연구목적 친환경적인전지를개발해배터리매립지와같은환경파괴적인시설의제거를목표로하고, 이와관련된다양한연구주제를모색한뒤가장유력한주제인유산균발효젖산을이용한전지개발로주제선정하였다. 이후외부전문가의자문에따라그의하위주제로파생되는유산균의생물학적효용성탐구를연구계획에추가보강하였다. 연구범위 기존발효환경에서서식하는균중산을내는종을탐색하였다. 충분한산을부산물로내는균, 그중에 Leuconostoc종 (Kimchi I, Gasicomitatum, Citreum) 과 Lactobacillus종 (Paraplantanum, Casei, Plantarum) 의증식과산의생성을관찰하고비교한다. 이전의유산균배양배지와는달리, 주변에서쉽게볼수있는폐기물형태의배추로배지를제작해새로운에너지를창출하는방안을제시한다. 유산균배양이이루어지고균을다시사용할시의면역학적효용성을검증하여낭비되는자원이없는전지생산과정을제시한다. 2. 연구수행내용 이론적배경및선행연구 발효과정 -homolactic fermentation( 호모발효 ) C 6 H 12 O 6 2 CH 3 CH(OH)COOH Lactobacillus의대부분이호모발효를한다. -heterolactic fermentation( 헤테로발효 ) C 6 H 12 O 6 CH 3 CH(OH)COOH + C 2 H 5 OH + CO 2 Leuconostoc의대부분이헤테로발효를한다. - 2 -
면역세포의암에대한반응 암에대한면역세포의반응은다양하지만그중대식세포만의반응을정리 하자면다음그림과같게된다. 암세포 B 세포 3. 종양괴사인자 (TNF) 분비 à 파괴 1. 종양항원으로취급 4. 항체생성 à 섭식작용활발히 다른면역세포 세포독성 ( 킬러 )T 세포 (T c ) 2. 활성화 대식세포 3. 인터루킨 -1 (IL-1) 분비 다른면역세포 그림 2 대식세포의반응 이때대식세포는사이토카인을만들게된다. 연구주제의선정 3월 18일교내 R&E 아이디어를구상하기위해오후동안모였다. 팀원 3명이서각자여러아이디어를구상한뒤에서울대박사과정을하신김태훈선생님께자문을구하였다. 가장유력한연구주제를선정하고, 이후서울대연구실에서외부전문가정가진교수님으로부터조언을들었다. 연구방법 산전지의원리를이해했으나산전지가전류가흐른다는것을확인할필요가있었다. 그에따라아세트산과과산화수소를전해질과감극제로, 구리와알루미늄은전극으로활용해서볼타전지를만들어확인하였다. 유산균발효를위해서유산균을접종하고배양하는방법을알아야했다. 그에따라서서울대연구실을방문해루프를이용한접종, Agar plate 활용법, 배지의구성요소, 균의 3차 Streaking 과균의 Spreading - 3 -
방법을익혔다. 다양한유산균이증식하면서나타나는 ph 변화를측정하여낮은 ph를보이는유산균을선별하였다. 가장낮은 ph를보이는것으로선정된균 2종 (Leuconostoc gasicomitatum, Lactobaccilus casei) 을토대로대조군 3개 (MRS, GYP, 배추 ) 와실험군 2세트 5개씩 ( 배추 :GYP 비율- 1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1/ 배추 :Glucose 2% 용액- 1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1) 의액상배지를선정하고균 2종을접종하여 ph 변화를관찰하였다. 유산균의생물학적효용성을면역학적관점에서검토하기위해이전과정에서사용한유산균 2 종을 heat-killing 한후에대식세포에시간별로 ( 미처리대조군 /30분, 1시간, 2시간 ) 처리하고, 대식세포의 RNA 를추출한다음, RT-PCR 을통해사이토카인의발현을겔전기영동으로확인하였다. 또한생쥐에유산균을경구투여하여관찰한유산균의생물학적효용성을재차확인하였다. 연구활동및과정 발효환경에서서식하는미생물탐색본연구과정에서는액체전지생성을위해많은양의산을만들어내는미생물을탐색하는목적을가지고있다. 또한산을생성하는미생물중에서사람이먹어정장작용을증가시키거나면역활성을높이는균을탐색하고자하였다. 미생물의탐색은크게두영역으로좁혀실험을진행하였다. 첫째는배추와김치로부터증식하는유산균을주목표로하였다. 둘째는유재품의발효로만들어지는치즈나발효식품에존재하는유산균을목표로하였다. - 4 -
