대한안과학회지 2 년제 5 권제 3 호 J Korean Ophthalmol Soc 2;5(3):46-47 pissn: 378-647 eissn: 292-9374 DOI :.334/jkos.2.5.3.46 = 증례보고 = 항히스타민 / 비만세포안정화복합제재의결막세포에대한효능비교 김수진 윤태진 2 이지은 이종수 부산대학교의학전문대학원안과학교실, 울산신세계안과의원 2 목적 : 항히스타민 / 비만세포안정화복합제재들이봄철각결막염환자의결막세포에미치는영향을비교하고자하였다. 대상과방법 : 배양된봄철각결막염환자의결막세포에 SCD-P(Fexofenadine), Patanol R, Zaditen R, Azelan R 을접촉시킨후세포의대사력, 프로콜라겐, 라미닌및사이토카인을비교하고, 약제독성을알아보고자젖산탈수소효소 (LDH) 의역가를측정하고, 결막세포의형태학적변화를광학및전자현미경으로관찰하였다. 결과 : MTT 분석법상 SCD-P 은대사력이유지되었으나, 다른 3 약제는활성도가감소하였다. 모든약제에서콜라겐, 라미닌, IL-6 및 IL-8 은대조군에비해감소하는경향을보였고, TNF-β 변화는거의없었다. Zaditen R 과 Azelan R 에비해 SCD-P, Patanol R 에서 LDH 역가가낮게측정되는경향을보였고, 세포의형태학적손상이나부종도경미하게관찰되었다. 결론 : 항알레르기점안약중세포대사활성도는 SCD-P 가가장좋은경향을보였고, 결막세포에미치는손상의정도는 Zaditen R, Azelan R 에비해 SCD-P, Patanol R 이적은경향을보였다. < 대한안과학회지 2;5(3):46-47> 알레르기결막염은꽃가루나애완동물의털, 분비물, 집먼지진드기등의항원이눈물에용해된후결막에있는비만세포표면에부착되어있는 IgE와반응함으로써발생하는과민반응으로눈에발생하는알레르기질환중가장흔한형태이다. -3 이러한알레르기결막염을치료하는데있어가장중요한것은원인항원을제거하는것이나실제원인항원으로부터완전히회피하는것은불가능한일이기때문에, 임상적으로알레르기결막염을치료하기위해여러항알레르기점안약이흔히사용되고있다. 알레르기결막염에사용되는약제들로는혈관수축제, 경구용및점안용항히스타민제, 비만세포안정제, 항히스타민 / 비만세포안정제복합제재, 비스테로이드성항염증제 (nonsteroidal anti-inflammatory drugs; NSAIDS) 와스테로이드제재, 면역억제제등이있다. 4,6 최근에널리사용되는알레르기점안약으로는 Azelastine hydrochloride.5% (Azelan, Taejoon, Korea), Ketotifen fumarate.25% (Zaditen, Novartis, USA), Olopatadine.%(Patanol, Alcon, USA) 등이있고, 세가지약제는공통적으로항히스타민과비만세포안정화작용을가지고있다. Fexofenadine또한항히스타민과비만세포안정화역할을가지고있는복합제재로알려져있지만국내에서는아직상업적으로생산이되고있지않아, 기존의항히스타민 / 비만세포안정화복합제재들과의임상적연구는아직없다. 이에저자들은새로운약제인 SCD-P (Fexofenadine, 삼천당, Korea) 과기존에사용하고있던항알레르기점안약인 Patanol, Zaditen, Azelan 과의결막세포에미치는영향및독성효과를비교하고자, MTT 분석법을사용한세포의대사력측정, procollagen typeⅠ생성및염증성사이토카인의생성여부, lactate dehydrogenase (LDH) leakage assay를각각시도하고, 결막세포의형태학적변화를광학현미경및전자현미경으로관찰하였다. 대상과방법 접수일 : 29 년 5 월 27 일 심사통과일 : 29 년 9 월 5 일 책임저자 : 이종수부산광역시서구아미동 - 부산대학교병원안과 Tel: 5-24-7323, Fax: 5-242-734 E-mail: jongsool@pusan.ac.kr * 본논문의요지는 29 년대한안과학회제 2 회추계학술대회에서포스터로발표되었음. 세포배양과처치봄철각결막염환자의동의하에결막조직을채취하여 transfer media에담아실험실로옮긴후 25 cm 2 flask에배양시켰다. 2 2 mm의크기로결막조직을절제한후배양접시에외이식법으로배양하였는데, 배양액으로는 % 46 www.ophthalmology.org
- 김수진외 : 항알레르기약물의효과 - 송아지혈청 (Gibco, USA) 을첨가한 Dulbecco s minimal essential medium (DMEM, Gibco,USA) 을사용하였고, 감염예방을위해 5 μg/ml gentamicin, 2 μg/ml fungizone을첨가하였다. 37 C 온도에서 5% CO 2-95% air 의보육기 (NAPCO model 5, USA) 에서결막세포를 3일간배양하였다. 세포가충분히자랐을때 (confluence), 배지를완전히제거하고.25% trypsin-.2% EDTA 를처리하여세포를배양접시로부터분리시킨후, 배양액을약 5cc 정도넣고피펫으로바닥면에부착된세포를분리시켰다. 결막세포가배양접시에서완전히이탈되면, 새로운조직배양접시에분리된세포가포함된배양액을약 cc넣고신선한배양액을약 2cc 첨가시켜세포를재배양시켰다. Coulter counter로세포수를측정하여배양액에결막세포 5 3 cell/ ml이되도록부유시킨다음, 96 well plate에 2 μl 씩심은후 37 5% CO 2-95% air의배양기에서다시배양시켰는데, 이때세포수가너무빽빽할경우각약물에의한영향이적을수있으므로배지에서결막세포가 8~9% 정도성장할때까지 4~5일정도배양시켰다. DMEM 배지로 배희석하여사용하였다. 상층의배양액을 4 μl 정도제거한후 MTT solution 을 μl 첨가하여알루미늄호일로 plate를가린후 37 에서 4시간반응시켰다. 다시상층액을 μl 제거한후 DMSO (Dimethyl sulfoxide: Sigma, Cat. D-5869, St. Louis, USA) 를 μl 넣어실온에서 2분간흔들어혼합시키고 ELISA reader (Moleculae Devices, USA) 로 57 nm에서흡광도를측정하였다. 이러한과정들을 3회반복하여각농도와노출시간별로측정된흡광도의평균을구하여각세포의생존율을구하였는데, 세포생존율은각칸의흡광도수치를대조군칸의흡광도수치로나눈백분율즉, 세포의생존율 (%)= 각칸의흡광도 / 대조군칸의흡광도 으로나타냈고, 상기의실험은각농도별로 3번씩시도하여각군과의통계학적유의성을비교하였다 (Student s t-test, p<.5). 