Korean J Lab Med 200;0:67-46 DOI 0.4/kjlm.200.0.6.67 Original Article Clinical Microbiology Evaluation of the Performance of the MicroScan Pos Breakpoint Combo Panel Type 28 for Susceptibility Testing of Staphylococcus aureus: Low-range Minimum Inhibitory Concentration of Vancomycin, Cefoxitin Screening, and Inducible Clindamycin Resistance Detection Misuk Ji, M.D., Miyoung Lee, M.T., Sinae Noh, M.T., and Mi-Na Kim, M.D. Department of Laboratory Medicine, University of Ulsan College of Medicine and Asan Medical Center, Seoul, Korea Background : Susceptibility testing of Staphylococcus aureus often requires cumbersome supplementary tests. MicroScan Pos Breakpoint Combo Panel Type 28 (PBC28) (Siemens, USA) includes cefoxitin screening to detect methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), inducible clindamycin resistance detection (ICD), and determination of low-range minimum inhibitory concentration of vancomycin (0.-6 mg/ml). The purpose of this study was to evaluate the performance of PBC28 in comparison with that of Pos Combo Type A (PCA) (Siemens). Methods : From December 2009 to March 200, 00 non-duplicate clinical isolates of S. aureus were tested with PCA and PBC28. Categorical agreements (CA) between the interpretations of the 2 panels were estimated. The presence of the meca gene was determined by PCR, and double-disk diffusion test (D-test) was performed on the isolates resistant to erythromycin but susceptible or intermediately resistant to clindamycin. Ninety-six isolates representing various vancomycin minimum inhibitory concentrations (MICs) were tested in parallel with repeat PBC28, broth macrodilution, and epsilometer test (E test). Results : The CA was 99.% with a very major error (VME) of 0.2%, major error (ME) of 0.%, and minor error (me) of 0.4% in total. PBC28 showed 00% CA for isolate with vancomycin MIC of 4 mg/ml and isolates (7.0%) with MIC of 2 mg/ml. However, only, 27, and isolates with vancomycin MIC of 2 mg/ml showed 00% CA in repeat PBC28, broth macrodilution, and E test, respectively. PCA and PBC28 detected all 4 meca-positive isolates. Among the 6 isolates tested with the D-test, 8 (92.%) were positive, and the results were 00% concordant with those of ICD. Conclusions : PBC28 can be appropriate susceptibility testing of S. aureus, including MRSA detection and ICD. However, the lower-range vancomycin MIC test was not reproducible enough to reliably differentiate MIC of 2 mg/ml from MIC mg/ml. (Korean J Lab Med 200; 0:67-46) Key Words : Staphylococcus aureus, susceptibility test, MRSA, clindamycin resistance, vancomycin resistance Received : April 0, 200 Manuscript No : KJLM0-089 Revision received : August 9, 200 Accepted : November, 200 Corresponding author : Mi-Na Kim, M.D. Department of Laboratory Medicine, University of Ulsan College of Medicine and Asan Medical Center, 88- Pungnapdong, Songpa-gu, Seoul 8-76, Korea Tel : +82-2-00-4, Fax : +82-2-478-0884 E-mail : mnkim@amc.seoul.kr *This work was supported by a grant from Siemens Healthcare Diagnostics. ISSN 98-6 The Korean Society for Laboratory Medicine 서론황색포도알균 (Staphylococcus aureus) 은가장흔하고중요한임상분리균종으로피부연조직감염, 창상감염, 폐렴, 패혈증의주요원인균이다 []. 황색포도알균은 methicillin 내성, 유도성 clindamycin 내성, vancomycin 내성등항균제선택에제한을주는중요한내성을획득하기때문에 [2] 임상미생물검사실에서는항균제감수성검사를신속하고정확하게해주어야한 67
