실공정하수처리장에서의암모니아산화고세균및 암모니아산화균군집구조조사 작성자 : DICER IP 조경진 1. 서론 질산화는암모늄을아질산염과질산염으로전환시키는생물학적공정으로질소순환및폐수처리반응조에서필수적인공정이다. 다양한미생물그룹이 two-step 공정에관여하고있는데, 그중암모니아산화과정을담당하는미생물은암모니아산화균 (ammonia-oxidizing bacteria, AOB) 과암모니아산화고세균 (ammonia-oxidizing archaea, AOA) 이며, 아질산염산화반응을담당하는미생물은아질산염산화균 (nitrite-oxidizing bacteria, NOB) 이다. 첫번째과정에서, AOA/AOB 는 NH 3 를 NO 2 - 으로 산화시키고, 두번째과정에서, NOB 는 NO - 2 를 NO - 3 으로산화시킨다. 첫번째과정이반응속도결정단계로알려져있으며, 여러연구자들에의해많은연구가수행되었다. 비록일부종속영양균과혐기성암모니아산화균도암모니아를아질산염으로산화시킬수있지만, AOA 와 AOB 가환경적암모니아산화및생물반응조에서주요반응공헌자로알려져있다. 문헌에따르면, Nitrosomonas 와 Nitrosospira 는활성슬러지에서가장중요한 AOB genera 으로알려져있다. 두 genera 중에 Nitrosomonas 는여러생물반응조에서우점하는경향이있다. 이와대조적으로 Nitrosospira sp. 는활성슬러지에서드물게발견되며, 이는그들의상대적으로낮은생장속도때문으로사료된다. 고세균의경우, 전통적으로호염성미생물, 고온성미생물, 메탄균과같은여러그룹을포함하는 Euryarchaeota kingdom 과초고열성미생물등으로 - 1 -
구성된 Crenarchaeota kingdom 을포함한다. 실제로 Crenarchaeota 는지구상에널리분포하고있으며, 이들중일부미생물은암모니아산화를수행한다 ( 참고로, 해양성 Crenarchaeota 는해저플랑크톤의 40% 를차지한다 ). 비교적많은연구가수행된 AOB 와는달리 AOA 는그연구도제한적이며, 아직생소하다. Ko nneke 과그동료들은 2005년세종류의 subunit (amoa, amob, and amoc) 유전자를갖고있는 Candidatus N. maritimus 를분리하여보고하였다. Candidatus N. maritimus 는암모니아를유일한에너지원으로사용하여 AOB 의생장속도와세포생산과유 사하다. 위종의최대생장속도는 0.78 day -1 이며, 이는폐수처리장에서생 장하는 AOB 의값과유사하다. 아직까지는 AOA 에대한암모니아산화기작은뚜렷하게밝혀지지는않았다. 일반적으로박테리아와고세균의반응기작은유사한것으로알려져있으며, 이두그룹의미생물을구별할수있는대표적특징중하나는만성적인에너지스트레스에대한순응현상이다. 상대적으로낮은침투성멤브레인과특이적인이화기작은고세균이만성적에너지스트레스에대해, 비교적잘대처할수있게하는주요생화학적기작으로알려져있다. 문헌에따르면, 활성슬러지에존재하는 AOA 에대해서는소수의연구만이수행되었으며, 토양, water column, 저류지와같은기타환경조건에서다른조성을나타낸다. 또한이들의개체수는상대적으로 AOB 보다적은것으로알려져있다. 본보고서에서는 AOA 와 AOB 의군집다양성을 4개국, 6개의폐수처리설비 (wastewater treatment plants, WWTPs) 로부터 amoa 및 16S rrna gene 유전자서열에기초하여분석한정보를제공하고있다. 16S rrna 유전자 high-throughput pyrosequencing 방법을적용하여 AOB 다양성및전체박테리아군집에대한그들의상대적풍부도를도표화하였다. 2. 연구방법 - 2 -
2.1 활성슬러지샘플링및 DNA 추출 본연구에서, 활성슬러지는중국, 싱가포르, 캐나다, 미국에위치한여덟곳의 WWTPs 의폭기조에서채취하였다. 폭기조에서채취한슬러지샘플은 50% 에탄올 (v/v) 으로고정화시켜주었으며, 연구실로운반한후, DNA를추출하였다. 10 mm 의고정화된활성슬러지샘플을 4 및 4,000 rpm 에서 10분간원심분리하여주었다. 약 200 mg 의샘플펠렛을 DNA 추출에사용하였으며, 일반적으로 DNA 추출에사용되는 FastDNA SPIN Kit for Soil (Qiagen, CA, USA) 으로추출하였다. 