ORIGINAL ARTICLE pissn: 2384-3799 eissn: 2466-1899 Int J Thyroidol 2018 November 11(2): 123-129 https://doi.org/10.11106/ijt.2018.11.2.123 갑상선종양에서 메틸화와 BRAF 유전자변이에관한연구 고려대학교의과대학이비인후 - 두경부외과학교실 오경호, 정광윤, 백승국, 우정수, 조재구, 권순영 Relation between Methylation and BRAF Mutation in Thyroid Tumor Kyoung Ho Oh, Kwang Yoon Jung, Seung Kuk Baek, Jeong Soo Woo, Jae Gu Cho and Soon Young Kwon Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Korea University College of Medicine, Seoul, Korea Background and Objectives: Hypermethylation of the tumor suppressor gene and activating mutation of BRAF gene have been recently reported in thyroid cancers. To investigate the role of these two epigenetic and genetic alterations in thyroid tumor progression, methylation of and BRAF mutation were examined in thyroid tumors. Materials and Methods: During 2007 to 2017, 69 papillary carcinomas, 18 nodular hyperplasia, 3 follicular carcinomas, and 13 follicular adenomas were selected. The methylation-specific polymerase chain reaction (MSP) technique was used in detecting methylation and polymerase chain reaction (PCR)-single-stranded conformation polymorphism and sequencing were used for BRAF gene mutation study. Results: The hypermethylation of the gene was found in 84.6%, 100% and 57.9% of follicular adenomas, follicular carcinomas, and papillary carcinomas, respectively. Nodular hyperplasia showed a hypermethylation in 33.3%. The BRAF mutation at V600E was found in 60.7% of papillary carcinoma and 27.0% of nodular hyperplasia, but none of follicular neoplasms. The BRAF mutation was correlated with the lymph node metastasis and MACIS clinical stage. There is an inverse correlation between methylation and BRAF mutation in thyroid lesions. Conclusion: Epigenetic inactivation of through aberrant methylation is considered to be an early step in thyroid tumorigenesis, and the BRAF mutation plays an important role in the carcinogenesis of papillary carcinoma, providing a genetic marker. Key Words:, Methylation, BRAF, Mutation, Thyroid 서론 갑상선암은국내에서 2015년기준으로전체암중에서남성에서 5번째, 여성에서는가장많이발생하는암이다. 1) 갑상선암종은조직학적으로여포성상피세포에서유래한유두상암종, 여포상암종, 역형성암종과부여포세포에서기원한수질성암종으로크게분류한 다. 갑상선암의발생은 RAS 유전자변이, BRAF 유전자의변이, RET/PTC 유전자재배열과같은 genetic alteration과종양억제유전자인 의 promoter 부분에위치하는 CpG island에서메틸화를보이는것과같은 epigenetic alteration이관여한다고알려져있다. 2-5) 유전자변이는갑상선암의종류에따라차이가있는데, 이중 BRAF (B-type Raf kinase) 유전자는 RAS 와결합을조절하며세포증식과분화에중요한역할을 Received October 23, 2018 / Revised November 12, 2018 / Accepted November 12, 2018 Correspondence: Soon Young Kwon, MD, PhD, Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Korea University Ansan Hospital, 123 Jeokgeum-ro, Danwon-gu, Ansan 15355, Korea Tel: 82-31-412-5170, Fax: 82-31-412-5174, E-mail: entkwon@korea.ac.kr Copyright c 2018, the Korean Thyroid Association. All rights reserved. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 123