교원질의전구물질인 Procollagen type I COOH-termial peptide (PIP) 생성비교 MTT 분석법을사용한세포의대사활성도측정세포의대사능력을측정하기위해 calorimetric assay를이용하여세포내에존재하는 formazan 화합물의흡광도를측정하여세포증식억제력을비교하였다. 세포의대사능력을측정하기위해 MTT solution (3-[4, 5-Dimethylthiazol -2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma, St. Louis, USA) 를이용한분석법을사용하였는데, 노란색의 tetrazolium salt가세포내미토콘드리아효소에의해청색의 formazan 화합물로바뀌는원리를이용한것으로, 생존하고있는세포즉대사작용이왕성한세포를흡광도를이용해서측정하는방법이다. 5 Subconfluence에도달한 cell을 Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS: Giboco BRL, Rockville, NY, USA) 로 회세척한후항알레르기약제를 4시간, 2시간, 24시간, 48시간동안결막세포와접촉시킨후다시 D-PBS 로 회세척한다음배지를넣어주었다. 약물처리후 24시간정도세포배양기에넣어배양한다음 MTT assay를실시하였다. 약제의효능을비교하기위해대조군으로는 Balanced salt solution (BSS) 를사용하였고, Dulbecco's modified Eagles's medium 배지 (DMEM: Giboco BRL, Rockville, NY, USA) 를사용하여상기와동일한방법으로세포를배양하여세포대사능력을측정하였다. 세포의흡광도를측정하기위해 5 mg의 MTT solution 을 PBS ml에녹인후.2 μl syringe filter로거른다음 봄철각결막염환자의경우결막조직에서생성되는교원질의양이많기에, 항알레르기약제를사용한후교원질의전구물질생성정도를비교하기위해 procollagen type I C-peptide EIA kit (Takara bio inc, Tokyo, Japan) 을이용하여프로콜라겐형의농도를측정하였다. 24 well plate 에 well당 4 cells/ml을심은후충분히자랄때까지 4 일정도배양한다음배지를제거하고 D-PBS 를이용하여세척하였다. 네가지항알레르기약제를 %, 2% 농도로 시간, 4시간접촉시킨후상층액을제거하고 D-PBS 로 회세척한후신선한 DMEM 배지를첨가하여 24시간배양한뒤배지를채취하여 -8 에보관하였다. 세포층은.5% Triton X-, mm EDTA, mm phenylmethylsulfonyl fluoride (ph 7.2) 가함유된 PBS.5 ml로추출하여세포추출물을 -8 에보관하였다. 각배양배지와세포추출물의 PIP의농도는 ELISA kits (Takara, Tokyo, Japan) 로측정하였다. Laminin의생성비교 Laminin 은세포의기저막을구성하는당단백질로서, 세포부착및성장에관여하며알레르기환자에서증가되어있다. 항알레르기약제를사용한후 Laminin 의생성정도를비교하기위해 Laminin EIA kit (Takara bio inc., Tokyo, Japan) 를이용하였다. 4가지약제를 %, 2% 의비율로 시간, 4시간노출시킨 sample 을각각 μl 씩 well에옮 www.ophthalmology.org 47
- 대한안과학회지 2 년제 5 권제 3 호 - 기고혼합한후알루미늄호일로싸고 25 에서 시간동안반응시켰다. Sample이담긴 well을 washing buffer 4 ul 로 3번씻어낸후 antibody-pod 결합용액 μl를각 well에첨가한후혼합하고알루미늄호일로싸고 25 에서 시간동안반응시켰다. 다시반응용액을버리고 well 을 4번씻은후 substrate solution ul을첨가한후 5 분간상온에두고 stop solution μl을첨가한후. ELISA reader로 45 nm에서흡광도를측정하였다. 젖산탈수소효소 (lactate dehydrogenase, LDH) 분석법을이용한약제의독성비교, 분석 항알레르기약물간의구성성분비교네가지항알레르기점안약제의분석은약제의성분인전해질조성, ph, 삼투압및보존제를각각조사하여약물간의차이를확인하고자하였다. 점안약을 sample tube에담은후전해질의조성은 LX-2 (Beckman coulter, USA), 삼투압은 Micro sample Osmometer (Fiske Associates, USA) 를이용하여측정하였으며, ph는 Metrohn 78 (Metrohn, Swiss) 을사용하였다. 약제에따른세포의창상회복정도검사 네가지항알레르기약제를 96 well 배지의전체양 2 μl 에서각각, 2, 3% 농도가되도록점안약을배지액에넣은후각각 4시간, 2시간, 24시간, 48시간동안접촉시켰다. 약물에노출된후세포질에서유리된 LDH양을 37 C 온도의암순응상태에서 ELISA reader (Moleculae Devices, USA) 를이용하여측정하였고, 대조군으로는평형염액 (Balanced salt solution) 을처리하여 49 nm의파장에서각각의파장을측정하여노출시간에따른농도의차이를비교하였다. 모든실험군과대조군은각각 개의배양된결막세포를대상으로실험을하였으며, 평균 LDH 역가를산출하여대조군과의통계학적인비교를하였다. 유의수준은 95% 수준이었고, ANOVA 검사법을사용하였다. 항알레르기약제에노출시세포의창상회복정도를관찰하기위해서배양액에결막세포를각각 5 3 cell/well이되도록부유시킨다음 6 well plate에 5 μl씩분 seeding 한후 37, 5% CO 2-95% air의배양기에서 4~5일정도배양하였다. Subconfluence에도달한배지에 pipet tip으로 scartch를낸후, 상층의배지를제거하고, 네가지약제를 % 비율로접촉시킨후위상차현미경 (Inverted phasecontrast light microscope) 으로즉시, 4시간, 7시간, 24시간후세포가 scratch 낸부분으로자라들어오는정도를관찰하였다. 