제중에서 1 종이상을선택하여사용할수있다. 상기성분이외에도공지의첨가제로서미각을돋구기위하여, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향등의천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드등의천연색소, 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕과같은감미성분, 또는구연산, 구연산나트륨과같은산미제를혼합하여사용할수도있다. 상기통상적인약제학적제형은당해기술분야에공지되어있는통상적인방법에따라당업자가적절한제조할수있으며, Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company Easton, Pennsylvania 19042 (Chapter 87; Blaug, Seymour) 을참조할수있다. 상기약학조성물은상기신장질환을예방또는치료하기위하여유효성분으로서성인을기준으로 1 일총투여량이상기마이얄형갈색화반응생성물을약 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg, 바람직하게는약 1 mg/kg 내지 1 g/kg, 이되도록임의로수회나누어서투여할수있다. 상기투여량은투여경로, 질병의진행정도, 성별, 나이, 체중등에따라, 또는전문가의임상적판단에따라적절히증감될수있다. 상기본발명에따른약학조성물은신장질환예방또는치료를위하여단독으로, 또는수술, 호르몬치료, 화학치료및생물학적반응조절제를사용하는방법들과병용하여사용할수있다. 상기본발명에따른건강기능식품용조성물은당해기술분야에공지되어있는통상적인건강기능식품의제형으로제제화될수있다. 상기건강기능식품은예를들어산제, 과립제, 정제, 환제, 캅셀제, 현탁액, 유제, 시럽제, 침제, 액제, 엑스 - 9 -
제등의일반적인제형으로제조될수도있고, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타면류, 껌류, 젤리, 아이스크림류를포함한낙농제품, 각종스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜음료및비타민복합제등의임의의건강식품형태로제조될수도있다. 상기건강식품의제제화를위해식품학적으로허용가능한담체또는첨가제를사용할수있으며, 제조하고자하는제형의제조에당해기술분야에서사용가능한것으로공지되어있는임의의담체또는첨가제가이용될수있다. 상기첨가제로서각종영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산및그의염, 알긴산및그의염, 유기산, 보호성콜로이드증점제, ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에사용되는탄산화제등을함유할수있다. 그이외에도천연과일쥬스, 과일쥬스음료및야채음료의제조를위한과육을함유할수있다. 이러한첨가제성분은독립적으로또는조합하여사용할수있으며, 첨가제의비율은크게중요하진않지만본발명의조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의범위에서선택될수있다. [0050] [0051] 상기건강기능식품용조성물은상기본발명에따른조성물을구성하는마이얄형갈색화반응생성물의함량을사용목적 ( 예방또는개선 ) 에따라적합하게결정될수있다. 일반적으로, 전체식품중량의 0.01 내지 15 중량 % 로포함할수있으며, 음료로서제조될경우 100 ml를기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g 의비율로함유할수있다. 상기음료는상기활성성분이외의다른성분을더포함할수있으며, 통상적으로음료에사용되는다양한향미제또는천연탄수화물등을더함유할수있다. 상기천연탄수화물로는단당류 ( 예 : 포도당, 과당등 ), 이당류 ( 예 : 말토즈, 수크로즈등 ), 다당류 ( 예 : 덱스트린, 시클로덱스트린등 ) 와같은통상적인당및자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨등의당알콜이함유될수있다. 