The Korean Journal of Microbiology, Vol. 44, No. 1, March 2008, p. 14-21 Copyrightc2008, The Microbiological Society of Korea Bovine Herpesvirus Type 1 정량검출을위한 Real-Time PCR 이동혁 1 정효선 2 이정희 1 김태은 1 이정숙 2 김인섭 1 * 1 한남대학교생명 나노과학대학생명과학과, 2 한스바이오메드 ( 주 ) 한스대덕연구소 소의혈액, 세포, 조직, 기관등은생물의약품과조직공학제제, 세포치료제의원료로널리사용되고있다. 소유래물질을원료로사용한제제의경우소유래원료물질에다양한바이러스가오염된사례가있기때문에바이러스안전성검증이필수적이다. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) 은소에게가장흔하게감염되는바이러스중의하나이다. 소유래물질을원료로하는생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제등에서 BHV-1 안전성을확보하기위해, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 BHV-1 을정량적으로검출하고, 제조공정에서 BHV-1 제거검증을위한시험법으로활용이가능한 BHV-1 real-time PCR 시험법을확립하였다. BHV-1 에특이적인 primer 를선별하였으며, 형광염료 SYBR Green I 을사용하여 BHV-1 DNA 정량검출시험법을최적화하였다. 세포배양법에의한감염역가와비교한결과 real-time PCR 민감도는 2 TCID 50 /ml 이었다. 확립된시험법의신뢰성 (reliability) 을보증하기위해시험법검증을실시한결과특이성 (specificity) 과재현성 (reproducibility) 이우수함을확인하였다. 확립된 realtime PCR 을생물의약품제조공정검증에적용할수있는지확인하기위하여인위적으로 BHV-1 을오염시킨 Chinese hamster ovary (CHO) 세포주와소유래콜라겐에서 BHV-1 검출시험을실시하였다. BHV-1 을감염시킨 CHO 세포에서세포변병효과를관찰할수없었지만, 세포와세포배양상청액에서 BHV-1 을정량적으로검출할수있었다. 소유래콜라겐에서도 10 TCID 50 /ml 까지정량적으로검출할수있었다. 위와같은결과에서확립된 BHV-1 real-time PCR 시험법은생물의약품안전성보증을위한세포주검증, 생물의약품생산공정검증, 바이러스제거공정검증등에서감염역가시험법과같은생물학적시험법을대신할수있는신속하고, 특이성과민감성이우수한시험법임을확인하였다. Key words bovine herpesvirus type 1, Chinese hamster ovary (CHO) cell, collagen, real-time PCR, virus validation 소유래혈액, 세포, 조직, 기관등은생물의약품과조직공학제제, 세포치료제의원료로널리사용되고있다 (24, 28). 소유래혈청은치료용단백질과항체등을생산하기위해사용하는 CHO 세포, baby hamster kidney (BHK) 세포, hybridoma 세포와백신을생산하기위한세포주를배양하기위한원료물질로사용된다. 또한소유래혈청은자가세포치료제, 동종유래세포치료제또는이종세포치료제의배양을위한원료물질로도사용된다 (10). 소조직으로부터추출하는콜라겐은낮은항원성, 지혈효과, 세포부착능력이우수하기때문에의료용생체재료로널리이용되고있다 (11, 20, 21, 23). 소양막은세포성장인자가풍부하며, 염증유발유전자발현억제, 단백질분해억제, 흉터생성억제등의효능이있는조직적합성의료용소재로창상피복제, 각막이식제등의원료로사용된다 (5, 12). 이러한세포배양유래생물의약품과조직공학제제, 세포치료제는생체에서유래한복잡한분자구조를가진물질로최종제품에대한물리화학적분석만으로는제품의효능을평가하기어렵다. 또한원료자체에감염성병원인자가 오염될가능성이크기때문에안전성에관한논란이오래전부터있어왔다 (4, 15, 19). 따라서최근 World Health Organization *To whom correspondence should be addressed. Tel: 82-42-629-8754 Fax: 82-42-629-8751 E-mail: inskim@hnu.kr (WHO), 미국, 유럽등을중심으로이러한제제의최종제품에대한안전성과유효성분석과함께원료부터완제품에이르는전체제조공정에대한철저한품질관리의중요성이대두되고있는실정이다 (2, 6, 16). 소유래물질에오염될수있는감염성병원인자중바이러스는종류의다양성과검출방법의제한성으로인해그중요성이더강조되고있다 (17). 세계각국의규제기관에서는생물의약품과조직공학제제, 세포치료제에서내인성또는외래성위해바이러스의오염을방지하기위하여감도와특이도가우수한검출시험방법개발, 바이러스제거및불활화공정확립과검증, 바이러스관련기준규격제정등에관한연구를활발히진행하고있다 (18). 생물의약품, 조직공학의약품, 세포치료제제조시사용되는원료물질의기원과특성에따라오염바이러스의검색대상이매우다양하나, 소유래원료물질을함유한제제에있어서공통적인검색대상이되는대표적인오염바이러스는 Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) 이다 (9). BHV-1 은소에게전염성비기관염 (infectious bovine rhinotracheitis), 전염성농포성외음질염 (infectious pustular vulvovaginitis), 전염성농포성포피염 (infectious pustular balanoposthitis), 유산, 결막염, 뇌염등을유발하는가장전형적인병원성바이러스이다. 이바이러스는 Herpesviridae 과에속하 14