2.2 PCR 및정량 PCR 올리고세트 amoa-1f (5 -GGGGT TTCTA CTGGT GGT-3 ) 와 amoa-2r (5 -CCCCT CKGSA AAGCC TTCTT C-3 ) 를사용하여박테리아 amoa 유전자를증폭하였으며, 0.2 μl 의 TaKaRa Ex TaqTM, 3 μl 의 10 Ex Taq Buffer (TaKaRa), 3 μl 의 10 mm dntp mixture (TaKaRa), 0.2 μm 의각올리고, 20 50 ng 의 genomic DNA 를넣고 PCR 반응을수행하였다. PCR 조건은선행문헌에보고된방법대로수행하였다 (Rotthauwe and colleagues et al., 1997). AOB amoa 유전자 copy 수는 amoa-1f/amoa-2r 올리고를사용하여, icycler IQ System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 으로세번반복분석하였다. 정량실시간 PCR 증폭은 15 μl 의 iqtm SYBR Green Supermix (Bio-Rad), 5 μl 의 DNA template ( 약 1 ng/μl 농도 ), 0.3 μm 의각올리고를넣고, 총체적 30 μl reaction 으로수행하였다. 고세균의 amoa 유전자는 Arch-amoAF (5 -STAAT GGTCT GGCTT AGACG-3 ) 와 Arch-amoAR (5 -GCGGC CATCC ATCTG TATGT-3 ) 를사용하여증폭하였다. PCR 증폭은 50 μl 으로수행하 - 3 -
였으며, 25 μl 의 2 MightyAmp Buffer (TaKaRa), 1 μl 의 (1.25 U) MightyAmp DNA Polymerase (TaKaRa), 0.3 μm 의각올리고, 20-50 ng 의 genomic DNA를넣고수행하였다. PCR 은초기 98 에서 1분간반응을수행한후, 98 /10s, 60 /15s, 68 /60s 에서 35 cycle 증폭하였다. PCR 산물은 1% 아가로즈젤을사용, 전기영동분석을수행하여확인하였다. high-throughput 454 pyrosequencing 을위해, 박테리아 DNA 는 16S rrna 유전자의서열의 hypervariable V4 region을대상으로한올리고세트로증폭하였다. forward primer 는 5 -AYTGG GYDTA AAGNG-3 를사용하였으며, reverse primer 는네종류의올리고 (5 -TACCR GGGTH TCTAA TCC-3, 5 -TACCA GAGTA TCTAA TTC-3, 5 -CTACD SRGGT MTCTA ATC-3, 5 -TACNV GGGTA TCTAA TCC-3 ) 를동량으로혼합하여사용하였다. pyrosequencing 분석에서여러 DNA 를식별해주기위한목적의바코드를 454 adaptor A 와 forward primer 사이에접합시켰다. 2.3 Dideoxy DNA sequencing PCR 산물은 PCRquick-spinTM PCR Product Purification Kit (intron Biotechnology, Korea) 을사용하여정제하였다. 정제된 PCR 산물은 pmd18-t Vector (TaKaRa) 으로접합시켜주었다. 재조합된플라스미드는 E. coli 으로형질전환시켜주었으며, ampicillin (60 μg/ml), X-Gal, IPTG를함유한 LB 고체배지에서흰색콜로니를찍어서 M13F 과 M13R 올리고세트를사용하여콜로니 PCR 증폭을수행하였다. PCR 산물은정제한후, ABI 3730xl capillary sequencers (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 으로서열분석을수행하였다. - 4 -
2.4 OTU 정의및계통분류분석 AOB amoa 유전자 clone library를여덟곳의활성슬러지샘플에대해구축하였다. (IDs CN-NJ-SJ, CN-HR-UN, SG-SG-UP, CN-QD-TD, CN-SH-TS, CN-BJJX, US-CO-CO, CA-GP-GP). 개별적인 AOA amoa 유전자 clone library 는 CN-NJ-SJ, CN-HR-UN, SG-SG-UP 에대해구축하였으며, 다른샘플에대해서는 clone library를구축하는데실패하였다. 각 clone library 당약 20개의 clone 이분석되었다. AOB amoa 유전자서열결과는 PHYLIP package (http://www.phylip.com/) 를사용하여 3% cut-off 기준으로총 43개의 OTU 으로분류하였다. 계통분류도를구축하기위해, 각 OTU에서 1개의서열을선택하여 NCBI Entrez Database 에기초한서열과함께배열하였다. AOB amoa 유전자서열의 neighbor-joining 계통분류도는 MEGA software를사용하여분석하였다. 