Journal of Bacteriology and Virology 2016. Vol. 46, No. 4 p.248 257 http://dx.doi.org/10.4167/jbv.2016.46.4.248 Original Article Immunostimulatory Activity of Apios Tuber Extract on RAW264.7 Macrophage Cells Jun Cui 1,2, Yosup Kim 1, Eun Byul Lee 1, Jong-Keun Kim 3, Tae-Hoon Kang 4* and Ho Hee Jang 1,5 * 1 Department of Molecular Medicine, Graduate School of Medicine, Lee Gil Ya Cancer and Diabetes Institute, Gachon University, Incheon, Korea; 2 Department of Pharmacology, College of Medicine, Yanbian University, Yanji, People's China; 3 Sungkyun Biotech Co., Ltd R&D Center, Sungkyunkwan University, Suwon; 4 Health Care Institute, Phytomecca Co., Ltd, Incheon; 5 Department of Biochemistry, College of Medicine, Gachon University, Incheon, Korea Apios americana Medik tubers are medicinal foods with anti-cancer and anti-inflammatory activities. However, mechanisms of immunostimulatory action of the Apios tuber extract (ATE) on macrophages have not been elucidated. In the present study, we investigated whether ATE could modulate immune responses, such as production of nitric oxide (NO), proinflammatory cytokines, and transcription factors, in RAW264.7 macrophage cells. ATE significantly increased the production of NO and proinflammatory cytokines such as interleukin-1β (IL-1β), IL-6, and tumor necrosis factor-α (TNF-α), and induced the mrna and protein levels of inducible nitric oxide synthase (inos), cyclooxygenase-2 (COX-2) and proinflammatory cytokines in a dose-dependent manner. Furthermore, Western blot analysis revealed that ATE activated the transcription factor Nuclear Factor-κB and mitogen-activated protein kinases signaling cascades, including extracellular signal-regulated kinase, c-jun N-terminal kinase, and p38 kinase. In addition, we found that ATE induced the activation of macrophages through upregulation of toll-like receptor 4 (TLR4) and TLR2. Taken together, these findings indicate that ATE possesses a potential as a functional food with immunostimulatory activity. Key Words: Apios americana Medik, Immunostimulatory activity, Nitric oxide, Cytokines, Toll-like receptor INTRODUCTION 면역이란자기자신과외부물질을구별하여배제함으로써, 외부로부터침입해오는각종물질로부터자기자신을보호하는생체방어수단이다. 면역반응은인체내존재하는각종면역세포들에의해이루어지며, 이러한면 역세포들의증식및분화는다양한종류의외부자극에의해조절되고활성화된다. 이중큰포식세포 (macrophage) 는체내의모든조직에분포하면서평상시에는노화된세포에대한탐식작용 (phagocytosis) 을통하여인체내불필요한찌꺼기를제거하는역할을담당하다가세균 (bacteria) 이나바이러스 (virus) 와같은병원성미생물의침입시활성화되어 1차적면역기능을수행한다. 