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단 보 The Korean Journal of Microbiology, Vol. 39, No. 3, September 2003, p. 201-205 Copyrightc2003, The Microbiological Society of Korea 구름버섯에서리그닌분해효소유전자들의클로닝 김용호 정수진 김선경 송홍규 최형태 * 강원대학교생명과학부미생물학과 리그닌분해에관련된효소중 laccase 는구리결합부위가, lignin peroxidase 와 manganese peroxidase 는헴 (heme) 결합부위의아미노산서열이잘보존된단백질들이다. 국내에서분리한구름버섯 (Trametes versicolor) 을대상으로관련유전자들의보존된지역의염기서열을근거로중합연쇄반응 (PCR) 에필요한 primer 를제작하였고, 이를사용하여해당유전자의조각을확보하였다. 이를 pgem-t vector 에 cloning 하고그염기서열을분석한결과약 1.3 kb 의 laccase 조각은다른백색부후균의 laccase 와 65~97% 의상동성을보였다. 또한 185 bp 의 lignin peroxidase 조각과 443 bp 의 manganese peroxidase 조각을타백색부후균의효소들과비교한결과각각 80~95% 및 61~83% 의상동성을보였다. Key words Trametes versicolor, laccase, lignin peroxidase, manganese peroxidase, PCR 리그닌은섬유질및 hemicellulose와함께자연계에매우풍부한유기탄소화합물이면서도아직활용도가가장낮은고분자화합물이다. 또한리그닌은분해가매우어려운화합물로서리그닌분해능을가진여러가지미생물및그효소들은다양한난분해성물질을분해할수있어오염물질및독성물질의제거가가능하므로리그닌분해관련미생물및효소들에대한연구가활발히진행되고있다 (5, 13). 담자균류중에서목재의섬유질과리그닌을함께분해하는백색부후균은리그닌을분해하는효소군, 즉 laccase, lignin peroxidase (LiP) 및 manganese peroxidase (MnP) 를모두, 또는일부가지고있어이들의효소단백질과유전자에대한연구가많은실험실에서진행되고있다. 국내에는자생하지않으나주로미국에서리그닌분해효소에대한연구가수행되는 Phanerochaete chrysosporium(2) 과우리나라의삼림에도널리분포하는 Trametes versicolor( 구름버섯 ) 의리그닌분해효소에대한연구가활발하게수행되고있다 (3, 14). 균류의 laccase는구리를가지고있는 blue copper oxidase로써 4곳의구리결합부위는잘보존되어있으며, 이지역의염기서열을 PCR primer로사용하여 laccase 유전자조각을 cloning할수있다 (1,4,11). LiP과 MnP는모두 heme을작용기로가지고있으며 heme 결합부위의염기서열도잘보존되어있어 PCR primer로사용할수있다. 본실험실에서는강원도동해지역에서분리한구름버섯을대상으로 hygromycin B에대한저항성을선택표지로사용하는형질전환방법을확립하였다 (12). 강력한리그닌분해능을가진이균을대상으로관련효소들의유전자에대한연구를수행하기위하여 primer를제작하고이를사용하여각효소들의유전자 *To whom correspondence should be addressed. Tel: 033-250-8543, Fax: 033-241-4627 E-mail: htchoi@kangwon.ac.kr 조각을 cloning하였으며보고된유전자와의상동성을비교하였다. 재료및방법균주및염색체 DNA 분리구름버섯 dikaryon(9522) 에서분리된 monokaryon(9522-1) 을실험에사용하였으며염색체 DNA는완전배지 (12) 에서 1일간진탕배양한균체로부터 CTAB 방법 (15) 으로분리하였다. Cloning된유전자조각의증폭을위하여대장균 XL1-Blue에형질전환방법으로재조합된벡터를도입하였다. Laccase 유전자조각의증폭 PCR에사용할 primer는다음과같이제작하였다. 