번역된단백질서열은 3% cut-off 기준으로각기다른 OTU 으로분류하였다. AOB amoa protein 서열의계통분류도역시 MEGA software 으로분석하였다. AOA amoa 유전자및 AOA amoa 단백질서열은 AOB 의그것과동일한방식으로분석하였다. AOB 16S rrna 유전자서열은 3% cut-off 범위에서분석하였다. 2.5. High-throughput pyrosequencing PCR 증폭 library 는 PCR 결함을최소화하기위해최소증폭 cycle (25 cycle) 으로수행하였다. 증폭된산물은 PCRquick-spinTM columns (intron Biotechnology) 를사용하여정제하였다. 이를 Roche 454 FLX Titanium platform (Roche, Nutley, NJ, USA) 를사용하여 pyrosequencing 분석을수행하였다. - 5 -
2.6. Accession numbers 본연구에서도출된 clone library 으로부터도출된서열은 GenBank 에 JF271927 JF271985 의 accession number 으로등록하였다. pyrosequencing 결과는 accession number SRA026842.2 으로등록하였다. 3. 연구결과 3.1. 여러활성슬러지샘플에서의 AOB amoa 및 16S rrna 유전자다양 성 전체적으로 8개의하수처리장슬러지샘플에대해 3% cut-off 기준에서 163 개의 AOB amoa 유전자서열에기초하여, 43개의 OTU 으로분류되었다 ( 그림 1). 그림 1 은상대적으로소수의 amoa OTU 만이슬러지샘플들끼리공유함을보여주며, 이는 amoa 유전자가매우다양하게존재함을나타낸다. AOB amoa OTU 분석결과, Nitrosomonas genus 에속하는 Nitrosomonas ureae, Nitrosomonas oligotropha, Nitrosomonas marina, Nitrosomonas aestuarii 가우점종으로분석되었다 ( 그림 2). 그러나두개의 OTU (OTU-17, OTU-32) 가 163개의서열중, Nitrosospira lineage 으로분석되었으며, 이는 Nitrosospira 그룹의 AOB 는전체하수슬러지에서낮은풍부도를가짐을보여준다. - 6 -
그림 1. 여러활성슬러지샘플에서의 AOB amoa 유전자 OTU 의상대적풍부도 및분포. AOB amoa 유전자 OTU 결과와비교해서, amoa protein 의다양성은 amoa 유전자 (43개 OTU) 의다양성보다낮았으며, 이는 codon wobble position 현상때문으로사료된다 (codon wobble position: 두개이상의 codon 이한개의아미노산을코딩 ). 12개의 AOB amoa protein OTU 가오직두개의활성슬러지샘플에서공유되었다. 본연구에서도출된 AOB amoa protein 은 amoa 유전자계통분석결과와마찬가지로대부분 N. ureae, N. oligotropha, N. marina, N. aestuarii 그룹에서유래하였다. amoa 유전자와더불어, high-throughput pyrosequencing 기법을적용하여, 16S rrna 유전자기반으로여섯개의슬러지샘플에대해 AOB 군집을분석하였다 (CN-NJ-SJ, CN-QD-TD, CN-HR-UN, US-CO-CO, SG-SG-UP, CA-GP-GP). - 7 -
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그림 2. amoa 유전자서열에기초한 AOB 의계통분류분석결과. 표 1 은 20,000 개이상의 16S rrna 유전자절편의서열이각샘플에서분석되었음을보여준다. 이러한서열들은 BLAST 와 MEGAN software 를이용하여 NCBI database 와비교해서분석하였다. AOB 유사서열에대한결과는표 1 에나타내었다. 분석결과 3% cut-off 기준으로 18개의 OTU 으로분류되었다. 그림 3은대부분의 AOB 16S rrna OTU ( 약 61%) 가두곳이상의하수처리장에서공유됨을보여주며, 두개의주요 OTU (OTU-14, OTU-15) 는전체서열정보의 49% 를차지하였다. 이와같은연구결과는 AOB 16S rrna 유전자가 amoa 유전자나 amoa protein 보다높은보존성을갖고있음을의미한다. - 9 -
표 1. 8 곳의 WWTP 에서의 AOA 및 AOB 의다양성및풍부도요약. 그림 3. 여러활성슬러지샘플에서의 AOB 16S rrna 유전자 OTU 의상대적 풍부도및분포. - 10 -