약제에따른세포의형태학적변화관찰 Inflammatory cytokines (IL-6, IL-8, TNF-β) 생성억제력비교알레르기결막염의경우결막세포에서 IL-6, IL-8, TNF-β 등의염증성사이토카인의생성이정상인보다증가하기에, 4가지항알레르기약제를 %, 2% 비율로 시간, 4시간노출한후생성의억제력을서로비교하고자하였다. Cell culture supernates를각각의 well에 2 μl씩담고봉한후 2시간동안상온에서반응시킨다음상층액을제거하고 4번에걸쳐 wash buffer 4 μl로씻어내었다. TNF-β conjugate 2 μl를 well에담고상온에서 2 시간동안반응시킨후다시 4 μl의 wash buffer로 4번씻어내고, substrate solution 2 μl를 well에담고상온에서 2분간빛을차단한상태로둔다음, stop solution 5 μl을첨가하여색깔의변화가나타나면 ELISA reader로 45 nm에서흡광도를측정하였다. IL-6, IL-8 도같은방법으로 ELISA kit (RnDSystems, inc., USA) 를이용하여측정하였다. 항알레르기약제에노출시세포의형태학적인변화를관찰하기위해서배양액에결막세포를각각 5 3 cell/ml이되도록부유시킨다음 6 well plate에 5 μl씩분seeding 한후 37, 5% CO 2-95% air의배양기에서 4~5일정도배양하였다. Subconfluence에도달한세포를 4가지약제로농도에따라약제를각각접촉시킨후위상차현미경으로세포형태를관찰하였다. 또한결막세포의미세구조를관찰하기위하여, 위와동일한방법으로처리한후 24시간배양후배양액을제거하고각군의각막실질세포들은. M sodium cacodylate buffer로씻어내고, 약 2시간동안 Karnosky fixative (2% paraformaldehyde, 2.5% glutaraldehyde, and.m sodium cacodylate buffer) 에고정시킨후. M sodium cacodylate buffer 로 3차례에걸쳐세척한후세포를 osmium tetroxide 로고정시키고계열 ethanol용액으로탈수한후 Epon으로포매하였다. 6~8 nm의절편을만들고 uranyl acetate와 lead citrate로이중염색시켜투과전자현미경 (JEOL, 2 EX, Japan) 으로세포의미세구조를관찰하였다. 48 www.ophthalmology.org
- 김수진외 : 항알레르기약물의효과 - MTT at hour MTT at 4 hour.4.2.8.6.4.2 % 2% 3% SCD-P.4.2.8.6.4.2 % 2% 3% SCD-P Figure. The absorption rate of the water-insolubale formazan dye in conjunctival cells with vernal keratoconjunctivitis exposed in the four anti-allergic agents by a scanning spectrometer (ELISA reader). The higher the concentration and the longer the exposure duration, the more decreased the metabolic activity of conjunctival cells, except fexofenadine. Procollagen titer at hour (%) 2 8 6 4 2 SCD-P % 2% Figure 2. Procollagen titers of cultured conjunctival cells of vernal keratoconjunctivitis in four anti-allergic agents. The procollagen titers in group of anti-allergic agents were lower than. The concentration of procollagen was decreased, the longer the exposure duration. 결 과 Procollagen typeⅠ 생성억제력비교 MTT 분석법을사용한세포의대사력비교 MTT분석에서의결과를보면 Azelan, Zaditen 및 Patanol 세가지약제에서 % 농도로약제노출후 시간째세포의대사력이감소하는경향을보였으나통계적의미는없었고, 2% 이상에서는약제노출후 시간째세포대사력이거의측정되지않았다. 4시간노출후에는 % 농도에서는세포활성도가 시간째보다더감소되는경향을보였으나통계적유의성은없었고, 2% 이상의농도에서역시세포의활성도는거의측정되지않았다. Azelan, Zaditen 및 Patanol 세가지약제에서흡광도는약제의농도가높을수록, 노출시간이길수록낮게측정되어결막세포의대사활동능력이저하되는경향을보였지만통계적유의성은없었다. SCD-P의경우세포의활성도가대조군과비슷하게유지되어, 다른약제와세포의대사활동능력에차이를보였다 (Fig. ). Procollagen type Ⅰ는약제노출 시간째 % 농도에서는 4가지약제모두감소경향을보였으나통계적유의성은없었고, 2 % 농도에서는 4가지약제모두대조군역가의 5% 이하로감소되었다. 약제노출 4시간째에는 %, 2% 농도에서 4가지약제모두대조군역가의 25% 이하로감소되었으며, 약제간의생성량에있어유의한차이를보이지않았다. 또한, 모든약제에서노출시간이길어질수록대조군에비해생성량이감소하는경향을보였으나통계적유의성은없었다 (Fig. 2). Laminin의생성비교라미닌의경우약제노출 시간후 4가지약제모두에서대조군의역가와유의한차이를보이지않았으나, 4시간노출후에는모든약제에서대조군에비해의미있게감소하였으며, 약제간의유의한차이는보이지않았다 (Fig. 3). www.ophthalmology.org 49
