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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): 214-218 (2016) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2016.31.4.214 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 연구논문 전복 (Haliotis discus) 에서분리한 Serratia marcescens 가생산하는적색색소의항균활성 신유진, 강창호, 소재성 * Red Pigment Producing Serratia marcescens Isolated from Abalone (Haliotis discus) YuJin Shin, Chang-Ho Kang, and Jae-Seong So* Received: 30 August 2016 / Revised: 31 October 2016 / Accepted: 9 November 2016 2016 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: Serratia marcescens characterized by the ability to produce red pigments inhabits various ecological niches. A strain Serratia marcescens PYU was isolated from abalone (Haliotis discus) collected at the West Sea in Korea. The isolated strain was gram-negative, motile, rods like coccus, oxidase-negative, and catalase-positive; and formed red pigment. S. marcescens PYU was grown in the presence of 0~10% (w/ v) NaCl, at ph 4~9, and at 10~40 C. The strain PYU produced red pigment, and the extracted pigment showed antibacterial activity against Streptococcus iniae and Lactococcus garviae which has been known as an important fish pathogens. Further studies are underway to elucidate the direct relationship between the red pigment and antibacterial activity. Keywords: Serratia marcescens, Abalone (Haliotis discus), Red pigment, Anti-bacterial activity 1. INTRODUCTION 해양환경이가지는풍부한생물학적다양성은해양자원을이용한다양한적용가능성을내포하고있으며큰연구가치를지닌다 [1]. 특히해양에서서식하고있는다양한해양세 인하대학교생물공학과 Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 402-751, Korea Tel: +82-32-860-8666, Fax: +82-32-872-4046 e-mail: sjaeseon@inha.ac.kr 균은특이적인생물학적특성을지니는이차대사산물들을생산하며, 일부의대사물질들은색을띠는것으로보고되고있다 [2]. 세균이생산하는이차대사물질중일부는생존을위한다른미생물들에대한방어기작으로작용하며, 이러한생리학적특성은다양한유해미생물의억제능력과관련한적용가능성을제시한다 [1]. Serratia 속은그람음성의세균으로 Enterobacteriaceae 과에속하며, 통성혐기성의특징을가지는짧은간균이다 [3,4]. Serratia 속에서가장흔한종은 Serratia marcescens 로알려져있으며, 물, 토양, 대기, 식물과동물을포함한다양한환경에서서식한다 [4]. S. marcescens 중일부는이차대사산물로써 prodigiosin 족에속하는적색색소이외에도분홍색 (pyrimine), 노랑색 (2-hydroxy-5-carboxymethyl muconic acid semialdehyde) 의색소나색소이외에 serrawettina, prodigiozan, serratine 등의생리활성물질들을생산한다 [5]. Prodigiosin 족의적색색소는항균작용, 항진균작용, 면역억제등의다양한생물학적특성을가지는것으로보고되었으며 [6,7], S. marcescens 이외에도 Streptomyces, Actinomadura, Pseudomonas 등의속에속한일부해양세균들도 prodigiosin 이나이와관련된물질들을생산하는것으로보고된바있다 [2]. 미생물이생산하는색소의정확한생리학적역할이모두밝혀지진않았지만, 일반적으로해양세균이생산하는색소는주변환경의적응과포식자에대한방어작용을하는것으로보고되고있다 [1]. 이에본연구에서는서해연안에서채취한전복으로부터적색색소를생산하는미생물을분리동정하여분리균주의생장특성을파악하고, 분리균주인 S. marcescens PYU 가생산

