16. 먹으면 건강해지는 천연 방부제, 김치 유산균

WISET 주니어과학기술논문집 2012 Vol. 1 먹으면건강해지는천연방부제, 김치유산균 이현정 1) ㆍ김문진 1) ㆍ허미영 1) ㆍ강윤정 2) ㆍ허혜원 2) ㆍ정화진 3) ㆍ최유정 3) 전북대학교 1) ㆍ전북사범대학부속고등학교 2) ㆍ이일여자고등학교 3) 초록 본연구는김치유산균의항균효과와실제활용가능여부를알아보고자진행되었다. JEI와 171의파쇄액과상층액, 두그룹으로나누어실험을진행하였으며다시그두그룹을멸균의유무에따라멸균한것과멸균하지않은것으로나누었다. 항균성의효과와그의효율성을알아내기위해 E. coli를배양시켜비교해보았으며, 그결과멸균시킨 171의상층액이가장 E. coli의 colony개채수를줄이는것으로나타났다. This study was processed to find out lactobacillus in kimchi to provide anti-bacterial effect and possibility of appllication in a real life. The experiment was divided into 2 groups (supernatant liquid, homogenate) and then the group again divided by sterilization processing. We compared each group to the others to identify anti-bacterial effect and the efficiency by culturing E.coli. As a result, sterilized supernatant of 171 is most efficient to reduce number of colony of E.coli. 키워드 : Leuconostoc mesenteroides JEI, Lactobacillus kimchii 171, 파쇄액, 상층액 Ⅰ. 서론 바쁜일상, 밥먹을시간이없어서편의점이나마트에서구입하게되는여러가지제조식품. 그속에는우리가흔히 방부제 라고알고있는식품첨가물이들어가는데, 이는세균류의성장을억제하거나방지하기위해식품에첨가하는화학물질이다.[1] 이러한방부제가첨가된식품들을과연안심하고먹어도되는것일까? 시중에서판매되는모든식품에방부제가첨가되는것은아니지만치즈, 초콜릿, 음료수, 칵테일, 고추장, 자장면, 마가린, 빵, 어육등과같 이오랜기간동안보관해야하는식품에는살리실산과같은몇몇인체에유해한방부제가포함되어있다. 이는방부제로써효과적인효능을갖추고있지만, 많이섭취하게되면체내에서아소산과반응하여식욕감퇴, 소화불량, 눈과피부점막자극, 중추신경마비, 출혈성위염등을일으킬수있다.[1] 그러한이유로우리연구팀은이런유해한방부제중하나인살리실산을대체할수있는안전한방부제를모색하였으며, 여러대안중 유산균의항균성 에초점을두게되었다. 유산균 (lactic acid bacteria) 은탄수화물을분 141

WISET 주니어과학기술논문집 표 1. JEI, 171 유산균의비교및특징 [3] Leuconostoc Lactobacillus O 2 의필요유무유 무에관계없음유 무에관계없음 생장최적온도 특징 20-30 ( 약 25 ) ( 예외적으로 5-30 에서도생장 ) 45 에서생장을못하고, 15 에는생장할수있다. Leuconostocs 가생장한후에출현 해하고, 이를이용하여유산을만드는세균으로서, 산소가적은곳에서잘증식하는통성혐기성균또는편성혐기성균이다.[2] 유산균은또다시여러종류로나뉘게되는데, 우리실험에서는두종류의김치유산균 [Leuconostoc mesenteroides JEI, Lactobacillus kimchii 171, 연구방법에대한내용부터는간략하게줄여 JEI 와 171이라칭하겠음 ] 을사용했다. 두유산균에대해간략히정리하면아래의표 1.[3] 과같다. Lactobacillus에는여러종류가있는데, 우리가사용한락토바실러스사케 (Lactobacillus sakei) 는염증성질환또는면역관련질환의예방및치료활성을갖는다. 이로부터분리한리포테이코익산 (lipoteichoic acid) 은김치로부터분리된것이기때문에섭취하더라도안전성이보장되며, 사이토카인 (Cytokine, 신체의방어체계를제어하고자극하는신호물질로사용되는당단백질 [4]) 의발현을유도함으로써면역력증가및항암활성을나타내는바, 식품또는약학조성물로서다양한염증성질환또는면역관련질환의예방및치료에유용하게사용될수있음을알아냈다.[2] 이러한특징을가진김치유산균의천연항균성분을이용하여유해세균을처리하기위해사용되었던화학소재제품을대체하고자하였으며, 식물추출물을이용한천연방부제속항균물질이외혼재된물질들에의한부작용발생을방지함으로써인체에무해한방부물질을개발하고자하였다. 뿐아니라식품을통해유산균을지속적으로섭취함으로써장내산도를증가시켜장의연동운동을적절하게유지하여소화흡수를촉진을돕고, 변비및설사를예방하는등방부제효과이외의여러가지효과를거둘수있는가능성이보였다. 이러한연구결과들을기반으로유산균발효액을제조하여상층액과 cell down된세포를파쇄한파쇄액으로항균력테스트를진행하였고, MTT assay를통하여독성평가를실시하였다. 또한시중에파는빵으로방부테스트를통해유산균발효액의방부제로서의가능성을확인하고자하였다. 142