- 대한안과학회지 2 년제 5 권제 3 호 - Laminin titer at hour (ng/m) Laminin titer at 4 hour (ng/m) 7 3 6 5 4 3 2 SCD-P % 2% % 2% Figure 3. Laminin titers of cultured conjunctival cells of vernal keratoconjunctivitis in the four anti-allergic agents. The concentration of laminin was similar to the after all the antiallergic agents were exposed for hour. However, after 4 hour exposure, laminin titers decreased compared to the. 25 2 5 5 SCD-P SCD-P 3 2.5 2.5.5 % 2% 3% 3 2.5 2.5.5 h 4 h 2 h 24 h h 4 h 2 h 24 h 3 2.5 2.5.5 3 2.5 2.5.5 h 4 h 2 h 24 h h 4 h 2 h 24 h Figure 4. LDH titers of cultured conjunctival cells of vernal keratoconjunctivitis in the four anti-allergic agents. Whithin 24 hour, the lactate dehydrogenase (LDH) titer of cultured conjunctival cells of vernal keratoconjunctivitis in the antiallergic agents showed a kind of dose and time response. LDH titers increased up to 4 hours after exposure and maintained its level for the following 2 hours, and then decreased. The LDH titer of ketotifen and azelastine was a higher value than that of olopatadine and fexofenadine, especially in the rate of dilution of and 2%. 약제의농도및노출시간에따른 LDH Assay 결막세포에서 SCD-P, Patanol, Zaditen 및 Azelan 네가지약제모두노출후 시간째와 4시간째세포외로유리된 LDH 수치가급격히증가하였고, 2시간까지는유지및감소되는양상을보이다가 2시간이후 24시간까지는다시감소하는양상을보였으나, 통계적으로유의하지는않았다 (Fig. 4). Zaditen 과 Azelan 은 %, 2% 약물농도에서접촉후 4시간째 LDH 역가가 2. 이상으로최고치 를나타낸반면, SCD-P, Patanol 의경우 %, 2% 약물농도에서 LDH 역가가.5 이하로유지되었다. 염증성사이토카인생성억제력비교 TNF-β 의경우 4가지약제모두에서 %, 2% 농도로노출시켰을때 시간째와 4시간째대조군과통계적으로유의한차이를보이지않았다 (Fig. 5). IL-6 의경우 % 약제에노출후 시간째 Azelan 에서 4.49 pg/ml로대조 4 www.ophthalmology.org
- 김수진외 : 항알레르기약물의효과 - TNF-beta at hour (pg/ml) TNF-beta at 4 hour (pg/ml) 9 8 7 6 5 4 3 2 % 2% SCD-P 9 8 7 6 5 4 3 2 % 2% SCD-P Figure 5. TNF-β concentration of cultured conjunctival cells of vernal keratoconjunctivitis in the four anti-allergic agents. The concentration of TNF-β was similar to the after all the antiallergic agents were exposed for up to 4 hours. IL-6 at hour (pg/ml) IL-6 at 4 hour (pg/ml) 2 8 6 4 2 8 6 4 2 % 2% SCD-P 25 2 5 5 % 2% SCD-P Figure 6. IL-6 concentration of cultured conjunctival cells of vernal keratoconjunctivitis in the four anti-allergic agents. The concentration of IL-6 was lower than the after all the antiallergic agents were exposed for 4 hours. Figure 7. IL-8 concentration of cultured conjunctival cells of vernal keratoconjunctivitis in the four anti-allergic agents. The concentration of IL-8 was lower than after all the antiallergic agents were exposed for up to 4 hours. 군에비해감소경향을보였으나통계적으로유의하지않았고, 2% 약제에노출후 시간째 Azelan 에서 26.65 pg/ml 로뚜렷하게감소됨을알수있었다. 약제노출 4시간후에는 %, 2% 모든약제에서대조군역가의 5% 이하로감소되었고, 약제간의차이는보이지않았다 (Fig. 6). IL-8 의경우를분석해보면 %, 2% 모두 4가지약제에서대조군에비해감소되는경향을보였으나통계적유의성은없었고, 특히약제노출 4시간후에는대조군역가의 5% 이하로감소하여노출시간이길수록감소비율이더큰경향을보였으나통계적유의성은없었다 (Fig. 7). 약물간의구성성분비교 SCD-P, Patanol, Zaditen 및 Azelan 의약제분석에서모든약제에는보존제로 Benzalkonium chloride (BAC) 가.mg/ml로동일하게함유되어있었으며, 전해질구성은 SCD-P, Zaditen 및 Azelan 이 Patanol 에비해매우낮은농도의 Na+, Cl- 을함유하고있었고, ph는 Patanol 의경우중성에가깝게측정되었으나나머지세약제에서는산성으로나타났다. 또한삼투압은 SCD-P 273 mosm/kg, Patanol 296 mosm/kg, Zaditen 257 mosm /kg, Azelan 284 mosm/kg 로유의한차이는없었다 (Table ). www.ophthalmology.org 4