3.2. 활성슬러지에서의 AOB 풍부도 pyrosequencing 에의한 AOB 16S rrna 유전자분석결과와함께 PCR 에의한활성슬러지샘플의 AOB 풍부도를정량할수있으며, 활성슬러지로부터추출한 genomic DNA 의중량 (nanogram) 에대한 amoa 유전자 copy number를도출할수있다. 표 1 은 qpcr 에의해정량한여러활성슬러지샘플에서의 AOB amoa 유전자의풍부도를보여준다. 샘플 CN-SH-TS 은여덟종류의대상슬러지샘플중가장많은 AOB amoa 유전자 copy number 를갖는것으로분석되었다. 표 1 은 pyrosequencing d로부터도출된전체서열과여섯개슬러지샘플에서도출된 AOB 연관서열에대한정보를담고있다. AOB 서열은여섯개샘플중, 다섯개샘플에서성공적으로도출되었으며, 0.29%-0.64% 를차지하였다. US-CO-CO 샘플의경우, ( 미국의콜롬비아지역에서채취한샘플 ) 어떤 AOB 서열도관찰되지않았으며, 이는하수처리장에서의낮은 AOB 풍부도때문으로사료된다. 3.3. 여러활성슬러지샘플에서의 AOA amoa 유전자다양성 본연구에서는서로다른 PCR 온도조건 (50-60 범위 ) 및네종류의 PCR 시스템 (TaKaRa Ex Taq, TaKaRa Mighty Amp DNA Polymerase, Sigma Taq DNA Polymerase, Bio-Rad SYBR Green Supermix) 을사용하여여덟개의슬러지샘플로부터 amoa 유전자를증폭하고자하였다. 위연구결과증폭은다섯개의슬러지샘플에서만성공적으로수행되었다. 그리고오직세개의슬러지샘플만이최종적으로클로닝및 sequencing 과정까지성공적으로수행되었다. 또한올리고 dimer 는모든샘플에대해서심각하게발견되었으며, 이에본연구에서적용된 SYBR Green qpcr 기법을이용한 amoa 정량은가능하지않았다. - 11 -
그림 4. 여러활성슬러지샘플에서의 AOA amoa 유전자 OTU 의상대적풍부도 및분포. 그러나 CN-NJ-SJ, CN-HR-UN, SG-SG-UP 샘플의 clone library 결과를바탕으로한 AOA amoa 유전자의다양성의사전평가결과는여전히흥미롭다. 위의세종류의슬러지로부터도출된 56개의서열정보는 3% cut-off 기준으로 15 개의 OTU 으로분류되었다 ( 그림 4). AOB amoa OTU 와는달리, 일부 AOA amoa OTU 는여러샘플들에서동일하게분석되었다. 이러한연구결과는 AOA amoa 유전자는 AOB amoa 유전자만큼다양성이크지않음을나타낸다. 그러나이는제한된샘플들을대상으로도출된결과이기때문에 AOB amoa 와 AOA amoa 유전자의다양성차이를명확하게결론짓기위해서는이에대한추가적인연구가필요하다고사료된다. AOA amoa 유전자서열의계통분류분석에의하면, 본연구에서도출된대부분의서열들은선행연구들에서발견된것들과는차이가있음을알수있다 ( 그림 6). 오직두개의 OTU (OTU-10, OTU-11) 이해양 - 12 -
및저류지에서발견되는것으로분류되었다. 그림 5. AOB 16S rrna 유전자서열에기초한계통분류분석결과. - 13 -
그림 6. AOA amoa 유전자서열에기초한계통분류분석결과. 4. 결언 일반적으로생물학적폐수처리공정은 black box 모델로여겨지고있어 그예측이어렵다. 이에생화학반응의핵심주체인미생물의군집을조사하 고, 이해하는것은공정이상상황해석및개선의초석이된다. 본보고서는 - 14 -
4개국, 여러지역의하수처리장폭기조에서의 AOB 및 AOA 군집을조사한정보를제공하고있다. 전통적인방법으로 clone library 를구축했을뿐만아니라, 최신기술인 high-throughput pyrosequencing 기법을적용하여암모니아산화를담당하는미생물군집의다양성을조사하였다. pyrosequencing 기법은단시간에방대한양의미생물정보를파악할수있는기술로써, 최근들어생물학적수처리공정해석에도적용되고있다. 연구결과 AOB 의경우, Nitrosomonas ureae, Nitrosomonas oligotropha, Nitrosomonas marina, Nitrosomonas aestuarii 와같은 Nitrosomonas genus 종들이하수처리장에우점하고있었으며, AOA amoa 유전자의경우, 대부분토양에서발견되는 CGI.1b 에속하는유전자가주로발견되었다. 5. 참고문헌 (1) Ammonia-oxidizing archaea and ammonia-oxidizing bacteria in six full-scale wastewater treatment bioreactors, Appl Microbiol Biotechnol (2011) 91:1215 1225, Tong Zhang et al. (2) Ammonia-oxidizing archaea involved in nitrogen removal, water research 43 (2009) 1801 1809, Jia You et al. - 15 -