구리결합부위가잘보존된 laccase의경우부위 I (P-1: 5'-CAYTGGCAYG- GNTTYTTYCA-3'; Kim 등, 2001) 을 forward primer, 부위 III (P-3: 5'-TGNCCGTGMARRTGSAANGG-3') 및부위 IV (P-4: 5' -RT-CRATRTGGCRTGSAGGAA-3'; 1) 를 reverse primer로사용하였다. PCR 수행조건은 96 o C에서 5분간 1회 denaturation하고, 95 o C 1분, 51 o C 2분 (P-1,3) 또는 52 o C 2분 (P-1,4), 72 o C 2분반응을 30회반복하였으며, 최종적으로 72 o C에서 5분간 1회증폭하였다. 증폭된유전자조각은 agarose gel로분석하였고, gel로부터 elution하여 pgem-t vector에 cloning한후염기서열을분석하였다.(m은 A 또는 C; N은 A, C, G, T 중하나 ; R은 A 또는 G; S는 C 또는 G; Y는 C 또는 T를나타냄 ) Peroxidase 유전자조각의증폭 LiP과 MnP들의유전자조각을증폭하기위한 primer는다음과같이제작하였다. P. chrysosporium을대표로 3가지백색부후균의 MnP들이가지는 heme 결합부위중에서 distal H (histidine) 201

202 Yong Ho Kim et al. Kor. J. Microbiol 부위 (F-1: 5'-CTGACSTTCCACGACGCCATC-3') 와 F-1의 downstream 부위 (F-2: 5'-CACGACGCCATCGSCATCTC-3') 를 forward prime 로, proximal H 부위 (R-1: 5'-CGTTGTTGGVRAGAAGTTGG-3') 와 hydrogen-bonded D (aspartic acid) 부위 (R-2: 5'-GTGCGASR- CSAGMAGMGMGAC-3') 를 reverse primer로사용하였다. PCR 수행조건은 F-1과 R-1 조합의경우 96 o C 5분 1회의 denaturation 과정, <95 o C 1분, 51 o C 2분, 72 o C 2분 > 증폭반응을 30 cycle, 그리고마지막에 72 o C 5분 1회로증폭하였다. F-2와 R-2 조합의경우 96 o C 5분 1회, <95 o C 1분, 60 o C 2분, 72 o C 2분 > 30 cycle, 72 o C 5분 1회로증폭하였다. 증폭된유전자조각은 laccase의경우와동일하게처리하여염기서열을분석하였다. 확인된염기서열을 GenBank의 Database를이용하여보고된효소들의유전자와그상동성을비교분석하였다. primer로사용하는 PCR을수행한결과 P-1과 P-3 조합에서약 1.3 kb와 1.4 kb 길이의조각을확보하였고 (Fig. 1), P-1과 P-4 조합에서 1.5 kb 및 1.6 kb 길이의증폭된 DNA를확인하였다 ( 자료미제시 ). 이들의염기서열을분석하기위하여증폭된 DNA를 pgem-t vector에 cloning하였다. P-1과 P-3 조합에서증폭된 1.3 kb 조각의염기서열을 Fig. 2와같으며이유전자를 klc1이라명명하였다. Klc1의아미노산서열을 Pleurotus ostreatus POX2 (6; GenBank Z34848), T. versicolor Lcc1 (10; GenBank X84683), T. villosa Lcc4 (17; GenBank L78077) 의해당부분과비교한결과각각 65.7%, 97.4%, 97.1% 의상동성을보였다 (Fig. 3). 이결과는확보한 Klc1의아미노산서열이같은종인 T. versicolor Lcc1과가장상동성이높았고, 세포생리학적특성이매우유사한 결과및고찰 Laccase 유전자증폭 구름버섯 monokaryon (9522-1) 의 laccase 유전자를증폭하기위하여염색체 DNA를 template로, 구리결합부위의염기서열을 Fig. 1. Agarose gel electrophoresis of PCR products by P-1 and P-3 primers of the laccase copper binding domains in T. versicolor. Lanes 1, 1 kb DNA molecular weight marker; 2, two PCR products. Fig. 2. Nucleotide sequences of the lower band (klc1) in Fig. 1, and its deduced amino acid sequence. Putative copper binding domains were underlined.

