폐암억제유전자 RRM1 의단일염기다형성검사를위한 PCR-RFLP 법과 Real-Time PCR 법의유용성비교 1 전남대학교의과대학의과학연구소, 2 내과학교실정주연 1, 김미란 1, 손준광 2, 정종필 2, 오인재 2, 김규식 2, 김영철 2 Comparison of PCR-RFLP and Real-Time PCR for Allelotyping of Single Nucleotide Polymorphisms of RRM1, a Lung Cancer Suppressor Gene Ju-Yeon Jeong, M.S. 1, Mi-Ran Kim, M.S. 1, Jun-Gwang Son, M.D. 2, Jong-Pil Jung, M.D. 2, In-Jae Oh, M.D. 2, Kyu-Sik Kim, M.D. 2, Young-Chul Kim, M.D. 2 1 Medical Science Laboratory, 2 Department of Internal Medicine, Chonnam National University Medical School, Hwasun, Korea Background: Single nucleotide polymorphisms (SNPs), which consist of a substitution of a single nucleotide pair, are the most abundant form of genetic variations occurring with a frequency of approximately 1 per 1000 base pairs. SNPs by themselves do not cause disease but can predispose humans to disease, modify the extent or severity of the disease or influence the drug response and treatment efficacy. Single nucleotide polymorphisms (SNPs), particularly those within the regulatory regions of the genes often influence the expression levels and can modify the disease. Studies examining the associations between SNP and the disease outcome have provided valuable insight into the disease etiology and potential therapeutic intervention. Traditionally, the genotyping of SNPs has been carried out using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(pcr-rflp), which is a low throughput technique not amenable for use in large-scale SNP studies. Recently, TaqMan real-time PCR chemistry was adapted for use in allelic discrimination assays. This study validated the accuracy and utility of real-time PCR technology for SNPs genotyping Methods: The SNPs in promoter sequence (-37 and -524) of lung cancer suppressor gene, RRM1 (ribonucleotide reductase M1 subunit) with the genomic DNA samples of 89 subjects were genotyped using both real-time PCR and PCR-RFLP. Results: The discordance rates were 2.2% (2 mismatches) in -37 and 16.3% (15 mismatches) in -524. Auto-direct sequencing of all the mismatched samples(17 cases) were in accord with the genotypes read by real-time PCR. In addition, 138 genomic DNAs were genotyped using real-time PCR in a duplicate manner (two separated assays). Ninety-eight percent of the samples showed concordance between the two assays. Conclusion: Real-time PCR allelic discrimination assays are amenable to high-throughput genotyping and overcome many of the problematic features associated with PCR-RFLP. (Tuberc Respir Dis 2007; 62: 406-416) Key word : SNP, PCR-RFLP, Real-time PCR, RRM1. 