또한, 향미제로서천연향미제 ( 예 : 타우마틴, 스테비아추출물등 ) 및합성향미제 ( 예 : 사카린, 아스파탐등 ) 를함유할수있다. 상기천연탄수화물의비율은음료 100 ml당일반적으로약 1 내지 20g, 바람직하게는약 5 내지 12g으로함유되는것이바람직하다. [0052] 발명의효과앞서설명한바와같이, 본발명에따른진세노사이드 Re, 진세노사이드 Re를포함하는파낙스속식물추출물, 또는글루코스의아미노산과의마이얄형갈색화반응생성물은활성산소소거능력이현저히우수하고, 산화적스트레스에의한신장상피세포손상을억제하는활성이현저히우수한것으로나타났으므로, 신장질환의예방, 개선, 또는치료에효과적으로사용될수있다. 또한, 상기조성물은과거오랫동안사용되어안전성이확립된식물생약의성분을원료로함으로써부작용의우려없이장기간사용할수있는장점이있다. [0053] 도면의간단한설명 도 1 은파낙스속식물에함유되어있는담마란계사포닌의분류, 명칭및구조를표로정리한것이다. 도 2는열처리가공에의해진세노사이드인 Rb1과 Rb2의화합물의화학구조가변화하는과정을나타낸반응식이다. 도 3은본발명의일구현예에따라진세노사이드 Re를마이얄형갈색화반응을수행시진세노사이드 Re의화학구조의변환및분리된글루코스의갈색화반응의결과물을도시한것이다. 도 4는본발명의일구현예에따른진세노사이드 Re와아미노산의마이얄형갈색화반응의반응물및생성물각각의사포닌성분을분석한결과얻어진 HPLC 크로마토그램이다. 도 5는진세노사이드 Re를 120 에서단순고온반응시킬경우반응전후의 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. 도 6은발명의일구현예에따른진세노사이드 Re와글리신의마이얄형갈색화반응의반응물및생성물각각에대해 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. 도 7은발명의일구현예에따른진세노사이드-유래글루코스와글리신의마이얄형갈색화반응의반응물및생성물각각에대해 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. 도 8은발명의일구현예에따른진세노사이드 Re와류신의마이얄형갈색화반응의반응물및생성물각각에대해 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. 도 9는발명의일구현예에따른진세노사이드-유래글루코스와류신의마이얄형갈색화반응의반응물및생성물각각에대해 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. - 10 -
도 10은발명의일구현예에따른진세노사이드 Re와세린의마이얄형갈색화반응의반응물및생성물각각에대해 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. 도 11은발명의일구현예에따른진세노사이드-유래글루코스와세린의마이얄형갈색화반응의반응물및생성물각각에대해 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. 도 12는발명의일구현예에따른진세노사이드 Re와알라닌의마이얄형갈색화반응의반응물및생성물각각에대해 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. 도 13은발명의일구현예에따른진세노사이드-유래글루코스와알라닌의마이얄형갈색화반응의반응물및생성물각각에대해 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. 도 14는글루코스와류신의마이얄형갈색화반응생성물을투여한후, 소변중의단백질양을측정한결과를도시한그래프이다 (Control: 정상군, Cisplatin : 시스플라틴투여군, Cisplatin + Glu-Leu : 시스플라틴 + 글루코스와류신의마이얄형갈색화반응생성물투여군 ). 도 15는글루코스와류신의마이얄형갈색화반응생성물을투여한후, 혈액중의크레아티닌양을측정한결과를도시한그래프이다 (Control: 정상군, Cisplatin : 시스플라틴투여군, Cisplatin + Glu-Leu : 시스플라틴 + 글루코스와류신의마이얄형갈색화반응생성물투여군 ). [0054] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하, 본발명을하기실시예에의해더욱구체적으로설명한다. 