Splice site recognition by the splicing machinery 정확한 5 -(GU) 와 3 -(AG) 를인식하기위해서는 exonic splicing enhancer 와그곳에결합하는 SR protein 이필요하다. 그림 ; SR 이 ESE 에결합하고 U1 snrnp 를 5 -splice site 로불러드린다. 그리고 U2AF 65, U2AF 35 를 pyrimidine tract 과 3 -splice site 의 AG 로불로드린다. U2AF 는 U2 snrnp 를 branch point sequence (A) 로불러드린다. 또한 SR 은 U1 snrnp 와 U2 snrnp 가반응을하게한다. Pre-mRNA 분자는 exon recognition 을 repress 하는서열을갖고있다. 이를 exonic splicing silencer (ESS) 혹은 intronic splicing silencer (ISS) 라고한다. 예로 hnrnp 단백질은 ESS 나 ISS 에결합하여 SR 이 ESE 에결합하는것을막는다고생각한다. 또한 splicing은교과서그림 17.39에서보는것처럼전사가되면서동시에 splicing이일어난다고생각된다. 물론전사이후에 posttranscriptional process로도진행된다. 1
17.5 Cleavage/polyadenylation & transcription termination Poly(A) tail synthesis and transcription termination are coupled, cotranscription processes. Transcription termination involves three steps 1. cleavage at the poly(a) site (cleavage/polyadenylation site) 2. addition of the poly(a) tail at the new 3' end 3. transcription termination downstream from the cleavage site 포유류에서 cleavage/polyadenylation site selection에관여하는 3가지 sequence element가존재한다. (a) Poly(A) site recognition in (a) mammals; 1cleavage site에서 10-30 nucleotide 앞의 polyadeny lation signal (AAUAAA) 2U-rich downstream element (b) 3UGUA sequence (b) Poly(A) site recognition in yeast cleavage site의 5 쪽에있는 efficiency element (EE) 와 positioning element (PE) 존재. 또한 Py(A)n 서열이존재. 2
cleavage/polyadenylation machinery in mammals 1. CPSF; polyadenylation signal AAUAA 에결합. cleavage 와 poly A 의첨가에필수적. 2. CstF; U-rich 서열에결합. cleavage 에필수적 3. CFI 과 CFII; cleavage 에필요. 4. PAP; 3 -end 에 A 를첨가 5. PABII; poly(a) 의첨가를촉진 poly(a) 의길이를조절 6. Ssu72 & PC4; TFIIB 와 interact 7. Symplekin; CstF complex 를안정화 8. CTD of RPB1 (largest subunit in RNA polymerase II); CPSF, CstF 와결합하고 3 cleavage 가일어나는동안다른 factor 와함께존재해야한다. 3
Transcription and polyadenylation factors are linked early in transcription transcription 과 cleavage/polyadenylation factor 는전사의초기부터끝까지서로연관이되어있다. Figure 17.42 전사를시작하기위하여 PC4 (red) 가 general transcription factor인 TFIID, TFIIB 등을불러드리고 CPSF가 TFIID와연관을맺고 pre-initiation complex로오게된다. 또한 Ssu72가 TFIIB와연관을맺는다. RNA polymerase II와다른 factor들도 promoter에모인다. Initiation; TFIIH의 subunit인 Kin28이 CTD의인산화를촉매. CPSF, CstF,Ssu72 PC4, symplekin등이인산화된ctd에연관이되어있다. Elongation; RNA polymerase II가 RNA chain을신장함. Polyadenylation/termination; CPSF, CstF등이 poly A signal을인식하고 PC4가 CTD로부터떨어져나온다. 3 cleavage site를자르고 poly A tail이첨가된다. 4
(a) (b) (c) Alternative poly(a) site selection 많은 transcription unit 는두개혹은그이상의 alternative polyadenylation site 를갖고있으며 3 가지형태로되어있다. (a) terminal exon 내에 multiple poly(a) site 를갖고있는경우. 상황에따라서 poly(a) site 를선택함. (b) physiological condition 에따라서 internal exon 혹은 terminal exon 으로작용을한다. terminal exon 으로작용하면전사가그곳에서끝나고 internal exon 으로작용하면다음 poly (A) 부위까지전사가됨 (c) 두개혹은그이상의 alternative 3 - terminal exon 이있는경우. termianl exon 으로작용하거나아니면 exon 으로작용을하지못한다. 구체적인예는다음페이지에서배움 5