서 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 은염색체가갖고있는염기서열중개인편차를나타내는염기변이를말한다 1. SNP는일반적으로한 론 Address for correspondence: Young-Chul Kim, M.D. Lung and Esophageal Cancer Clinic, Chonnam National University Medical School and Hwasun Hospital, 160 Ilsim-ri, Hwasun-gun, Jeonnam, 519-809, Korea. Phone: 82-61-379-7614, FAX: 82-61-379-7628 E-mail: kyc0923@jnu.ac.kr Received: Feb. 21. 2007 Accepted: May. 4. 2007 염기쌍 (single base-pair variation) 의차이로관찰되고, DNA에존재하는다형성중에서가장흔하게존재한다. 사람의유전자는대략 1,000개의염기마다 1 개의염기다형성이나타나는데질병에대한감수성과치료제에대한효과가달라지는등의개인편차가있는것은 SNP의차이때문이라고추정된다 2-4. SNP는암 5, 심장병 6, 고혈압 7 등과같은다양한질병과도관련되며, 이는아미노산을생성하는 3개의염기중의하나가달라져결국기능이다른단백질이생성됨으로써치명적인질병으로까지연결되는것이다. 이러한이유때문에최근질병과관련된 SNP 연구도활발하게진행되고있다 8. 406
Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 62. No.5, May. 2007 SNP 연구는큰집단을대상으로수행되므로적은비용으로정확하게, 그리고대용량 (hight throughput) 으로할수있는시스템이요구된다. SNP를검색하기위한일반적인방법으로서기존에는제한효소절단양상으로 SNP 형태를추정하는 polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) 9-11 방법이많이시행되어왔으나이는시간적소비와비특이적 PCR산물의오염가능성이있는단점이있다. 이에반해 real-time PCR(RT- PCR, TaqMan probe assay) 12-14 방법은유전자증폭을시행한후모니터에보여지는형광물질곡선을통해바로유전자다형성조합을예측할수있고 1회유전자증폭반응으로 72-96개샘플의결과를한번에확인할수있어보다빠르고정확하게 SNP를검색할수있는방법이라할수있겠다. 그러나이는고가의장비와특수하게고안한 oligonucleotide를사용해야한다는부담감으로아직까지는고전적인방법인 PCR- RFLP법이보통사용되고있다. 따라서저자들은본연구를통해폐암환자 227명의말초혈액백혈구로부터얻은 genomic DNA를대상으로하여, promotor부위에다형성이존재하는것으로알려져있는 RRM1(ribonucleotide reductase M1) 15 유전자의 -37, -524부위의 SNP 양상을 PCR- RFLP법과 RT-PCR법을동시에시행, 결과를비교분석해봄으로써유전자다형성을보다쉽고정확하게검사할수있는방법으로서 RT-PCR 방법의효용성을검증하여보고자하였다연구재료및방법 1. 연구재료전남대학교병원호흡기내과에내원한폐암환자들로부터동의하에채취된 227명의말초혈액을이용하여연구를수행하였다. 2. 연구방법 1) 말초혈액에서 Genomic DNA 추출 말초혈액 4 ml를 7.5% EDTA가포함된 vacutainer(becton Dickinson, Plymouth, UK) 에채취하여 15 ml polypropylen tube에옮겨담고 RBC lysis buffer(150 mm NH 4 Cl, 20 mm Tris ph 8.0) 를넣은후 37 진탕수조에서 20분간반응시켰다. 이후상온 3,500 rpm에서 20분간원심분리하여침전물만취하는과정을 2회반복하였다. 이렇게얻은침전물에 TEN buffer(10mm Tris, 10mM EDTA, 150mM NaCl) 1 ml를가하여잘혼합한다음, 3500 rpm에서 10분간원심분리하고, 침전물만다시얻어 TEN buffer 375 μl, 10% SDS 25μl, proteinase-k 10 mg/ml 10 μl를넣고 37 진탕수조에서 16시간이상반응시켰다. Eppendorf tube에반응물을옮기고 5M NaCl 160 μl를첨가하여잘혼합한다음 13,000 rpm 으로 15 분간원심분리시켰다. 다음으로상층액만을취하여다른 eppendorf tube에옮겨담고 2배부피의 100% alcohol을넣어잘흔든후, DNA 침전물을얻었다. 얻어진침전물을다른 eppendorf tube에옮겨담고, 70% ethanol 400 μl를가한후가볍게흔들어준다음 13,000 rpm에서 5분간원심분리하여상층액을버리고 37 heat block에서 5분간건조시킨후 TE buffer(10mm Tris, 1mM EDTA) 300 μl를첨가하여 37 에서 16시간이상용해시켰다. NanoDrop 으로 DNA 농도를측정하고 PCR 용으로 5 ng/ μl농도를만들어냉동보관한후중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 을시행하였다. 2) PCR - RFLP (1) 중합효소연쇄반응에의한유전자좌증폭 (PCR) Promoter 부위에다형성염기가존재한다고보고되어져있는 RRM1 유전자의염기서열을 GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 로부터얻은후, 다형성을보이는염기서열위치 -37(Genebank accession number AF107045의 1038 위치 ) 부위를포함하는 primer와 -524(Genebank accession number AF107045 의 551 위치 ) 부위를포함하는 primer를 primer ㅡ3 프로그램으로각각디자인하여주문제작하고중합효소연쇄반응 (PCR) 에이용하였다. Primer의염기서열은 Table 1과같다. 유전자증폭은 Perkin Elmer 2400 407