또한큰포식세포는 Received: November 18, 2016/ Revised: November 29, 2016/ Accepted: December 2, 2016 These authors contributed equally to this work. * Corresponding author: Dr. Ho Hee Jang. Department of Biochemistry, College of Medicine, Gachon University, Incheon 21999, Korea. Phone: +82-32-899-6317, Fax: +82-32-899-6318, e-mail: hhjang@gachon.ac.kr * Corresponding author: Dr. Tae-Hoon Kang. Health Care Institute, Phytomecca Co., Ltd, Incheon 21990, Korea. Phone: +82-32-720-5533, Fax: +82-32-720-5535, e-mail: hoony89652@hanmail.net ** This study was supported by a grant from the Technological Innovation R&D Program (S2226237) funded by the Small and Medium Business Administration. CC This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/license/by-nc/3.0/). 248
Immunostimulatory Activity of Apios Tuber Extract 249 항원제시작용또는각종사이토카인 (cytokine) 및생리활성물질을분비하여 2차적면역반응을극대화시키는중요한매개체역할을담당한다. 활성화된큰포식세포에서분비하는사이토카인및생리활성물질에는 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), IL-6, interferon-γ (IFN-γ) 및 nitric oxide (NO) 등이알려져있으며, 이는암세포에대한직접적이독성을나타내어항암에도효과적인것으로알려져있다 (1, 2). 이와같이큰포식세포는선천성면역반응 (innate immune response) 을담당하는주요세포로알려져있어, 각종염증성질환및면역조절에효과적인물질탐색연구에널리활용되고있다. Toll-like receptor (TLR) 는세포막에존재하면서세균이나바이러스와같은병원성미생물의침입시에이들이가진특정분자패턴을인식하여활성화되어숙주의선천적면역반응을매개하는수용체단백질이다 (3, 4). 현재까지 13종류의 TLRs가밝혀져있으며, 이중 TLR1, TLR2 및 TLR4는세균의 lipopolysaccharide (LPS) 또는바이러스의 double-stranded RNA 등과같은특이적인리간드를인식하여세포내부의신호전달경로를활성화시킴으로써다양한전사인자들을활성화시킨다 (5). 이는여러가지사이토카인, 케모카인 (chemokine) 및인터페론 (interferon) 의생성을촉진시킴으로써효과적인 1차및 2차면역반응을유도하여외부감염으로부터숙주를보호한다 (6~9). 아피오스 (Apios americana Medik) 는콩과에속하는덩굴성다년생초본으로, 북미동부의온대및아열대지역이원산지인외래종작물이다. 아피오스는지상부에꽃과잎을, 지하부에덩이줄기모양의괴경을형성하는데, 예로부터북미인디언들이괴경부위를식용으로많이이용한탓에 ' 인디언감자 ' 라고도불린다. 아피오스는아시아지역에서는일본에먼저도입되어어린이와여성들의영양간식으로애용되고있으며, 최근국내에도도입되어재배되고있다. 일반적으로아피오스에는지질, 단백질, 칼슘, 철분, 식이섬유, 사포닌등여러가지영양소가다량함유되어있으며, 단백질은고구마의 4배, 칼슘은우유의 2배, 철분은감자의 4배, 식이섬유는감자의 5배에이르는것으로알려져있다. 또한아피오스는여러종류의 isoflavone glucosides을주요성분으로함유하고있으며 (10), 항산화및전립선암예방에효과적인것으로보고되어있다 (11, 12). 본연구에서는마우스큰포식세포주를이용하여아피오스괴경추출물의면역증강활성및분자적작용기전을 규명하고, 면역증강소재로서의개발가능성을알아보고자하였다. MATERIALS AND METHODS 시료의조제본연구에사용된시료아피오스괴경추출물의원료인아피오스괴경은국내산으로경상남도사천시의농가로부터구입하였다. 건조된아피오스괴경 100 g에 70% 에탄올 1 l를첨가하여 80 에서 3시간환류추출하였다. 추출액은여과지로여과한후, 60 에서에탄올이완전히제거되는시점까지농축기 (N-1000; EYELA, Tokyo, Japan) 를이용하여감압농축하였다. 이후농축액은 -110 에서 3일간동결건조하여분말화하였으며, 분말화된시료는 dimethylsulfoxide (DMSO; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 에녹여실험에사용하였다. 세포배양본연구에사용된마우스큰포식세포주인 RAW264.7 세포는한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea) 으로부터분양받아사용하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 가첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 배지를사용하여 37, 5% CO 2 조건에서배양하였다. 세포생존율측정 RAW264.7 세포를 96 well plate에 5 10 3 cells/well이되도록분주한다음, LPS (Sigma Aldrich, St Louis, MO) 를 (1 μg/ml) 또는다양한농도 (0, 12.5, 25, 50, 100 및 200 μg/ ml) 의아피오스괴경추출물을처리하여 24시간배양하였다. 배양액에 10 μl씩동일한양의 EZ-CyTox cell viability assay kit (Daeil Lab Service, Seoul, Korea) 시약을각각의 well에넣고 3시간반응시켰다. VersaMax microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 를이용하여 450 nm 파장에서흡광도를측정한다음, 평균흡광도 (cell viability (%) = mean absorbance in test wells/mean absorbance in control wells 100) 로세포생존율을계산하였다. NO 생성량측정 RAW264.7 세포를 96 well plate에 1 10 5 cells/well이되도록분주한다음, LPS (1 μg/ml) 또는다양한농도 (0,