그러나, 이들실시예는본발명에대한이해를 돕기위한것일뿐, 어떤의미로든본발명의범위가이들에의해제한되는것은아니다. [0055] [0056] < 실시예 1> 진세노사이드 Re를포함하는인삼추출물의제조본발명에서사용된인삼은금산인삼시장한약재상에서구입하여사용하였다. 세절된인삼 200 g에 50% 에탄올 (1.5 L) 을넣고 70 에서 3시간환류추출하여 50% 에탄올추출물을수득하고, 수득한 50% 에탄올추출물을감압하에서용매를증발건조하여진세노사이드 Re를포함하는건조추출물 (27 g) 을수득하였다. [0057] [0058] < 실시예 2> 진세노사이드 Re의분리진세노사이드 Re는상기실시예 1에의해제조된 50% 에탄올추출물을실리카겔컬럼 (silica gel column) 법과반분취 (semi-preparative) HPLC 법을사용해분리및정제하였다. 상기실시예 1과같이추출하여수득한 50% 에탄올추출물 20g을물에현탁하여 1L 크기의유리용기에 100 g 의비극성 DIAION HP 20 수지와함께교반하였다. 수지를정제수로 3회세척후메틸알코올로용출하여얻은메틸알코올분획을감압건조하여사포닌분획 1.9 g을얻었다. 이사포닌분획을헥산 : 에틸아세테이트 (10:1 5:1 1:1) 용매조건하에서실리카겔컬럼을실시하였으며, 진세노사이드 Re 함유분획만을분취하고수집, 농축하였다. 진세노사이드 Re의함량이 50% 이상인분획물을반분취 (semi-preparative) HPLC를이용하여, 이동상 (water : CH 3 CN) 을 40 : 60로부터시작하여 40 분후 0 : 100 이되도록용출하여 50 mg 의순수한진세노사이드 Re 를수득하였다. [0059] [0060] [0061] < 실시예 3> 진세노사이드 Re 또는진세노사이드 Re-유래당과아미노산의마이얄형갈변화반응생성물의제조상기실시예 2에서얻어진진세노사이드 Re 혹은진세노사이드 Re-유래글루코스와아미노산을이등의방법 (Lee et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 18(16), 4515-4520, 2008) 에의하여열처리가공하였다. 상기진세노사이드 Re-유래글루코스는이등의문헌 (Lee et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 18(16), 4515-4520, 200 8) 에서시약으로판매중인글루코스와구조가동일함에밝혀졌으므로씨그마알드리치코리아 ( 유 ) 에서구입하여사용하였다. 구체적으로는, 상기진세노사이드 Re 20 mg 또는글루코스 48 mg을글리신 20 mg, 류신 20 mg, 세린 20 mg, 또는알라닌 20 mg과함께가압멸균기에서 120 로 3시간가열한후, 동결건조하여마이얄형갈색화반응생성물을수득하였다. 이러한마이얄형갈색화반응을수행시, 진세노사이드 Re의화학구조의변환및분리된글루코스의갈색화반응의결과물을도 3에나타내었다. - 11 -
[0062] 진세노사이드 Re 의열처리가공에의해유리된 20 번탄소의당인글루코스는글리신, 류신, 세린, 또는알라닌 과마이얄형갈색화반응을일으켜도 3 에나타난바와같이갈변반응생성물이생성되었다. [0063] [0064] < 비교예 1> 진세노사이드 Re 의단순고온처리물의제조 상기실시예 3 에서진세노사이드 Re 에아미노산을가하지않는것만을제외하고는동일한방법으로진세노사이 드 Re 를 120 에서고온처리한생성물을획득하였다. [0065] [0066] [0067] [0068] < 실험예 1> 마이얄형갈색화반응생성물의분석 1-1. 실험방법진세노사이드 Re, Rg2, Rg6, F4 표준액을대조로하여문헌의방법 (Kwon et al., J. Chromatogr. A, 921(2), 335-339, 2001) 에의하여 HPLC로상기실시예 3에서의진세노사이드 Re와글리신의마이얄형갈색화반응의반응전후의사포닌성분을분석하였다. 