Kyoung Ho Oh, et al 하는 serine/threonine kinase로서유두상암종에서높은발생률을보인다. 특히 V600E 타입에서변이가가장많이일어나며, RAS 변이와높은연관성이있다고알려져있다. 5-7) 최근갑상선암에서 유전자의동질접합체소실위치인 3p21.3에서의이형접합성소실 (loss of heterozygosity, LOH) 과 promoter 과메틸화현상이관련이있음이보고되었다. 8) 유전자는폐암, 유방암, 췌장암, 신장암, 간암및전립선암등여러신체에발생하는암의발생과관련이있는종양억제유전자로 RAS 관련 domain과신호전달및성장촉진과관련된 protein kinase C1 domain을가지고있다. 9-11) 본연구에서는갑상선종양에서 MSP (methylationspecific polymerase chain reaction) 방법으로 유전자의메틸화를조사하고, BRAF 유전자의변이를 polymerase chain reaction (PCR)-single-stranded conformation polymorphism (SSCP) 방법으로조사한다음변이가있는경우 sequencing하여돌연변이여부를확인하였다. 대상및방법 대상 2007년부터 2017년까지고려대학교의료원이비인후- 두경부외과에서갑상선결절로수술받은환자중파라핀고정으로갑상선조직의사용이가능한 103례를대상으로하였다. 수술후보고된조직학적진단을종양분류의기준으로하였고, 각각유두상암종 69례, 결절성증식증 18례, 여포성선종 13례, 여포성암종 3례를선택하였다. 성별은남자 11례, 여자 94례였고, 진단당시연령은 24세부터 82세로평균연령은 50.3세였다. 방법 1) 파라핀고정조직에서 DNA추출파라핀블록을각각 10 μm 두께로 4조각씩박절한후 eppendorf tube에넣은다음파라핀을제거하기위해 xylene 1 ml을가한후 56 o C에서 5분동안방치하였다가 13,000 rpm으로 10분간 24 o C에서원심분리하였다. 이런과정을 3회반복하였다. 무수메탄올 1 ml을각각가하고 5분간방치한후 10,000 rpm에서 8분간원심분리하였다. 이과정을 3회반복한후알코올을제거하기위해상온에서완전히시료를건조시켰다. High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche Molecular Systems, Inc., California, USA) 에서, tissue lysis buffer 200 μl와 proteinase K 40 μl를가한후 56 o C에서 24시간방치하였다. Binding buffer 200 μl를가한후혼합하여 72 o C에서 10분간방치하고 isopropanol 100 μl와혼합하였다. 8000 rpm에서원심분리를 1분간가한후 collection tube를교체하였다. Inhibitor removal buffer 500 μl를넣고 8000 rpm에서 1분간원심분리시키고 washing buffer 500 μl를가한후원심분리한후 collection tube를버리고 1.5 ml reaction tube 에 filter tube를끼웠다. 마지막으로 72 o C elution buffer 200 μl를 filter tube를가한후 1분간원심분리하고 microfuge tube에 DNA를얻어 20 o C에서보관하여 template DNA로사용하였다. 2) 유전자에대한 MSP 방법 (1) DNA의 bisulfite 처리분리한 DNA 48 μl와 5M NaOH 2 μl를 eppendorf tube에넣어 mixing 혼합한다음 37 o C water bath에서 10분간방치하였다가 sodium bisulfite (ph 5), hydroquinone 550 μl를넣어다시 50 o C water bath에서 16시간동안방치하였다. DNA clean up resin (Wizard R DNA clean up system, Promega Corp., Madison, USA) 1 ml를넣고혼합한후 vacuum을이용하여용액을뺀다음튜브에 isopropanol 2 ml를넣고내렸다. Minicolumn을 eppendorf tube에꽂고 10,000 rpm에서 2분간원심분리한후, 꽂힌 eppendorf tube를버리고새로운 eppendorf tube에 minicolumn을꽂고, 60-70 o C 사이의 DW 50 μl를넣고 10,000 rpm에서 20초간원심분리를시킨후 minicolumn을버린다. 5M NaOH 5 μl를상온에서 10분동안방치한후 3M NaAc 5 μl, 100% EtOH 150 μl를넣어혼합한후 20 o C에서 3시간동안방치하였다. 다시 4 o C 13,000 rpm으로 10분간원심분리시킨후 DNA pellet에 70% EtOH 1 ml를넣고 4 o C 10,000 rpm으로 8분간원심분리하였다. EtOH을버리고남은 DNA pellet를 mini-vacuum에서 15분간건조시켰다. DW 50 μl를넣고 pipetting한다음 20 o C에서보관하였다. (2) Methylation-specific PCR (MSP) 에대한 MSP를실시하였다. Bisulfite 처리한 DNA 5 μl (200-400 ng), primer 각각 3 μl, 2 μl dntp, 2.5 μl buffer, 0.2 μl Taq polymerase를가하여 20 μl 되게한후 PCR thermal cycler (Perkin Elmer 2400) 를사용하여 94 o C에서 60초, 59 o C에서 60초, 72 o C Vol. 11, No. 2, 2018 124