1 2 3 4 5 6 김치간장고추장치즈요거트정장제 표 1 < 시료의종류 > 시료는총여섯가지를선택하여실험을진행하였다. 배지는일반영양배지로 potato dextrose agar(pda) 를사용하였으며, 혐기적환경에서발효가일어나는유산균을선별하기위해 MRS(Gibco) 배지를이용하였다. 각각의시료는 1mL 씩추출하여연속희석법의방법으로평판배지에도말하였다. - Gimsa 염색을통한미생물관찰및생화학적특성확인 Gimsa 염색은 crystal violet, Gram's io.d.ine, 95% ethyl alcohol, safranine을이용하여염색하였다. 관찰은 1000배의광학현미경 (nikon) 으로관찰하였다. 생화학적특성은 indol test, catalase test, 등을사용하여분리된미생물의종류를확인하였다. 균의산도 screening 배추김치, 깍두기, 동치미, 치즈, 유산균음료, 유산균정장제에서시료를채취해각각 MRS배지에접종하였다. 그리고혐기적대사를진행할수있도록가열을통해산소를제거해주었다. 그리고 12시간마다 O.D. 를측정하여균의생장곡선을그렸다. 균의산생성여부를알아보기위해 stationary phase에이르렀을때두가지방법을통해그여부를확인하였다. - Calcium phosphate를이용한산생성시각화 Calcium phosphate 는산성에서다음과같은반응을통해산을시각화한다. Ca PO RH H PO CaR - 5 -
이때 H PO 는흰색고체로써뿌옇게나타나게된다. - Phenol red를이용한산생성시각화보다정확한유산균의분리, 동정을위해 Phenol red 용액을사용하였다. Phenol red는 ph 6.8이하에서노란색, 중성에서빨간색, ph 8.2이상에서자주색을띠어세포생물학에자주사용된다. Phenol red 지시약을사용하기위해 agar배지에균을접종하고자람에따라주황색, 노란색순으로변하면서배지의 ph변화를알수있게한다. 그리고 colony 중노란색으로변한것을선별하여 16s rrna 분석을통해균의종을파악하였다. 산생산에적합한유산균세부분석균의산도 screening 실험을통해대표적인유산균 6종 (Leuconostoc kimchii, Lactobacillus paraplantanum, Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei, Lactobacillus Plantarum, Leuconostoc Citreum) 중에서산생산에적합한균주를선별하였다. 균을선별하기위해균을접종한 broth의 ph 변화와 O.D. 값을 12Hr 마다 3번, ph는 ph테이프지로 O.D. 값은 O.D. 측정기기 (powerwave x. BIOTEK) 로측정하였다. Broth는 MRS, MRS+, GYP, GYP+ ( + 는 glucose 를 10g/L 더추가한것임 ) 로 5mL씩이용하였다. 이와같이다양한 broth에균을접종하여경제성있는배지를디자인할때참고하였다. 유산균을접종한배지의종류와성분에따른 ph 변화측정 그림 2 ph 변화실험장치 - 배지의종류에따른 ph 변화측정 산생산에적합한유산균세부분석에서 ph 와 O.D. 값에따라균 2 종 - 6 -
(Lactobacillus casei, Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus paraplantanum) 이선별되었다. 하지만 paraplantanum의경우 agar에서의성장이매우느려실험의대상에서제외하였다. 그리고앞서말했듯이 MRS나 GYP 배지는경제적으로효율성이떨어져본연구의취지에맞지않아이를대체할경제적인배지가필요하다. 본연구에서는배추를갈아배추즙을만들어사용하였다. 배추는김치발효가이루어지는환경으로써 Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides 등의여러유산균이자라는것으로알려져있다. 그리고보다효율적인배지를만들기위해포도당용액 [20g/L] 와 GYP배지를배추와각각 1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1의비율로섞어두종의유산균을접종하고 ph를측정하였다. ph를측정하기위해서는 ph Sensor (Vernier Software & Technology) 를이용하였다. 비교를위해 MRS, GYP, 배추, 혼합배지를각각 10mL씩취하여 autoclave(all AMERICAN-PRESSURE STERILIZER MO.D.EL NO. 1925X) 를한후균을접종하고인큐베이터에넣어 37 에서하루간격으로 7일간 ph를측정하였다. 그림 3 ph 측정 MBL 실험장치 유산균의생물학적효용성의검토와증명유산균의생물학적효용성을면역반응을통해관찰하고자했다. 이를위해사람이유산균을직접복용하는상황을실험모델로선정하였다. Balb/c mouse에게직접유산균과 Pathogen을경구투여하여유산균을투여한군과그렇지않은군을비교하는실험과, 대식세포에직접처리하여대식세포의사이토카인분비량을유산균처리유무, 시간과종에따라비교하는실험을진행하였다. - 7 -