15 Dong Hyuck Lee et al. Kor. J. Microbiol 며, 선형의 double-stranded DNA로구성된 137 kb 유전체를갖고있는외피보유바이러스 (enveloped virus) 이다 (27). BHV-1은동물세포배양배지로사용되는우혈청 (Fetal bovine serum) 에가장빈번하게오염되는바이러스중의하나이기때문에생물의약품생산용세포주와제조공정에오염될가능성이있다 (3, 10, 13). BHV-1 검출시험법에대한연구는주로인공수정을위해사용할소의정자에서 BHV-1 감염여부를빠른시간에진단하고자하는 PCR과 nested-pcr 시험법에집중되어왔다 (8, 14, 22, 25). 본연구에서는소유래물질을원료로하는생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제등에서 BHV-1 안전성을확보하기위해, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 BHV-1 을정량적으로검출하고, 제조공정에서 BHV-1 제거검증을위한시험법으로활용이가능한민감도와특이도가우수한 real-time PCR 시험법을확립하고자하였다. 또한확립된 real-time PCR 시험법을활용하여인위적으로 BHV-1 을감염시킨 CHO 세포와소유래콜라겐에서 BHV-1 을정량적으로검출하여바이러스안전성검증시험법으로의활용가능성을평가하였다. BHV-1 의배양및정량 재료및방법 BHV-1 (ATCC VR-188) 의배양과정량을위해 Madian-Derby bovine kidney (MDBK; ATCC CCL-22) 세포를사용하였다. MDBK 세포를 10% 우혈청 (Gibco BRL, USA) 을첨가한 Dulbecco's Minimun Essential Medium (DMEM: Gibco BRL, USA) 배지에배양하였다. T-150 flask에배양된단층세포에바이러스를감염시킨후주기적으로세포병변효과 (cytopathic effect: CPE) 를관찰하였다. CPE가명백하게관찰될때배양액과세포를수거한다음, 400 g에서 5분간원심분리하여상층액은따로모으고 pellet은재현탁하였다. Pellet을동결과해빙과정을 2회반복하여파쇄한후 400 g에서 5분간원심분리하여상등액을얻었다. 원심상등액을혼합한후 0.45 µm filter로여과한다음소분하여 -70 o C에보관하였다. BHV-1 의정량을위해감염성있는바이러스의 titer를 50% tissue culture infectious dose (TCID 50 ) 로나타내었다. BHV-1 을 2% 우혈청을첨가한 DMEM 배지로 7배수로희석하여 24 well plate에배양된세포에 0.25 ml씩접종하였다. 음성대조군으로세포배양배지를 0.25 ml씩접종하였다. 그후 CO 2 배양기에서 5% CO 2, 35 o C로배양하면서계속적으로현미경으로 CPE를관찰하였다. Primer 의선별 BHV-1 유전자를증폭하기위해사용한올리고핵산 primer 염기서열은 NCBI data base에보고된 BHV-1 complete genome (NC 001847) 을기초로 Primer3 Software를이용하여디자인하였다 (Table 1). Corbett Research사 (Australia) 의 PALM-CYCLER 를이용한일반 PCR 반응을통해디자인한 primer 5쌍들의특이 성을확인하고, annealing temperature와 MgCl 2 농도를변화시켜 PCR 조건을최적화하였다. 또한증폭된 DNA가목적하는산물인지를확인하기위하여 PCR product의 DNA sequencing을실시하였다. BHV-1 DNA는 GENE ALL TM Blood SV Mini Kit (General Biosystem, Korea) 을사용하여분리하였다. PCR 반응을위해바이러스 genomic DNA 2 µl, 10 pmol forward primer 1 µl, 10 pmol reverse primer 1 µl, 2 GoTaq Green Master Mix (Promega, USA) 12.5 µl 혼합액에 Nuclease-free water 8.5 µl를첨가하여최종부피를 25 µl로맞추었다. 핵산증폭은 preincubation은 95 o C에서 2분, denaturation은 95 o C에서 30초, annealing은 30초 (annealing 온도최적화를위해 52, 54, 56, 58 o C에서 PCR 수행 ), extention은 72 o C에서 1분으로하여 45 cycle 을수행하였다. 45 cycle PCR 후 72 o C에서 5분반응시킨후 1.5% agarose gel (Sigma Co., USA) 을사용하여 100 V 전압으로 30분정도전기영동한후 ethidium bromide로염색하여 PCR 반응산물을확인하였다. Real-time PCR 을이용한 BHV-1 DNA 정량 BHV-1 의정량을위해일반 PCR을통해확립된 PCR 조건을기초로 AccuPower Greenstar PCR Premix Ex Taq (Bioneer, Korea) 을사용하여 real-time PCR 조건을확립하였다. BHV-1 정량을위해 Corbett Research사의 Rotor-Gene 3000 real-time PCR 기계를사용하였다. PCR 반응액은 AccuPower Greenstar PCR Premix Ex Taq 5 µl, 10 pmol forward primer 0.5 µl, 10 pmol reverse primer 0.5 µl, template 2 µl에멸균된 3차증류수를넣어총 20 µl가되게하였다. 