JY Jeong et al: PCR-RFLP and real time PCR for SNP analysis Table 1. Primer sequences for PCR-RFLP of -37 and -524 SNP* of RRM1 gene SNP Primer Sequence - 37 F : 5 ㅡ GGTCT TGCCC AGACT CAACA ㅡ 3 R : 5 ㅡ CTGCT CAGGG GAAAG AACTG ㅡ 3-524 F : 5 ㅡ ATACC CTGTC TCTGC CACCA ㅡ 3 R : 5 ㅡ CTTTT AGATC GGCCA GAGGA ㅡ 3 F: Forward; R: Reverse. *SNP: single nucleotide polymorphism, RRM1: ribonucleotide reductase M1. thermal cycler(norwalk, CT) 를이용해시행하였으며, 반응성분은 1U의 Taq DNA polymerase(super BIO Co. Ltd) 와함께 40 ng의 genomic DNA, 800 um 의 dntp, 200 nm 각각의 primer, 1.5 mm MgCl 2, 50 mm KCl으로하여총반응액을 20 μl로하였다. 두쌍의 primer 모두각각 94 에서 5분간 denature 시킨후 94 에서 30초, 55 에서 30초, 72 에서 1분간반응하는온도순환을 35회반복하고마지막으로 72 에서 10분간유지후 4 로냉각시켰다. PCR 과정이 끝난후, 증폭산물은 2% agarose gel 내에서전기영동을시행하여증폭여부를확인하였다. (2) 제한효소처리 (Enzyme digestion) 중합효소연쇄반응에의해증폭되는염기구조를 www.neb.com 의제한효소 search program에입력한후 -37과 -524부위를한번씩만절단하는제한효소를찾았다. RRM1-37번째염기는 C/A 다형성을보이는위치로써이는제한효소 Bbs I 으로구분될수있는데이효소는 GAAGACNN(NNNN) 염기배열을읽어서절단한다. 또한 -524의경우는 T/C 다형성을보이는위치로써이는제한효소 Apo I 으로구분될수있는데, 이효소는 (A or G) + AATTY + (C or T) 염기배열을읽어서절단한다. RRM1-37유전자는 10 μl의 PCR 증폭산물에 10U Bbs I 제한효소를첨가하여 3 7 에서 16시간이상반응시켰으며, -524유전자는 10U Apo I 제한효소를 10 μl의 PCR 증폭산물에첨가하여 50 에서 2시간이상반응시켰다. 제한효소반응후 2% agarose gel 내에서전기영동을시행하여제한효소에의해분절된 DNA의크기를확인함으로써다 Figure 1. Allelotyping of RRM1 by restriction enzyme digestion. (A) RRM1-37 C/A polymorphism. Restriction enzyme Bbs I cuts when -37 base is A. Homozygous A allelle type (lane 3 from left shows complete digestion into 156 bp bands. Homozygous C allele type (lane 4 and 7) have original 217 bp bands only without digestion. The primer dimers are seen in all the lanes that are barely distinguishable from 61 bp bands in lanes with CA or AA. (B) RRM1-524 T/C polymorphism. Restriction enzyme Apo I cuts when -524 base is T. Homozygous T allelotype (lane 2, 5 and 6 from left) shows complete digestion into 70 bp bands. Homozygous C allele type (lane 3 and 4) have original 176 bp bands only without digestion. 408
Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 62. No.5, May. 2007 Table 2. Primer and probe sequences for real-time PCR of -37 and -524 SNP of RRM1 gene SNP Substitution Oligo Sequence5'->3' (fluorophore/quencher) -37 C A Probe- C (6-FAM)-TGTGAAGCCTACCCCG-(3BHQ)* Probe- A Primer- F Primer- R (HEX)-TCTGTGAAGACTACCCC -(3BHQ) CTTGCCCAGACTCAACAT CCAGACAGCACTTTCTTCAG -524 T C Probe- T (6-FAM)-AGAGAATTTTAAGCAGG-(3BHQ) *BHQ: black hole quencher. Probe- C Primer- F Primer- R (HEX)-AGAGGATTTTAAGCAGG-(3BHQ) TCCATCCTACCTCCACAAGG CGATGGCGTTTGGATTTTAT 형성의종류에의한유전자형을결정하였다 (Figure 1). 3) 실시간유전자증폭 (Real-time PCR) Gene bank(http:/ncbi.nih.gob/) 로부터얻은 -37, -524의염기서열을 proligo(paris, France) 에의뢰해, 유전자증폭 (RT-PCR) 에필요한 primer 와각각의 allele를인식할수있는 primer사이의 SNP를포함한 TaqMan probes를디자인, 제작하고 RT-PCR에의해각각의 polymorphism을확인하였다. RT-PCR에이용한 primer와 probe는 Table 2와같다. 