and BRAF in Thyroid Tumor 에서 60초간의반응을 40회반복하였다. 증폭된 PCR 산물을 1.5% agarose gel 전기영동으로확인하였다. 사용한 에대한 primer는 Forward 5' GCG TTG AAG TCG GGG TTC 3' 과 Reverse 5' CCC GTA CTT CGC TAA CTT TAA ACG 3' 였고, β actin에대한 primer는 Forward 5' TGG TGA TGG AGG AGG TTT AGT AAG T 3' 과 Reverse 5' AAC CAA TAA AAC CTA CTC CTC CCT TAA 3' 였다. BRAF 유전자변이검사 1) PCR-SSCP BRAF exon 15에대해 PCR을실시하였다. 증폭시킬각 DNA 2.5 μl (200-400 ng), primer 각각 1 μl, dntp 2 μl, buffer 2.5 μl, Taq polymerase 0.2 μl를가하여 20 μl 되게한후 PCR thermal cycler (Perkin Elmer, Massachusetts, USA) 를사용하여 94 o C에서 30초, 58 o C 에서 30초, 72 o C에서 30초간의반응을 40회반복하였다. 증폭된 PCR 산물을 1.5% agarose gel 전기영동으로확인하였다. 사용한 primer는 Forward 5'TCA TAA TGC TTG CTC TGA TAG GA-3', Reverse 5'GGC CAA AAA TTT AAT CAG TGG-3' 였다. PCR 산물을 10 μl 취해끓이면서변성시킨후, 얼음으로급히냉각시킨다음, 5% glycerol을포함한 12% polyacrylamide gel 에서 250 V로 5시간전기영동하였다. 전기영동이끝난 gel은 10% ETOH로 10분간고정시켰다. 아래기술한은염색법으로 DNA band pattern을확인하였다. 먼저 gel을 1% nitric acid에서 3분담근다음증류수를가해 3분간세척하고다시 0.2% silver nitrate 용액 (0.2% silver nitrate, 300 μl 37% formaldehyde, 200 ml DW) 을 30분간반응시킨후재빨리증류수로세척하였다. 발색용액 (6 g sodium carbonate, 120 μl formaldehyde, 200 ml DW, 100 μl 1% sod. thiosulfate) 을가한후 band가뚜렷이보일때까지반응시키고 10% glacial acetic acid로고정하였다. 양성대조로정상인의혈구세포에서분리한 DNA를이용하여 SSCP band 양상을비교검토하였다. 2) BRAF 유전자염기서열검사 ABI PRISM BigDye TM Terminator Cycle Sequencing Kits (ThermoFisher, Massachusetts, USA) 를이용하였다. PTC-225 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, Minnesota, USA) 를사용하여 PCR 반응을보고 BRAF primer를이용하여 sequence를조사하였다. 반응이끝나면 ethanol을이용하여반응하지않은 dntp와반응물을분리하고, 정제된 PCR product는 3차증류수에다시녹여 ABI PRISM 3730XL Analyzer (ThermoFisher, Massachusetts, USA) 로분석하였다. 통계분석 SPSS for Windows Version 20을이용하여분석하였으며, Chi-Square test와 t-test를사용하였다. 결과 유전자의메틸화 의메틸화는유두상암종에서 69례중 40례 (57.9%) 에서관찰되었고, 여포성암종 3례는모두 (100%) 메틸화를보였으며, 여포성선종은 13례중 11 례 (84.6%) 에서메틸화를보였다. 반면비종양성결절성 Fig. 1. The methylation status of the promoter region was analyzed by MSP; Methylation (m) and unmethylation-specific (u) primers were used. The methylationspecific product (93 bp) and unmethylation-specific product (105 bp) were resolved on 1.8% TBE gel. FA: follicular adenoma, FC: follicular carcinoma, NH: nodular hyperplasia, PC: papillary carcinoma Table 1. Methylation specific PCR analysis of methylation in thyroid lesions Histologic diagnosis Methylated/unmethylated bands +/+ +/ /+ / Methylated/total (%) Papillary carcinoma 24 16 29 0 40/69 (57.9) Follicular carcinoma 1 2 0 0 3/3 (100) Follicular adenoma 9 2 2 0 11/13 (84.6) Nodular hyperplasia 2 4 12 0 6/18 (33.3) 125 Int J Thyroidol