핵산증폭은 pre-incubation은 95 o C에서 15분, denaturation은 95 o C에서 10초, annealing은 30초 (annealing 온도최적화를위해 52, 54, 56, 58, 60 o C에서 realtime PCR 수행 ), extention은 72 o C에서 30초로하여 50 cycle을수행하였다. 마지막 cycle 후에는모든반응물에대하여 72부터 95 o C까지영역에서 melting curve 분석을실시하였다. 최적 MgCl 2 농도를설정하기위해최적화된 annealing 온도 52 o C에서 MgCl 2 를 2 mm에서 5 mm까지변화시켜첨가해준 BHV-1 DNA 농도에따른 crossing point 값을비교하였다. Titer를측정하고자하는시료들과함께 Titer가 2 10 7 TCID 50 / ml인 BHV-1 을순차적으로 2 10 0 TCID 50 /ml까지 10단계희석한후 real-time PCR을수행하여정량을위한표준곡선을작성하였다. 시료속에들어있는 BHV-1 DNA의양을표준곡선에대입하여정량하였다. 표준곡선은 BHV-1 의농도에따라 real-time PCR 에의해검출되는 crossing point 값을 TCID 50 equivalent/ml로전환하여작성하였다. Crossing point는 PCR cycle이 exponential phase로들어가는 cycle 수를나타낸다. 시료속에들어있는 BHV-1 양을환산하기위해아래와같은식을사용하였다. Virus titer (TCID 50 equivalent/ml) = Result (TCID 50 equivalent/µl) Elution volume (µl)/sample volume (ml)
Vol. 44, No. 1 Bovine herpesvirus type 1 정량검출을위한 real-time PCR 16 Real-time PCR 의신뢰성검증 확립된 BHV-1 DNA 정량법의신뢰성 (reliability) 을보증하기위해확립된실험법의민감도 (sensitivity), 재현성 (reproducibility) 등을검증하였다. 민감도를측정하기위해 titer가 2 10 7 TCID 50 / ml인 BHV-1 을순차적으로 2 10 0 TCID 50 /ml까지 10단계희석한후 real-time PCR을수행하였다. 재현성검증을위해 titer가 2 10 7 TCID 50 /ml인 BHV-1 을순차적으로 2 10 0 TCID 50 /ml까지 10 단계희석한표준시료를서로다른날에 3회정량분석하여 crossing point 값을비교하였다. 특이성검증을위해 human parvovirus B19 (BBI Diagnostics, USA), minute virus of mice (ATCC VR 1346), bovine parvovirus (ATCC VR 767), porcine parvovirus (ATCC VR 742) 에대한 cross-reactivity를측정하였다. 시험에사용한바이러스의 titer는각각 9.4 10 5 IU/ml, 10 6 TCID 50 /ml, 10 6 TCID 50 /ml, 10 6 TCID 50 /ml 이었다. 인위적으로 BHV-1 을감염시킨 CHO 세포에서 real-time PCR 을이용한 BHV-1 검출 확립된 real-time PCR을생물의약품제조공정검증에적용할수있는지확인하기위하여인위적으로 BHV-1 을오염시킨 CHO 세포주에서 BHV-1 검출시험을실시하였다. CHO DG44 세포를 5% 우혈청을첨가한 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM: Gibco BRL, USA) 배지에 100 Hypoxanthine- Thyminidine supplement (HT supplement; Gibco BRL, USA) 1% 를첨가하여배양하였다. T-25 flask에배양된 CHO DG44에 BHV-1 을감염시킨후 4일동안배양하였다. 세포배양액을제거한후세포배양액에남아있을수있는 BHV-1 을완벽히제거하기위해 phosphate buffered saline (PBS) 으로 3번세척한다음 CHO DG44를계대배양하였다. 4일동안배양한후다시계대배양한다음 4일후에현미경으로 CHO DG44의모양을관찰한 후세포배양액과세포를따로수거하였다. 확립된 real-time PCR 방법을이용하여세포배양액과세포에 BHV-1 이존재하는지여부를확인하였다. Real-time PCR 양성대조군으로는 Titer가 10 7 TCID 50 /ml인 BHV-1 을사용하였으며, 음성대조군으로는 CHO 세포주배양배지또는비감염된 CHO 세포주를사용하였다. 소유래콜라겐에서 real-time PCR 을이용한 BHV-1 검출 확립된 real-time PCR을소유래콜라겐제조공정검증에적용할수있는지확인하기위하여인위적으로 BHV-1 을오염시킨 콜라겐에서 BHV-1 검출시험을실시하였다. Titer가 10 8 TCID 50 / ml인 BHV-1 을순차적으로 10배씩희석한후각희석액 0.2 ml 을소유래콜라겐 1.8 ml에 spiking한다음확립된 real-time PCR 방법을사용하여 BHV-1 을검출하였다. Real-time PCR 음성대조군으로는바이러스를첨가하지않은콜라겐을사용하였다. 결과 Primer의선별 PCR 방법을사용하여특정바이러스존재를확인하고, 정량분석하기위해서는바이러스내에서유전적인변이가심하지않은 conserved sequence를가진부위를선택하여야한다. 선택된 sequence는특정바이러스에만존재하여특이성이높아야한다. 생물의약품과조직공학제제, 세포치료제의원료물질, 공정중간물질, 최종제품등에미량으로오염될수있는바이러스검출을위한정량 PCR의경우높은민감도가요구된다 (1, 2). 