250 J Cui, et al. 12.5, 25, 50, 100 및 200 μg/ml) 의아피오스괴경추출물을처리하여 24시간배양하였다. 배양액에동일한양의 Griess reagent (1% sulfanilamide, 0.1% N-[1-naphthy]-ethylenediamine dihydrochloride, 5% phosphoric acid) 를첨가하고실온에서 10분간반응시킨후, VersaMax microplate reader를이용하여 540 nm 파장에서흡광도를측정하였다. NO 농도는 NaNO 2 표준액을이용하여정량곡선을작성한후, 이를기준으로계산하였다. 사이토카인분비량측정 RAW264.7 세포를 12 well plate에 5 10 5 cells/well이되도록분주하고 24시간배양한다음, LPS (1 μg/ml) 또는다양한농도 (0, 25, 50, 100 및 200 μg/ml) 의아피오스괴경추출물을처리하여 48시간배양하였다. 상층액을모은후, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MI, USA) 를이용하여 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 각각의분비량을측정하였다. RNA 추출및 RT-PCR RAW264.7 세포를 6 well plate에 1 10 6 cells/well이되도록분주하고 24시간배양한다음, LPS (1 μg/ml) 또는다양한농도 (0, 25, 50, 100 및 200 μg/ml) 의아피오스괴경추출물을처리하여 6시간배양하였다. 배양액을버리고 phosphate-buffered saline (PBS; Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 로 2회세척한후, total RNA extraction kit (Qiagen, Hilden, Germany) 를이용하여세포로부터 total RNA를분리하였다. Total RNA를정량하고, high-capacity cdna RT kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 를이용하여 1 μg씩동일한양의각 total RNA로부터각각의 cdna를합성하였다. inos, COX-2, TNF-α, IL-1β, IL-6, TLR2 및 TLR4 등각각의유전자에해당되는 primer를사용하여 94 45초, 62 45초, 72 1분, 총 35 cycles 조건으로 PCR을수행하였다. PCR product는 1.5% agrarose gel 상에전기영동하여 UV transilluminater로확인하였다. 정량적비교를위해서 Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) 를이용하여밴드의 density를측정한후 β-actin으로표준화하여비교그래프로나타내었다. RT-PCR에사용된 oligonucleotides sequence는다음과같다. inos, Forward: 5'-CCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3', Reverse: 5'-GG- CTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG-3', COX-2, Forward: 5'- TCTCAGCACCCACCCGCTCA-3', Reverse: 5'-GCCCCGT- AGACCCTGCTCGA-3', TNF-α, Forward: 5'-TTGACCTCA- GCGCTGAGTTG-3', Reverse: 5'-CCTGTAGCCCACGTCGT- AGC-3', IL-1β, Forward: 5'-TTGACGGACCCCAAAGAGTG- 3', Reverse: 5'-ACTCCTGTACTCGTGGAAGA-3', IL-6, Forward: 5'-GTACTCCAGAAGACCAGAGG-3', Reverse: 5'- TGCTGGTGACAACCACGGCC-3', TLR2, Forward: 5'-CGG- AGGTAGAGTTCGACGACTG-3', Reverse: 5'-GGCTTCCT- CTTGGCCTGG-3', TLR4, Forward: 5'-CCTGTAGAGATGA- ATACCTC-3', Reverse: 5'-TGTGGAAGCCTTCCTGGATG-3', β-actin, Forward: 5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC- 3', Reverse: 5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'. 세포질과핵분리 RAW264.7 세포를 6 well plate에 1 10 6 cells/well이되도록분주하고 24시간배양한다음, LPS (1 μg/ml) 또는다양한농도 (0, 25, 50, 100 및 200 μg/ml) 의아피오스괴경추출물을처리하여 24시간배양하였다. 배양이끝난세포를수집하여차가운 PBS로 2회세척한다음, hypotonic buffer (10 mm 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) ph 7.9, 10 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2, 0.2 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.5 mm dithiothreitol (DTT), 10 μg/ml aprotinin) 를첨가하여현탁시켰다. 