Vol. 39, No. 3 리그닌분해효소유전자 203 Fig. 3. Comparison of amino acid sequences of Klc1 with other laccases. The same amino acids were shaded. Pox2, P. ostreatus laccase 2 (GenBank Z34848); Lcc1, T. versicolor laccase 1 (GenBank X84683); Lcc4, T. villosa laccase 4 (GenBank L78077). T. villosa의 Lcc4와도높은상동성을보인반면느타리버섯균의 laccase와는상대적으로낮은상동성을보였다. P-1과 P-3 조합에서얻은약 1.4 kb 길이의유전자조각의염기서열을분석한결과 klc1과달랐으며, P-1과 P-4 조합에서는 P-1과 P-3 조합에서얻은각각의유전자를더길게증폭한것으로확인되었다 ( 자료미제시 ). Fig. 4. Agarose gel electrophoresis of PCR products and the pgem-t plasmids containing the cloned PCR products in T. versicolor. Lanes 1, 1 kb DNA molecular weight marker; 2, PCR product (klp1) amplified with F-1 and R-1 primers (185 bp); 3, cloned klp1 with pgem-t vector; 4, PCR product (kmp1) amplified with F-2 and R-2 primers (443 bp); 5, cloned kmp1 with pgem-t vector. Peroxidase 유전자증폭구름버섯의 LiP과 MnP들이가지는 heme 결합부위의염기서열을이용하여각효소의유전자를증폭하고자 PCR을수행한결과 F-1과 R-1 조합에서 185 bp의 DNA band를, F-2와 R-2 조합에서 443 bp 길이의 DNA band를확보하였고, 이들을각각 pgem-t vector에 cloning하였다 (Fig. 4). 증폭된 185 bp의염기서열은 Fig. 5A와같으며, LiP으로추정되는 Klp1의아미노산서열을 P. chrysosporium LiP1(16; GenBank AAD02880), T. versicolor LiP1(9; GenBank S32581), LiP2(9; GenBank S47649) 의해당부분과비교한결과각각 80%, 95%, 85% 의상동성을보였다 (Fig. 5B). klp1의 17번째 codon GNC가다른 LiP의경우와같이 GGC가되어 glycine이된다면 T. versicolor LiP1 (GenBank S32581) 과 97.5% 의높은상동성을보인다. F-1과 R-1 조합으로증폭된유전자조각이상대적으로짧아다른 LiP들과높은상동성을보인것으로판단되며, 더긴유전자를확보하여 Fig. 5. A: Nucleotide sequences of a PCR product (185 bp) and its deduced amino acid sequence. B: Comparison of amino acid sequence of Klp1 with other lignin peroxidases. Pc-lip, P. chrysosporium LIP (GenBank AAD46494I); Tv-lip1, T. versicolor LIP I/IV precursor (GenBank S32581); Tv-lip2, T. versicolor LIP II/III precursor (GenBank S47649) 분석한다면다음의 MnP 경우와같이 60~85% 정도의상동성을보일것으로판단된다. 증폭된 443 bp의염기서열은 Fig. 6에정리하였으며 MnP로추정되는 Kmp1의아미노산서열을 P. chrysosporium MnP1(7;

204 Yong Ho Kim et al. Kor. J. Microbiol 유전자에서고유한유전자를가지고있는것으로확인하였다. 앞 으로이유전자들에대한연구를통하여구름버섯이난분해성 물질을분해하는과정에서관련유전자들의발현조절기전을분 석하고자한다. 감사의글 이연구는한국과학재단특정기초연구 (R01-2002-000-00270-0) 지원으로수행되었음. 참고문헌 Fig. 6. Nucleotide sequences of kmp1 and its deduced amino acid sequence. Fig. 7. Comparison of amino acid sequences of Kmp1 with other lignin/ manganese peroxidases. Pc-Lip, P. chrysosporium lignin peroxidase B precursor (GenBank JH0156); Mnp2 T. versicolor manganese peroxidase isozyme Mnp2 (GenBank AAD02880); MP2, T. versicolor manganese peroxidase isozyme MP2 (GenBank CAA83148). GenBank JH0156), T. versicolor MNP2 (GenBank AAD02880; unpublished) 와 MP2 (8; GenBank CAA83148) 의해당부분과비교한결과각각 61%, 85%, 83% 의상동성을보였다 (Fig. 7). Blue copper oxidase라고도알려진 laccase는구리결합부위가잘보존되어있으므로해당지역의염기서열을 PCR primer로사용하여유전자조각의증폭이가능하다. 이실험을통하여 LiP과 MnP들이공통적으로가지는 heme-binding domain의염기서열을 PCR primer로사용할수있음이확인되었다. 