유전자증폭반응액의조성은 genomic DNA 10 ng에 0.5U Taq polymerase 와 10x buffer 1 μl, dntp 200 um, 5pM Primer 각각 0.5 μl씩, 2pM probe 0.1 μl씩첨가, 총반응액을 10 μl로하였다. 95 에서 5분간 denature시킨후 95 에서 10초, 64 에서 30초간반응하는온도순환조건을 40회반복하였고, Roter-Gene 3000TM multiplex system(corbett Research) 를이용해수행하였으며, 결과분석은이에상응하는분석프로그램 (Roter-Gene software 6.0) 으로자동분석하였다 (Figure 2). 4) 염기서열분석 (Auto-direct sequencing) 증폭된 PCR 증폭산물을 Gene All PCR Purification kit(general Biosystem, Seoul, Korea) 를사용하여정제한다음염기서열분석에이용하였다. Forword primer 1.6 pmol/ μl 1μl, Big Dye Terminator (ABI-version 3.1) 1 μl, 정제된 PCR 증폭산물 1 μl, 5x sequencing buffer 2 μl, 멸균수 5 μl로총반응액 10 μl가되도록한후 95 10초, 50 5초, 60 4분으로구성된순환조건을 25회반응시킨후에탄올침전과정을통하여반응물만을정제하였다. 정제된반응물을건조시키고 formamide에녹인후 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer(PE Biosystems, Foster City, CA, USA) 로염기서열을분석하였다 (Figure 3). 5) 통계 RRM1유전자의다형성은각각의위치에서 allele들의빈도가 Hardy-Weinberg equilibrium 16 을따르는지 chi-square 검증으로확인하였다. 결과 1. PCR-RFLP 89예의 genomic DNA를이용 RRM1-37과 -524유전자를각각 PCR 증폭하였다. -37의증폭산물크기는 217 bp, -524의크기는 176 bp이었다. RRM1-37번째염기는 C/A 다형성을보이는위치이다. 전기영동에의해원하는크기로증폭되었는지확인한후, 남은 PCR 증폭산물에 10 U Bbs I을처리하고반응시킨결과, -37위치에 C를가지고있는검체는절단되지않고 217 bp가그대로관찰되었으며, A를가지고있는검체는 156 + 61 bp로절단된형태 409
JY Jeong et al: PCR-RFLP and real time PCR for SNP analysis A. Allelic 2 Homozygous Heterozygous Allelic 1 Homozygous B. Figure 2. Allelotyping of RRM1 by real-time PCR (TaqMan probe assay) Allelic discrimination of genotyping by auto analysis software 6.0 program of Roter-Gene after RRM1 amplication. (A) genotype analysis result (B) scatter graph analysis result. 의증폭산물이 2% agarose gel상에서확인되었다 (Figure 1A). 또한 -524의경우는 T/C 다형성을보이는위치로써 PCR 증폭산물에 10U Apo I을처리한후반응시킨결과 T 를가지고있는검체는 176 bp가효소에의해절단되어 70 bp + 106 bp 크기단편이관찰되었고 C를가지고있는검체는절단되지않은 176 bp band가 2% agarose gel상에서확인되었다 (Figure 1B). 대상환자 89명에대하여 RRM1 의유전자다형성을 PCR- RFLP 방법으로검색하여본결과 -37번째염기는 CC ( 42 ), CA ( 39 ), AA ( 8 ) 이었고, -524 번째염기는 TT ( 45 ), TC ( 28 ), CC ( 16 ) 이었다. 410
Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 62. No.5, May. 2007 2. Real-time PCR SNP를확인하는데있어 PCR-RFLP 방법으로확인한결과와 RT-PCR 방법을통해확인한결과가어느정도일치도를보이는지비교분석해보기위해앞서 PCR-RFLP을시행했던동일 DNA샘플 89예를대상으로 RT-PCR을시행하였다. 이는유전자증폭이끝남과동시에별도의처리과정없이모니터상에서바로결과를확인할수있었다. 샘플이가지고있는 Table 3. Comparison of allele frequency at -37 and -524 region of RRM1 gene between PCR-RFLP and RT-PCR. The results from RT-PCR were validated using Hardy-Weinberg equilibrium. - 37 SNP CC CA AA PCR-RFLP (n=89) Real-time PCR (n=89) Expected frequency 42 42 42.5 39 39 38 8 8 8.5 Error rate* = 2 / 89 ( 2.24%) X 2 =0.03, p > 0.05-524 TT TC CC 45 42 41.1 28 37 38.7 16 10 9.1 Error rate = 15 / 89 ( 16.85%) X 2 =0.09, p > 0.05 *Errors / Total genotypes, Mismatched results of two samples were changed to CC CA, CA CC. SNP조합형이 homo wild type이라면 FAM 형광곡선만관찰되어지고 homo mutant type이라면 HEX 형광곡선만, hetero type경우에는 FAM, HEX 형광곡선이모두관찰되었다. 