calcitonin pre-mrna undergoes alternative splicing and polyadenylation 6 개의 exon 이있고조직에따라두가지단백질을만든다. thyroid 나대부분다른조직에서처음 4 개의 exon 이사용되고 exon4 의 poly(a) 가사용되어 calcitonin 을만든다. 신경세포에서는 exon 3,5 가사용되고 exon 6 의 poly(a) 가사용되어 clacitonin gene related peptide (CGRP) 를만든다. The IgM transcription unit can also be alternatively processed IgM transcription unit 는두가지의 poly(a) site 를갖으며두가지의 IgM 을만든다. B cell 은 membrane bound IgM 을만들며 weak upstream poly(a) 를 splicing 될때제거하고다음 poly(a) site 을이용한다. Plasma cell 은 soluble IgM 을만들고 weak upstream poly(a) 를이용하여짧고 soluble 한형태를만든다. 6
Nuclear run-on shows that termination takes place after poly(a) cleavage 전사의종결은 cleavage/polyadenylation site 로부터수백 bp downstream 에서일어난다. 이를증명하기위하여 nuclear run-on 실험을사용. (1) 핵을분리하여 (2) radioactive necleoside triphosphate 를포함한반응혼합액에넣은후일정기간반응을시킨다 (red). (3) 반응을멈추고 radioactive RNA (red) 를추출한다. transcript 는주형 DNA 를따라각각다른위치까지전사가됨 (4) 다른지역을갖고있는 (A-E) DNA fragment 와반응시킴. termination site 전에것은 (A-D) 는강한신호가있고뒤의것은신호가없다 (E) transcription termination requires poly(a) signals transcription termination requires factors for 3'- cleavage but does not require factors for polyadenylation transcription terminates downstream from the poly(a) site (200 2000bp downstream) some transcripts terminate efficiently at a single site, whereas others terminate inefficiently over an extended region RNA polymerase II release requires 3' end processing 7
(a) The antitermination model for termination (b) The torpedo model for termination poly(a) cleavage signal 은 RNAP II 가전사종결을하게끔유도한다. 어떻게 poly(a) site 가전사종결을자극하는가두가지모델이존재. (a) antitermination model positive elongation/antitermination factor 를갖고있다가 polyadenylation signal (pa) site 를지나면서 negative elongation/ termination factor 를갖고형태변화가일어나 RNAPII 가분리됨. (b) Torpedo model adenylation/polyadenylation 에의하여 RNA 가절단되어분리되면 uncapped 5 -end 를갖은 RNA 가남고이것은 Rat1 Xm2 nuclease 에의하여절단이된다. 이것은 mrna 의 extra part 만절단하는것이아니라 termination 을야기시킨다. 8
Processing mechanism of histone pre-mrna Histone 은 poly(a) tail 이없으며 cleavage recognition signal 이다른 pre-mrna 와완전히다르다. Histone pre-mrna 는 cleavage site 위로 26-nucleotide stem loop structure 와아래쪽으로 purine 이많은 histone downstream element (HDE) 가존재한다. stem-loop structure 에는 stem-loop binding protein (SLBP) 이결합하고 small nuclear ribonucleoprotein 인 U7snRNP 가결합하게한다. U7snRNA 는 HDE 와 base pair 를이루어 cleavage site 를확립한다. U7snRNP 는 CPSF subunit, Cst-77, Cst-64, symplekin 등을불러드린다. CPSF 73 subunit 는다른결합된 factor 의도움을받아 endonuclease 로작용하여 histone pre-mrna 를자른다. 화살표가 cleavage site 임 9
17.6 RNA editing RNA editing permits a cell to recode genetic information in a systematic and regulated fashion. RNA editing; 해독이전에 RNA base 를변화시켜서 DNA coding sequence 와는다른서열이된다. 고등생명체에서가장잘연구된것은 deamination reaction 으로 cytidine 이 uridine 으로그리고 adenosine 이 inosine 로된다. translation machinary 는 codon 에서 inosine 를 guanosine 으로해독한다. Editing of spliced ApoB RNA in the intestine (C-to-U editing) Human apoenzyme B (ApoB) 유전자는 43 kb이고 29개의 exon으로되어있다. liver cell에서는전부해독이되어 512kDa의 ApoB100를만든다 ( 좌측그림 ), 그러나 intestine cell에서는 exon 26에있는 codon 2153의 CAA(glutamine) 가 UAA로바뀌어 termination codon으로바뀐다. 그결과 C-terminal이없는 truncated protein 10 (ApoB48) 이된다 ( 우측그림 ).