위와같은조건을만족하는 PCR을확립하기위해 Primer3 Software를이용하여 BHV-1 특이적인 primer 5쌍을디자인하였다 (Table 1). 일반 PCR을실시하여각각의 primer 쌍들의민감도를확인하였다. Titer 가 2 10 3 TCID 50 /ml과 2 10 1 TCID 50 /ml인 BHV-1 을시료로 PCR을수행한결과 primer 쌍 BHV-F2, BHV-R2가가장민감도가우수하였다 ( 자료미제시 ). PCR 조건을최적화한결과 annealing temperature와 MgCl 2 농도는각각 52 o C와 3 mm이었다. 최적조건에서 PCR의민감도를측정하였다. Titer 가 2 10 7 TCID 50 /ml인 BHV-1 을순차적으로희석하여 PCR한결과 2 10 0 TCID 50 /ml까지 PCR 산물을확인할수있었다 (Fig. 1). PCR 산물을 sequencing한후 blast searching (www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/) 한결과 PCR 산물이 BHV-1 유전자임을확인할수있었다 ( 자료미제시 ). BHV-1 DNA 정량을위한 real-time PCR 최적화일반 PCR을통해확립된 PCR 조건을기초로 AccuPower Greenstar PCR Premix Ex Taq (Bioneer, Korea) 을사용하여 real-time PCR 조건을확립하였다. Forward primer로 BHV-F2를 reverse primer로 BHV-R2를사용하여 PCR 반응의 annealing temperature를최적화하였다 (Fig. 2). Titer 가 2 10 7 TCID 50 /ml, 2 10 5 TCID 50 /ml, 2 10 3 TCID 50 /ml, 2 10 1 TCID 50 /ml인 BHV를시료로 annealing temperature를 52, 54, 56, 58 o C로변화시키며 Table 1. Sequences of oligonucleotide primer sets used in the detection of BHV-1 Forward primer Reverse primer Nucleotide position a Amplicon size BHV-F1 GACCCTCGCCGATATTTATT BHV-R1 GAGGGACCACAGAGAAGGAT 127549-127651 103 BHV-F2 GAGGGACCACAGAGAAGGAT BHV-R2 GACCCTCGCCGATATTTATT 110567-110669 103 BHV-F3 GCGTCGTTTCTAAAGAGCAG BHV-R3 GAGCTGTTCACCCAAAAAGA 23143-23255 113 BHV-F4 GCCGCAAGTTTATGCTGTAT BHV-R4 CATCGAGGCAGTGTAGGTCT 706-849 144 BHV-F5 GGTGCATTGAGCTTGACTTT BHV-R5 GTACTTGTTGGGGACACAGG 1458-1600 143 a NC 001847
17 Dong Hyuck Lee et al. Kor. J. Microbiol Fig. 1. Sensitivity of PCR assay for detection of BHV-1. M, 100 bp DNA ladder; 1; 2 107 TCID50/ml, 2; 2 106 TCID50/ml, 3; 2 105 TCID50/ml, 4; 2 104 TCID50/ml, 5; 2 103 TCID50/ml, 6; 2 102 TCID50/ml, 7; 2 101 TCID50/ml, 8; 2 100 TCID50/ml, NC; Negative control. Fig. 2. Optimization of annealing temperature. The crossing point value refers to the cycle number at which the fluorescence of the PCR reaction rises above a set threshold and is inversely proportional to the amount of starting target. ( ) 2 107 TCID50/ml, ( ) 2 105 TCID50/ ml, ( ) 2 103 TCID50/ml, ( ) 2 101 TCID50/ml, ( ) Negative control. Fig. 3. Sensitivity of real-time PCR assay for quantification of BHV1. (A) Amplification plots obtained with 10-fold serial dilutions of BHV-1 stock solution. (B) Melting curve analysis of the amplification plot. BHV-1 stock solution of 2 107 TCID50/ml was serially diluted and cycle-by-cycle detection of BHV-1 DNA was performed with SYBR Green I. real-time PCR을 수행하였을 때 52oC에서 crossing point가 가장 낮게 나타나 52oC가 최적 온도임을 알 수 있었다. 최적 온도에서 MgCl2 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하 (reliability)을 보증하기 위해 확립된 실험법의 민감도(sensitivity), 였다(Table 2). Titer가 2 105 TCID50/ml, 2 103 TCID50/ml, 2 재현성(reproducibility), 특이성(specificity) 등을 검증하였다. 