전복 (Haliotis discus) 에서분리한 Serratia marcescens 가생산하는적색색소의항균활성 215 하는적색색소의특성을분석하여항균활성능력을확인하였다. 2. MATERIALS AND METHODS 2.1. 분리시료및전처리적색색소를생성하는균주의분리를위한해양샘플로 2013 년 6 월부터 11 월까지서해안의태안소원면 (36 44'49.04"N, 126 10'43.51"E) 에서채취된전복 (Haliotis discus) 을사용하였다. 채취된전복은멸균된칼로패각을제거하였으며, 멸균된분쇄기 (7011S, Waring, Torrington, CT, USA) 를이용하여패육 (200 g) 과 phosphate-buffered saline (PBS, 2.5 mm KH 2 PO 4 ; ph 7.2) 200 ml 를넣어분쇄하였다. 그후분쇄된샘플을 PBS 로연속적으로 10 배씩희석하여희석된샘플을각각 100 µl 씩 Miller Luria-Bertani media (Difco, Franklin Lakes, NJ, USA) 에 NaCl 이 1% (w/v) 추가된배지 (LB-N) 위에도말한후 30 C 에서 24 시간동안배양하였다. 분리된적색색소생성균주는 25% (v/v) 글리세롤이포함된 LB-N 액체배지에접종하여 -70 C 에서보관하였다. 2.2. 분리균주의특성확인및동정분리균주의생화학적특성확인을위하여 LB-N 배지, 30 C 에서 24시간동안배양하였다. 배양된균은그람염색법 [8] 을실시하였으며, 균의 oxidase 활성과 catalase 활성은각각 1% N,N,N,N -Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydro-chloride (BDH Limited, Poole, England) 시약의색변화와 3% H 2 O 2 시약의기포생성여부를통하여확인하였다. 균의이동성은 soft LB-N 배지에올린멸균된 paper disc에균을 10 µl를접종한후 30 C에서 24시간동안배양하여확인하였다. 균의생화학적특성은 API 20E kit (BioMerirux, France) 로확인하였다. 분리균주의동정을위하여 16S rrna gene sequencing을수행하였으며, 유전자의증폭은 the universal rrna gene primers (518F and 800R) 를사용하였고, 각과정은 Macrogen Co. (Daejeon, Korea) 을통하여진행하였다. 이후분석된 16S rrna sequencing 결과는 National Center for biotechnology Institute (NCBI) 의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analysis (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi) 를통해 Genbank database 와비교하여동정하였다. Sequence 는 PHYDIT 3.1 을통하여 alignment 를진행하였고, 이후 MEGA 5.1 software 를이용하여 neighborjoining method 로계통수를작성하였다 [9]. 2.3. 분리균주의생장조건확인분리균주의생장조건을확인하기위하여, 각각온도와염농도, ph 조건을다르게하여배양하였다. 온도조건의확인을위하여분리균주를 LB-N 액체배지에접종하여 5 C 부터 45 C 범위 (5 C 간격 ) 의온도에서배양하였으며, 염농도와 ph 조건의확인은각각 NaCl 농도를 0% 에서 12% 범위 (1% 간격 ) 로조정한배지와 ph 를 4 부터 10 으로조정한배지에분리균주를배양하여확인하였다. 기본배양조건은 30 C, 200 rpm 으로 24 시간배양후 OD 600 값의변화로균의생장을확인하였다. 2.4. 분리균주가생산하는적색색소의추출분리균주를 LB-N 액체배지에접종하여각각 1 일, 2 일, 3 일배양한후에각배양액을 16,180 g 로 10 분동안원심분리하여상등액을제거하였다. 이후 95% ethanol 을넣어세포를재현탁한후 2 시간동안 25 C 에서진탕시키고다시원심분리하였다 [10]. 분리된상등액을병에모아 filter paper (Whatman Internation Ltd, Maldstone, England) 로거르고 60 C 에서용매를증발시킨후, 1 mg/ml 의농도가되도록다시 ethanol 로용해하였다. 2.5. 적색색소의항균활성측정추출한적색색소의항균활성을확인하기위하여 4 종의병원균 (Bacillus cereus KCCM40935, Staphylococcus aureus KCCM12214, Salmonella typhimurium KCCM41038, Escheri- Fig. 1. Phylogenetic placement of Serratia marcescens PYU compared to red-pigment produced microorganisms. The tree was based on 16S rrna gene sequences and constructed by using the neighbor-joining method. Numerical values indicate bootstrap percentile from 1,000 replicates.