68 Korean J Lab Med 200;0:67-46 다. 그러나다양한내성기전과검출기법의민감도, 특이도문제로인해황색포도알균의항균제감수성검사는임상미생물검사실에서가장어려운검사업무중하나이다. 황색포도알균의감수성검사에서가장중요한것이 methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 의검출이다. 국내임상분리주에서 MRSA의비율은 70% 정도로세계최고수준의내성률을보인다 [-]. MRSA를검출하는감수성검사는불균질한표현형의존재, 배양온도나배지조성에따른영향등으로오류가발생하기때문에 oxacillin salt agar법이나 cefoxitin 디스크법또는액체배지희석법으로 methicillin 내성을선별하는방법을사용하고있다 [6, 7]. 액체배지희석법에의한 oxacillin MIC 검사는 MRSA 검출에높은민감도와특이도를보여서 [8, 9] 별도의보조적인검사가권장되지는않지만 CLSI에서는희석법에서 cefoxitin과 oxacillin을둘다검사할때둘중하나라도내성기준에해당하면 MRSA로보고하도록되어있다 [0]. Macrolide-lincosamide-streptogramin B에함께교차내성이유발되는 MLS B 내성빈도또한국내에서매우높다 [, 2]. 이중유도성내성은표현형적으로 erythromycin 내성, clindamycin에는감수성인결과를보이나실제 clindamycin 내성이유도되기때문에 clindamycin을사용할수없다. Clindamycin 억제대가 erythromycin 디스크쪽에서편평해지는 D-zone 현상을관찰하는검사 (double-disk diffusion test, D-test) 로비교적쉽게확인할수있지만 [, 4], 최소억제농도 (minimum inhibitory concentration, MIC) 법을이용하는경우별도로검사를실시해야하므로업무량이증가하고검사하는데하루가더필요하다는단점이있다. 이에최근상용화된희석법키트에유도성 clindamycin 내성을검출하는방법이추가되고있다 []. Vancomycin에서감수성과내성범위의구분외에저농도 MIC 검사까지필요하다는점이최근문제가되고있다. 997년 vancomycin 중간내성황색포도알균이발견된이래 [6] 상용화된미량액체배지희석법에서 vancomycin 내성균의검출률이낮아서문제가되어왔다 [7, 8]. 또한최근 MRSA 감염증에서 vancomycin MIC가 2 mg/ml이면치료실패와관련이있고, 약물용량의증량이필요하다고알려져 [9-2], 더낮은농도의 MIC까지검사할필요성이대두되고있다. 황색포도알균의감수성검사지침이변화함에따라 [0] 상용화된감수성검사제품들은여러가지선별검사와확인검사를추가하여왔다 [7, ]. MicroScan Pos Breakpoint Combo Type 28 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., West Sacramento, CA, USA; PBC28) 패널은 vancomycin이 0. mg/ml 에서 6 mg/ml까지여섯농도가포함되어저농도 MIC까지판독할수있고, 정확하고신속한 methicillin 내성선별을위해 cefoxitin을추가하였으며, 유도성 clindamycin 내성검사 (inducible clindamycin test, ICD) 를할수있도록고안되었다. 또한 mupirocin, linezolid, daptomycin 등의항균제가추가되어다제내성 MRSA 감수성검사에적합할것으로생각되었다. 이에임상에서분리된황색포도알균을대상으로 oxacillin 내성, 유도성 clindamycin 내성, vancomycin MIC 검사에대한수행능을평가하고, 기존에사용하던 MicroScan Pos Combo Type A (Siemens; PCA) 패널과비교평가하고자하였다. 재료및방법. 대상균주 2009년 2 월 일부터 200년 월 일까지 PCA 패널에서황색포도알균으로동정된 00주를연속적으로모아서연구대상으로하였다. 한환자당하나의균주만포함시켰다. 검체별로혈액 6 주, 호흡기검체 88주, 개방농 7주, 폐쇄농 주, 체액 9주, 배액관 2주, 조직 2 주, 기타 7 주였다. 2. MicroScan 패널비교제조사의권장에따라 PCA 패널과 PBC28 패널에균접종후 MicroScan WalkAway 96 SI (Siemens) 를이용하여동정과항균제감수성검사를시행하였다. 판독은 LabPro System Version.0 (Siemens) 을사용하였다. PCA 패널과 PBC28 패널에공통으로포함된항균제는 amoxicillin-clavulanic acid, ampicillin, ciprofloxacin, clindamycin, erythromycin, fusidic acid, gentamicin, imipenem, nitrofurantoin, oxacillin, penicillin, rifampin, quinupristin-dalfopristin, teicoplanin, tetracycline, trimethoprim-sulfamethoxazole, vancomycin, gentamicin 고농도내성검사, streptomycin 고농도내성검사등 9 가지이며 PCA 패널에비해 PBC28 패널은 가지의세팔로스포린과 meropenem, chloramphenicol, ticarcillin-clavulanic acid, ofloxacin, norfloxacin이빠지고대신 cefoxitin 선별검사, ICD, azithromycin, daptomycin, fosfomycin, levofloxacin, linezolid, moxifloxacin, mupirocin 등이추가되었다 (Table ). PCA 패널과 PBC28 패널은기본적으로 6시
Ji M, et al., Evaluation of MicroScan PBC28 for S. aureus 69 Table. Compositions and concentrations of the antimicrobials common among the PCA and PBC28 panels and all antimicrobials of the PBC28 panel Antimicrobials Range of concentrations (mg/ml) PCA PBC28 Amoxicillin-clavulanic acid 4/2 4/2-8/4 Ampicillin 0.2, 2-8 0.2, 4-8 Azithromycin - 2-4 Cefoxitin screen well - 4 Ciprofloxacin -2-2 Clindamycin 0., 2 0.2-0., 2 Daptomycin - -4 Erythromycin 0.2-0., 4 0., 4 Fosfomycin - 2 Fusidic acid 2, 6 2, 6 Gentamicin 4-8, 4-8 Gentamicin synergy 00 00 Imipenem 4-8 4-8 Inducible clindamycin - 4/0. Levofloxacin - -4 Linezolid - 2-4 Moxifloxacin - 0.