Kyoung Ho Oh, et al 증식에서는 18례 중 6례(33.3%)에서 메틸화를 보였다 메틸화와 BRAF 유전자 변이의 관계 (Table 1, Fig. 1). 메틸화와 BRAF 유전자 변이의 관계를 보 BRAF 유전자 변이 면 유두상 암종에서 메틸화를 보였던 40례 중 유전자 BRAF 유전자의 변이 여부를 확인하기 위해 exon 15 변이를 보이지 않은 예는 24례(60.0%)였던 반면 메틸화 에서 PCR-SSCP을 시행한 결과 유두상 암종은 69례 중 를 보이지 않았던 29례 중 24례(89.7%)에서 유전자 변 42례(60.8%)에서 유전자 변이가 관찰되었고, 결절성 증 이를 보였다. 여포성 암종과 여포성 선종은 각각 100%, 식에서는 18례 중 5례(27.7%)에서 변이가 관찰되었다. 84.6%로 높은 메틸화를 보였으나 BRAF 유전자 변이는 그러나 여포성 암종 3례와 여포성 선종 13례에서는 모 관찰되지 않았다(Table 2, Fig. 4). 두 유전자 변이를 보이지 않았다(Fig. 2). 염기서열 검 결론적으로 유두상 암종에서는 BRAF 유전자 변이 사에서 BRAF 변이를 보였던 42례의 유두상 암종에서 와 의 메틸화가 서로 상보적으로 관찰되는 반 모두 nucleotide 1796에서 T A (V600E)로 염기 간의 면, 여포성 종양에서는 의 메틸화만 관여하고 변화를 보였다(Fig. 3). Fig. 2. The example of BRAF (exon 15) mutation was analyzed by PCR-SSCP (single-stranded conformation polymorphism) in papillary thyroid carcinoma. The arrow indicates the mutation band. M: mutation, N: normal Fig. 4. The frequency of methylation and BRAF mutation. FA: follicular adenoma, FC: follicular carcinoma, NH: nodular hyperplasia, PC: papillary carcinoma Fig. 3. Sequencing of the BRAF gene. Heterozygous missense mutation (T1796A/V600E) in exon 15. (A) Papillary carcinoma tissue and (B) nucleotide sequence in the corresponding normal tissue. Table 2. Correlation between methylation and BRAF mutation in thyroid lesions Tumor Papillary carcinoma (n=69) Follicular neoplasm (n=16) Nodular hyperplasia (n=18) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) BRAF mutation ( ) 16 26 0 0 1 4 (40.0%) (89.7%) (0%) (0%) (16.7%) (33.3%) BRAF mutation ( ) 24 3 14 2 5 8 (60%) (10.3%) (100%) (100%) (83.3%) (66.7%) Total No. 40 29 14 2 6 12 Vol. 11, No. 2, 2018 126
and BRAF in Thyroid Tumor Table 3. Correlation between BRAF mutation and clinicopathologic features in papillary thyroid carcinomas BRAF (+) BRAF ( ) p value Age (years) 52.21 45.67 0.112 Sex (male:female) 39:3 23:4 0.303 Size (cm) 2.34 1.86 0.133 Invasion 24 (57%) 9 (33%) 0.053 Metastatic node 15 (36%) 3 (11%) 0.023 AMES 13:29 4:23 0.133 MACIS 5.59 4.68 0.004 AMES: Lahey Clinic Foundation, 1998, MACIS: Mayo Clinic, 1993 BRAF 유전자변이는관련이없으며, 결정성증식에는 BRAF 유전자와 의메틸화가일부관여한다고할수있겠다. 임상및조직학적특징과 의메틸화및 BRAF 유전자변이의관계 종양에서피막외침습유무, 종양의크기, 경부림프절전이유무, 원격전이유무, 병기등과 BRAF 유전자변이의차이를비교한결과 (Table 3), 환자의연령 (p=0.112), 성별 (p=0.303), 종양의크기 (p=0.133), 침습여부 (p=0.053) 와는유의한차이가없었으나, 림프절전이 (p=0.023) 와는유의한차이가있었으며임상병기중 AMES (Lahey Clinic Foundation, 1998) 와 MACIS (Mayo Clinic, 1993) 에서 AMES (p=0.133) 와는유의한차이가없었으나, MACIS (p=0.004) 에서는두군간에서통계적으로유의하게상관관계가있었다. 고찰 갑상선암은 DNA sequence의변화없이유전자의발현과 chromatin의변화를초래하는 epigenetic alteration 과 DNA 변이나재배열을보이는 genetic alteration 등에의해발생한다. 12) 종양억제유전자인 의 promoter 메틸화는대표적 epigenetic alteration 기전으로갑상선암, 폐암, 유방암, 비인강암, 췌장암, 난소암등암발생초기에나타나는것으로알려져있다. 