각각의샘플에대한형광물질이나타내는곡선의양상을통해자동분석프로그램의 genotype analysis 또는 scatter graph analysis로 SNP 조합형을확인하고 PCR-RFLP 결과와비교분석하였다 (Table 3)(Figure 2). 89예를대상으로 RT-PCR을통해유전자다형성을조사하여본결과 -37염기위치에서는 CC ( 42 ), CA ( 39 ), AA ( 8 ) 이었고, -524는 TT ( 42 ), TC ( 37 ), CC ( 10 ) 이었다. 3. PCR-RFLP: RT-PCR 의결과비교단일염기다형성을확인하는데있어 PCR-RFLP법을통해확인한결과와 RT-PCR법을통해확인한결과가동일한결과를보이는지살펴보기위해동일대상 89예를대상으로 PCR-RFLP와 RT-PCR을각각시행한후확인된결과를비교해보았다. 대상 DNA 89예중 RRM1-37에서는 2예 (2.17%), -524에서는 15 예 (16.26%) 가다른양상을보였다 (Table 3). -37에서보였던불일치양상은 CA가 CC로, CC가 CA로관찰되었고, -524에서는 CC CA가 8예, CA AA 5예, Figure 3. Allelotyping of RRM1 gene by auto-direct sequencing. 411
JY Jeong et al: PCR-RFLP and real time PCR for SNP analysis CC AA, AA CC가각각 1예씩확인되었다. 4. 염기서열분석결과 PCR-RFLP법에의한결과와 RT-PCR법에의한결과가일치하지않은 17예를대상으로정확한유전자형확인을위해자동염기서열분석을시행하였다 (Figure 3). 결과 -37에서불일치했었던 2예와 -524에서의 15예모두 RT-PCR법에서확인되었던 allele type과일치하였다. PCR-RFLP법에서보인불일치결과들은많은경우가제한효소의불완전한절단에의해서생긴결과였고일부샘플들은 templete의부분적인오염이있었던것으로사료되어진다. 이로써 SNP양상을확인하는방법으로써, PCR-RFLP 결과보다는 RT-PCR 결과가보다신뢰성있음을확인할수있었다. 예에서만다른양상을보여 98% 이상의높은일치율이관찰되었다 (Table 4). -37에서보였던불일치결과는 CC CA, CA CC 로관찰되었으며, -524에서는 TC TT 1예와 TT TC 2예가관찰되었다. 정확도를한번더검증하기위해불일치결과를보였던샘플 5예와일치결과를보였던 10예를무작위로선정하여직접염기서열을실시하여보았다. 결과불일치샘플들의경우는두번째시행한결과와모두일치하였고일치샘플들은모두이전검사와동일한결과를확인할수있었다 (10/10=100%). RT-PCR에서보인오차율의원인은유전자증폭과정에서의차이는없었으나영상분석과정에서생긴오류였음을확인할수있었다. 따라서증폭곡선을이용한판독이명확하지않는경우는추가적인검증이필요하다하겠다. 6. 통계 5. 반복된 RT-PCR 의일치율 앞선실험에서 RT-PCR법이거의 100% 에가까운정확도를보였던결과를기반으로해서추가샘플 138 예는 RT-PCR에의해 allele type을확인하였다. 1차, 대상 DNA 138예에대한결과를확인하고동일샘플을대상으로 RT-PCR법을재반복시행하여결과를비교하여본결과, 138예중 -37은 2예에서, -524는 3 Table 4. Comparison of allele frequency at -37 and -524 region of RRM1 gene in duplicated RT-PCR experiments. The results from RT-PCR were validated using hardy-weinberg equilibrium. SNP RT-PCR-1st (n=138) RT-PCR-2nd (n=138) Expected frequency - 37 CC 85 85 86.1 CA 48 48 41.8 AA 5 5 6.1 Error rate* = 2 / 138 ( 1.4%) X 2 =0.17, p > 0.05-524 TT 87 86 86.8 TC 46 47 45.2 CC 5 5 5.8 Error rate = 3 / 138 ( 2.1%) X 2 =0.09, p > 0.05 *Errors / Total genotypes, Mismatched results of two samples were CC CA and CA CC, Mismatched results of three samples were TC TT, TT TC and TT TC. PCR-RFLP와 RT-PCR 에의해확인되었던결과를 Hardy-Weinberg 법칙에적용시켜보니 -37, -524 모두 p>0.05이상의값을보여예상되는 allele의빈도와검사결과가일치함을알수있었다 (Table 3, 4). 고찰 Single nucleotide polymorphism(snp) 이란우리말로단일염기변이또는단일염기다형성이라고표현할수있는데 1, 최근이를이용한질병유전체접근방법이큰관심의대상이되고있다. 이는 mutation과는다른의미를가지는것으로 1000 염기마다한번꼴로일어나는가장일반적인형태의염기서열변이의유형을말한다. SNP의유전학적정의로는집단내에서가장적은빈도를보이는 single base allele의빈도가최소 1% 이상관찰되는염기다형성 (polymorphism) 이라고할수있다. 인간의유전체에는수백만개의 SNP가존재한다. 즉, 각개인이갖고있는유전자전체는약 30억개의염기로구성되어있는데이중에서매 1000개염기마다하나의단일염기다형성을보이고있다. 같은질병이라고해도질병방생의감수성이나치료에대한효과등개인편차가있는것은모두이러 412
Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 62. No.5, May. 2007 한 SNP 차이때문이다 2-4,17-19. SNP는 2, 3, 4개의대립인자를가질수있다. 하지만사람의경우거의모든 SNP는 {C,T} 혹은 {C,G} 와같은 bi-allelic polymorphism만을보이고있어서 bi-allelic polymorphism 의하나로간주되고있다. 3개의염기는한개의아미노산을만들고몇개의아미노산이결합해단백질을만들게되는데, 염기에변이가생기게되면, 변이된염기가변형된아미노산을만들게되므로단백질기능의변화가생기며, 질병에쉽게노출될수가있다. 이와같이 SNP가특정질병에대한개인적특이성이나, 약물에대한의학적반응도에있어서개인적차이를나타내는것과관련하여, 유전적변이를찾아내는중요한자료가될수있다. SNP로인하여, 가까운장래에암 5 이나, 심혈관질환 6, 자가면역증 20, 천식 21, 고혈압 7 등과같은복합적인질병에대한유전적인기전을확인할수있게될가능성도크다. 또한, 최근에는약물투여에대한부작용이나효과가유전자의조절과밀접한관계가있다는것이알려지면서, DNA 염기서열정보를이용하여특정의약품이환자에게효과가있는지, 아니면부작용으로고통을받을지, 심지어는적정한투여량을결정할수있는지에대하여알수있을것이라는가능성또한많은연구자들에게새로운관심을불러일으키고있다 17-19. 이러한것이가능하기위해서는 SNP 분석을적은비용으로정확하게그리고대용량으로분석할수있는방법이필요하다. 주요 SNP 연구를위한방법으로기존에는 PCR-RFLP 9-11 법을많이시행해왔었다. 그러나최근에는대량의검체를신속하게검사하기위해 OLA genotyping 22 방법, Mass spectrometry 23 를이용하는방법, DNA microarray genotyping 24, DASH 방법 25, pyrosequencing 26 방법, RT-PCR 12-14 방법등여러가지새로운기술들이많이개발되어시행되어지고있다. 이들중, 본연구에서는기존부터여러실험실에서많이수행해왔던 PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism) 법과최근에사용증가추세를보이고있는 RT-PCR(TaqMan probe assay) 법을비교하였다. 동일샘플을대상으로두방법을각각시행한후확인되 어진결과를비교해봄으로써정확성과유용성을살펴보았다. 염기서열분석은직접해독하는 direct sequencing 방법이가장정확하지만이는다소복잡하고시간이많이걸리는방법이기에최종확인을위한방법으로만사용을하였다. PCR-RFLP방법은개체마다차이를보일수있는 polymorphic한 restriction site를특정제한효소로절단한후전기영동상에서관찰되어지는절편의양상으로 allele type을확인하는방법이다. 반면 RT-PCR 법은 5' nuclease assays 원리를이용하여형광물질이나타내는곡선을통해별도의전기영동과정을거치지않고한번에정확한 genotyping을하는방법이다. RT-PCR은 mrna을볼수있을뿐만아니라 DNA를증폭하면서실시간으로 SNP 양상을확인할수있는방법도제공한다. SNP에따라각기다른색을발광하도록제작된 TaqMan probe는 SNP를포함한 target 의고유염기서열이므로 allele type에따라 specific하게결합한다. 각각의샘플이가지고있는 SNP 조합양상에따라특정 probe만이 PCR에반응을하고, 이후형성된고유의형광값을정량하여 allele type을구별하게된다. 하나의 SNP를 genotyping하기위해서는각기다른 fluorescent dye을가지고있는두종류의 probe가필요하다. 각 probe의 5 끝에는 reporter fluorescent dye가있고다른한끝에는 quencher dye가있어 PCR 반응이없으면 quencher dye에의해형광이억제되고 PCR이진행될때에만 reporter fluorescent dye가 probe로부터분리되면서, quencher dye로부터멀어지게됨으로써고유의형광값을내게되어, 이를정량하여 allele type을구별하게된다. 환자말초혈액으로부터얻은 genomic DNA 89예를대상으로폐암억제유전자인 RRM1(ribonucleotide reductase M1) 의 -37, -524부위에존재하는 SNP 양상을 PCR-RFLP와 RT-PCR을동시에시행하여결과를비교분석하여본결과 19.1% 다른결과값을얻었고이를대상으로직접염기서열분석을통해확인한결과서로상이한결과를보였던검체들은모두 RT-PCR법에의해확인되었던유전자형인것을확인할수있었다. PCR-RFLP법의오차율이다소높게 413
JY Jeong et al: PCR-RFLP and real time PCR for SNP analysis 관찰되어진이유는아마도제한효소처리단계에서 enzyme 의첨가량부족, 또는반응시간이충분치않았거나온도조건의부적합, 보관과정에서의 enzyme 의 activity감소등의원인으로 PCR 증폭산물이불완전하게절단되어 allele type이잘못판단되어진것으로사료되어진다. 또한제한효소절단에의해생성된 100 bp이하크기의작은단편들은 primer dimer 와비슷한위치에존재하고있어서명확하게구별하기가어려웠다. 본연구에서는 RT-PCR법이비교적정확성을보인결과를근거로해서추가대상 138예를 RT-PCR법을통해 2회반복시행한후결과를비교해본결과역시 98% 이상의높은정확도를확인할수있었다. 