- Mupirocin - 4-8, 26 Nitrofurantoin 2-64 2-64 Oxacillin 0.2-2 0.2, -2 Penicillin 0.0, 0.2-0.2, 2, 8 0.0-0.2, 8 Rifampin -2-2 Streptomycin synergy 000 000 Quinupristin-dalfopristin -2-2 Teicoplanin 4-6 4-6 Tetracycline 4-8 4-8 Trimethoprim-sulfamethoxazole 2/8 2/8-4/76 Vancomycin 2-6 0.-6 Abbreviations: PCA, Pos Combo Panel Type A; PBC28, Pos Breakpoint Combo Panel Type 28. 간만에모든판독을마치지만, PCA 패널은 oxacillin을 24 시간까지연장하여판독하도록되어있다. 두패널에공통으로포함된항균제중 amoxicillin-clavulanic acid, ampicillin, imipenem, gentamicin 고농도내성검사, streptomycin 고농도내성검사를제외한 4가지항균제에대해비교하여 PCA 패널을기준으로중대오류 (very major error, VME), 대오류 (major error, ME), 소오류 (minor error, me) 를판정하였다 [22]. PCA 패널에서는 CLSI 기준에따라 vancomycin MIC 결과가 2 mg/ml 이하이면동일한결과치를보이는데비해 PBC28 패널에서는 0. mg/ml 이하, mg/ml, 2 mg/ml로세분화되기때문에두패널에서 2 mg/ml 이하의결과를보이면일치하는것으로판정하였다. 새로추가된항균제중 mupirocin은 MIC가 4 mg/ml 이하이면감수성, 8-26 mg/ml이면저도내성, 26 mg/ml을초과하면고도내성으로 판독하였다.. PBC28 패널의 vancomycin MIC 검사의평가 PBC28 패널에서 vancomycin MIC가 0. mg/ml 이하, mg/ml, 2 mg/ml 이상인균주가각각 /씩포함되도록 00주정도를골라대량액체배지희석법 (broth macrodilution) 과 E test를시행하여비교하였다. 대량액체배지희석법은양이온조절 Mueller-Hinton 배지에 0 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0. mg/ml, mg/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml 농도의 vancomycin 용액을만들고균액을접종하여 24시간배양한후판독하였다. 참조균주로 ATCC292을사용하였다. E test는 Mueller-Hinton 배지에 0. McFarland 탁도의균액을골고루바른후 E test 시험봉 (AB Biodisk, Solna, Sweden) 을올려 24시간동안 에서배양하였다. 동일한조건에서비교실험을실시하기위해동일한균액으로 PBC28 패널을재검하였다. 이실험을통해 PBC28 패널 vancomycin MIC 결과의재현성을평가하고, 배양 6 시간후 MicroScan 장비에서판독한결과와 24시간후육안판독을비교하였다. 대량액체배지희석법으로구한 MIC를기준으로하여 PBC28 패널의 MIC가 ± 이내의희석배수차이를보인경우일치 (essential agreement) 한것으로판정하였다. 4. Methicillin 내성확인검사 PBC28 패널에서는 cefoxitin이 4 mg/ml를초과하거나 oxacillin이 4 mg/ml 이상이면 MRSA로판독한다. Cefoxitin 결과가 6시간만에내성으로판독되면 oxacillin이감수성범위일지라도내성 (R*) 으로바꾸어판독한다. Oxacillin 감수성결과가불일치할때는재검을시행하였고, mg oxacillin 디스크 (Becton Dickinson Microbiology System, Cockeysville, MD, USA) 와 0 mg cefoxitin (Becton Dickinson) 디스크로감수성검사를시행하였다. meca PCR은혈액한천배지에서하룻밤키운집락을이용하여 InstaGene Matrix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) 추출키트로제조사의지시에따라 DNA를추출한뒤, meca 유전자에대한한쌍의시발체 ( -TCCAGATTA- CAACTTCACCAGG-, -CCACTTCATATCTTG- TAACG- ) 를이용하여문헌 [2] 에따라시행하였다. meca PCR 결과를참고로 cefoxitin과 oxacillin 감수성결과를판정하였다.
640 Korean J Lab Med 200;0:67-46. 유도성 clindamycin 내성검출 결 과 PBC28 패널에서 ICD 시험정은 erythromycin 내성이면서 clindamycin 감수성혹은중간인경우에판독을하게된다. Erythromycin 4 mg/ml와 clindamycin 0. mg/ml를포함한 ICD 시험정에서균이자라면 clindamycin에대해내성 (R*) 으로판독한다. ICD 시행균주에대해 D-test를시행하였다. D- test는 CLSI 지침에따라 mg erythromycin (Becton Dickinson) 과2 mg clindamycin (Becton Dickinson) 디스크를 2 mm 간격으로배치하여검사하였다. 두가지패널에서 erythromycin 또는 clindamycin 감수성결과가불일치할경우 erythromycin과 clindamycin 디스크확산법을시행하여비교하였다. 6. 통계처리각검사법간의 MIC 비교또는 PBC28 패널에서의 MIC 상관성분석을위해 Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corp, Redmond, WA, USA) 로추세선과상관계수를구하였다.. 항균제의감수성률및패널간감수성검사결과의비교 PCA 패널에서의감수성률은 oxacillin 7.2%, clindamycin.2%, vancomycin 99.8%, ciprofloxacin 46.4%, erythromycin 9.2%, fusidic acid 2.2%, gentamicin 0.2%, penicillin.6%, rifampin 94.4%, quinupristin-dalfopristin 00.0%, trimethoprim-sulfamethoxazole 97.2%, nitrofurantoin 00.0%, tetracycline 49.6%, teicoplanin 00.0% 였다. PBC28 패널에만포함된 daptomycin, fosfomycin, levofloxacin, linezolid, moxifloxacin, mupirocin 의감수성률은 00.0%, 69.4%, 48.4%. 