- 대식세포의사이토카인발현정도로파악한유산균의생물학적효용성 유산균균주의배지는 Lactobacilli MRS broth (Difco 0881) 를사용하였으며, 25 incubator에서대수기까지배양하였다. 유산균은인체에서소화된형태로면역세포에노출되며, 인체섭취를모델로삼았기때문에수확하여 PBS(phospatate buffered saline, ph7.2) 로 3회세척한후 1x10 12 cfu/ml의농도로 100 에서 20분간가열하여 heat-killing을거친다. 유산균을처리를위한대식세포주는 TNF-α, IL-6, β-actin 을분비하는 AW 264.7 세포주를사용하였다. AW 264.7 세포주는 10% fetal bovine serum 과 50ug/ml gentamycin을넣은 RPMI 1640 media (Gibco BRL) 을이용하여 37, humidified 5% CO 2 incubator(formascientific) 에서배양하였으며, 고착성을갖는세포를 cell scraper로회수, 부유시켜사용하였다. RAW 264.7cell을 6-well plate에 3x10 5 cells/well이되도록분주한후, 1x10 10 cfu/well의유산균균주를시간별 ( 미투여대조군 /30min/1hr/2hr) 로처리하여 37, humidified 5% CO 2 incubator에서배양하였다. 유산균을세포주에시간별로처리하여배양한후, RNeasy mini kit (Qiagen, USA) 을이용하여 RNA를분리하였다. 그림 4 RNeasy mini kit 를이용한실험 모든 RT-PCR 분석에서는 2μg RNA를주형으로하여 AMV reverse-transcriptase (Intron biotechnology) 를이용하여실시하였다. RT-PCR 분석용 mixture는 37 온도조건에서 60분간반응한후 97 에서 10분간가열하였다. PCR 분석은 5 U/μl Taq polymerase - 8 -
(Takara Co., Japan) 를이용하여준비된 total cdna의 의양을사용하여실시하였다. PCR이끝난후, 1.0% agarose gel을이용하여 pro.d.uct를전기영동하였으며 ethidium bromide (Sigma-Aldrich Co., MO, USA) 로염색하여각사이토카인의발현정도를 cdna band( 그림 c) 의형성여부를통해관찰하였다. PCR 분석조건은다음과같다 : 94, 30 sec for denaturation; 58, 30 sec for annealing; 72, 30 sec for polymerization; 총 30 cycles. 실험에서사용한 PCR primer는다음과같다. Mouse TNF-α IL-6 β-actin Forward Primer 5 -ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC-3 5 -GAC AAA GCC AGA GTC CTT CAG AGA G-3 5 -TGT GAT GGT GGG AAT GGG TCA G-3 Reverse Primer 5 -TAC AGG CTT GTC ACT CGA ATT-3 5 -CTA GGT TTG CCG AGT AGA TCT C-3 5 -TTT GAT GTC ACG CAC GAT TTC C-3 -생쥐에유산균을경구투여하여관찰한유산균의생물학적효용성모든생체내실험동물은 ( 주 ) 샘타코에서분양받은약 18~20g, 생후 5~6주의 female Blab/c 생쥐를플라스틱 cage에넣고고형사료와물을제한없이공급하며 12시간일광을주기로온도 24, 습도 50% 를유지하는항온항습동물사육장에서사육하였다. 모든생체내실험은환경적응기를주기위해 1주일간사육한후시작하였다. Pathogen으로 Salmonella thyphimurium(atcc 14028) 을사용하였으며생쥐를 3군으로나누어 day 14부터 day 1까지 14일동안 Gasicomitatum, L.casei, 물을각군별로먹이고 day 0에 Salmonella thyphimurium을 2x10 8 cfu/ml의농도로맞추어마리당 200ul씩경구투여하고, 다시 day +1부터 day +5까지 Gasicomitatum, L.casei를각군별로먹인후생존시간을관찰하였다. - 9 -