민감 10 TCID50/ml인 BHV-1을 시료로 MgCl2 농도를 2 mm, 3 도를 측정하기 위해 titer가 2 107 TCID50/ml인 BHV-1을 순차적 mm, 4 mm, 5 mm로 변화시켜가며 real-time PCR을 수행하였 으로 10배씩 희석한 후 real-time PCR을 수행하였다. 각 시료에 을 때 2 mm에서 crossing point가 가장 낮게 나타나 최적 대해 real-time PCR cycle 수에 따른 fluorescence값의 증가를 관 1 MgCl2 농도는 2 mm임을 알 수 있었다. 찰한 결과 민감도는 2 TCID50/ml임을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). Melting curve 분석 결과 BHV-1 DNA에 특이적인 부분과 Real-time PCR의 신뢰성 검증 primer dimer 등 비특이적인 부분으로 나뉘었으며, 완충용액 대 BHV-1 DNA 정량을 위한 real-time PCR 방법의 신뢰성 조군에서는 BHV-1 DNA에 특이적인 peak를 확인할 수 없었다 (Fig. 3B). 증폭된 PCR 산물을 2% (w/v) agarose gel을 사용하 Table 2. Optimization of MgCl2 concentration in real-time PCR assay TCID50/ml MgCl2 concentration 여 전기 영동한 결과 각 BHV-1 양성시료에서 예상 크기의 밴드 를 확인할 수 있었지만, 완충용액 대조구에서는 PCR 산물을 확 인할 수 없었다(자료 미제시). 2 mm 3 mm 4 mm 5 mm 확립된 BHV-1 DNA 정량법의 재현성 검증을 위해 서로 다른 5 2 10 a 21.02 25.42 33.38 41.84 날에 BHV-1 표준시료에서 DNA를 추출하고 real-time PCR을 2 103 27.91 32.29 38.18 43.24 수행한 후 crossing point 값을 비교하였다(Fig. 4). BHV-1 log 2 10 34.74 36.91 41.00 44.74 titer (log10 TCID50/ml; x)에 대한 crossing point 값(y) 간의 표준 Buffer control 47.50 46.90 a Values indicate crossing point value 47.20 47.54 회귀식은 첫째 날의 경우 y=-4.3831x+50.671 (결정계수 r2= 1 0.995), 둘째 날의 경우 y=-4.3262x+50.255 (r2=0.994), 셋째 날의
Vol. 44, No. 1 Bovine herpesvirus type 1 정량검출을위한 real-time PCR 18 Fig. 4. Reproducibility of real-time PCR assay for quantitative detection of BHV-1. The standard curves were obtained by the regression analysis of crossing point values versus initial virus titer. These results were obtained from three independent assays performed at different days. 경우 y=-4.1439x+49.666 (r 2 =0.996) 로 BHV-1 log titer와 crossing point 값간의회귀성이매우높았다. 다른 DNA virus들 (human parvovirus B19, minute virus of mice, bovine parvovirus, porcine parvovirus) 을대상으로특이성을실험할결과 BHV-1 의경우에만 fluorescence값의증가를관찰할수있었고, 다른바이러스에서는완충용액음성대조군과같이 fluorescence값의증가를관찰할수없었다 (Fig. 5A). Realtime PCR 산물을 1.5% agarose gel 상에서분석한결과 BHV-1 양성대조군에서만 PCR 반응산물이생성되었고, 다른바이러스와완충용액음성대조군에서는 PCR 반응산물이생성되지않았다 (Fig. 5B). 이와같은결과에서확립된 real-time PCR 방법은 BHV-1 에특이적인실험법임을확인하였다. BHV-1 이오염된 CHO 세포주에서 real-time PCR 을이용한 BHV-1 검출 확립된 real-time PCR을생물의약품제조공정에적용할수있는지확인하기위하여인위적으로 BHV-1 을오염시킨 CHO 세포주에서 BHV-1 검출시험을실시하였다. T-25 flask에배양된 CHO DG44 세포에 BHV-1 을인위적으로오염시킨후 T-25 flask에 3번이상계대배양하면서병변효과를관찰하였다. BHV- 1은 CHO DG44 세포주에서병변효과를나타내지않았다 (Fig. 6A and B). 세포배양상청액 4 ml을회수하고, CHO DG44 세포를 trypsin을처리하여 4 ml 부피로회수하였다. 세포배양상청액과 CHO 세포에서각각 DNA를추출하고, 확립된 real-time PCR을활용하여 BHV-1 을정량검출하였다 (Fig. 6C). 세포배양액에서는 1.4 10 6 TCID 50 equivalent/ml BHV-1 이검출되었고, 세포에서는 5.8 10 5 TCID 50 equivalent/ml BHV-1 이검출되었다. 