13) 이렇게 DNA 메틸화의변화는여러암종에서볼수있는가장흔한분자적변화의하나로서 CpG dinucleotide 내의 cytosine에메틸기가공유결합을하는것으로인간게놈에다양한영향을주며특히종양억제유전자내에존재하는 CpG site는암을야기하는체세포돌연변이의중요한장소가된다. 14) 인간의유전자반이상 의 promoter에 CpG island라고알려진 CpG가풍부한 DNA 구조물이종양억제유전자의 promoter에서과메틸화가일어나게되면그유전자는활동하지않게되어결손이나돌연변이와같은기능장애를초래하게된다. 대표적인 promoter 과메틸화성장조절유전자에는, p16, TSHR, RAR-beta, S100, DH1, GSTpi, TIMP-3, TGF-beta, CALCA, DAP-Kinase 등이있다고알려져있다. 15-19) 본연구에서는이중 RAS 관련 domain과신호전달및성장촉진에관련된 protein kinase C1 domain을가진 유전자를 MSP를통해암종과비종양갑상선조직에서메틸화를측정하였다. 여포성선암과선종모두에서높은메틸화를보였고, 유두상암종은 57.9%, 결절성증식증에서는 33.3% 에서메틸화가관찰되어 의비활성화기전이병소유발의주요인자로간주된다고할수있겠다. BRAF 유전자의변이는 RET/PTC 재배열과함께갑상선유두암종의발생에중요한인자로알려져있다. 5) BRAF는 B-type Raf kinase로 RAS와결합을조절하며세포증식과분화에중요한역할을하는 serine/threonine kinase이다. 7) BRAF 유전자의변이에서가장흔한형태는 V600E 형태인데특이하게이돌연변이는 K-RAS 변이를가지고있다고한다. 20) 이는 BRAF 변이가 RAS 변이와서로밀접한관련이있음을보여준다. BRAF 유전자는최근에갑상선암을포함한여러암에서변이된다는사실이보고되었는데, 흑색종에서가장많이발견되고, 대장암, 난소암, 폐암에서도유전자결함을보였다. 20-23) 본연구결과 BRAF 유전자는유두상암종에서변이율이 60.8% 로갑상선종양중가장높았으며, 변이의유무에따라임상적인차이를보였다. BRAF 변이가관찰되는유두상암종군은변이를보이지않는군보다종양의크기 (2.34 cm/1.86 cm) 와연령 (52.21세/ 45.67세 ) 이높았으나, 통계학상에서유의한차이가없었다. 그러나변이가있는유두상암종에서는통계학적으로유의하게경부림프절전이가흔하였고, MACIS 점수가더높았다. 결절성과증식에서는이전연구와유사한 유전자의메틸화빈도를보였으나 BRAF 유전자변이는이전연구와는달리관찰되었다. 24) 본연구에서는 메틸화와 BRAF 변이는유두상암종과여포성암종에서서로다른결과를보였다. 즉여포성종양에서는 BRAF 유전자변이가관찰되지않고 메틸화만이높은빈도로관찰되는반면유두상암종에서는 의메틸화와 BRAF 127 Int J Thyroidol
Kyoung Ho Oh, et al 유전자변이는서로반대의관계를보였다. 이는아마도두암종의발생기전이서로다르다는사실을암시한다고생각한다. 갑상선암은여러염색체상위치 (1p, 3p, 3q, 10q, 11p, 13q, 22q) 에서이형접합성소실 (LOH) 을보인다. 특히 3번염색체단완에서의 LOH는갑상선암과같은고형암발생과정에서공통적으로나타난다고알려져있다. 7) 최근동질접합체결실위치인 3p21.3에 가위치한다고밝혀졌다. 12) 분자생물학적으로 단백은세포분열시방추사와중심체에위치하며세포분열표적단백이자 cyclin 분해단백인 Cdc20의기능을억제시키고, cyclin 단백의안정성을조절함으로써정확한세포분열진행과정과시간을조절한다. 12) 따라서 유전자가발현되지않으면비정상적인세포분열을유발하고, 세포분열진행시간을촉진시켜정상세포가암세포로전환되도록한다. 암발생초기에 유전자의발현이감소하게되면염색체의이상을초래하고다른항암유전자의돌연변이를촉진시켜결국악성종양으로발전시키게된다. 궁극적으로암유발의중요한원인이되는것은암억제유전자의비활성화이다. 12) 본연구를통해 promoter 과메틸화현상으로인한종양억제유전자인 유전자가불활성화됨으로써, 여포성종양을포함한양성갑상선질환과 BRAF 변이가없는유두상암종의발생에중요한역할을한다는사실을알수있었다. 갑상선암에서의 는 critical level에도달했을때메틸화가축적되고, genetic/epigenetic alteration이일어나면서양성종양에서계속증식하는세포의집단이형성된다고한다. 결론 유전자의메틸화와 BRAF 유전자의변이는유두상암종의 57.9% 와 60.8% 에서관찰되는반면, 여포성암종과선종에서는메틸화만 100% 와 84.6% 에서관찰되었고, 결절성증식증에서는 33.3% 와 27.7% 에서 메틸화와 BRAF 유전자변이가관찰되었다. BRAF 유전자변이는 V599A였다. 중심단어 :, 메틸화, BRAF, 변이, 갑상선. References 1) Ministry of Health and Welfare, Korea Cetral Cancer Registry, National Cancer Center. Anual report of cancer statistics in Korea in 2017. 2) Baylin SB. Mechanisms underlying epigenetically mediated gene silencing in cancer. Semin Cancer Biol 2002;12(5):331-7. 3) Kimura ET, Nikiforova MN, Zhu Z, Knauf JA, Nikiforov YE, Fagin JA. High prevalence of BRAF mutations in thyroid cancer: genetic evidence for constitutive activation of the RET/PTC-RAS-BRAF signaling pathway in papillary thyroid carcinoma. Cancer Res 2003;63(7):1454-7. 