00.0%, 48.2%, 92.2% 였다 (Table 2). Mupirocin에서 MIC 8-26 mg/ml인저도내성은 4.8%, 26 mg/ml 초과인고도내성은.0% 였다. 균주-항균제조합 7,000개중 6,9개 (99.%) 에서감수성판독결과가일치하였다. 4가지항균제중 nitrofurantoin, teicoplanin, vancomycin은 00% 일치하였고, 불일치한결과중 VME가 개 (0.2%), ME가 8개 (0.%), me가 26 개 (0.4%) 였다. VME는 gentamicin이 개, clindamycin, rifampin, trimethoprim-sulfamethoxazole이각각 2개, oxacillin, cipro- Table 2. Antimicrobial susceptibility and categorical agreement rate of 00 Staphylococcus aureus clinical isolates tested with PCA and PBC28 panels Antimicrobials N (%) of isolates PCA PBC28 S I R S I R VME ME me % Categorical agreement (CA) Penicillin 28 (.6) - 472 (94.4) 28 (.6) - 472 (94.4) (0.2) (0.2) 0 (0.0) 99.6 Oxacillin* 86 (7.2) - 4 (62.8) 87 (7.4) - (62.6) (0.2) 0 (0.0) 0 (0.0) 99.8 Erythromycin 96 (9.2) (0.2) 0 (60.8) 97 (9.4) 0 (0.0) 0 (60.8) (0.2) (0.2) (0.2) 99.4 Clindamycin 26 (.2) 2 (0.4) 242 (48.8) 28 (.6) 2 (0.4) 240 (48.4) 2 (0.4) (0.2) 2 (0.4) 99.0 Gentamicin 2 (0.2) 2 (0.4) 247 (9.8) 28 (.6) (0.2) 24 (8.6) (.0) 0 (0.0) (0.6) 98.4 Ciprofloxacin 22 (46.4) 8 (.6) 260 (.6) 2 (46.2) 8 (.6) 26 (.8) (0.2) 2 (0.4) 2 (0.4) 99.0 Fusidic acid 26 (2.2) 4 (6.8) 20 (47.8) 27 (.4) 7 (7.4) 206 (48.0) 0 (0.0) (0.2) 7 (.4) 98.4 Rifampin 472 (94.4) 2 (0.4) 26 (.6) 47 (94.6) 0 (0.0) 2 (.4) 2 (0.4) (0.2) 2 (0.4) 99.0 Tetracycline 248 (49.6) 7 (.4) 24 (0.4) 246 (49.2) (0.2) 2 (2.0) 0 (0.0) (0.2) 8 (.6) 98.2 Quinupristin- 00 (00) 0 (0.0) 0 (0.0) 499 (99.8) (0.2) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) (0.2) 99.8 dalfopristin Teicoplanin 00 (00) 0 (0.0) 0 (0.0) 00 (00) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 00.0 Trimethoprim- 486 (97.2) - 4 (2.8) 488 (97.6) - 2 (2.4) 2 (0.4) 0 (0.0) 0 (0.0) 99.6 sulfamethoxazole Vancomycin 499 (99.8) (0.2) 0 (0.2) 499 (99.8) (0.2) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 00.0 Total 00 00 (0.2) 8 (0.) 26 (0.4) 99. *Concordance rate was evaluated according to the oxacillin minimum inhibitory concentrations (MICs), regardless of the cefoxitin screening results; Concordance rate was evaluated according to the clindamycin MICs, regardless of results of inducible clindamycin resistance test. Abbreviations: PCA, Pos Combo Panel Type A; PBC28, Pos Breakpoint Combo Panel Type 28; S, susceptible; I, intermediate; R, resistant; VME, very major error; ME, major error; me, minor error.
Ji M, et al., Evaluation of MicroScan PBC28 for S. aureus 64 floxacin, erythromycin, penicillin이각각 개로모두 % 이하였다. ME 또한 erythromycin, clindamycin, fusidic acid, rifampin, tetracycline, penicillin에서각각 개씩, ciprofloxacin 2개에불과하여대부분의항균제에서판독일치율이 99% 이상이었다. Tetracycline과 fusidic acid는 me 가 8개, 7개발생하여 98% 대의일치율을보였다. Erythromycin과 clindamycin ME는동일한균주에서발생하였고디스크확산법으로확인하였을때둘다내성이었으며, clindamycin에서 me, erythromycin에서 VME를보였던 주는디스크확산법결과 erythromycin, clindamycin 둘다감수성이었다. 2. Vancomycin MIC에대한MicroScan PBC28 패널, 대량액체배지희석법, E test법의비교 PCA 패널에서 499주는 vancomycin 감수성이었고 주가 4 mg/ml이었다. PBC28 패널에서도 0. mg/ml 이하가 주 (7.0%), mg/ml가 429주 (86.0%), 2 mg/ml가 주 (7.0%) 였고, vancomycin MIC가 4 mg/ml인 주는동일하게 4 mg/ml 이었다. Vancomycin MIC 검사의정확도를판단하기위해 PBC28 패널에서 0. mg/ml 이하 0주, mg/ml 0주, 2 mg/ml 주, 4 mg/ml 주등 96 주를골라서대량액체배지희석법과 E test, PBC28 패널검사를동시에실시하였다. 대량액체배지희석법에서 ATCC292 균주의 MIC는 2회검사시각각 mg/ml와 2 mg/ml로정도관리허용범위에들었다. 