216 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): 214-218 (2016) chia coli O157:H7 KCCM40406) 과 4종의어병세균 (Edwardsiella tarda FP5060, Streptococcus iniae FP5228, Vibrio ichthyoenteri FP4004, Lactococcus garviae FP5245) 을사용하였다. 4종의병원균은 LB 배지에접종하여 35 C, 200 rpm 조건에서배양하였으며, 4종의어병세균의경우 2% NaCl이포함된 Brain-Heart Infusion medium (Bacto, Spark, USA) 에접종하여 30 C, 200 rpm 조건으로배양하였다. 항균활성측정은병원균과어병세균희석액 100 µl을 Müller-Hinton Agar (MHA, BBL, Spark, USA) 와 2% NaCl이포함된 MHA에각각도말한후, 멸균된 paper disc에각각 1 일, 2일, 3일동안배양하여추출한적색색소와대조군으로 95% ethanol을 50 µl씩흡수시켜균이도말된배지에올리고 18시간동안각각 35 C와 30 C에서배양하였다. 배양후 paper disc 주변에생성되는저해환의크기를측정하여적색색소의항균활성을측정하였다. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 분리균주의특성및동정 7 월태안소원면에서채취된전복샘플로부터붉은색의 col- Table 1. Comparison of biochemical characteristic with Serratia marcescens; +, positive,, negative Characteristic PYU Serratia marcescens a β-galactosidase + + Arginine dihydrolase Lysine decarboxylase + + Ornithine decarboxylase + + Citrate utilization + + H 2 S production Urease Tryptophane deaminase Indole production Gelatinase + + D-glucose fermentation + + D-mannitol fermentation + + inositol fermentation + + D-sorbitol fermentation + + L-rhamnose fermentation D-sucrose fermentation + + D-melibiose fermentation Voges-Proskaeur + + L-arabinose fermentation a Characteristics were compiled from several references (serratia infection, genus serratia). Fig. 2. Growth condition of isolated strain Serratia marcescens PYU. (a) at various temperature, 5~45 C; (b) at various ph, ph 3~10; (c) at various salt (NaCl) concentrations, 0~12%.

전복 (Haliotis discus) 에서분리한 Serratia marcescens 가생산하는적색색소의항균활성 217 ony 를생성하는균주를분리하였고 PYU 로명명하였다. PYU 균주의생화학적특성확인을통해그람음성이며 rod-shape 의구균으로 catalase-positive, oxidase-negative 이고운동성을가지는것을확인하였다. LB-N 배지에서 PYU 균주는둥글고매끄러운표면에우유빛을띠는 colony 를형성하며, 붉은색의색소를생산한다. 최근국내해안에서적색색소를생산하는분리균주들로 Hahella chejuensis [11] 와 Zooshikella rubidus [12] 가보고되었다. 기존의연구를통해각분리균주가생산하는적색색소의생리학적특성에대하여 prodiginines (H. chejuensis) 은항균작용과조류를고사시키는작용을하며 [11], prodigiosin 과 cycloprodigiosin (Z. rubidus) 은항균작용을가지는것으로확인되었다 [12]. PYU 의 16S rrna gene sequence 와계통수분석결과, S. marcescens 와 99% 의유사성을가지는것을확인하였으며 (Fig. 1), 본연구를통해새롭게분리한 S. marcescens PYU (PYU) 의 16S rrna gene sequence 을 GenBank 에등록하였다 (accession number KJ469400). 또한 PYU 의생화학적특성도일반적으로알려진 S. marcescens 의생화학적특성과비교하였을때 [3,4], 매우유사함을확인하였다 (Table 1). 3.2. Determination of range of growth condition PYU는통성혐기성으로, 호기적조건에서상대적으로더빠른속도로높은농도까지생장하는것을확인하였다 (data not shown). 이에 PYU의생육조건을확인하는실험은호기적조건에서실시하였다. 실험결과 PYU는 10~40 C ( 최적온도 25~30 C), ph 4~9 ( 최적 ph 6~8), NaCl 농도 0~10% ( 최적농도 2%) 의조건에서생장하는것이확인되었다 (Fig. 2). 