얼음에 15분간방치하고 0.1% NP-40를첨가하여잘섞어준다음, 4, 15,000 rpm에서 1분간원심분리하여세포질내단백질이포함된상층액을수집하였다. 상층액이제거된 pellet에 high-salt buffer (20 mm HEPES, ph 7.9, 25% glycerol, 400 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2, 0.2 mm ethylenediaminetetraacetic acid, 0.5 mm DTT, 1 mm NaF, 1 mm sodium orthovanadate) 를첨가하여현탁시킨후, 4, 15,000 rpm에서 1분간원심분리하여핵내단백질이포함된상층액을수집하였다. Western blot analysis 수집된단백질들은 BCA protein assay reagent kit (Pierce, Rockford, IL, USA) 를이용하여농도를측정한후, 20 μg 씩동일한양의각단백질을 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis 겔에전기영동하고, nitrocellulose membrane (Whatman, Dassel, Germany) 상으로 transfer하였다. 항체의비특이적결합을차단하기위하여 membrane에 5% skim milk를넣고 1시간반응시킨다음, antiinos monoclonal antibody (BD Biosciences, San Diego, CA, USA), anti-cox-2 polyclonal antibody (Santa Cruz Technology
Immunostimulatory Activity of Apios Tuber Extract 251 Technology), anti-tlr2 polyclonal antibody (Cell Signaling Technology), TLR4 polyclonal antibody (Cell Signaling Technology) 및 anti-β-actin monoclonal antibody (Sigma Aldrich) 항체가첨가된 5% skim milk로교체하여 4 에서 12시간반응시켰다. TBST (50 mm Tris-HCl (ph 7.5), 150 mm NaCl, 0.1% Tween-20) 로 5분간 3회세척하고각각에대한이차항체로실온에서 1시간반응시킨후, TBST로 5분간 3회세척하였다. ECL solution (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 을이용하여 membrane 을 3분간반응시킨후, Chemi- Doc XRS+ image analyzer (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) 를이용하여각단백질의발현을확인하였다. 정량적비교를위해서 Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) 를이용하여밴드의 density 를측정한후 β-actin 으로표준화하여비교그래프로나타내었다. 통계분석본연구에서얻은정량적인결과는평균값과표준편차로표시하였다. 통계처리는 Student's t-test 방법을사용하여그룹간차이를비교하였으며, *p < 0.05 인경우유의성이있는것으로판정하였다. Figure 1. Effect of ATE on nitric oxide (NO) production and cell viability of RAW264.7 cells. (A) RAW264.7 cells were treated with various concentrations (12.5, 25, 50, 100, and 200 μg/ml) of ATE or LPS (1 μg/ml) and then incubated for 24 h. Nitrite levels in the culture media were determined using the Griess reagent and were presumed to reflect the levels of NO. (B) RAW264.7 cells were treated with 12.5~200 μg/ml of ATE for 24 h. Cell viability was quantified using the EZ-CyTox cell viability assay kit. Data are presented as the means ± SD of three independent experiments. *p < 0.05 vs. control. Inc., Santa Cruz, CA, USA), anti-nuclear factor (NF)-κB p65 polyclonal antibody (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), anti-iκb polyclonal antibody (Cell Signaling Technology), anti- PARP monoclonal antibody (Santa Cruz Technology Inc.), antiphospho-erk1/2 polyclonal antibody (Cell Signaling Tech- nology), anti-erk1/2 polyclonal antibody (Cell Signaling Tech- nology), anti-phospho-p38 polyclonal antibody (Cell Signaling Technology), anti-p38 polyclonal antibody (Cell Signaling Tech- nology), anti-phospho-jnk polyclonal antibody (Cell Signaling Technology), anti-jnk polyclonal antibody (Cell Signaling RESULTS 아피오스괴경추출물이큰포식세포의 NO 생성에미치는영향아피오스괴경추출물이 NO 생성에미치는영향을알아보기위하여 Griess reagent assay를실시하였다. 