대량액체배지희석법에서 MIC의분포는 0. mg/ml 이하가 7주, mg/ml가 26 주, 2 mg/ml가 2 주, 4 mg/ml가 주로, Table. Dilution difference between the results of the MicroScan and E test vancomycin susceptibility test and the broth macrodilution test Method or system N of results with dilution difference* -2-0 + +2 %Agreement (± dilution) MicroScan 6 hr (st) 0 0 0 94.8 MicroScan 6 hr (2nd) 8 49 6 0 96.9 MicroScan 24 hr (2nd) 2 8 0 96.9 E test 6 7 20 0 96.9 *0: vancomycin test results are the same as that of the broth macrodilution test results; -: vancomycin test results are log 2 concentration lower than the broth macrodilution test results; -2: vancomycin test results are 2 log 2 concentration lower than the broth macrodilution test results; +: vancomycin test results are log 2 concentration greater than the broth macrodilution test results; +2: vancomycin test results are 2 log 2 concentration greater than the broth macrodilution test results. 대량액체배지희석법에서 MIC가 2 mg/ml인 2주는 PBC28 패널재검에서 2 mg/ml가 주, mg/ml가 4 주, 0. mg/ml 이하가 주였다. 대량액체배지희석법과 PBC28 패널간 ± 희석배수내일치하는비율은 96.9% 이었고 96주중 49주 (.0%) 가동일한결과를보였다 (Table ). 대량액체배지희석법을기준으로 PBC28 패널의 MIC값을비교시추세선은 y=0.489x+0.72 (R 2 =0.4) 로 PBC28 패널에서낮게나오는경향을보였다 (Fig. ). 대량액체배지희석법과 E test 간 ± 희석배수내일치하는비율은 96.9% 이었고 96주중 7주 (9.4%) 가동일한 MIC를보였으며, 대량액체배지희석법에서 MIC가 2 mg/ml인 2 주중 8 주 (7.%) 가 E test MIC도.- 2 mg/ml로일치하였다 (Table ). E test에서 MIC의분포는 0.7-0. mg/ml가 7주, 0.7- mg/ml가 28주,.-2 mg/ml가 0주, 4 mg/ml가 주였다. E test에서 MIC가.-2 mg/ml인 0 주는 PBC28 패널재검에서 2 mg/ml가 4 주, mg/ml가 6 주였다. E test와 PBC28 패널간 ± 희석배수내일치하는비율은 00% 이었고 96주중 주 (.2%) 가동일한결과를보였다 E test를기준으로 PBC28 패널의 MIC값을비교시추세선은 y=0.749x+0.6 (R 2 =0.628) 로 PBC28 패널의 MIC가낮은값을보였지만, 대량액체배지희석법과비교했을때에비해더높은상관성을보였다 (Fig. ). PBC28 패널에서처음과재검시의 vancomycin MIC 결과가동일한경우는 96주중 64주 (66.7%) 였으며, ± 희석배수이내의차이를기준으로하면 00% 일치하였다 (Fig. ). 처음 PBC28 패널검사에서 MIC가 2 mg/ml인 주를 PBC28 패널로재검했을때다시 2 mg/ml인경우는 주 (42.9%) 에불과하였고대량액체배지희석법에서는 27주 (77.%) 가 2 mg/ml였으며, E test에서는 주모두.-2 mg/ml이었다. 원래 PBC28 패널검사에서 MIC mg/ml이었던균주중 주는재검에서 2 mg/ml로바뀌었다. 처음 PBC28 패널검사에서 MIC가 0. mg/ml 이하인 주, mg/ml인 20 주가대량액체배지희석법에서2 mg/ml로바뀌어총 2 주가대량액체배지희석법에서 MIC 2 mg/ml였다. 처음 PBC28 패널검사에서 MIC가 mg/ml인 주가 E test에서.-2 mg/ml로바뀌어서총 0 주가 E test 에서 2 mg/ml의 MIC를보였다. PBC28 패널재검에서 6시간과 24시간 vancomycin MIC 판독을비교했을때 7주가 mg/ml에서 2 mg/ml로 MIC가높아졌다. 이중각각 주는대량액체배지희석법과 E test에서 MIC가.-2 mg/ml였고, 7주모두대량액체배지희석법과 E test 중하나이상에서 MIC가.-2 mg/ml였다 (Fig. ).
642 Korean J Lab Med 200;0:67-46 MicroScan MIC (mg/ml) 4 2 0 2 2 4 4 0 2 4 6 Macrodilution MIC (mg/ml) y=0.489x+0.72 R 2 =0.4 A MicroScan MIC (mg/ml) 4 2 6 7 29 2 2 4 0 0 2 4 E test MIC (mg/ml) y=0.749x+0.6 R 2 =0.628 B MicroScan MIC 2 (mg/ml) 4 2 9 29 20 y=0.7x+0.8 R 2 =0.29 MicroScan MIC 24 (mg/ml) 4 2 9 7 6 y=0.976x+0.099 R 2 =0.809 0 0 2 4 MicroScan MIC (mg/ml) C 0 0 2 4 MicroScan MIC 6 (mg/ml) D Fig.. Correlation of vancomycin MICs of 96 isolates with broth macrodilution, E test, and MicroScan PBC28 (A, B) and reproducibility of vancomycin MICs in MicroScan PBC28 (C, D). The digits beside the square dots represent the number of isolates. (A) Broth macrodilution vs. MicroScan PBC28. (B) E test vs. MicroScan PBC28. (C) MicroScan PBC28 of the MicroScan MIC 2 batch vs. original results of MicroScan PBC28 (MicroScan MIC ). (D) MicroScan PBC28 at 6 h-incubation (MicroScan MIC 6) vs. MicroScan PBC28 at 24-incubation (MicroScan MIC 24). Abbreviations: MIC, minimum inhibitory concentration; PBC28, Pos Breakpoint Combo Panel Type 28.. MRSA의검출을위한 cefoxitin 선별검사, oxacillin 감수성결과와 meca PCR의비교 meca 유전자양성은 4주 (62.8%) 로두패널모두 meca 양성 MRSA를 00% 검출하였다. Cefoxitin 선별양성은 주 (6.0%) 였고이중 2주의 oxacillin MIC가 2 mg/ml 이하로 R* 로판독되었다. 