증폭된 PCR 산물을 1.5% (w/v) agarose gel을사용하여전기영동한결과각 BHV-1 양성시료, 세포배양액, 세포에서예상크기의밴드를확인할수있었지만, 음성대조구에서는 PCR 산물을확인할수없었다 (Fig. 6D). BHV-1 이비감염된 CHO DG44에서도 BHV-1 을검출할수없었다 ( 자료미제시 ). 소유래콜라겐에서 Real-Time PCR 을이용한 BHV-1 검출 Fig. 5. Specificity of real-time PCR assay to potential cross-reactive viruses. (A) Amplification plots. ( ) Bovine herpesvirus type 1, ( ) human parvovirus B19, ( ) minute virus of mice, ( ) bovine parvovirus, ( ) porcine parvovirus, ( ) Negative control. (B) Agarose gel electro-phoresis of the PCR products. Specificity of the real-time PCR assay was evaluated using the optimized protocol and then the PCR products were analyzed by 1.5% agarose gel electrophoresis. M; 100 bp DNA ladder, 1; Bovine herpesvirus type 1, 2; human parvovirus B19, 3; minute virus of mice, 4; bovine parvovirus, 5; porcine parvovirus, NC; Negative control. 확립된 real-time PCR을소유래콜라겐제조공정에적용할수있는지확인하기위하여인위적으로 BHV-1 을오염시킨콜라겐에서 BHV-1 검출시험을실시하였다. Titer가 10 8 TCID 50 /ml인 BHV-1 을순차적으로 10배씩희석한후 real-time PCR을수행하고, 각시료에대해 real-time PCR cycle 수에따른 fluorescence 값의증가를관찰한결과 10 TCID 50 /ml 까지정량적으로검출할수있었다 (Fig. 7). 고 소유래혈액, 세포, 조직, 기관등을이용하여생산되는생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제는원료자체에감염성병원인자가오염될가능성이있기때문에안전성확보가가장큰문제중의하나로대두되고있다. 인체에유해한바이러스가오염되는것을방지하여안전한생물학적제제가제조되도록하기위해서는오염바이러스의검출및불활화또는제거검증관련기술을확립해야만한다 (1, 4, 7). 또한완제품은물론원료부터완제품의생산에이르기까지전체제조공정에대한철저한품질관리가필수적이다. BHV-1 은소에게가장흔하게감염되는바이러스 찰
19 Dong Hyuck Lee et al. Kor. J. Microbiol Fig. 7. Quantitative detection of BHV-1 in artificially contaminated bovine collagen. BHV-1 stock solution of 10 8 TCID 50 /ml were serially diluted with 10-fold and then 0.2 ml of each diluted solution was spiked in a 1.8 ml aliquot of 0.5% bovine collagen. Cycle-by-cycle detection of BHV-1 DNA in the artificially contaminated bovine collagen was performed with SYBR Green I. Fig. 6. Quantitative detection of BHV-1 in artificially infected CHO DG44 cell line. (A) Morphology of CHO DG44 cell line not infected with BHV-1. (B) Morphology of CHO DG44 cell line infected with BHV-1. (C) Amplification plots of BHV-1 positive control, CHO DG44 cell line infected with BHV-1, cell culture supernatant, and negative control. (D) Agarose gel electrophoresis of the PCR products. M; 100 bp DNA ladder, 1; BHV-1 positive control, 2; CHO DG44 cell line infected with BHV-1, 3; cell culture supernatant, NC; negative control. 중의하나이기때문에소유래원료물질을사용하는생물의약품과조직공학제제, 세포치료제의경우 BHV-1 에오염될가능성이있다. BHV-1 은생물의약품제조용세포주의배양을위해첨가하는우혈청에오염된사례가있기때문에, 인체에직접적인위해여부는알려져있지않지만, 잠재적인위해요소의하나이다. 따라서우혈청을세포배양원료로사용한세포주의경우반드시 BHV-1 의오염여부를민감도와특이도가우수한검증된시험법으로확인하여야만한다 (3, 10, 13). 세포치료제의배양원료로우혈청을사용할경우에도, BHV-1 의오염여부를확인하여야만한다. 또한소의조직을이용하여생산되는콜라겐과조직공학제제의경우에도 BHV-1 의오염여부를확인하여야만한다. 