용출용매인물 (H 2 O) 과아세토니트릴 (CH 3 CN) 은 0.45μm멤브레인필터 (membrane filter) 를통해필터링한후 2 개 의펌프를이용하여각각펌핑하여사용하였다. 상기표준용액 10 μl를시린지 (syringe) 를이용하여분리컬럼인역상컬럼 (C18 column, 4.6 X 150 mm, 5 μm) 에주입시키고, 30부피 % 의아세토니트릴, 70부피 % 의물의조성을갖는용출용매를 1ml / 분의유속으로흘렸다. 그후, 아세토니트릴의부피 % 가 40분이내에 100% 가되도록변화시켰고, 100부피 % 의아세토니트릴의조성을 15분동안더유지시켰다. 상기과정후컬럼에서분리된각성분을증기화광산란검출기 (ELSD) 를통하여도 4의피크를얻었다. [0069] 도 4는본발명의일구현예에따른진세노사이드 Re와글리신의마이얄형갈색화반응의반응전후의각각의사포닌성분을분석한결과얻어진 HPLC 크로마토그램이다. 또한, 진세노사이드 Re와류신또는세린또는알라닌의마이얄형갈색화반응의반응전후의각각의사포닌성분을분석한결과, 도 4와유사한패턴을갖는것으로나타났다. [0070] [0071] 1-2. 실험결과도 4에따르면, 진세노사이드 Re는아미노산과함께 120 의열처리가공에의해 20 번위치의당인글루코스가이탈되어 Rg2, Rg6, F4로변환되는것으로나타났다. 따라서, 진세노사이드 Re는도 3에나타낸바와같은구조의변환을나타내는것으로확인되었다. [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] < 실험예 2> 항산화활성평가 2-1. 실험방법 DPPH라디칼소거능은 Hatano등의방법을변형하여실시하였다 (Hatano et al., Chem. Pharm. Bull., 38(5), pp1224-1229, 1990). 각시료용액 100μL에 60μM의 DPPH(α-α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) 100μL를넣고교반한후 30분간방치한다음 540nm에서흡광도를측정하였다. 항산화활성 ( 전자공여능 ) 은시료용액의실험군와대조군의흡광도감소율을측정하여확인하였다. 2-2. 실험결과상기비교예 1에서제조한진세노사이드 Re의단순고온처리물과상기실시예 3에서제조한진세노사이드 Re의글리신과의갈색화반응생성물의반응전후의물질에대해 DPPH 라디칼소거활성을측정하였다. 그결과를도 5 내지도 13에나타내었다. 도 5는진세노사이드 Re를 120 에서단순고온반응시킬경우반응전후의 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. 도 6은발명의일구현예에따른진세노사이드 Re와글리신의마이얄형갈색화반응의반응물및생성물각각에대해 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. - 12 -
[0079] [0080] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] 도 7은발명의일구현예에따른진세노사이드-유래글루코스와글리신의마이얄형갈색화반응의반응물및생성물각각에대해 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. 도 8은발명의일구현예에따른진세노사이드 Re와류신의마이얄형갈색화반응의반응물및생성물각각에대해 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. 도 9는발명의일구현예에따른진세노사이드-유래글루코스와류신의마이얄형갈색화반응의반응물및생성물각각에대해 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. 도 10은발명의일구현예에따른진세노사이드 Re와세린의마이얄형갈색화반응의반응물및생성물각각에대해 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. 도 11은발명의일구현예에따른진세노사이드-유래글루코스와세린의마이얄형갈색화반응의반응물및생성물각각에대해 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. 