해양세균은압력, 온도, 염, 등의다양한스트레스환경에노출되며 [13], 본연구의 PYU는 7월연안에서채취된전복으로부터분리된균주로 PYU의최적생장조건은일반적으로알려진여름철표층해수의온도, ph, 염도와유사함을확인하였다. 특히 PYU가최대 10% 의 NaCl이포함된배지에서도 Fig. 3. Anti-bacterial activity of crude red pigment produced by Serratia marcescens PYU. (a) clear zone of crude red pigment by incubating duration of Serratia marcescens PYU against S. iniae, L. garviae, E. tarda, B. cereus, E, coli O157:H7, and S. aureus; the paper disc at the top is 95% ethanol and 3 other paper discs are the crude red pigment incubated for each 1, 2, and 3 day, clockwise. (b) clear zone of crude red pigment by concentration against S. iniae and E. tarda; the paper disc at the top is 0 ppm and 6 other paper discs are each 1, 10, 100, 1000, 5000,and 10000 mg/l clockwise.

218 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): 214-218 (2016) 생장하며최적의배양을위하여배지내 NaCl 의농도가 2% 라는특징은대부분의해양세균들이상대적으로높은 Na + 농도인바닷물의영향으로 Na + 를필요로한다는사실 [13] 에부합한다. 3.3. 적색색소의항균작용이전연구에따르면 [2], S. marcescens 가생산하는적색색소인 prodigiosin 은항균, 항진균, 면역억제등의다양한생리학적특성을가지는것으로보고되고있다. 본실험에서는총 8 종의병원균중어병세균인 S. iniae 와 L. garviae 만이 PYU 가생산하는적색색소에의한저해를보였으며 (Fig. 3(a)), 배양한시간이길수록저해정도가강해지는것을확인할수있는데, 이는배양시간에서따라적색색소의생산이증가하는것과같은양상을보였다. 또한 S. iniae 와 E. tarda 에대한적색색소의농도에따른저해여부를확인하는실험에서 E. tarda 는저해를보이지않았으나 S. iniae 는 100 mg/l 의농도부터저해가되는것을확인하였다 (Fig. 3(b)). S. iniae 와 L. garviae 는중증의어병세균으로담수와해양환경에서식하는어류에 streptococcosis (lactococcosis 포함 ) 를유발한다 [14]. 중동지역과캐나다, 미국, 호주, 일본, 싱가포르등아시아 - 태평양지역의담수와해양환경에서양식되는어류중최소 27 종에대하여 streptococcosis 에의한감염이보고되었으며, streptococcosis 감염시 3~7 일이내 50% 이상의폐사율을보여심각한경제적손실을야기한다 [15]. 국내에서도 S. iniae 나 L. garviae 에의한 streptococcosis 은여름철해수온도가 16 C 이상이되는시기의어류양식에서많이발생하며, 높은폐사율로인하여경제적손실을야기하는것으로조사되었다 [16,17]. 본연구를통해새롭게분리한 S. marcescens PYU 균주가생산하는적색색소는 S. iniae 와 L. garviae 에대한항균효과를가지고있으며, 이를통하여여름철어류의높은폐사율을야기하는 streptococcosis 의발생을줄일대안방안으로적색색소에대한다양한적용가능성을확인할수있었다. 4. CONCLUSION 서해안에서채취한전복으로부터 Serratia marcescens PYU 를최초로분리하였다. 균주 PYU 는그람음성의통성혐기성구균으로적색색소를생산하며, 10~40 C, ph 4~9, NaCl 농도 0~10% 조건에서생육이가능하다. 균주 PYU 가생산하는적색색소를에탄올로추출하여, 여름철양식어류의높은폐사율를야기하는어병세균인 S. iniae 와 L. garviae 에대한항균효과를확인하였다. REFERENCES 1. Bhatnagar, I. and S. K. Kim (2010) Immense essence of excellence: Marine microbial bioactive compounds. Mar. Drugs 8: 2673-2701. 2. Soliev, A. B., K. Hosokawa, and K. Enomoto (2011) Bioactive pigments from marine bacteria: applications and physiological roles. Evid.-based Complement Altern. Med. 2011: 17. doi:10.1155/2011/ 670349 3. Mahlen, S. D. (2011) Serratia infections: From military experiments to current practice. Clin. Microbiol. Rev. 24: 755-791. 