먹으면건강해지는천연방부제, 김치유산균 Ⅱ. 실험및방법 1) 성장곡선확인 효율성을높이기위해 171과 JEI를 MRS액체배지 10 ml에 colony를따서배양시켜주는 seed culture 해주었다. 그리고 JEI와 171은 25 C 인큐베이터에기울어지게넣어 171은 48 hr, JEI 는 24 hr 씩다른기간동안배양해주었다. 171은 48 hr, JEI는 24 hr가지난후 main culture를해주었다. MRS배지용액을 100 ml씩삼각플라스크에담고 seed culture 용액을 1 ml 따내어삼각플라스크에넣어주었다. 그리고 25 C의인큐베이터에넣어배양시켜주었다. 실험의정확성을높이기위해모든것은 triplication으로진행되었다. main culture 시작후 0 hr부터시작하여 3시간단위로 JEI는 24 hr, 171은 48 hr까지 spectrophotometer를이용하여 OD(optical density) 값을찍었다. 2) 유산균항균성테스트가. 추출준비항균성테스트에는유산균추출액을이용하였다. 추출을하기위해 main culture한 JEI, 171 을분주하여원심분리를시행하였고, 조건은 3000 rpm, 20분동안 cell down하였다. cell down을통해분리된것을세포가따라나오지않게상층액을따라내주었고남은부분은피펫을이용해서최대한 cell만남도록상층액을제거하였다. 그리고 cell down 된세포는증류수를사용하여 washing 하였으며두번반복하 였다. 그리고다시 cell down된것의 cell만을남긴후파쇄시켰다. 나. 파쇄 washing 후 50% 파쇄액을만들기위하여 OD 값이 4.5정도된 100 ml 에배양된 cell을 100% 로하여 3차멸균 D.W를 2 ml 넣어주었다. purse를 on 20초, off 10초, 강도 40% 로맞추어 1시간동안소니케이션하였다. 그리고모두파쇄된것을가지고마이크로튜브에 1 ml 씩따라담은후원심분리기에 13000 rpm, 20 분, 그리고 4 로맞춘후 cell down 시켰다. 그리고나서상층액만모은후필터링하였다. 다. spreading spreading을위해 E. coli를배양하였다. 그리고원심분리후얻은상층액을 filtering하여얻은상층액을 50% 로정하여상층액을희석한후 10-4 까지희석시킨 E. coli에상층액과파쇄액을각각첨가하여최종 E. coli농도를 10-5 로희석한후, 그 100ul씩 spreading을하였다. 모든실험은 triplication으로이루어졌고같은방법으로 50% 파쇄액도실험이진행되었다. 라. 필터링과멸균 E. coli를이용하여항균성테스트를하였다. 추출과정중얻은상층액을반으로나누어필터링과멸균을하였다. 필터링은필터 (0.2μm) 와실린지를이용해서실행하였고, 멸균은 autoclave에넣어 121 C 15분동안멸균해주었다. 143

WISET 주니어과학기술논문집 필터링과멸균과정을거친각각의상층액을 10%, 30%, 50% 로희석해서샘플을만든후, 항균성테스트를할 E. coli( ABS 0.67) 를 10-5 으로희석해 LB배지에 spreading 하였다. 그후, 37 (E. coli 성장최적온도 ) 인큐베이터에서 24시간배양을해준뒤, colony 수를세주었다. 다. 만든용액을분무기를이용하여반으로자른식빵 3개에각각 5 ml씩분사해주었다. 다른종류의용액을분사할때에는멸균 3차 D.W로먼저분사하여세척한뒤다른용액을분사해실험의정확도를높이고자하였다. 경과를두고식빵이썩는과정을관찰해주었다. 3) MTT assay dish에서 cell을뗴어내어 hemocytometer방법을이용해세포수를세어주고, 96well plate에 104 ~ 106 / 200 μl로계산해주어넣어주었다. 그리고배지 blank(180 μl + PBS 20 μl ), control(cell 넣은배지 180 μl + PBS 20 μl ), sample 1(cell 넣은배지 180μl + JEI 상층액 20 μl ), sample 2(cell 넣은배지 180 μl + L.171 상층액 20 μl ) 를 triplication으로준비후 24 hr동안 incubation한다. 그리고나서시료를제거하고, PBS로 2번 washing하고 MTT solution을 100 μl처리해주었다. 4시간반응후 MTT solution을제거하고, 각 well에 DMSO 100 μl처리하여 20min 반응시켜고정하였다. 그후 ELASA reader로 570 nm에서측정하였다. 결과값은 MTT 환원된양을뜻하며, 세포의생존수와비례한다. Ⅲ. 결과및토론 1) 성장곡선확인 OD값의측정결과 JEI와 171의성장곡선을알수있었다. JEI는약 15시간후에, 171은약 21시간에서정지기에들어간것을알수있었다. 둘의그래프를비교해보면 JEI의성장하는속도가 171보다더빠르지만 171의 cell이더잘자라는것을확인할수있었다. 4) 방부테스트 시중에판매되는같은제과점제품의식빵을이용하여실험을진행하였다. 식빵에 15 ml씩분사를하기위해여유롭게 control, JEI, 171, 살리실산을 1%, 3%, 5% 씩 20 ml씩만들어주었 그림 1. L. mesenteroides JEI 성장곡선 144