- 대한안과학회지 2년 제 5 권 제 3 호 - Table. The ingredient, electrolyte composition, ph, osmolarity and preservatives of the commercial four antiallergic agents Antiallergic agents SCD-P Patanol Zaditen Azelan Chief ingredient Fexofenadine Olopatadine hydrochlorid Ketotifen fumarate Azelastine hydrochloride hour Na+ (meq/l) 7.3 77 5.3 9.7 K+ (meq/l).63.46.45.95 4 hour Cl(mEq/L) <5 8. <5 <5 ph 5.32 7.3 5.2 5.47 Osmolarity (mosm/kg) 273 296 257 284 7 hour Preservative (mg/ml) BAC. BAC. BAC. BAC. 24 hour A A2 A3 A4 B B2 B3 B4 C C2 C3 C4 D D2 D3 D4 E E2 E3 E4 Figure 8. Scratch assay of conjunctival cells after -hour exposure to (A) (B) % SCD-P, (C) %, (D) % Zaditen, (E) % Azelan, 4-hour exposure to (A2) (B2) % SCD-P, (C2) % Patanol, (D2) % Zaditen, (E2) % Azelan, 7-hour exposure to (A3) (B3) % SCD-P, (C3) % Patanol, (D3) % Zaditen, (E3) % Azelan, 24-hour exposure to (A4) (B4) % SCD-P, (C4) % Patanol, (D4) % Zaditen, (E4) % Azelan. In group (A), normal conjunctival cell was proliferated and moved into scratched scar in media. After exposure to SCD-P (B), conjunctival cell was proliferated and moved into scratched scar in media. However, in group of Patanol (C), Zaditen (D), Azelan (E), normal conjunctival cells decreased and proliferation was not found. 42 www.ophthalmology.org
- 김수진외 : 항알레르기약물의효과 - A B C D E Figure 9. Phase-contrast microscopic photographs of conjunctival cells after -hour exposure to (A) (B) % SCD-P, (C) % Patanol, (D) % Zaditen, (E) % Azelan. Many cultured conjunctival cells of the are of an elongated, spindle-shaped appearance. The number of conjunctival cells decreased and round, rather than normal conjunctival cells after exposure to % rate of dilution of antiallergic agents, especially Azelan. 약제에따른세포의창상회복정도검사 Scratch assay 결과를보면대조군과 SCD-P 의경우 24시간이지나면정상결막세포가창상부위로증식, 이주하여창상회복이이루어짐을알수있었고 (Fig. 8A, B), Patanol 의경우약제노출 24시간째정상결막세포가손상되면서세포의이주현상을관찰할수없었다 (Fig. 8C). Zaditen 및 Azelan 의경우도약제노출 4시간째부터정상결막세포가손상되면서세포수가감소되었고, 세포의창상회복에따른증식소견이보이지않았다 (Fig. 8D, E). 약제의농도및노출시간에따른세포의형태학적비교위상차현미경으로관찰한결막세포는 시간노출시킨대조군의경우모양은원주혹은입방형으로핵은뚜렷하지않지만수가많아빽빽한양상을나타내었으며 (Fig. 7A), 항알레르기점안약 시간접촉후 SCD-P, Patanol 의경우결막세포의밀도는대조군과큰차이를보이지않았다. 반면, Zaditen 과 Azelan 의경우세포의밀도가감소됨을알수있었고, 특히 Azelan 의경우현저하게세포의수가감소됨을알수있었다 (Fig. 7B-F). 결막세포의전자현미경적소견은대조군에서는정상적인원형질막에미세융모가있으면서세포질과핵질의형태 가뚜렷하게관찰되었다 (Fig. 9A). 각약제 % 농도에 4 시간접촉한후 SCD-P 의경우미세융모가일부탈락되고세포질내의사립체의확장및공포화소견이보였다 (Fig 9B). Patanol 과 Zaditen 에서는미세융모의대부분이소실되었고, 사립체의확장및파열, 과립세포질세망의확장이더욱뚜렷하게보였다 (Fig. 9C, D). Azelan 의경우앞서언급한 3가지약제에비해세포손상이심하여세포질내공포화소견이심하게관찰되었고, 핵막은유지되고있으나, 미세융모는관찰할수없었다 (Fig. 9E). 고찰 항히스타민 / 비만세포안정화복합제재는히스타민이히스타민수용체에결합하는것을막고비만세포를안정화시켜초기알레르기반응에서즉각적인증상개선을가져오고, 후기알레르기반응에서장기적인예방효과가있어, 새로이항알레르기약제의 차약제로각광받고최근에는임상적에서도널리사용되고있다. 7,8 알레르기결막염에흔히사용되는약제인 Azelan, Zaditen, Patanol 은모두항히스타민제와비만세포안정화작용을가지고있고, 최근소개되는 Fexofenadine 또한항히스타민 / 비만세포안정화복합제재로점안약으로개발되었다. 9, 기존에흔히사용되고있던약제들의결막독성에대한보고는있지만, 새로소개된약 www.ophthalmology.org 43
- 대한안과학회지 2년 제 5 권 제 3 호 - A B C D E Figure. Transmission electron micrographs of conjunctival cells appeared after 4-hour exposure to (A) the, (B) % SCD-P, (C) % Patanol, (D) % Zaditen, (E) % Azelan (bar lenth 2 μm, original magnification, 2~4). In general, the plasma membrane with micro- villi (black arrow head), nuclear membrane, and nuclei of conjunctival cells were visible. Azelan and Zaditen had more severe and damaged cellular structures, such as the plasma membranes with microvilli being disrupted (white arrow head), vacuoles enlarged (black arrow), and chromatin margination of the nucleus (white arrow), rather than SCD-P and Patanol. 44 www.ophthalmology.org