전지구현 - 전지구현 비커에농축한발효젖산전해질을넣은후이온화경향이다른두금속 (Cu,Al) 을전극으로삽입하였다. 배추 +GYP(1:9) 1000mL 로 15 개의셀을 제작하였고, MRS 1000mL 로 15 개의셀을제작하여직렬로연결하였다. 연구결과및시사점 연구결과 발효환경에서서식하는미생물탐색 1 각각의발효환경에존재하는미생물 colony 종류 1 2 3 4 5 6 표 3 미생물의종류 - 10 -
2 대표적인균의 Gram 염색관찰 1 2 3 4 5 6 표 4 균의 Gram 염색관찰 발효가잘진행된환경에있는균은대부분그람양성간균의형태로확인되었다. 김치에서는구형처럼보이는단간균형태로 Leuconostoc종류와유사한특성이나타났다. 유제품과유산균정장제의경우그람양성간균이뚜렷하게관찰되는데 Lactobacillus 종류와유사한특성임을확인할수있었다. 균의산도 screening -Calcium phosphate를이용한산생성시각화 6개의시료를 agar배지에접종하여 Calcium phosphate 를이용해산생성을확인하였다. 6종모두 Calcium phosphate 에의해뿌옇게되는효과가보여유산균을분리, 동정할때는유용하지않았다. -Phenol red를이용한산생성시각화 Phenol red를이용해시료를재접종하고산생성을관찰하였다. 그리고노란색으로변한부분을 16s rrna 분석을의뢰해균종을파악하였다. 생성 - 11 -
된균종은 Leuconostoc kimchii, Lactobacillus paraplantanum, Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei, Lactobacillus Plantarum, Leuconostoc Citreum으로확인되었다. 산생산에적합한유산균세부분석 그림 5 실험결과사진 네른스트식을살펴보면 broth 의 ph 가낮을수록전지의산으로이용할시에전압이높다는것을알수있다. 따라서 broth 의 ph 가가장낮은균주가적합하다. 실험결과 Lactobacillus paraplantanum, Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei 의 ph 가낮은것을확인할수있다. Day 1 오전 Day 1 오후 Day 2 오전 그림 6 실험결과 O.D. 값은유산균의개체수를간접적으로측정하는방법이다. 균주별로개체수를파악함으로써어떤균주가건강기능식품에이용할시경쟁력있는지판단할수있다. 측정결과 Lactobacillus paraplantanum, Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei 가다른균주에비해 O.D. 값이크다. 즉, 이세균주가개체수가많아건강기능식품으로써의경쟁력이높다. - 5 -
ph 측정결과와 O.D. 값측정결과를보면 Lactobacillus paraplantanum, Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei가 ph가낮을뿐만아니라개체수도많다는것을알수있다. 또한 GYP배지보다 MRS배지에서균이더잘자란다는것도확인할수있다. 따라서, 이결과를통해개체수가많을수록그만큼젖산이많이생성되어결과적으로낮은 ph로이어진다는것을유추할수있다. 이로써, Lactobacillus paraplantanum, Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei 3종을산생성에적합한유산균으로선별하였다. 유산균을접종한배지의종류와성분에따른 ph 변화측정 - 6 -