이와같은결과를고려해볼때, SNP( 단일염기다형성 ) 를확인하는데있어 RT-PCR법은 98% 이상의높은정확도를확인할수있었으며, in-tube assay 방식으로샘플의오염을최소화할수있었고 72well based system(corbett Research) 을이용함으로다량의 SNP 분석을정확하고빠르게진행할수있었다. 게다가결과가연구자가보기쉬운그래프형식으로출력되므로쉽게분석이가능한장점도있었다. RT-PCR법은빠르고간편하고정확하게판독이가능한장점이있지만, 제작된 probe를이용하여실험조건을맞추는초기에세밀한조절이필요하다. Primer의 annealing temperature 만잘잡아주면되는 PCR과달리 RT-PCR은 primer와 probe 모두가만족할수있는온도조건을잡아주어야하는점과두형광의신호가중복되지않게농도를잘조절해서 PCR 조건을결정해야하는까다로움도있다. 만약제작된 probe로적절한조건이잘잡히지않아다시 probe 제작을요하는상황이된다면 probe 제작비용의중복투자를감수해야한다는부담도있다. 여러 SNP를동시에검사하는복합검사는많게는 6 개의 SNP까지한번반응으로확인할수있다고한다. 그러나현실적으로는모두만족할만한 annealing temperature 를설정하는것이쉽지않으므로보통 2 개정도의 SNP까지는동시에검색할수있다고판단된다. 비용효과면에서두가지방법을비교할필요도있 겠는데, RT-PCR과 PCR-RFLP를업체에의뢰하지않고, 본교실의실험실에서시행한것이므로정확한비용의비교는어려웠다. 또한단순한시약및 probe 제작비뿐만아니라실험자의노동력, 투자해야하는시간을모두감안하여야하므로비용효과를비교하기는어려웠다. 그러나검체의수가많아질수록 RT-PCR이더유리할것임은알수있었다. RT-PCR은 probe를필요한양만큼제작하여실험조건을잡은후에는추가적으로필요한시약이나투자해야하는시간과노동력이적은반면에 PCR-RFLP는초기투자비용은낮지만검체의수가많아질수록막대한시간과노동력그리고제한효소등의비용이지속적으로발생되기때문이다. 따라서연구용으로소수의검체만을검사하는경우에는 PCR-RFLP가비용효과면에서유리하지만많은임상검체들의검사에사용되게된다면 RT-PCR이비용효과면에서유리하다고판단된다. 요약연구배경 : 단일염기다형성 (Single nucleotide polymorphism, SNP) 은인간의유전자서열 1000염기에 1 개빈도로발견되어인간은대략 300만개의유전자다형성을가지고있다. 이유전자다형성의조합결과로인간의개체간특성들이결정되는것으로이해되고있다. 이러한다형성들의조합양상에따라특이질환에대한유전자감수성또한달라지게되므로최근에는많은질환들과유전자다형성들과의상관관계를보는연구들도활발하게진행되고있다. 이러한 SNP 분석은큰집단을대상으로진행되어지므로적은비용으로정확하게그리고대용량으로분석할수있는방법이필요하다. 방법 : 대상환자 89명의 genomic DNA를가지고서 promotor상에위치한 -37과 -524 염기부위에서유전자다형성을보이는것으로보고되어져있는 RRM1 (ribonucleotide reductase M1) 유전자를대상으로 PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism) 와 real-time PCR(RT- PCR, TaqMan probe assay) 을동시에시행한후각 414
Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 62. No.5, May. 2007 각의결과를비교분석하였다. 결과 : 대상 DNA 89예중 -37에서는 2예 (2.17%), -524에서는 15예 (16.26%) 가서로다른양상을보였다. 결과차이를보인샘플 17예를대상으로직접염기서열분석을시행하여본결과, 17예모두 RT-PCR 에서확인되었던결과와일치함을확인할수있었다. 추가샘플 138예를대상으로 RT-PCR을 2회연속실행하여 genotyping을해본결과 98% 이상의높은일치율을보였으며, 그중 10예를무작위로골라직접염기서열분석을시행하여본결과, 역시 100% 일치, 높은정확도를보였고이는 in-tube assay 방식으로샘플의오염을최소화할수있었으며 72 well based system(corbett Research) 을이용함으로 1회유전자증폭반응을통해많은검체를한번에확인할수있어매우빠른검사방법이었다. 결론 : 큰집단을대상으로다량의 SNP를분석하기위한실험방법으로는 RT-PCR이신속하면서도정확한결과를얻을수있는방법으로사료된다. 참고문헌 1. Shastry BS. SNP alleles in human disease and evolution. J Hum Genet 2002;47:561-6. 2. Syvanen AC. Accessing genetic variation: genotyping single nucleotide polymorphisms. Nat Rev Genet 2001;12:930-42. 3. Brookes AJ. The essence of SNPs. Gene 1999; 234:177-86. 4. Collins FS, Brooks LD, Chakravarti A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res 1998;8:1229-31. 5. Knudson AG. Hereditary predisposition to cancer. Ann N Y Acad Sci 1997;833:58-67. 6. Ohnishi Y, Tanaka T, Yamada R, Suematsu K, Minami M, Fujii K, et al. Identification of 187 single nucleotide polymorphisms(snps)among 41 candidate genes for ischemic heart disease in the Japanese population. Hum Genet 2000;106:288-92. 