The mechanism of RNA editing C-to-U RNA editing of ApoB apob mrna 에일어나는 C-to-U RNA editing 기작. deamination 이될 C (red asterisk) 주위의 35 nucleotide 에 regulatory elements, spacer element 11 nucleotide mooring sequence 가있어이차구조를만든다. 이곳에 cytidine deaminase acting on RNA (CDAR) homodimer 가 additional stimulatory factor (ASF) 의도움으로 editing 이일어난다. Editing of pre-mrnas by ADAR A-to-I editing 기작은 intron이있는동안 premrna에서일어난다. neurotransmitter receptor 를암호화하는 pre-mrna에서일어나며 CAG (glutamine) 가 CIG(argine) 로바뀌면 receptor에 ca 2+ 가통과하지못하게된다. A-to-I conversion은 A 부근의 double stranded RNA 구조를요구하며 exon complementary structure (ECS) 라고한다. 이곳에 adenosine deaminase acting on RNA (ADAR) 이작용하여 A가 I로바뀌게된다. 11 핵내에서일어난다
17.7 Messenger RNA export Messenger RNA splicing and export are coupled processes 완전히 processing 이끝난 mrna 를세포질로이동시키는것은매우중요한기작이다. exon junction complex (EJC) 는새로이생긴 exon-exon junction 에결합하며중요한역할을한다. stage 1; SR protein 이 exon 에결합하고 spliceosome 을부른다. UAP56 (U2F associated protein) 이 spliceosome 과관계를맺으며 RNA export factor (REF1 을부른다 ) stage 2: REF1 과 NMD factor 등다른단백질들이모여 EJC 를만든다. mrna export protein (heterodimer) 이 REF1 에결합한다. 이때 UAP56 은방출된다. mrna binding protein 과 nuclear pore protein 사이의 interaction 으로 mrna 가이동한다. stage 3; cytoplasm 으로 mrna 가이동후 mrna export factor 가분리된다. 12
17.8 sirna and mirna pathways for silencing Short mrna molecules can silence gene expression 1998 년 sense 혹은 antisense RNA 를 c. elegance 에넣었을때특정유전자의발현이안되는것을발견함. myofilament 유전자의 742 nucleotide 에해당하는 sense strand, antisense strand, 이들을합쳐서만든 double-stranded RNA 를주입했을때 double stranded RNA 가 myofilament 유전자의발현을막는데 100 배이상효과가있는것을발견하고이중가닥 RNA 에의한 sequence specific silencing 을 RNA interference (RNAi) 라고명명하였다그림은초파리의 gene silencing pathway 를나타낸다. double stranded RNA 에 heterodimer protein 이결합하며이중하나는 Dicer2 (DCR2) 라는 RNase III enzyme 의한종류이고다른하나는 RNA binding protein 인 R2D2 이다. 이들은 double stranded RNA 를 short interfering RNA (sirna) 로만든다. sirna 의두가닥중한가닥은 RNA induced silencing complex (sirisc) 로모여서 target mrna 의절단을촉매한다. sirisc assembly 는 sirna duplex, DCR2 R2D2 heterodimer 그리고부가적인단백질들이모여서만들어진 RISC loading complex (RLC) 가필요하다. guide strand RNA 는 sirisc 로조립되고 passenger RNA 는방출되고파괴된다. Argonaute (AGO) protein 은 guide 가 mrna 와쌍을이룰때 target mrna 를파괴한다. 13
Transitive RNAi in C. elegans Transitive RNAi 는소량의 double stranded RNA 에의하여 silencing 이한세포에서일어나면다른세포까지퍼져나가는현상을말하며 c. elegance 와식물에서관찰되어지나척추동물이나초파리에서는관찰되지않는다. transitive RNAi 라는용어는 silencing signal 이특정 mrna target 의 upstream 으로이동하는현상에서나온용어임. 그림 ; C. elegance 의 myofilament (UNC-22) 를 GFP 와 fusion 을하고 intact UNC-22 와 cell 내에동시에존재하게한다. UNC-22 는 warm 의 coordinated 된움직임을위하여필요하다. 또한이곳에 GFP 를 target 으로하는 dsrna 를넣어주어작동할경우에는 GFP 가파괴된다. 좌측 ; UNC-22 의 3 말단에 GFP 가 fusion. 이경우는 RNA dependent RNA polymerase 가 double strand RNA 를이용하여 RNA 를합성한다. 이것에의하여 UNC-22-GFP 와 intact 한 UNC-22 가파괴된다. fluorescence 가없어지고움직임도 uncoordinated 하다. 우측 ; UNC-22 의 5 말단에 GFP 가 fusion. 이경우는 GFP 만 dsrna 가작용하여 fluorescence 는없어지나 UNC-22 는온전하여 coordinated 한움직임을갖게된다. 14
mirna formation and action endogenous imperfect hairpin RNA structure (micro RNA 혹은 mirna) 를이용하여 mrna 의해독을조절하는기작에도 sirna 의기작에쓰이는동일한효소들이작용을한다. C. elegans 의 lin-4 유전자는첫번째 larval stage 에서두번째단계로넘어가는데중요한역할을한다. lin-4 전사체는해독이되는것이아니라 22- nucleotide 의 RNA precursor 로작용하여 lin-14 와 lin-28 의 3 -UTR 지역에결합하여이들의해독을방해하는것이밝혀짐. 그림은불완전한 homology 에의한 7 개의결합중두개의결합을보여줌 mirna 의 pathway DNA 에서 pri-mirna (primary RNA) 가전사가되면 microprocessor complex (Drosha, Pasha 를포함 ) 가 60-70 염기의 stem-loop 구조를갖은 pre-mirna (mirna precursor) 로만든다. 이것이세포질로이동하여 Dicer1 (DCR1) 에의하여잘려진다. 이중가닥 RNA 는 mirna RISC loading complex (mirlc) 에의하여단일가닥이되고 Argonaute (AGO) 가결합한다. 22-nucleotide의 guide RNA와 3 -UTR 지역간에 incomplete homology가있으면 3 -UTR 지역에결합하여해독을막는다. guide RNA와 target RNA간에 complete homology가 15 존재하면결합하여 AGO 단백질이 target mrna를파괴하게한다.