내인성또는외래성위해바이러스오염을방지하기위한 ICH 가이드라인 (Q5A) 은원료의오염여부를검사하고, 제조공정에서바이러스제거능력을평가하기위하여민감도와특이도가우수한검증된시험방법을사용하도록권장하고있다 (16). BHV-1 검출시험법은주로소질병의진단을위해개발되어왔다. BHV-1 검출시험법으로는소의정액, 비즙, 질점액, 유산태아등으로부터세포배양법에의해직접바이러스를분리하거나, 형광항체법과 ELISA 방법으로항원을검출하거나, 혈액내의 BHV-1 항체를검출하는방법등이있다. 이러한시험법은시간과비용이많이들고, 민감도와특이도가떨어지는단점이있다. 따라서 PCR을이용하여 BHV-1 을검출하려는연구가활발히진행되어왔는데, 주로 conventional PCR 또는 nested PCR 방법을이용하여소의정자에서 BHV-1 감염여부를빠른시간에진단하고자하는연구였다 (8, 14, 22, 25). 최근에와서 real-time PCR 을이용하여소의정자에서 BHV-1 감염여부를판별하려는연구가시도되었다 (26). 최적화된조건에서 real-time PCR의민감도는 3.8 TCID 50 /ml이었다. 본연구에서는소유래원료를사용하는생물의약품과조직공학제제, 세포치료제의안전성을보증하기위해서 BHV-1 을정량적으로신속하게검출할수있는민감도와특이도가우수한 real-time PCR 시험법을개발하고자하였다. BHV-1 전체유전자를대상으로 BHV-1 에만특이적인 primer 5쌍을디자인하였다. 5 쌍의 primer 중 BICP4 (early-intermediate transcription control protein) 유전자를대상으로디자인한 primer쌍 BHV-F2, BHV- R2의민감도가가장우수하였다. 선별된 primer를활용하여 annealing temperature와 MgCl 2 농도등 PCR 조건을최적화한결과확립된실험법의민감도는 2 TCID 50 /ml이었다. 본연구결과는 Wang 등 (26) 이발표한 real-time PCR의민감도 3.8 TCID 50 /ml 보다더우수하였다. 확립된 BHV-1 DNA 정량법의재현성검증을위해서로다른날에 BHV-1 표준시료에서 DNA 를추출하고 real-time PCR을수행한후 crossing point 값을비교한결과, BHV-1 log titer (log 10 TCID 50 /ml; x) 에대한 crossing point 값 (y) 간의표준회귀식의결정계수 (r 2 ) 는모두 0.99 이상으로재현성뿐만아니라회귀성이매우높음을알수있었다. 생물의약품의품질관리평가에있어시험법의민감도와재현성은분석의정확성, 특이성, 검출한계등과함께매우중요한요인으로고려되는데, 본연구에서확립한시험법은 BHV-1 을정량하는데있어민감도와재현성이우수함을확인할수있었다. WHO, EMEA (European Medicines Agency), FDA (Food and
Vol. 44, No. 1 Bovine herpesvirus type 1 정량검출을위한 real-time PCR 20 Drug Administration) 와같은규제기관은유전자재조합단백질의약품을생산하기위해사용하는동물세포주의마스터세포 (Master cell) 와제조용세포 (Working cell) 에서외인성바이러스검출에대한관리규정을정하고, 세포주에의한바이러스오염사고를최소화하고있지만, 비용과시간이많이드는생물학적시험법 (In vitro 시험법, In vivo 시험법, 항체생산시험법 ) 을대체할수있는민감한분자시험법이상용화되지않은실정이다. 9CFR section 113.53은원료물질유래생물의세포주 (primary cells 또는 cell line) 를사용하여생산용원료물질, 생산용세포주, 공정시료등에오염될수있는바이러스를검출하도록요구하고있다 (6). BT (bovine turbinate) 세포주는소유래바이러스에쉽게감염되기때문에우혈청을사용하는공정에서바이러스검출에사용되는세포주이다. 일반적으로 BT 세포주단층세포에원료물질, 세포주파쇄액, 공정시료, 반제품, 완제품등을첨가한후 7일이상배양을하면서병변효과를관찰하여오염여부를판단하거나 haemadsorption test를통해바이러스오염여부를판단한다. 또한 BT 세포주단층세포에원료물질, 세포주파쇄액, 공정시료, 반제품, 완제품등을첨가한후 7일이상배양한다음소유래바이러스에대한항혈청을이용해면역형광방법으로바이러스오염여부를판단한다. 이러한생물학적실험법의경우시간이많이걸리고, 비용이많이드는단점이있다. 본연구를통해확립된 BHV-1 검출시험법을 CHO 세포주에서 BHV-1 검출시험에활용하였을때, BHV-1 에오염된 CHO 세포주가병변현상을일으키지는않았지만, CHO 세포주와세포주배양상등액에서 BHV-1 을효과적으로검출할수있었다. 따라서 BHV-1 real-time PCR 시험법은동물세포주검증과생산공정검증에서 BHV-1 오염여부를정성적또는정량적검출할수있는우수한시험법임을확인할수있었다. 동물세포주검증에서 realtime PCR을활용한 BHV-1 검출시험은지금까지보고된바없다. 소유래콜라겐은의료용생체재료로널리이용되고있지만, 콜라겐의바이러스안전성검증에관한구체적인가이드라인이현재까지제시되지않아제조사에서자체적으로안전성검증시스템을구축하고안전성보증시험을실시하고있다. 하지만 BHV- 1을효과적으로검출할수있는시험법이확립되지않아 realtime PCR 시험법같은민감한시험법이요구되고있다. 본연구를통해확립된 BHV-1 검출시험법을 0.5% 콜라겐에적용하였을때 10 TCID 50 /ml 까지정량적으로검출할수있어콜라겐의품질보증에활용할수있는우수한시험법임을확인하였다. 민감도를높이기위해서는콜라겐으로부터 BHV-1 DNA 추출조건의최적화가필요하다고판단된다. Real-time PCR을활용한바이러스정량검출방법은크로마토그래피공정과같은단백질분리정제공정에서미량의바이러스를실시간에정량화할수있기때문에, 생물의약품제조공정에서바이러스제거검증실험시감염역가시험과함께적용할수있는유용한평가기술일뿐만아니라, 감염역가시험으로는분석할수없는크로마토그래피세척공정에서의바이러스안전성검증에활용할수있는적절한방법이다 (1). 