도 12는발명의일구현예에따른진세노사이드 Re와알라닌의마이얄형갈색화반응의반응물및생성물각각에대해 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. 도 13은발명의일구현예에따른진세노사이드-유래글루코스와알라닌의마이얄형갈색화반응의반응물및생성물각각에대해 DPPH 라디칼소거능을측정한결과를도시한그래프이다. 도 5, 도 6 및도 7에따르면, 진세노사이드 Re와 Re를 120 에서단순히열처리가공한생성물은활성산소소거능력이미약하였다. 이에반해, 진세노사이드 Re와글리신의마이얄형갈색화반응의생성물은반응전의 Re 와글리신의단순혼합물에비해농도의존적으로탁월한 DPPH 라디칼소거능을나타내었다. 또한진세노사이드 Re의열처리에의해 Re로부터유리되는당인글루코스와글리신을 120 에서열처리하여얻어진마이얄형갈색화반응생성물은진세노사이드 Re을단순히열처리가공한생성물에비해농도의존적으로탁월한 DPPH 라디칼소거능을나타내었다. 도 5, 도 8 및도 9에따르면, 진세노사이드 Re와류신의마이얄형갈색화반응의생성물은반응전의 Re와류신의단순혼합물에비해농도의존적으로탁월한 DPPH 라디칼소거능을나타내었다. 또한진세노사이드 Re의열처리에의해 Re로부터유리되는당인글루코스와류신을 120 에서열처리하여얻어진마이얄형갈색화반응생성물은진세노사이드 Re를단순히열처리가공한생성물에비해농도의존적으로탁월한 DPPH 라디칼소거능을나타내었다. 도 5, 도 10 및도 11에따르면, 진세노사이드 Re와세린의마이얄형갈색화반응의생성물은반응전의 Re와세린의단순혼합물에비해농도의존적으로탁월한 DPPH 라디칼소거능을나타내었다. 또한진세노사이드 Re의열처리에의해 Re로부터유리되는당인글루코스와세린을 120 에서열처리하여얻어진마이얄형갈색화반응생성물은진세노사이드 Re를단순히열처리가공한생성물에비해농도의존적으로탁월한 DPPH 라디칼소거능을나타내었다. 도 5, 도 12 및도 13에따르면, 진세노사이드 Re와알라닌의마이얄형갈색화반응의생성물은반응전의 Re와알라닌의단순혼합물에비해농도의존적으로탁월한 DPPH 라디칼소거능을나타내었다. 또한진세노사이드 Re의열처리에의해 Re로부터유리되는당인글루코스와알라닌을 120 에서열처리하여얻어진마이얄형갈색화반응생성물은진세노사이드 Re를단순히열처리가공한생성물에비해농도의존적으로탁월한 DPPH 라디칼소거능을나타내었다. 따라서, 본발명에따른조성물은탁월한전자공여능을갖는것으로확인되었다. [0091] [0092] [0093] [0094] < 실험예 3> 신장세포보호활성평가 3-1. 실험방법문헌에보고된방법 (Yokozawa et al., Food Chem., 48, pp5068-5073, 2000) 을참조하여신장세포 (LLC-PK1) 를사용하여신장독성에대한보호효과를다음과같이평가하였다. 먼저, LLC-PK1 세포를 5% 소태아혈청 (fetal bovine serum;gibco BRL Life Technologies), 페니실린 G 50 유닛 /ml(gibco BRL Life Technologies) 및스트렙토마이신 (streptomycin; Gibco BRL Life Technologies) 50 ㅅ g/ml을가한 DMEM/F12(Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, NY, USA) 배지를사용하여 37 가유지된 - 13 -
95% 공기 /5% 이산화탄소배양기에서배양하였다. 배양된 LLC-PK1 세포를 96-웰배양플레이트에 10 4 개씩도입하고 2시간동안세포가안정되도록하였다. 그후, 샘플과라디칼발생시약 ( 배지에녹인 10 mm AAPH) 을첨가하여 24 시간배양한후 50 μl의 MTT(1 mg/ml) 시약을각웰 (well) 에첨가후, 37 에서배양하였다. 4 시간후 MTT를포함한배지를제거하고, 디메틸설폭시드 (dimethylsulfoxide) 를 100 μl첨가하여 SPECTRAmax 340PC (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 마이크로플레이트리더 (microplate reader) 에서 540 nm 검출파장을이용하여흡광도를측정하여세포의생존율을측정하였다. [0095] [0096] [0097] 3-2. 