이를위해 RAW264.7 세포에아피오스괴경추출물을농도별 (0, 12.5, 25, 50, 100, 및 200 μg/ml) 로처리하여 24시간배양하였다. 그결과, NO 생성은아피오스괴경추출물처리농도에의존적으로증가되는것을관찰할수있었으며 (Fig. 1A), 아피오스괴경추출물처리에따른유의적인세포독성은관찰되지않았다 (Fig. 1B). 아피오스괴경추출물이 inos와 COX-2 mrna 및단백질발현에미치는영향아피오스괴경추출물이 inos 및 COX-2 의 mrna 및단백질발현에미치는영향을알아보기위하여 RT-PCR 과 Western blot analysis 를실시하였다. 이를위해 RAW264.7 세포에아피오스괴경추출물을농도별 (0, 25, 50, 100, 및 200 μg/ml) 로처리하여 6시간또는 24시간배양하였다. 그
252 J Cui, et al. Figure 2. Effect of ATE on the mrna and protein expression of inos and COX-2 in RAW264.7 cells. (A) RAW264.7 cells were treated with various concentrations (25, 50, 100, and 200 μg/ml) of ATE or LPS (1 μg/ml) for 24 h. Total RNA was isolated for RT-PCR analysis of the expression of inos and COX-2. *p < 0.05, **p < 0.01 vs. control. (B) RAW264.7 cells were treated as described above. inos and COX-2 protein levels were detected by Western blot analysis. *p < 0.05, **p < 0.01 vs. control. 결과, inos와 COX-2 모두 mrna 및 단백질 발현이 아피 오스 괴경 추출물 처리농도에 의존적으로 증가되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 2A, 2B). 아피오스 괴경 추출물이 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생 성에 미치는 영향 3B, 3C). 아피오스 괴경 추출물이 TLR2와 TLR4 mrna 및 단 백질 발현에 미치는 영향 아피오스 괴경 추출물이 TLR2와 TLR4 mrna 및 단 백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 RT-PCR과 TNF-α, IL-1β 및 IL-6는 큰포식세포가 분비하는 주요한 Western blot analysis를 실시하였다. 이를 위해 RAW264.7 염증성 사이토카인으로 알려져 있다. 따라서 아피오스 괴 세포에 아피오스 괴경 추출물을 농도별(0, 25, 50, 100, 및 경 추출물이 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성에 미치는 영향을 200 μg/ml)로 처리하여 6시간 또는 24시간 배양하였다. 그 알아보기 위하여 RT-PCR, Western blot analysis 및 ELISA 결과, TLR2와 TLR4 모두 mrna 및 단백질 발현이 아피 kit assay를 실시하였다. 이를 위해 RAW264.7 세포에 아피 오스 괴경 추출물 처리농도에 의존적으로 증가되는 것을 오스 괴경 추출물을 농도별(0, 25, 50, 100, 및 200 μg/ml) 관찰하였다(Fig. 4A, 4B). 로 처리하여 6시간, 24시간 또는 48시간 배양하였다. 그 결과, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 mrna 발현이 아피오스 괴경 추출물 처리농도에 의존적으로 증가되었으며(Fig. 3A), 단 백질 발현 및 분비량 또한 아피오스 괴경 추출물 처리 농도에 의존적으로 증가되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 아피오스 괴경 추출물이 큰포식세포의 mitogenactivated protein kinases (MAPK) 신호전달경로에 미 치는 영향 아피오스 괴경 추출물이 MAPK 신호전달경로에 미치는