그중 주는 PCA 패널에서 oxacillin 내성, PBC28 패널에서감수성으로 VME를보였으나 cefoxitin 선별양성에서 oxacillin 내성으로판정되었다. 이균주의 oxacillin 억제대직경은 8 mm로내성이었다. 다른 주는 meca 음성이었고두패널에서모두 oxacillin MIC가 0.2 mg/ml 이하였으며, 디스크확산법결과 oxacillin 억제대직경은 9 mm, cefoxitin 억제대직경은 27 mm로모두감수성으로 cefoxitin 선별위양성이었다. PBC28 패널에서 cefoxitin 선별검사음성인 8주는모두 oxacillin에도감수성이었으며, meca 음성이었다. 4. 유도성 clindamycin 내성검출전체 00주중에서 240주 (48.0%) 가구성형 MLS B 내성이었고, MRSA가 26주 (98.%), methicillin-susceptible Staphylococcus aureus (MSSA) 가 4주 (.7%) 였다. PBC28 패널에서 erythromycin에내성이면서 clindamycin에감수성인 6주와중간내성인 2주등총 6주에대해 ICD가시행되었으며양성이
Ji M, et al., Evaluation of MicroScan PBC28 for S. aureus 64 8주 (92.%), 음성이 주 (7.9%) 였고, D-test와 00% 일치하였다. ICD 양성 8 주중 erythromycin에내성이면서 PBC28 패널에서 clindamycin 감수성인 2주, 중간내성인 주등 주는 PCA 패널에서 clindamycin에내성으로구성형내성을나타내었다. Erythromycin과 clindamycin에모두감수성인균주는 97주 (9.4%) 로 MRSA가 42주 (2.%), MSSA가 주 (78.7%) 였다. ICD 양성균주중 MRSA가 주 (6.9%), MSSA가 2 주 (4.%) 였고 ICD 음성균주중 MRSA가 주 (60.0%), MSSA가 2주 (40.0%) 였다. MRSA는구성형내성이 7.2%, 유도성내성이 0.%, 둘다감수성이.4% 인데비해 MSSA는구성형내성이 2.2%, 유도형내성이.4%, 둘다감수성이 8.% 였다. 고찰황색포도알균의항균제감수성검사에서 PBC28 패널은 PCA 패널과 99.% 의높은일치율을보였다. 비선택적인방법으로수집한많은수의임상분리주를대상으로새로운감수성방법을평가했을때참조방법과비교해서 VME는.% 미만, ME 는 % 미만이면적절하다고판정한다 [22]. PBC28 패널은전체 VME가 0.2%, ME가 0.% 있었고항균제조합별로가장불일치율이높았던 gentamicin이 VME.0%, ciprofloxacin이 ME 0.4% 로서모든항균제에대해우수한일치율을보여 PCA 패널을대치할수있다고판정하였다. 하지만감수성률이 0% 전후였던 gentamicin, tetracycline, fusidic acid 등은일치율이 98% 대로상대적으로낮았다. 이에비해거의내성이거나감수성이었던항균제는균주의 MIC 분포가한쪽으로치우쳐서판독일치율이높게나올수밖에없다는점은이연구의제한점이다. PBC28 패널검사에서 vancomycin MIC가 2 mg/ml인균주는 주로전체임상분리주의 7.0% 를차지하였고이중 주 (94.%) 가 MRSA였다. 황색포도알균임상분리주에서 vancomycin MIC가 2 mg/ml의비율에대한국내보고는없으며 vancomycin 치료를받은 MRSA 혈액분리주의 2.9% 가 MIC 2 mg/ml였다는보고가유일하다 [24]. 2000년에서 2004 년까지 년간한미국대학병원에서황색포도알균임상분리주 6,00주를대상으로한연구에서 vancomycin MIC 2 mg/ml 인균주의비율은 0.4% 인것에비해 [2], 국내삼차병원은더높은비율을보이는것으로생각된다. 미국보고에서도 vancomycin MIC가 2 mg/ml인균주가대부분 MRSA였다는점 [2] 에서 MRSA의비율이높았던점이 vancomycin MIC의 분포에영향을주었을것으로추정할수있다. 이번연구에서는 vancomycin MIC가 4 mg/ml인균주가 주만포함되어범주일치율 (categorical agreement rate) 을제대로구하지못한한계점이있었다. 이균주는대량액체배지희석법, E test, PBC28 패널재검시에도동일한결과를나타내었는데추후 MIC 4 mg/ml를충분히포함한추가연구가필요하리라생각된다. 대량액체배지희석법이나 E test에의한 vancomycin MIC와 PBC28 패널의 MIC를비교하였을때모두높은상관성을나타내었고 ± 희석범위안에서각각 96.9%, 00% 일치하였는데 PBC28 패널에서더낮은 MIC를보이는경향이있었다. 이는 MicroScan 다른패널을사용한연구 [26] 에서미량액체배지희석법에비해 MIC가더높게나온다는결과와배치된다. 이는패널의차이거나대량액체배지희석법에서 MIC가높게나온것이원인일수있다. MicroScan 시스템은최근패널에서 vancomycin 감수성검사의정확도가향상되어서 vancomycin MIC가 4 mg/ml, 8 mg/ml인균주를많이포함시켰던평가에서 CLSI 액체배지희석법과 ± 희석범위이내범위에서 00% 일치하였다는보고가있는반면 [27], 비선택적수집균주들의평가에서는 2 mg/ml인비율이미량액체배지희석법이나 Vitek (biomerieux, Marcy I Etoile, France) 보다높지만, E test와는유사하고, 임상적인치료성적은 E test 나 MicroScan 결과와상관성이높아서 E test검사법을기준으로치료방침을정할것을권장하였다 [26]. 향후 MicroScan PBC28 패널의저농도 MIC와 vancomycin 치료성적과의관련성연구가필요할것으로생각하였다. 처음 PBC28 패널에서 MIC 2 mg/ml인균주들을 PBC28 패널로재검하면동일한결과를얻는경우는 42.9% 에불과했고 CLSI 희석법이나 E test에서는처음 PBC28 패널에서 MIC가 2 mg/ml인균주중 28.8%, 68.0% 만검출하였다. 이는검사방법에따라또는같은제품에서도재검할때상당수결과가바뀌어 mg/ml와 2 mg/ml를정확히구분하기는어렵다는것을보여주며, 여러가지상용화된감수성제품을비교한이전논문 [28, 29] 과일치된소견으로 PBC28 패널만의문제는아니다. PBC28 패널에서 6시간판독을기본으로하는데 24시간판독시 7주가 mg/ml 에서 2 mg/ml로바뀌었고, CLSI 희석법과 E test에서는이 7주가 MIC.-2 mg/ml인결과를보여 6시간판독을하면 MIC 2 mg/ml인균주를놓칠수있음을보여준다. 반복검사에서계속 MIC가 2 mg/ml이었던 주처럼여러방법에서 2 mg/ml가안정적으로나오는균주와검사법에따라결과가바뀌는균주간에어떤임상적차이가있는지에대해서는향후더연구가필요하다. Vancomycin MIC