- 김수진외 : 항알레르기약물의효과 - 제의항알레르기효과와결막세포에미치는영향에대해기존약제들과비교한보고가국내에서는없어본연구에서는각약제가결막세포에미치는영향을알아보고자하였다. MTT 분석법을통해세포의흡광도를분석한결과 SCD- P 의경우세포대사활성도감소를보이지않았고, Azelan, Zaditen 및 Patanol 에서는노출시간이길수록약제의비율이높을수록세포대사활성도가감소되는경향을보였다. 봄철각결막염환자의결막조직에는교원질과그전구물질인프로콜라겐의생성이증가되어있고, 라미닌도많이생성된다. 이러한프로콜라겐의생성양을비교함으로써알레르기약제의치료효능을비교할수있는데, 네가지약제모두에서비슷한효과를보였고, 시간째보다 4시간째치료효과가더좋은경향을보였다. 알레르기결막염환자의눈물에는인터루킨 (IL)-6, TNF-α, β, 인터페론 (INF)-γ 등의염증성사이토카인과인터루킨 (IL)-8, eotaxin 등의케모카인농도도증가되어있다고알려져있다. 2,3 본연구에서는 TNF-β 의역가는항알레르기점안약네가지모두에서대조군과비교하여큰차이를보이지않았으나, 인터루킨-6 및 8의경우는농도가높을수록약제의노출시간이길수록대조군에비해생성량이감소하는경향을보여알레르기결막염에서증가되는염증성사이토카인의생성억제효과를확인할수있었으나, 통계적유의성은없었다. LDH 역가분석결과 LDH는약제노출후 4시간에최고치를보이고 2시간까지유지되다가 24시간에는다시감소되었다. 또한약제희석농도가높을수록결막세포손상이더심한경향을보였다. % 농도에서는 SCD-P과 Patanol 이 Zaditen, Azelan 보다 LDH 역가가낮은경향을보였고, 2% 농도에서도 SCD-P 과 Patanol 이 Zaditen, Azelan 보다 4, 2시간째 LDH 역가가낮은경향을보였다. 이는 Azelan, Zaditen 이결막세포의세포질의변성과손상이더심한경향을보여준다. SCD-P과 Patanol 의경우 3% 농도에서만 4시간및 2시간째 LDH 역가가 2. 이상으로상승하였지만, Azelan 과 Zaditen 은 %, 2% 3% 희석농도모두에서 4시간이상노출시 2. 이상으로증가하였으나, 통계적의미는없었다. LDH 역가는노출 2시간이지나면서 2. 이하로다시감소하였다. 이는항알레르기점안약의세포독성에의해많은결막세포들이죽어남아있는일부의결막세포들이 LDH 효소를유리하는것으로해석될수있다. 본연구에서는소수의봄철각결막염환자결막조직을채취하여반복실험을시행한것으로, 임상시험의특성상샘플의수가많지않아통계적인유의성을관찰하기는어려웠으나, 그럼에도불구하고약 제에따른결막의반응을추정하는데에는이결과가의의가있다고판단되며, 향후추가적인환자를대상으로한실험이필요할것으로생각된다. 임상적으로사용되는점안약은장기간사용하거나과량을사용했을때안구표면에독성을야기할수있는데, 그요인으로는약제의전해질, ph, 삼투압, 보존제의성분등이있다. 특히전해질과삼투압이안표면세포의기능이상을야기하는가장중요한요인으로알려져있다. 4 일반적으로점안약에포함되어있는전해질은 Na +, Cl -, K +, Ca 2+ 등이있는데, 본연구에서는 K + 은다섯가지약제모두에서낮게측정되었으나세포손상에영향을일으킬정도의차이는보이지않았다. 그러나 Na +, Cl - 의경우세포외액에서적정농도는각각 42~52.7 meq/l, 4.~7.4 meq/l 인데 5, Patanol 에비해 SCD-P, Zaditen, Azelan 에서매우낮은농도를보여낮은농도의 Na +, Cl - 이세포의기능이상및손상에영향을미칠수있을것으로생각된다. Luo et al 6 는고삼투성 NaCl이조직배양결과결막상피에염증유발스트레스효과가있다고보고하였고, Lee and Oum 7 에의하면 diclofenac sodium (Decrol, Ilyang, Korea) 에각막실질세포를노출한경우스테로이드제재보다세포손상이많이발생하였고, 낮은농도의 Na +, Cl - 이원인으로간주되었다. SCD-P의경우 Na +, Cl - 농도가낮음에도불구하고, 세포손상은적어다른요인들도세포손상에관여함을짐작할수있어보다정밀한관찰및검사가필요한것으로생각된다. 삼투압의불균형또한세포기능의손상을야기할수있다. Wee et al 4 은토끼각막세포가삼투압이 227 mosm/kg 로낮은인공누액인 Aqua Site 에노출되었을때세포손상이일어남을보고하였고, Luo et al 6 는고삼투성생리식염수가조직배양결과결막상피에염증을유발하는효과가있다고보고하였다. 일반적으로세포에손상을주지않는삼투압은 26~32 mosm/kg 로알려져있는데 8, SCD- P, Patanol, Azelan 은각각 273, 296, 284 mosm/kg 로정상범위였고, Zaditen 은 257 mosm/kg 로약간낮은삼투압을보여세포손상에영향을줄수있을것으로도생각된다. 세포외액의 ph가 7.~7.7 범위일때세포의생명현상이유지되므로점안약의 ph도세포의손상에영향을미치는요인으로볼수있다. 9 Patanol 의경우다른세가지약제들과달리중성으로나타나세포손상이적은것이이런연유인것으로도생각된다. 점안약에는세균의성장을억제하기위해보존제를첨가하는데, Benzalkomium chloride (BAC) 가가장흔히사용되고있다. BAC는세포막에서친지질성성분으로존재하면서전해질이세포내로들어갈수있도록세포막의성질 www.ophthalmology.org 45