먹으면건강해지는천연방부제, 김치유산균 2) 유산균항균성테스트 그림 2. L. kimchii 171 성장곡선 유산균내에항균성물질이존재할것이라고생각되어유산균을배양한후, 유산균파쇄액을이용해항균성테스트를진행하였다. 그러나우리가예상했던결과와는달리그림 3, 그림 4에서보면 JEI와 171 모두유산균파쇄액의농도가높아질수록 E. coli의콜로니수가오히려증가하는것을확인할수있었다. 즉이결과는유산균파쇄액내에항균물질이아닌균 그림 3. L. esenteroides JEI 항균력테스트 그림 4. L. kimchii 171 상층액파쇄액항균력테스트 그림 5. L. esenteroides JEI 상층액멸균, fitering 항균력테스트 그림 6. L. kimchii 171 상층액멸균,fitering 항균력테스트 145

WISET 주니어과학기술논문집 의성장에도움이되는물질이생성되었을것이라추측이되었고, 그림 3과그림 4의결과를통해유산균내에항균물질이생성되는것이아니라유산균에서생성된항균물질이유산균배양배지로방출하였을것이라예상되어배양배지를분리하여항균실험을진행하고자하였다. 그래서파쇄액대신에유산균을키운후분리한상층액을분리하였고, 분리한상층액을필터링하여실험한결과상층액의농도가증가할수록항균성이증가하는것을확인할수있었지만 E. coli뿐만아니라다른균도함께자라는것을확인할수있었다. 즉필터링이제대로되지않아오염이된다고판단되어 autoclave를통해완전히멸균한뒤항균성을다시한번확인하였다. autocleave를이용하여균을제거하고, 높은열에의해항균물질의변성이일어나는지확인하기위하여필터링을한상층액과함께실험에사용하였다. 그림 5와그림 6 에서보이는것과같이필터링한상층액에비해 autoclave를통해멸균을한상층액에서항균성이약 5-8배정도높게나타는것을확인할수있었으며, JEI의상층액이 171의상층액보다항균성이더높게나타남을알수있었다. 고찰해본결과항균성을띄는물질은 cell 밖으로배출되며 autoclave를통해서멸균을했을때항균성띄는물질외에항균성저해물질들이높은열과압력에의하여변성이되면서기능을잃어항균성이더욱높아졌다고생각된다. 3) MTT assay 그림 7. MTT assay 항균물질로사용하기위해서는독성이나타나지않아야하기때문에 MTT assay을통하여유산균상층액의독성여부를확인해보았다. ( 앞의항균성테스트실험결과를토대로그다음모든실험에서는멸균시킨유산균의상층액을사용하였다.) 그결과 JEI의상층액은 cell viability가 5% 정도밖에나오지않아독성이있음을확인하였고, 171의상층액은 control에비해독성이조금나타남을확인할수있었지만 JEI의상층액에비해독성이나타나지않아항균물질로사용하기에 171의상층액이조금더안전함을확인하였다. 4) 방부제평가실험 ( 빵실험 ) 실질적으로우리가개발한항균물질이방부효과가있는지확인하기위하여, 시중에판매되는빵을이용하여부패정도를확인하는실험을시행하였다. 항균력이있다는것은부패균 146