4) Moretti F, Nanni S, Pontecorvi A. Molecular pathogenesis of thyroid nodules and cancer. Baillieres Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2000;14(4):517-39. 5) Soares P, Trovisco V, Rocha AS, Lima J, Castro P, Preto A, et al. BRAF mutations and RET/PTC rearrangements are alternative events in the etiopathogenesis of PTC. Oncogene 2003;22(29):4578-80. 6) Namba H, Nakashima M, Hayashi T, Hayashida N, Maeda S, Rogounovitch TI, et al. Clinical implication of hot spot BRAF mutation, V599E, in papillary thyroid cancers. J Clin Endocrinol Metab 2003;88(9):4393-7. 7) Xing M. BRAF mutation in thyroid cancer. Endocr Relat Cancer 2005;12(2):245-62. 8) Lerman MI, Minna JD. The 630-kb lung cancer homozygous deletion region on human chromosome 3p21.3: identification and evaluation of the resident candidate tumor suppressor genes. The International Lung Cancer Chromosome 3p21.3 Tumor Suppressor Gene Consortium. Cancer Res 2000;60(21):6116-33. 9) Agathanggelou A, Honorio S, Macartney DP, Martinez A, Dallol A, Rader J, et al. Methylation associated inactivation of from region 3p21.3 in lung, breast and ovarian tumours. Oncogene 2001;20(12):1509-18. 10) Burbee DG, Forgacs E, Zochbauer-Muller S, Shivakumar L, Fong K, Gao B, et al. Epigenetic inactivation of in lung and breast cancers and malignant phenotype suppression. J Natl Cancer Inst 2001;93(9):691-9. 11) Dammann R, Yang G, Pfeifer GP. Hypermethylation of the cpg island of Ras association domain family 1A (), a putative tumor suppressor gene from the 3p21.3 locus, occurs in a large percentage of human breast cancers. Cancer Res 2001;61(7):3105-9. 12)Xing M, Cohen Y, Mambo E, Tallini G, Udelsman R, Ladenson PW, et al. Early occurrence of hypermethylation and its mutual exclusion with BRAF mutation in thyroid tumorigenesis. Cancer Res 2004;64(5):1664-8. 13)Schagdarsurengin U, Gimm O, Hoang-Vu C, Dralle H, Pfeifer GP, Dammann R. Frequent epigenetic silencing of the CpG island promoter of in thyroid carcinoma. Cancer Res 2002;62(13):3698-701. 14) Boltze C, Zack S, Quednow C, Bettge S, Roessner A, Schneider-Stock R. Hypermethylation of the CDKN2/p16INK4A promotor in thyroid carcinogenesis. Pathol Res Pract 2003; 199(6):399-404. 15) Harada K, Toyooka S, Maitra A, Maruyama R, Toyooka KO, Timmons CF, et al. Aberrant promoter methylation and silencing of the gene in pediatric tumors and cell lines. Oncogene 2002;21(27):4345-9. 16) Hawthorn L, Stein L, Varma R, Wiseman S, Loree T, Tan D. TIMP1 and SERPIN-A overexpression and TFF3 and Vol. 11, No. 2, 2018 128
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