- 배지의종류에따른 ph 변화측정 Lactobacillus casei 와 Leuconostoc gasicomitatum 를 MRS, GYP, 배추 즙, 포도당 + 배추즙 (1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1), GYP+ 배추즙 (1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1) 에접종하였다 ( 그림 : 접종 9 일째 ). 그림 7 접종 9 일째 그결과 Lactobacillus casei와 Leuconostoc gasicomitatum는배추, GYP, MRS를비롯한모든혼합배지에서증식하는것으로관찰되었다. 그리고배추와포도당혼합배지에서배추와포도당의비율이 1:9일때가장잘증식하는것으로보인다. 배추와 GYP 혼합배지에서도역시배추와 GYP의비율이 1:9일때가장잘증식하는것으로보였다. 또한배추 +GYP(1:9), 배추 + 포도당 (1:9) 와배추, GYP, MRS배지를비교하였을때배추 : 포도당 (1:9) 과 GYP가비슷한정도로가장잘증식하는것으로보인다. 표1,2에는각각 Lactobacillus casei와 Leuconostoc gasicomitatum를하루에한번, 7일간측정한 MRS, GYP, 배추, 혼합배지의 ph를나타낸것이다. 배추나혼합배지의초기 ph가낮은것은배추가기본적으로내는유기산때문으로보인다. 배지에따라차이가있지만대체적으로모든배지가 1~3일에는 ph가낮아지고 3~5일사이에서최저의 ph - 7 -
를가지며 6 일이후로는상승하는경향을보인다. L.casei Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5 Day 6 Day 7 MRS 6.26 4.15 4 4 3.77 3.94 4.22 GYP 6.14 3.99 3.72 3.73 3.49 3.63 3.95 배추 4.05 4.04 3.96 3.98 3.74 3.9 4.16 G: 배 1:9 4.05 4.09 3.95 3.97 3.73 3.91 4.15 3:7 4.16 4.07 3.97 3.99 3.71 3.86 4.15 5:5 4.32 4.12 3.99 4 3.73 3.83 4.02 7:3 4.59 3.99 3.8 3.82 3.52 3.66 3.97 9:1 5.13 3.74 3.54 3.57 3.3 3.46 3.78 포 : 배 1:9 4 4 3.91 3.94 3.67 3.84 4.09 3:7 4.02 3.96 3.88 3.92 3.63 3.83 4.08 5:5 4.1 3.96 3.83 3.86 3.57 3.75 4.01 7:3 4.06 3.83 3.64 3.67 3.38 3.55 3.81 9:1 4.06 4.06 3.31 3.34 3.03 3.26 3.57 표 5 ph값의변화 L.gasicomitatum Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5 Day 6 Day 7 MRS 6.25 4.18 3.99 4.03 3.74 3.96 4.16 GYP 6.2 4.58 4.04 4.06 3.77 3.96 4.14 배추 4.07 4.09 4.04 4.06 3.67 3.79 3.86 GYP: 배추 1:9 4.1 4.09 3.75 3.77 3.44 3.74 3.86 3:7 4.18 4.03 3.59 3.64 3.32 3.59 3.76 5:5 4.31 3.82 3.59 3.59 3.27 3.49 3.7 7:3 4.68 3.78 3.58 3.6 3.26 3.49 3.7 9:1 5.17 3.86 3.63 3.68 3.33 3.57 3.76 포도당 : 배추 1:9 4.04 4.09 3.85 3.85 3.43 3.66 3.74 3:7 4.01 4.08 3.63 3.66 3.32 3.54 3.69 5:5 4.07 3.93 3.43 3.48 3.15 3.41 3.58 7:3 4.13 3.56 3.35 3.4 3.03 3.28 3.43 9:1 4.2 3.4 3.1 3.18 2.78 3.07 3.18 표 6 ph 값의변화 Lactobacillus casei 와 Leuconostoc gasicomitatum 의두경우모두포도 당 + 배추혼합배지 (9:1) 의 11/19 일 ph 가가장낮음을확인할수있다. 유산균의생물학적효용성의검토와증명 - 8 -
-대식세포의사이토카인발현정도로파악한유산균의생물학적효용성 Macrophage는여러가지 factor에의해자극을받아활성화될수있는데이러한과정에서 TNF, cytokine protein등을분비하여항암효과를비롯한면역반응을일으킨다. 따라서 TNF를비롯한 cytokine의발현량을측정함으로써 Leuconostoc gasicomitatum와 L.casei에의한 Macrophage의활성화정도를측정할수있으며, macrophage-like cell line인 RAW 264.7 cell 역시같은방법으로활성화정도를측정할수있다. 