- 대한안과학회지 2 년제 5 권제 3 호 - 을바꾸어세포내의전해질농도에변화를초래하여세포의손상을초래하며, 세포막에작용하여이온이나물질의투과성을변화시켜결막이나각막의세포조직에독성을초래할수있다. 2-23 본연구에서는네가지약제모두 BAC. mg/ml 가첨가되어있어보존제로인한세포의손상이나타날수있으나농도가같으므로약제간의차이는비교할수없을것으로생각된다. 위상차현미경상에서대조군의결막세포는방추상이나길쭉한모양으로세포배열은밀집되어있었다. 그러나항알레르기점안약에노출되어 LDH 역가가증가한경우많은결막세포들이배지에서떨어져나와부풀고둥근모양으로변해있었다. LDH 역가가높을수록투시전자현미경상많은결막세포들이손상을받아세포막이파괴되고조면소포체가확장되며, 미토콘드리아가비대해진모습을보였으며, 미세융모가소실되고크로마틴이핵의주변부로몰리는변화가더욱현저하게관찰되었다. 항알레르기점안약의약물농도가높을수록노출시간이길수록결막세포의손상은증가함을알수있었다. 대조군에비해네가지약제중에서 SCD-P, Patanol 의경우결막세포의손상이경미하였으나, Azelan 과 Zaditen 은 LDH 역가가높을뿐만아니라세포부종과세포질의손상및핵의변성등이보다심하게관찰되었다. 본연구에서살펴본것과같이새로소개된항알레르기점안약제인 SCD-P도현재널리사용되고있는약제들과항알레르기효과는비슷하면서결막세포에미치는독성은적어안전하게사용할수있을것으로생각되며, 알레르기결막염의증상개선에대한임상적연구나약제의주성분자체의약동학적연구조사가필요할것이다. 참고문헌 ) Holgate ST, Lack G. Improving the management of atopic disease. Arch Dis Child 25;9:826-3. 2) Weeke ER. Epidemiology of hay fever and perennial allergic rhinitis. Monoger Allergy 987;2:-2. 3) Foster CS. Immunologic disorders of the conjunctiva, cornea, and sclera In: Albert PM, Jakobiec FA, eds. Principles and Practice of Ophthalmology. Philadelphia: WB Saunders Company, 994; v. 2. chap. 65. 4) Bielory L. Therapeutic targets in allergic eye disease. Allergy Asthma Proc 2;22:25-8. 5) Mosmann TJ. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxic assays. J Immunolo Methods 983;65:55-63. 6) Schultz BL. Pharmacology of ocular allergy. Current Opin Allergy Clin Immunol 26;6:383-9. 7) Abelson MB, Smith L, Chapin M. Ocular allergic disease: Mechanisms, disease sub-types, treat. Ocul Su 23;:27-49. 8) McGill JI. A review of the use of olopatadine in allergic conjunctivitis. Int Ophthalmol 24;25:7-9. 9) Frossard N, Strolin-Benedetti M, Purohit A, Pauli G. Inhibition of allergen-induced wheal and flare reactions by levocetirizine and desloratadine. Br J Clin Pharmacol 27;65:72-9. ) Spangler DL, Abelson MB, Ober A, Gomes PJ. Randomized, double-masked comparison of olopatadine ophthalmic solution, mometasone furoate monohydrate nasal spray, and fexofenadine hydrochloride tablets using the conjunctival and nasal allergen challenge models. Clin Ther 23;25:2245-67. ) Lee JS, Lee JE, Kim NM, Oum BS. Comparison of the conjunctival toxicity of topical ocular antiallergic agents. J Ocular Pharmacol Ther 28;24:557-62. 2) Leonardi A, Curnow SJ, Zhan H, Calder VL. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast cultures. Clin Exp Allergy 26;36:777-84. 3) Sarac OI, Erdener U, Irkec M, et al. Tear eotaxin levels in giant papillary conjunctivitis associated with ocular prosthesis. Ocul Immunol Inflam 23;:223-3. 4) Wee RW, Wang XW, McDonnell PJ. Effect of anrtificial tears on cultured keratocytes in vitro. Cornea 995;4:273-9. 5) Park YS. Physiology of body fluid. In: Kang DH, ed. Physiology, 5th ed. Seoul: Sin-Kwang publishing & printing 2; chap. 5. 6) Luo L, Li DQ, Corrales RM, et al. Hyperosmolar saline is a proinflammatory stress on the mouse ocular surface. Eye Contact Lens 25;3:86-93. 7) Lee JS, Oum BS. The effects of artificial tear formulation and anti-inflammatory agents on the cultured keratocyted of rabbit. J Korean Ophthalmol Soc 998;39:42-5. 8) Freshney RI. The culture environment: Substrate, gas phase, medium, and temparature, 2nd ed. New York: Wiley-Liss, 987;7-. 9) Lee SJ. Body fluid and acid-base balance. In: Kim KH, Oum YE, Kim J, eds. Physiology. Seoul: Eui-hak publishing & printing 22; v. 7. chap. 2. 