644 Korean J Lab Med 200;0:67-46 mg/ml와 2 mg/ml를구분하는것이치료와상관성이있다고하나 [20, 2] 전통적인감수성검사가 2배수희석법이고 2배수희석차이는허용된다는점에서근본적인한계가있다. E test 방법을사용하면더세밀한결과를얻을수있기때문에이와같은오차에서벗어날수있다 [26]. 본연구에서도 E test는대량액체배지희석법과비교시 MIC 2 mg/ml인것의일치율이 7.% 로높으면서 PBC28 패널에서 MIC 2 mg/ml인균주를모두 MIC.-2 mg/ml로재현하여저농도 vancomycin MIC 를확인할때유용할것으로판단하였다. 따라서 MicroScan 등자동화된미량액체배지희석법에서 vancomycin MIC가 2 mg/ml일때 CLSI 희석법으로확인해주는것이좋겠지만, 임상검사실에서는 E test로재검하는것이현실적인방법일것이다. PCA 패널과 PBC28 패널의 MRSA 검출능은 meca 유전자 PCR 결과와 00% 일치율을보여서매우우수한수행능을보였다. PBC28 패널에서 cefoxitin 선별에의해서 MRSA로검출되었던 2주중 주는 cefoxitin 선별검사가포함되면서 oxacillin 판독시간이 6시간으로단축되어 oxacillin 판독에오류가발생한것으로추정되며, 다른 주는선별위양성이었기때문에 cefoxitin 선별검사를추가하여판독시간을단축시켰지만 MRSA의검출민감도향상은없었고특이도는낮아지는단점이있었다. 따라서, PBC28 패널에서 oxacillin에감수성이면서 cefoxitin 선별양성일때는디스크확산법등으로확인검사를할필요가있을것으로생각하였다. 황색포도알균의 oxacillin 감수성검사를희석법으로한다면 cefoxitin 선별검사를추가할필요는없지만 [0], cefoxitin 선별검사를추가함으로써 MRSA 검출률을높였다는보고가있다. Vitek 2 (biomerieux) 와 Phoenix (BD, Sparks, MD, USA) 시스템에서황색포도알균에대해 meca PCR 결과와비교했을때, cefoxitin 선별검사로검출한 MRSA 가 Vitek 2에서 7주, Phoenix에서 9주가있었던데비해 [7], 본연구에서 MicroScan 시스템에서 cefoxitin 선별검사를추가함으로써검출률을높이지못한것은 MicroScan oxacillin 감수성검사가 00% 의우수한민감도를보였기때문으로생각된다. 하지만, oxacillin MIC가 4 mg/ml 근처의균주일때 cefoxitin 선별검사가가장높은효과를보였다는결과와비교하면 [7] 본연구에서 MIC가판독기준에근접한경계성 MRSA가포함되지않아서 cefoxitin 선별검사의효과가낮았을수도있다. 유도성 clindamycin 내성검출에있어 D-test와 ICD가 00% 일치하여 D-test를대치할수있을것으로생각되었다. ICD 검사대상중 8주 (92.%) 가 ICD 양성이어서유도성 clindamycin 내성으로, 주 (7.9%) 가 ICD 음성이어서 clindamycin에감수성으로최종판독되었다. 국내에서 4,497주의 황색포도알균임상분리주에대한 MLS B 표현형연구에서 00% 가유도성 clindamycin 내성이었다는보고 [] 가있는데비해본연구결과는 erythromycin 내성, clindamycin 감수성인황색포도알균의일부는 MLS B 내성이외의기전을가지고있어서 ICD 검사로 clindamycin 감수성여부를확인해야할필요가있음을보여준다. 더욱이한삼차병원의보고 [2] 에서는 D-test 시행균주중 4% 만이유도성 MLS B 내성이었는데이경우 ICD 검사의효용성이더높다. 이번연구에서 ICD 양성인균주중패널간불일치했던 주는 PCA 패널에서모두 clindamycin 내성이었고, PBC28 패널에서 clindamycin 감수성 2주, 중간내성 주였다. 유도성 MLS B 내성은 erm 유전자의발현이불완전할수있기때문에 clindamycin에서 VME나 me 가발생할우려가있다 [4]. ICD는 clindamycin의 VME나 me 를효과적으로교정할수있을것이다. 황색포도알균에서 linezolid, daptomycin, vancomycin, teicoplanin, quinupristin-dalfopristin에내성을보이는경우는드물며, 이들은 MRSA에대해서도동등한감수성을유지하는약제들이다 [0]. 본연구에서도이항균제들은 vancomycin 중간내성 MRSA 주외에는모두감수성을보여서이들약제가감수성패널에포함됨으로써항균제선택의폭을넓힐것으로생각하였다. Mupirocin은고도내성이.0%, 저도내성이 4.8% 로, 200년 9주의황색포도알균임상분리주에서 mupirocin 고도내성이.0% 라는국내보고 [] 와고도내성의비율이유사하여국내에서도 mupirocin 고도내성의확산이우려된다. 따라서 mupirocin 연고제를 MRSA 탈집락화에사용할때감수성검사가필요할것으로생각하였다. 결론적으로, 황색포도알균감수성검사에서 PBC28 패널은 PCA 패널과높은일치율을보였고, MRSA의검출시간단축, 유도성 clindamycin 내성확인, 저농도 vancomycin MIC를감별할수있다는장점이있었다. 또한높은감수성률을보이는 linezolid, daptomycin, mupirocin 등이추가되어다제내성 MRSA 항균제선택폭을넓힐수있을것으로생각한다. 요약배경 : 황색포도알균의항균제감수성검사의정확도를높이기위해여러가지보조적인검사들이필요하다. MicroScan Pos Breakpoint Combo Panel Type 28 (PBC28)(Siemens, USA) 은 cefoxitin에의한 methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) 선별검사, 유도성 clindamycin 내성검사 (inducible clindamycin resistance test, ICD), 0. mg/ml에서
Ji M, et al., Evaluation of MicroScan PBC28 for S. aureus 64 6 mg/ml 농도의 vancomycin을포함한다. 이에임상에서분리된황색포도알균에대해 PBC28 패널을 PosComboA (PCA) 패널 (Siemens) 과비교평가하였다. 방법 : 2009년 2 월부터 200년 월까지한환자당 주씩총 00주의황색포도알균을연속적으로모아서 PCA와 PBC28 패널로동시에동정과감수성검사를실시하고, 패널간범주일치율 (categorical agreement rate) 을조사하였다. 모든균주는 meca 유전자 PCR을시행하였으며, ICD 시행균주에대해서는 erythromycin과 clindamycin 디스크로 double-disk diffusion test (D-test) 를시행하여비교하였다. Vancomycin의다양한 minimum inhibitory concentration (MIC) 을포함할수있도록 96주의황색포도알균을선정하여 broth macrodilution, epsilometer test (E test), PBC28 패널검사를동시에실시하였다. 