유산균을 RAW 264.7 cell에처리하여 TNF, IL-6의발현량을측정한결과, 유산균을처리한세포에서 TNF와 IL-6 모두높게발현되는것을확인하였으며, gasicomitatum의경우 1h, L.casei의경우 2h 에서가장높은발현을보였다. 이를통해유산균은 macrophage를활성화시켜항암작용및면역을유도할것으로생각할수있다. -생쥐에유산균을경구투여하여관찰한유산균의생물학적효용성유산균은장기복용했을때장내세균총을정상화시켜 diarrhea를예방하고면역계를활성화시키는것으로알려져있다, 장내에서 nisin과같은 bacteriocin을분비하여병원성세균의성장을저해하고, mutagenic compound와결합하여 tumor development를지연시키거나억제한다. 또한장점막의 toxin receptor를 degradation시켜장을질병으로부터보호하고 nutrient와장점막의 adhesion site에대해병원성세균과경쟁하여우위를지킴으로써이들의번식을막는다. 이러한사실로부터김치에서분리한유산균이복용했을때면역계를활성화시키고장내에정착하여병원균에대한방어력을높일수있는지알아보기위해생쥐에게유산균을장기간먹인후, 병원균을경구투여하여이에대한생존율을비교하였다. - 9 -
Pathogen으로는 Salmonella thyphimurium(atcc 14028) 을사용하였으며생쥐를 3군으로나누어각군별로 Leuconostoc. gasicomitatum, L.casei, 물을 14일동안먹인후, Salmonella thyphimurium을경구투여하고생존시간및생쥐의상태를관찰하였다. 실험결과유산균을먹인실험군의생존기간이대조군에비해훨씬높은수준으로연장되었으며, 특히 Leuconostoc gasicomitatum를경구투여한실험군의 60% 이상이완치되는효과를보여유산균이장내에서정착하여정상세균총을유지시키고병원균에대한방어능력을높이는것을알수있다. 또한이러한효과는유산균에따라차이를보이는것을알수있으며, 그림 9에서보이듯이, 물투여군은생존율이 0% 인데비해 Leuconostoc gasicomitatum 투여군이최종 60% 생존율, L.casei투여군이최종 20% 의생존율을보인다. 그림 9 생존율 - 10 -
전지구현 - 전지구현 그림 10 전지 기전력은 가측정되어경쟁력이있다는것을확인하였다 시사점 현재우리가사용하고있는전지중에서는제작과정이나사용에유독한것이많다. 특히자동차에쓰이는황산전지의경우그생산과정에서이산화황과산화바나듐등의물질이쓰이는데, 특히산화바나듐을흡입할경우같은양의비소보다유독한것으로나타난다. 본연구에서는유독한물질을대체하는친환경적이고인체에무해한전지를개발하기위해유산균을활용하였다. 먼저 6개의시료-배추김치, 깍두기, 백김치, 치즈, 유산균음료, 유산균정장제를활용하여유산균의생화학적특성을파악하였다. 그리고산의생성을파악하기위해시료를접종하여 Calcium phosphate 와 Phenol red로확인한결과유산균 6종이나왔다. 따라서유산균 6종 -Leuconostoc kimchii, Lactobacillus paraplantanum, Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei, Lactobacillus Plantarum, Leuconostoc Citreum-를 broth에배양해가장잘증식하고낮은 ph를유지하는균을선별하기위해 O.D. 와 ph를측정하였다. 그결과 Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei, Lactobacillus paraplantanum이가장높은 O.D. 값과낮은 ph를나타내었다. 그러나균을선별하기위해사용했던 MRS나 GYP는비싸경제적으로 - 11 -
효율적이지않으므로첫번째로배지를경제적으로바꿀필요성이있었다. 따라서김치발효가이루어지는환경으로써 Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides 등의여러유산균이자라는것으로알려져있는배추를활용하였다. 배지는배추를갈아배추즙을만들어 GYP와포도당과혼합하였다. 배추는그리고선별된두균 -Leucomostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei-을배양하고 7일간 ph를측정하였다. 측정한결과두균모두 5일째의배추 + 포도당 (1:9) 배지에서가장잘자랐다. 그리고배지의구체적인성분을바꾸어실험해본결과 Glucose를 8g/L 더추가한배지, sodium acetate를 1.5g/L 추가한배지에서가장낮은 ph가관찰되었다. Polysorbate 80를추가한배지에서는 polysorbate 80 + 0.4g/L가 ph 최소치에가장빠르게도달하였다. 