본연구를통해확립된 BHV-1 real-time 시험법도세포배양유래생물의약품제조 공정에서바이러스제거검증과크로마토그래피세척검증에유용하게사용될수있을것으로기대된다. 감사의말 본논문은산업자원부와한국산업기술재단의지역혁신인력양성사업과식품의약품안전청용역연구개발사업 (2006년도, 2007년도 ) 으로수행된연구결과임. 참고문헌 1. 길태건, 김원중, 이동혁, 강용, 성학모, 유시형, 박순희, 김인섭. 2005. 혈장분획제제제조공정에서크로마토그래피세척검증을위한모델바이러스로서의 Porcine Parvovirus 정량. 미생물학회지 41, 216-224. 2. 류승렬, 신진호, 백선영, 김재옥, 민경일, 민복순, 김병국, 김도근, 박미경, 안미진, 채경숙, 정혜성, 이석호, 박순희. 2003. 세포배양유래생물의약품중 Bovine Viral Diarrhoea Virus 검출을위한 RT-PCR, Real-time RT-PCR 및 RT- PCR-ELISA 기법의검출한계와정량범위평가. J. Bacteriol. Virol. 33, 161-168. 3. Adamson, S.R. 1999. Experiences of virus, retrovirus and retrovirus-like particles in chinese hamster ovary (CHO) and hybridoma cells used for production of protein therapeutics. Dev. Biol. Stand. 93, 89-96. 4. Celis, P. and G. Silvester. 2004. European regulatory guidance on virus safety of recombinant proteins, monoclonal antibodies and plasma derived medicinal products. Dev. Biol. Stand. 118, 3-10. 5. Choi, Y.-M., J.-K. Kim, J.-I. Park, and S.-W. Jeong. 2006. Evaluation of bovine amniotic membrane for the treatment of superficial canine corneal ulcer. J. Vet. Clinics 23, 334-336. 6. Code of federal regulation 9 (9CFR), animal and animal products. 1996. Part 113.53. Requirement for ingredients of animal origin used for production of biologics. 7. Darling, A. 2002. Validation of biopharmaceutical purification process for virus clearance evaluation. Mol. Biotechnol. 21, 57-83. 8. Deka, D., Ramneek, N.K. Maiti, and M.S. Oberoi. 2005. Detection of bovine herpesvirus-1 infection in breeding bull semen by virus isolation and polymerase chain reaction. Rev. Sci. Tech. 24, 1085-1094. 9. Eloit, M. 1999. Risks of virus transmission associated with animal sera or substitutes and methods of control. Dev. Biol. Stand. 99, 9-16. 10. Erickson, G.A., S.R. Bolin, and J.G. Landgraf. 1991. Viral contamination of fetal bovine serum used for tissue culture: risks and concerns. Dev. Biol. Stand. 75, 173-175. 11. Faraj, K.A., T.H. Van Kuppevelt, and W.F. Daamen. 2007. Construction of collagen scaffolds that mimic the three-dimensional architecture of specific tissues. Tissue Eng. 13, 2387-2394. 12. Gajiwala, K. and A.L. Gajiwala. 2004. Evaluation of lyophilised, gamma-irradiated amnion as a biological dressing. Cell Tissue Bank 5, 73-80. 13. Garnick, R.L. 1998. Raw materials as a source of contamination in large-scale cell culture. Dev. Biol. Stand. 93, 21-29. 14. Grom, J., P. Hostnik, I. Toplak, and D. Barlic-Maganja. 2006. Molecular detection of BHV-1 in artificially inoculated semen and in the semen of a latently infected bull treated with dexametha-
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