7. Kamide K, Kokubo Y, Yang J, Matayoshi T, Inamoto N, Takiuchi S, et al. Association of genetic polymorphisms of ACADSB and COMT with human hypertension. J Hypertens 2006;25:103-10. 8. Risch N, Merikangas K. The future of genetic studies of complex human diseases. Science 1996;273:1516-7. 9. Sousa MC, Morais JB, Machado JE, Poiares-DA-Silva J. Genotyping of Giardia lamblia Human Isolates from Portugal by PCR-RFLP and Sequencing. J Eukaryot Microbiol 2006;53:174-6. 10. Hatzaki A, Razi E, Anagnostopoulou K, Iliadis K, Kodaxis A, Papaioannou D, et al. A modified mutagenic PCR-RFLP method for K-ras codon 12 and 13 mutations detection in NSCLC patients. Mol Cell Probes 2001;15:243-7. 11. Bravo-Villalta HV, Yamamoto K, Nakamura K, Baya A, Horiuchi R. A novel intronic mutation that may affect genotyping result of CYP2C8 by PCR-RFLP is strongly associated with CYP2C8*3 in a South American population. J Hum Genet 2006;52:195-9. 12. Ruiz-Ponte C, Carracedo A, Barros F. Duplication and deletion analysis by fluorescent real-time PCR-based genotyping. Clin Chim Acta 2006;363:138-46. 13. Gibson NJ. The use of real-time PCR methods in DNA sequence variation analysis. Clin Chim Acta 2006;363:32-47. 14. Joneson VJ, Yucesoy B, Luster MI. Genotyping of single nucleotide polymorphisms in cytokine genes using real-time PCR allelic discrimination technology. Cytokine 2004;27:135-41. 15. Bepler G, Zheng Z, Gautam A, Sharma S, Cantor A, Sharma A, et al. Ribonucleotide reductase M1 gene promoter activity, polymorphisms, population frequencies, and clinical relevance. Lung cancer 2005;47: 183-92. 16. Ueda T, Ugawa S, Ishida Y, Shibata Y, Murakami S, Shimada S. Identification of coding single nucleotide polymorphisms in human taste recepter genes involving bitter tasting. Biochem Biophys Res Commun 2001;285:147-51. 17. Shi MM. Technologies for individual genotyping: detection of genetic polymorphisms in drug targets and disease genes. Am J Pharmacogenomics 2002; 2:197-205. 18. Abraham J, Earl HM, Pharoah PD, Caldas C. Pharmacogenetics of cancer chemotherapy. Biochim Biophys Acta 2006;1766:168-83. 19. Shi MM, Bleavins MR, de la iglesia FA. Technologies for detecting genetic polymorphisms in pharmacogenomics. Mol Diagn 1999;4:343-51. 20. Lazarus R, Vercelli D, Palmer LJ, Klimecki WJ, Silverman EK, Richter B, et al. Single nucleotide polymorphisms in innate immunity genes: abundant variation and potential role in complex human disease. Immunol Rev 2002;190:9-25. 21. Palmer LJ, Cookson WO. Using single nucleotide polymorphisms as a means to understanding the pathophysiology of asthma. Respir Res 2001;2:102-12. 22. Iannone MA, Taylor JD, Chen J, Li MS, Rivers P, 415
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