Immunostimulatory Activity of Apios Tuber Extract 253 Figure 3. Effect of ATE on cytokine production in RAW264.7 cells. (A) RAW264.7 cells were treated with various concentrations (25, 50, 100, and 200 μg/ml) of ATE or LPS for 24 h. Total RNA was extracted for RT-PCR analysis of the expression of IL-1β, IL-6, and TNF-α. PCR of the β-actin gene was performed as a housekeeping control. *p < 0.05, **p < 0.01 vs. control. (B) Protein expression of IL-1β, IL-6, and TNF-α was assessed by Western blot analysis. The experiment was repeated in triplicate, and similar results were obtained in all three replicates. *p < 0.05, **p < 0.01 vs. control. (C) RAW264.7 cells were treated with various concentrations of ATE (25, 50, 100, and 200 μg/ ml). The supernatants were collected, and the extracellular levels of cytokines were measured in the culture media using cytokine ELISA kits. The results are reported as the mean ± SD of three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01 vs. control. 영향을 알아보기 위하여 아피오스 괴경 추출물 처리에 따 p38 및 JNK 단백질의 인산화가 아피오스 괴경 추출물 처 른 EKR1/2, p38, JNK 단백질의 인산화 정도를 Western blot 리농도에 의존적으로 증가되는 것을 관찰하였으며(Fig. 5A), analysis로 알아보고자 하였다. 이를 위해 RAW264.7 세포 200 μg/ml 농도의 아피오스 괴경 추출물을 시간별(0, 15, 에 아피오스 괴경 추출물을 농도별(0, 25, 50, 100, 및 200 30, 및 60분)로 처리할 시 이들 단백질의 인산화가 30분까 μg/ml)로 처리하여 30분간 배양하였다. 그 결과, ERK1/2, 지 크게 증가되다가 점차적으로 감소되는 것으로 확인할
254 J Cui, et al. Figure 4. Effect of ATE on the mrna and protein expression of TLR2 and TLR4 in RAW264.7 cells. (A) RAW264.7 cells were treated with the indicated concentrations of ATE (0, 50, 100, and 200 μg/ml) or LPS (1 μg/ml) for 6 h. The mrna levels of TLR2 and TLR4 were detected by RT-PCR. (B) The protein levels of TLR2 and TLR4 were evaluated by Western blot analysis. *p < 0.05, **p < 0.01 vs. control. 수 있었다(Fig. 5B). 아피오스 괴경 추출물이 큰포식세포의 NF-κB 활성화 에 미치는 영향 을 유도함으로써, NF-κB 활성화를 유도한다는 것을 의미 한다. DISCUSSION 면역세포가 분비하는 국소 단백질인 염증성 사이토카인 은 NF-κB 활성화에 의해 발현된다. 따라서 아피오스 괴 NO는 정상적인 상태에서는 혈관의 항상성 유지, 신경 경 추출물이 NF-κB 활성화에 미치는 영향을 알아보기 위 전달물질, apoptosis 유도 등과 같은 생리적으로 중요한 기 하여 아피오스 괴경 추출물 처리에 따른 NF-κB p65 단백 능을 담당하지만, 과량의 NO는 정상세포를 공격하여 염 질 발현 정도를 Western blot analysis로 알아보고자 하였 증을 유도하여 급성 및 만성 염증질환의 원인으로, 독성 다. 이를 위해 RAW264.7 세포에 아피오스 괴경 추출물 을 갖는 염증매개인자로 알려져 있다 (13). 하지만 적절한 을 농도별(0, 25, 50, 100, 및 200 μg/ml)로 처리하여 24시 양의 NO는 면역세포를 활성화시켜 외부 병원체로부터의 간 배양한 다음, 핵 내 단백질 fraction 및 세포질 내 단백 저항성을 가진다. 따라서 NO를 효과적으로 조절하는 것 질 fraction으로 각각 분류하였다. 그 결과, 핵 내 단백질 은 면역조절에 있어서 대단히 중요하며, 실제로 이에 대 fraction에서 NF-κB p65 단백질 발현은 아피오스 괴경 추 한 연구가 활발히 진행되고 있다. 출물 처리농도에 의존적으로 증가된 반면, 세포질 내 단 본 연구에서는 아피오스 괴경 추출물을 처리할 시, 마 백질 fraction에서의 NF-κB 단백질 발현은 감소되는 것을 우스 큰포식세포주인 RAW264.7 세포에서 NO 생성이 촉 관찰하였다(Fig. 6A, 6B). 이는 아피오스 괴경 추출물이 세 진되었으며(Fig. 1), inos 및 COX-2의 mrna 및 단백질 포질에 존재하는 NF-κB p65 단백질의 핵 내 translocation 발현 또한 처리농도에 의존적으로 증가되는 것을 확인할