또한경제적으로효율성을높이기위한두번째방안으로산생산에쓰인유산균을활용하는것이다. 본연구에서는김치에서분리한유산균이항암효과및면역활성효과를보이는지확인하기위해수행한실험에서, 유산균은 Macrophage-like cell line인 RAW 264.7 cell 을활성화시켜 TNF, IL-6와같은 cytokine의발현량을증가시키는것을확인할수있었다. 또한, 김치에서분리한유산균을장기복용했을때, 장내세균총을정상화시키고면역계를활성화시키는지알아보기위해유산균을생쥐에게경구투여한실험에서김치유산균을장기복용시킨생쥐에서병원균에대한방어력을강화시켜생쥐의생존율을높이는것을확인할수있었으며, 이러한효과는유산균에따라차이를보이는것을확인할수있었다. 이러한결과로부터김치에서분리한유산균은장내세균총을정상화시켜건강증진에기여할수있음을확인할수있다. 또한 immunomodulator로써작용하여암의치료및질병예방의목적으로사용될수있음을예상할수있다. 위의결과를정리하면, 6종의시료 ( 배추김치, 깍두기, 백김치, 치즈, 유산균음료, 유산균정장제 ) 에서균을추출하고산을내는유산균을 - 12 -
분리, 동정한결과, 6종의유산균의시간에따른 ph와 O.D. 를측정한결과중가장낮은 ph와높은증식률을보이는것은 Leucomostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei이다. 그리고이들을배추 + 포도당, 배추 +GYP, 배추, GYP, MRS에서배양한결과이들이 ph가가장낮아지는조건은배추 + 포도당 (1:9) 배지에서 5일째라는결과가나왔다. 또한경제적인효율성을위해유산균의생물학적효용성을테스트하였다. 항암효과및면역활성효과를보이는지확인한결과유산균은 cytokine의발현량을증가시키고장기복용시생쥐에서병원균에대한방어력을강화시켜생존률을높이는것으로확인되었다. 또한본연구결과를활용해제품화하면, 일반적인휴대용전지뿐만이아니라발전소의친환경에너지생산에상당한기여를할것으로보인다. - 13 -
홍보및사후활용 후속연구 배지의성분에따른 ph변화측정배지의종류에따른 ph변화측정에서 ph가가장낮게나오는배지를선별한후에그배지종류를기준으로삼아성분을다르게하여 ph 변화를관찰한다. 유산균의배양에최적화된 MRS 배지의조성과비교하여선별된배지의성분에변화를주는것을변인으로한다. 다음이 MRS배지의조성이다. 1.0 % peptone 0.8 % meat extract 0.4 % yeast extract 2.0 % glucose 0.5 % so.d.ium acetate trihydrate 0.1 % polysorbate 80 (also known as Tween 80) 0.2 % dipotassium hydrogen phosphate 0.2 % triammonium citrate 0.02 % magnesium sulfate heptahydrate 0.005 % manganese sulfate tetrahydrat MRS 에서 glucose, yeast extract, meat extract, peptone 는유산균이배양되는데기본적으로필요한탄소, 질소그리고비타민을제공한다. sodium acetate은유산균이외의균이자라는것을억제하고, polysorbate 80 은계면활성제의일종으로환원제역할을한다. 환원제역할을하는 polysorbate 80 는배지내의용존산소량을줄여젖산발효가일어나도록혐기적환경을조성한다. 그리고마지막으로 magnesium sulfate, manganese sulfate 는균의신진대사에이용되는양이온을제공한다. MRS의구성성분중유산균배양에핵심적인역할을하는 glucose, sodium acetate 그리고 polysorbate 80를 2-1에서선별한배지에각각추가하여 ph변화를관찰할것이다. Glucose는 2g/L, 4g/L, 6g/L, 8g/L - 14 -
씩배지에추가할것이다. sodium acetate는 0.5g/L, 1g/L, 1.5g/L, 2g/ 씩배지에추가할것이다. Polysorbate 80는 0.1g/L, 0.2g/L, 0.3g/L, 0.4g/L씩배지에추가할것이다. 추후활용 삼성휴먼테크논문대상에제출 참고문헌 강영희, 생명과학대사전, 아카데미서적, 2008. 2 이정은, 김치에서분리한유산균의항암효과및면역세포에미치는영향, 서울대학교학위논문 - 15 -