실험결과 1 상기실시예 2에서얻어진진세노사이드 Re, 2 비교예 1에서얻어진진세노사이드 Re의단순고온처리물, 34상기실시예 3의진세노사이드 Re와글리신의마이얄형갈색화반응의반응물3 및생성물4, 5 상기실시예 3의글루코스및글리신의마이얄형갈색화반응생성물, 그리고 6 양의대조군으로서아미노구아니딘을샘플로서사용하여실험한결과를하기표 1에나타내었다. 하기표 1의결과에따르면, LLC-PK1 세포수는 10 mm AAPH 처리로 AAPH 비처리군의 71.7% 까지감소하였다. 진세노사이드 Re는고농도에서이런세포손상을억제하는것으로나타났으며, 120 에서열처리가공한 Re는더욱강한신장보호활성을보였다. 특히, Re와글리신의단순혼합물은신장보호활성이매우미약하게나타났으나, Re와글리신을함께 120 에서반응시킨마이얄형갈색화반응생성물은 10μg /ml의농도에서 AAPH에의해감소한세포수를 97.6% 까지향상시켰다. 또한 Re의열처리에의해 Re로부터유리되는당인글루코스와글리신을 120 에서열처리하여얻어진마이얄형갈색화반응생성물은 10 μg /ml의농도에서 AAPH에의한신장세포의손상을 100% 이상유의적으로회복시켰으며, 이효과는당뇨병성신증치료제인아미노구아니딘 (Aminoguanidine) 보다월등히탁월한것이다. - 14 -
표 1 [0098] [0099] [0100] 78상기실시예 3의진세노사이드 Re와류신의마이얄형갈색화반응의반응물7 및생성물8, 9 상기실시예 3의글루코스및류신의마이얄형갈색화반응생성물, 1011상기실시예 3의진세노사이드 Re와류신의마이얄형갈색화반응의반응물10 및생성물11, 12 상기실시예 3의글루코스및류신의마이얄형갈색화반응생성물, 그리고 1314상기실시예 3의진세노사이드 Re와류신의마이얄형갈색화반응의반응물13 및생성물14, 15 상기실시예 3의글루코스및류신의마이얄형갈색화반응생성물을실험한결과를하기표 2에나타내었다. 하기표 2의결과에따르면, LLC-PK1 세포수는 10 mm AAPH 처리로 AAPH 비처리군의 77.4% 까지감소하였다. 진세노사이드 Re와류신의단순혼합물은신장보호활성이매우미약하게나타났으나, Re와류신을함께 120 에서반응시킨마이얄형갈색화반응생성물은 10μg /ml의농도에서 AAPH에의해감소한세포수를 96.3% 까지향상시켰다. 또한 Re의열처리에의해 Re로부터유리되는당인글루코스와류신을 120 에서열처리하여얻어진마이얄형갈색화반응생성물은 10 μg /ml의농도에서 AAPH에의한신장세포의손상을 90% 이상유의적으로회복시켰다. 다음으로, 진세노사이드 Re와세린의단순혼합물은신장보호활성이매우미약하게나타났으나, Re 와세린을함께 120 에서반응시킨마이얄형갈색화반응생성물은 10μg /ml의농도에서 AAPH에의해감소한세포수를 93.6% 까지향상시켰다. 또한 Re의열처리에의해 Re로부터유리되는당인글루코스와세린을 120 에서열처리하여얻어진마이얄형갈색화반응생성물은 10 μg /ml의농도에서 AAPH에의한신장세포의손상을 90% 이상유의적으로회복시켰다. 다음으로, 진세노사이드 Re와알라닌의단순혼합물은신장보호활성이매우미약하게나타났으나, Re와알라닌을함께 120 에서반응시킨마이얄형갈색화반응생성물은 10μg /ml의농도에 - 15 -
서 AAPH 에의해감소한세포수를 93.1% 까지향상시켰다. 또한 Re 의열처리에의해 Re 로부터유리되는당인글 루코스와알라닌을 120 에서열처리하여얻어진마이얄형갈색화반응생성물은 10 μg /ml 의농도에서 AAPH 에 의한신장세포의손상을 99.2% 까지향상시켰다. 표 2 [0101] [0102] 상기결과에따르면, 진세노사이드 Re와글리신, 류신, 세린, 또는알라닌을 120 에서열처리가공한마이얄형갈색화반응생성물, 및글루코스와글리신, 류신, 세린, 또는알라닌을 120 에서열처리가공한마이얄형갈색화반응생성물은진세노사이드 Re 보다효과적으로 AAPH에대한신장세포손상을보호함을알수있었으며. 이런결과들은담마란계진세노사이드 Re 또는글루코스와아미노산의마이얄형갈변화반응생성물이산화적스트레스로부터야기되는신장세포손상을보호해줄수있다는것을의미한다. [0103] [0104] [0105] < 실험예 4> 항암제에의해유발되는신장독성질환보호효과평가 4-1. 실험방법 - 16 -