4. Grimont, F. and P. A. D. Grimont (2006) The genus Serratia. pp. 799-811. In: D. J. Brenner, N. R. Krieg, and J. T. Staley (eds.), The Proteobacteria. Springer, NY, US. 5. Luna, M., S. García, O. García, and Á. Trigos (2013) Serratin a new metabolite obtained from Serratia marcescens, a bacterium isolated from the microflora associated with banana plantations. Nat. Prod. Res. 27: 49-53. 6. Khanafari, A., M. M. Assadi, and F. A. Fakhr (2006). Review of prodigiosin, pigmentation in Serratia marcescens. J. Biol. Sci. 6: 1-13. 7. Williams, R. P. and S. M. H. Qadri (1980) The pigment of Serratia. pp. 31-75. In: A. von Graevenitz, and S. J. Rubin (Eds.), The genus Serratia. CRC Press, Boca Raton, FL, US. 8. Gerhardt, P., R. G. E. Murray, W. A. Wood, and N. R. Krieg (1994) Methods for general and Molecular Bacteriology. pp. 31-32. American Society for Microbiology, Washington DC, USA. 9. Tamura, K., D. Peterson, N. Peterson, G. Stecher, M. Nei, and S. Kumar (2011). MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28: 2731-2739. 10. Park, H., S. G. Lee, T. K. Kim, S. J. Han, and J. H. Yim (2012) Selection of extraction solvent and temperature effect on stability of the algicidal agent prodigiosin. Biotechnol. Bioprocess Eng. 17: 1232-1237. 11. Lee, H. K., J. Chun, E. Y. Moon, S. H. Ko, D. S. Lee, H. S. Lee, and K. S. Bae (2001) Hahella chejuensis gen. nov., sp. nov., an extracellular-polysaccharide-producing marine bacterium. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 661-666. 12. Yi, H., Y. Chang, H. W. Oh, K. S. Bae, and J. Chun (2003) Zooshikella ganghwensis gen. nov., sp. nov., isolated from tidal flat sediments. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 1013-1018. 13. Macleod, R. A. (1965) Question of existence of specific marine bacteria. Bacteriol. Rev. 29: 9-23. 14. Vendrell, D., J. l. Balcazar, I. Ruiz-Zarzuela, I. de Blas, O. Girones, and J. L. Muzquiz (2006) Lactococcus garvieae in fish: A review. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 29:177-198. 15. Agnew, W. and A. C. Barnes (2007) Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122: 1-15. 16. Moon, J. S., H. Jang, J. Y. Kim, S. J. Joh, M. J. Kim, and S. W. Son (2007) Evaluation on efficacy of β-hemolytic Streptococcus iniae vaccine on olive flounder, Paralichthys olivaceus. J. Vet. Sci. 47: 291-298. 17. Cho, M. Y., M. S. Kim, H. S. Choi, G. H. Park, J. W. Kim, M. S. Park, and M. A. Park (2008) A statistical study on infectious disease of cultured olive flounder, Paralichthys olivaceus in Korea. J. Fish Pathol. 21: 271-278.