또한이실험에서확보한구름버섯의 laccase, lignin peroxidase, manganese peroxidase 유전자의조각들을외국균주의해당유전자부분과비교하였을때 laccase인 Klc1의경우외국의동일균주와매우높은상동성을보인것에비하여 manganese peroxidase인 Kmp1 의아미노산서열은외국균주와 83-85% 의상동성을보였으며, 이는국내에서분리한미생물자원은외국의동일종과비교할때난분해성물질의분해와깊은관련이있는세가지효소들의 91. 조지현, 최형태, 김경훈. 2000. 영지버섯 laccase 유전자의구리결합부위 I 과 IV 사이지역의클로닝. 미생물학회지 36, 192-195. 92. Cameron, M., S. Timofeevski, and S.D. Aust. 2000. Enzymology of Phanerochaete chrysosporium with respect to the degradation of recalcitrant compounds and xenobiotics. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54, 751-758. 93. Collins, P.J., M.M. O'Brien, and A.D. Dobson. 1999. Cloning and characterization of a cdna encoding a novel extracellular peroxidase from Trametes versicolor. Appl. Environ. Microbiol. 65, 1343-1347. 94. D Souza, T.M., K, Boominathan, and C.A. Reddy. 1996. Isolation of laccase gene-specific sequences from white rot and brown rot fungi by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3739-3744. 95. Fritsche, W., K. Scheibner, A. Herre, and M. Hofrichter. 2000. Fungal degradation of explosives: TNT and related nitroaromatic compounds. In Biodegradation of nitroaromatic compounds and explosives, ed. by J. Spain, J. Hughes and H.-J. Knackmuss, Lewis Pub. Baca Raton. 96. Giardina, P., V. Aurilia, R. Cannio, L. Marzullo, A. Amoresano, R. Siciliano, P. Pucci, and G. Sannia. 1996. The gene, protein and glycan structures of laccase from Pleurotus ostreatus. Eur. J. Biochem. 235, 508-515. 97. Huopoene K., P. Ollikka, M. Kalin, I. Walther, P. Mantsala, and J. Reiser. 1990. Characterization of lignin peroxidase-encoding genes from lignin-degrading basidiomycetes. Gene 89, 145-150. 98. Johansson, T. and P.O. Nyman. 1996. A cluster of genes encodinf major isozymes of lignin peroxidase and manganese peroxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor. Gene 170, 31-38. 99. Jonsson, L. and P.O. Nyman. 1994. Tandem lignin peroxidase genes of the fungus Trametes versicolor. Biochim. Biophys. Acta 1218, 408-412. 10. Jonsson, L., K. Sjostrom, I. Haggstrom, and P.O. Nyman. 1995. Characterization of a laccase gene from the white-rot fungus Trametes versicolor and structural features of basidiomycete laccases. Biochim. Biophys. Acta 1251, 210-215. 11. Kim, S., Y. Leem, K. Kim, and H.T. Choi. 2001. Cloning of an acidic laccase gene (clac2) from Coprinus congregatus and its expression by external ph. FEMS Microbiol. Lett. 195, 151-156. 12. Kim, K., Y. Leem, K. Kim, K. Kim, and H.T. Choi. 2002. Transformation of the medicinal basidiomycete Trametes versicolor to hygromycin B resistance by restriction enzyme mediated integration. FEMS Microbiol. Lett. 209, 273-276. 13. Mester, T. and M. Tien. 2000. Oxidation mechanism of ligninolytic enzymes involved in the degradation of environmental pol-

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