[0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] 문헌에보고된방법 (Sahu et al., Food Chem. Toxicol., 49, pp3090-3097, 2011) 을참조하여 Sprague-Dawley 숫쥐를사용하여항암제인시스플라틴 (cisplatin) 의신장독성에대한보호효과를다음과같이평가하였다. 실험동물은체중 170 190 g의 Sprgue-Dawley 숫쥐를사용하였다. 전체실험과정은한국과학기술연구원의실험동물사용윤리규정에관한지침을준수하였다. 시스플라틴신장독성을유발하기위하여복강내로시스플라틴 7.5 mg/kg를 1회주사하였다. 시스플라틴주사 6 일전부터그리고 4 일후까지총 10 일간상기실시예 3의글루코스와류신의마이얄형갈색화반응생성물을 0.5 중량 % 의농도로먹는물에섞어먹였다. 10 일간의마이얄형갈색화물질투여가끝난후, 신장기능을측정하기위해동물을대사상자에넣고 24 시간소변을채취하여뇨중단백질을측정하고, 마취하에개복후혈액을채취하여혈청크레아티닌을측정하였다. 뇨중단백질은 COMBOSTIK-2GP 뇨검사지 ( 디에프아이, 한국 ) 를사용하여비색법으로측정하였으며, 혈중크레아티닌농도는 creatinine 시약 (Roche, USA) 으로 hitachi modular(japan) 기기를사용하여 Rate blank Jaffe Kinetic 방법으로측정하였다. 4-2. 실험결과상기실시예 3에서얻어진글루코스와류신의마이얄형갈색화반응생성물을샘플로서사용하여실험한결과를도 14 및도 15에나타내었다. 도 14는글루코스와류신의마이얄형갈색화반응생성물을투여한후, 소변중의단백질양을측정한결과를도시한그래프이다. 도 15는글루코스와류신의마이얄형갈색화반응생성물을투여한후, 혈액중의크레아티닌양을측정한결과를도시한그래프이다. 도 14 및도 15에따르면, 시스플라틴을글루코스및류신의마이얄형갈색화반응생성물과함께투여한군의소변중단백질양은시스플라틴투여군에비하여약 70% 감소하여정상군의농도를나타내는것을확인하였으며, 크레아티닌혈액농도는시스플라틴투여군에비하여 25% 감소한것으로확인하였다. 상기결과에따르면, 글루코스와류신의마이얄형갈색화반응생성물은항암제시스플라틴에의해유도된신장기능의감소를효과적으로개선함을알수있었으며, 이런결과들은마이얄형갈변화반응생성물이항암제에의해유도된신장손상을보호해줄수있다는것을의미한다. [0114] 본발명의조성물을위한제제예를하기예시한다. 활성성분으로서상기실시예 3 에서제조한진세노사이드 Re 또는진세노사이드 Re 에서이탈된당과아미노산의마이얄형갈색화반응생성물을사용할수있다. [0115] [0116] < 제제예 1> : 약학적제제의제조 1. 산제의제조 [0117] [0118] 활성성분 유당 1 g 2 g [0119] 상기의성분을혼합하고기밀포에충진하여산제를제조하였다. [0120] [0121] 2. 정제의제조 활성성분 100 mg [0122] [0123] [0124] 옥수수전분 유당 스테아린산마그네슘 100 mg 100 mg 2 mg [0125] 상기의성분을혼합한후, 통상의정제의제조방법에따라서타정하여정제를제조하였다. - 17 -