결과 : 두패널에공통적으로포함된항균제에대한감수성결과의일치율은 99.% 였으며, 중대오류 (very major error) 가 0.2%, 대오류 (major error) 가 0.%, 소오류 (minor error) 가 0.4% 였다. meca 양성 MRSA는 4주였고, 두패널모두 00% MRSA로검출하였다. ICD는 6 주에대해시행되었으며, ICD 양성이 8 주 (92.%) 로 D-test와는 00% 일치하였다. Vancomycin은 00% 의일치율을보였으며 MIC 4 mg/ml인 주, 2 mg/ml인 주 (7.0%) 를포함하였다. 하지만, MIC가 2 mg/ml인균주를 PBC28 패널, broth macrodilution, E test로재검하였을때 주, 27주, 주에서 MIC가재현되었다. 결론 : PBC28 패널은 MRSA의검출, 유도성 clindamycin 내성확인등을포함하여황색포도알균의항균제감수성검사에적절한수행능을보였다. 저농도 vancomycin MIC의재현성이떨어져서 2 mg/ml인균주를 mg/ml와감별하기에는부족하였다. 참고문헌. Lowy FD. Staphylococcus aureus infections. N Engl J Med 998;9: 20-2. 2. Schito GC. The importance of the development of antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Infect 2006;2(S):-8.. Lee H, Yong D, Lee K, Hong SG, Kim EC, Jeong SH, et al. Antimicrobial resistance of clinically important bacteria isolated from 2 hospitals in Korea in 2004. Korean J Clin Microbiol 200;8:66-7. ( 이혁민, 용동은, 이경원, 홍성근, 김의종, 정석훈등. 2004년도국내 2개병원에서분리된주요세균의항균제내성율. 대한임상미생물학회지 200;8:66-7.) 4. Kim JS, Kim HS, Song W, Cho HC, Lee KM, Kim EC. Antimicrobial resistance profiles of Staphylococcus aureus isolated in Korean hospitals. Korean J Lab Med 2004;24:22-9. ( 김재석, 김한성, 송원근, 조현찬, 이규만, 김의종. 국내 개의료기관에서수집된 Staphylococcus aureus의항균제감수성양상. 대한진단검사의학회지 2004;24:22-9.). Lee H, Kim CK, Lee J, Lee SH, Ahn JY, Hong SG, et al. Antimicrobial resistance of clinically important bacteria isolated from 2 hospitals in Korea in 200 and 2006. Korean J Clin Microbiol 2007;0:9-69. ( 이혁민, 김창기, 이종욱, 이성희, 안지영, 홍성근등. 200-2006년국내2개병원에서분리된주요세균의항균제내성률. 대한임상미생물학회지 2007;0:9-69.) 6. Sakoulas G, Gold HS, Venkataraman L, DeGirolami PC, Eliopoulos GM, Qian Q. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: comparison of susceptibility testing methods and analysis of meca-positive susceptible strains. J Clin Microbiol 200;9:946-. 7. Junkins AD, Lockhart SR, Heilmann KP, Dohrn CL, Von Stein DL, Winokur PL, et al. BD Phoenix and Vitek 2 detection of mecamediated resistance in Staphylococcus aureus with cefoxitin. J Clin Microbiol 2009;47:2879-82. 8. Spanu T, Sanguinetti M, D'Inzeo T, Ciccaglione D, Romano L, Leone F, et al. Identification of methicillin-resistant isolates of Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci responsible for bloodstream infections with the Phoenix system. Diagn Microbiol Infect Dis 2004;48:22-7. 9. Yamazumi T, Marshall SA, Wilke WW, Diekema DJ, Pfaller MA, Jones RN. Comparison of the Vitek Gram-Positive Susceptibility 06 card and the MRSA-screen latex agglutination test for determining oxacillin resistance in clinical bloodstream isolates of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 200;9:-6. 0. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Twentieth informational supplement, M00-S20. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 200.. Uh Y, Hwang GY, Jang IH, Kwon O, Yoon KJ, Kim HY. Distributions of macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance phenotypes in clinical isolates of staphylococi. Korean J Clin Microbiol 2008;:78-8. ( 어영, 황규열, 장인호, 권오건, 윤갑준, 김효열. 임상검체에서분리된 Staphylococcus 균속의 Macrolide-lincosamide-streptogramin B 내성표현형의분포. 대한임상미생물학회지 2008;:78-8.) 2. Lim HS, Lee H, Roh KH, Yum JH, Yong D, Lee K, et al. Prevalence
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