Immunostimulatory Activity of Apios Tuber Extract 255 Figure 5. Effect of ATE on the MAPK pathway in RAW264.7 cells. (A) RAW264.7 cells were incubated with the indicated concentrations of ATE or LPS for 30 min. The protein levels of phospho-erk1/2, ERK1/2, phospho-p38, p38, phospho-jnk, and JNK were determined by Western blot analysis. (B) RAW264.7 cells were treated with ATE for 15, 30, and 60 min. The protein levels of phospho-erk1/2, ERK1/2, phospho-p38, p38, phospho-jnk, and JNK were determined by Western blot analysis. *p < 0.05, **p < 0.01 vs. control. 수 있었다(Fig. 2). TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등과 같은 염증성 만 이러한 면역증강 활성은 아피오스 괴경 내 어떠한 성 사이토카인은 면역세포가 분비하는 대표적인 국소 단백질 분에 의한 것인지는 본 연구결과로 판단할 수 없다. 다만 로서, 세포의 성장, 분화, 활성화, 염증 및 면역반응 등의 아피오스가 이소플라본(isoflavones)을 다량 함유하는 콩과 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 이러한 사이토카인 식물인 점과 실제 이소플라본을 다량 함유한 점으로 미루 또한 효과적으로 조절 시, 큰포식세포의 활성화를 도와 어볼 때 아피오스 괴경 내에 존재하는 특정 이소플라본 외부로부터 유입되는 병원성 물질에 대한 저항성을 키워 성분에 기인할 것으로 여겨진다. 실제 genistein, daidzein, 면역력을 향상시킨다. 본 연구에서는 RAW264.7 세포에서 glycitein과 같은 이소플라본 성분의 면역증강효과는 보 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 mnra 및 단백질 발현이 아피오스 고되고 있다 (14). 게다가 몇몇 연구들에 따르면 겨우살 괴경 추출물에 의해 증가되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 이가 암세포에 대한 세포독성 및 면역증강 활성을 가지 3). 이는 아피오스 괴경 추출물이 면역세포를 활성화 시킴 며 (15, 16), 이러한 활성이 겨우살이 내에 존재하는 '렉틴 으로써, 면역증강 활성을 가질 수 있음을 의미한다. 하지 (letin)' 성분에 기인하는 것으로 보고된 바 있다 (17, 18).
256 J Cui, et al. Figure 6. Effect of ATE on NF-κB activation in RAW264.7 cells. RAW264.7 cells were incubated with ATE (0, 25, 50, 100, and 200 μg/ml) or LPS (1 μg/ml). Proteins were analyzed by Western blot analysis. β-actin and PARP were used as a control. *p < 0.05, **p < 0.01 vs. control. 겨우살이에 함유된 렉틴 성분이 면역세포와 렉틴 당 결합 이상의 결과로 미루어 볼 때, 아피오스 괴경 추출물은 을 유도함으로써, 면역세포로부터 TNF-α, IL-1β, IFN-γ 등 큰포식세포의 TLR2/4활성화를 통하여 그 신호를 MAPK 과 같은 여러 가지 염증성 사이토카인들을 생산하는 비특 신호전달경로에 전달하고 이후 전사인자인 NF-κB를 활성 이적 면역자극활성을 나타내어 생체방어력을 증진시키는 화시킴으로써, 궁극적으로 큰포식세포의 활성화를 유발하 것으로 알려졌다. 흥미롭게도 최근 아피오스 괴경 내에도 는 것으로 판단된다. 최근 H1N1 인플루엔자 바이러스로 렉틴 성분이 함유되어 있다는 연구결과가 보고됨에 따라 급성 폐손상이 유발된 마우스에 아피오스 괴경 추출물을 (19), 아피오스 괴경 추출물의 면역증강 활성은 렉틴 성분 투여할 시, 염증을 억제하여 폐 손상을 감소시킬 수 있음 에 의한 것일 수도 있다고 추측되나, 추가적인 성분분석 을 보고한 바 있다 (23). 이는 아피오스 괴경 추출물이 면 연구를 통하여 규명할 필요가 있다. 역력을 증진시켜 감기예방에도 효과적일 수 있음을 의미 큰포식세포는 세포막에 존재하는 TLRs와 같은 pattern recognition receptors (PRRs)를 통하여 병원체의 분자적 구 하는 것으로, 아피오스 괴경 추출물은 면역증강용 기능성 소재로 활용될 가능성이 충분하다고 판단된다. 조를 인식하고, 이를 바탕으로 MAPK 및 NF-κB 신호전 달경로를 활성화하는 것으로 알려져 있다 (20~22). 본 연 REFERENCES 구에서는 RAW264.7 세포에서 TLR2와 TLR4 mrna 및 단백질 발현 모두 아피오스 괴경 추출물에 의해 증가되는 1) Hamsa TP, Kuttan G. Evaluation of the anti-inflammatory 것으로 나타났으며, TNF-α, IL-1β와 IL-6 mnra 및 단백질 and anti-tumor effect of Ipomoea obscura (L) and its mode 발현이 아피오스 괴경 추출물에 의해 증가하는 것을 확인 of action through the inhibition of proinflammatory cyto- 할 수 있었다(Fig. 3). kines, nitric oxide and COX-2. Inflammation 2011;34:171
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