[0126] [0127] 3. 캡슐제의제조 활성성분 100 mg [0128] [0129] [0130] 옥수수전분 유당 스테아린산마그네슘 100 mg 100 mg 2 mg [0131] 상기의성분을혼합한후, 통상의캡슐제의제조방법에따라서젤라틴캡슐에충전하여캡슐제를제조하였다. [0132] [0133] 4. 환의제조 활성성분 1 g [0134] [0135] [0136] 유당 글리세린 자일리톨 1.5 g 1 g 0.5 g [0137] [0138] [0139] 상기의성분을혼합한후, 통상의방법에따라 1 환당 4 g 이되도록제조하였다. 5. 과립의제조 활성성분 150 mg [0140] [0141] [0142] 대두추출물 포도당 전분 50 mg 200 mg 600 mg [0143] [0144] [0145] [0146] [0147] [0148] [0149] [0150] [0151] [0152] [0153] [0154] [0155] [0156] 상기의성분을혼합한후, 30% 에탄올 100 mg을첨가하고섭씨 60 에서건조하여과립을형성한후포에충진하였다. < 제제예 2> : 건강식품의제조 1. 토마토케찹및소스의제조활성성분 0.2~1.0 중량부를토마토케찹또는소스에첨가하여건강증진용토마토케찹또는소스를제조하였다. 2. 밀가루식품의제조활성성분 0.5~5.0 중량부를밀가루에첨가하고, 이혼합물을이용하여빵, 케이크, 쿠키, 크래커및면류를제조하여건강증진용식품을제조하였다. 4. 스프및육즙 (gravies) 의제조활성성분 0.1~5.0 중량부를스프및육즙에첨가하여건강증진용육가공제품, 면류의수프및육즙을제조하였다. 5. 그라운드비프 (ground beef) 의제조활성성분 10 중량부를그라운드비프에첨가하여건강증진용그라운드비프를제조하였다. 6. 유제품 (dairy products) 의제조활성성분 5~10 중량부를우유에첨가하고, 상기우유를이용하여버터및아이스크림과같은다양한유제품을제조하였다. 7. 선식의제조현미, 보리, 찹쌀, 율무를공지의방법으로알파화시켜건조시킨것을배전한후분쇄기로입도 60 메쉬의분말로제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도공지의방법으로쪄서건조시킨것을배전한후분쇄기로입도 60 메 - 18 -
쉬의분말로제조하였다. 활성성분을진공농축기에서감압농축하고, 분무, 열풍건조기로건조하여얻은건조물 을분쇄기로입도 60 메쉬로분쇄하여건조분말을얻었다. [0157] [0158] [0159] [0160] [0161] [0162] [0163] [0164] [0165] 상기에서제조한곡물류, 종실류및실시예 <1-2> 의추출물의건조분말을다음의비율로배합하여제조하였다. 곡물류 ( 현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부 ), 종실류 ( 들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부 ), 실시예 <1-2> 의추출물에서분리한화합물의건조분말 (3 중량부 ), 영지 (0.5 중량부 ), 지황 (0.5 중량부 ) < 제제예 3> : 건강음료의제조 1. 건강드링크의제조활성성분 1000 mg [0166] 구연산 1000 mg [0167] [0168] [0169] 올리고당 매실농축액 타우린 100 g 2 g 1 g [0170] 정제수를가하여전체 900 ml [0171] [0172] [0173] [0174] [0175] [0176] [0177] 통상의건강음료제조방법에따라상기의성분을혼합한다음, 약 1시간동안 85 에서교반가열한후, 만들어진용액을여과하여멸균된 2 l용기에취득하여밀봉멸균한뒤냉장보관한다음본발명의건강음료조성물제조에사용한다. 상기조성비는비교적기호음료에적합한성분을바람직한실시예로혼합조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도등지역적, 민족적기호도에따라서그배합비를임의로변형실시하여도무방하다. 2. 야채쥬스의제조활성성분 5 g을토마토또는당근쥬스 1,000 ml에가하여건강증진용야채쥬스를제조하였다. 3. 과일쥬스의제조활성성분 1 g을사과또는포도쥬스 1,000ml에가하여건강증진용과일쥬스를제조하였다. 이상으로본발명내용의특정한부분을상세히기술하였는바, 당업계의통상의지식을가진자에게있어서, 이러한구체적기술은단지바람직한실시양태일뿐이며, 이에의해본발명의범위가제한되는것이아닌점은명백할것이다. 따라서본발명의실질적인범위는첨부된청구항들과그것들의등가물에의하여정의된다고할것이다. - 19 -
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