2) Burstein NL. Preservative cytotoxic threshold for benzalkonium chloride and chlorhexidine digluconate in cat and rabbit corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci 98;9:38-3. 2) Cha SH, Lee JS, Oum BS, Kim CD. Corneal epithelial cellular dysfunction from banzalkonium chloride (BAC) in vitro. Clin Exp Ophthalmol 24;32:8-4. 22) Green K, Tonjum A. Influence of various agents on corneal permeability. Am J Ophthalmol 97;72:897-95. 23) Lee JS, Jung DY, Oum BS, Kim CD. Cytotoxicity of banzalkonium chlorid on the corneal epithelial cell of rabbit. J Korean Ophthalmol Soc 998;39:326-33. 46 www.ophthalmology.org
- 김수진외 : 항알레르기약물의효과 - =ABSTRACT= Comparison of the Efficacy of Topical Antihistamine/Mast Cell Stabilizers in vitro Su Jin Kim, MD, Tae Jin Yoon, MD 2, Ji Eun Lee, MD, PhD, Jong Soo Lee, MD, PhD Department of Ophthalmology, Pusan National University School of Medicine, Medical Research Institue, Busan, Korea Shinsegae Eye Clinic 2, Ulsan, Korea Purpose: To investigate the biologic effects of topical anti-allergic agents with H-receptor antagonism and inhibition of histamine release from mast cells in the cultured conjunctival cells of patients with vernal keratoconjunctivitis in vitro. Methods: Conjunctival cells of vernal keratoconjunctivitis were exposed to the anti-allergic agents SCD-P (Fexofenadine, Samchundang, Korea), Patanol R (Alcon, USA), Zaditen R (Novartis, USA), and Azelan R (Taejoon, Korea). Efficacy of the topical antihistamine/mast cell stabilizers was evaluated using the MTT assay, measuring the concentration of procollagen and inflammatory cytokines. Cell damage was determined using the lactate dehydrogenase (LDH) assay with dilution rates of, 2, and 3% and compared with the balanced salt solution-treated group. Cellular morphologic results were examined by inverted light microscopy and transmission electromicroscopy. Results: Metabolic activity of conjunctival cells decreased at higher concentrations and longer exposure durations, except for the SCD-P agent. The procollagen, laminin, IL-6 and IL-8 titers tended to be lower than that of the in the eyes exposed to all the anti-allergic drugs tested in this study, but the concentration of TNF-β was similar to that of the group. Zaditen R and Azelan R tended to show a greater LDH titer and edema, as well as cytoplasmic and nuclear degeneration of the conjunctival cells than did SCD-P or Patanol R. Conclusions: Cellular metabolic activity was the highest in the new anti-allergic agent SCD-P. SCD-P and Patanol R caused marginally less damage to cultured conjunctival cells than did Zaditen R and Azelan R. J Korean Ophthalmol Soc 2;5(3):46-47 Key Words: Azelan R, Conjunctival cell toxicity, Patanol R, SCD-P, Zaditen R Address reprint requests to Jong Soo Lee, MD, PhD Department of Ophthalmology, Pusan National University Hospital #- Ami-dong, Seo-gu, Busan 62-739, Korea Tel: 82-5-24-7323, Fax: 82-5-242-734, E-mail: jongsool@pusan.ac.kr www.ophthalmology.org 47