먹으면건강해지는천연방부제, 김치유산균 대조군 JEI 171 살리실산 JEI 171 살리실산 JEI 171 살리실산 0day 1day 2day 3day 그림 8. 방부물질에따른빵의부패정도 의성장을저해함으로인해음식물의부패를억제한다고생각되어빵의부패정도를통해방부제로의사용가능성을판단하였다. 우선현재판매되고있는방부물질인살리실산과우리가추출한 JEI의상층액과 171의상층액의항균력을비교해보았다. 그결과, 사진을보여지는것과같이 2일후부터빵이부패하기시작하였고, 부패정도가심한대조군에비해세가지방부물질 1%, 3%, 5% 순으로부패의정도가줄어드는것을확인할수있었다. 또한살리실산에비해 JEI의상층액을처리한빵의부패정도가감소된것을확인할수있었고, 171의상층액을처리한빵이가장부패하지않음을확인할수있었다. 앞서확인된결과에서는 JEI의항균성이높게나타났지만이와다르게빵에상층액을뿌려방부효과를알아보았을때에는 171의방부효과가높게나타났다. 이는항균성테스트를확인할때대장균으로진행이되었지만빵을부패시키는균은대장균이아닌곰팡 이나빵속의다른균에의하여부패한것이라판단하였으며빵을부패시키는미생물에대한방부물질은 JEL 보다는 171에더많이포함되어있다고생각된다. Ⅳ. 결론 현재시중에판매되고있는음식물중장기간보관을해야하는음식물들에인체에유해한방부물질들이포함되어있다. 따라서우리는인체에무해하면서오랜기간보관할수있는천연방부물질을개발하기위해, 김치유산균에방부물질이함유되어있다는문헌을토대로김치유산균인 Leuconostoc esenteroides JEI, Lactobacillus kimchii 171를이용하여천연방부물질을개발하고자하였다. 우선유산균을이용하기위하여성장정도를파악하기위해성장곡선을확인하였고, 항균성 147

WISET 주니어과학기술논문집 테스트를통해유산균파쇄액과유산균상층액중어느부분에항균물질이존재하는지를확인하였고, 그중유산균을배양한배지의상층액에항균물질이있음을알았다. 그리고상층액의추출과정에서필터링을한것보다멸균을하여추출한것이항균효과가더좋으며. 멸균을통해항균성을저해하는물질이제거됨을확인할수있었다. 또한유산균상층액을방부물질로사용하기위해선독성이나타나지않아야함으로 MTT assay를통하여독성여부를평가해본결과, JEI 의상층액은독성이나타남을확인할수있었으나, 171의상층액에서는대조군과같은정도로독성이나타나지않음을확인함으로인해방부물질로사용하기에적당함을확인하였다. 유산균배양액의항균성테스트를통해미생물의성장을억제함을확인하였고, 독성여부도확인되어실질적으로방부효과를나태내는지확인하기위해시중에판매되는빵에현재사용되고있는방부물질중의하나인살리실산과직접적으로비교하여방부효과를확인하였다. 그결과, 살리실산에비해두종류의유산균상층액의방부효과가더높게나타남을확인하였고, 그중 171의상층액의방부효과가더좋음을확인할수있었다. 이결과를토대로, 유산균배양상층액에항균효과를갖는물질이존재하며, 두종류의유산균중 171 유산균의상층액이독성을나타내지않으면서방부효과가탁월한것을확인함으로인해화학방부제를대체할수있는천연방부제로써사용할수있는가능성이있음을확인하였다. Ⅴ. 참고문헌 [1] 방부제종류와내용 http://blog.naver.com/ white5375?redirect=log&logno=166265231 검색일자 : 2012년 9월 16일방부제의부작용 http://cafe.naver.com/wkdal 9872/5 검색일자 : 2012년 9월 16일 [2] 면역관련및염증성질환의예방및치료활성을갖는신규한락토바실러스사케이 (Lactobacillussakei) K101 (Lactobacillus sakei K101 having an activity for prevention and treatment of immune diseases and inflammatory diseases) Int. Cl C12N 1/20 (2006.01) A61K 35/74 (2006.01) A23K 1/16 (2006.01) C12R 1/225 (2006.01) 출원번호 ( 일자 ) 10-2011-0019619 (20110304) 공개번호 ( 일자 ) 1020120100608 (20120912) [3] Leuconostoc, Lactobacillus 에관한내용 http://www.kimchitech.co.kr/index_edit/frame 1_edit.htm 검색일자 : 2012년 9월 15일 [4] Cytokine에관한내용 http://terms.naver.com/ entry.nhn?docid=1257514&mobile&categoryi d=200000466 검색일자 : 2012년 9월 16일 [5] MTT시험에관한내용 http://kin.naver.com/knowhow/detail. nhn?d1id=10&dirid=10&docid=567439&qb= 64+Z66y87IS47Y+sIG10dOyLnO2XmA==&e nc=utf8&section=kin&rank=1&search_sort=0 &spq=0&pid=rauo/c5y7ussssiwwyvssc--46 148

먹으면건강해지는천연방부제, 김치유산균 1470&sid=UFXd1kKWVVAAAAeWhv8 검색일자 : 2012년 9월 16일 [6] 세균의증식곡선에관한내용 http://irahel. blog.me/60101995289 검색일자 : 2012년 9월 16일 * 이연구는한국여성과학기술인지원센터 2012 WISET 여대학 ( 원 ) 생팀제연구지원사업의지원을받아수행되었습니다. 149