대한임상병리학회지 : 제 20 권제 1 호 2000 Korean J Clin Pathol 2000; 20: 56-61 임상미생물학 결핵균배양기기 BACTEC MGIT 960 System 의평가 최윤미 이명희 한국보훈병원임상병리과 Evaluation of the BACTEC MGIT 960 System for the Recovery of Mycobacteria Youn Mi Choi, M.D. and Myung Hee Lee, M.D. Department of Clinical Pathology, Korea Veterans Hospital, Seoul, Korea Background : We evaluated the BACTEC MGIT 960 system (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, Md, USA), which is a fully automated, noninvasive and nonradiometric fluorescent indicator broth detection system for the growth and detection of mycobacteria with a capacity to incubate and continuously monitor 7 ml MGIT (Mycobacterium growth indicator tube) culture tube. Methods : We studied 1,690 specimens (1,258 respiratory and 432 non-respiratory specimens). Processed specimens with 2% NaOH-NALC (final NaOH concentration: 1%) were inoculated into MGIT and solid media (3% Ogawa, Japan). Polymerase chain reaction was performed for the discrimination of Mycobacterium tuberculosis complex from Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT). Results : From all culture system, a total of 181 isolates of mycobacteria were recovered. The greatest number of isolates of mycobacteria was recovered with MGIT 960 system (174, 96.1%), followed by solid media (73, 40.3%). 108 isolates (59.7%) were recovered with MGIT only and 7 (3.9%) recovered with solid media only (P value <0.0001). From a total of 1,617 AFB smear negative specimens, 101 (6.3%) were recovered with MGIT 960 system and 34 (2.1%) recovered with solid media. The mean times to detection were average 11.1 days for MGIT 960 system and 31.6 days for solid media (P value <0.0001). Contamination rates for each system were 14.9% for MGIT 960 and 2.6% for solid media. Conclusions : The newly introduced MGIT 960 system is easy to use and has advantages of high detection rate and rapid recovery than solid media, but there are some problems such as high contamination rate and high cost in the management of this liquid system. (Korean J Clin Pathol 2000; 20: 56-61) Key words : MGIT 960 system, Solid media, Mycobacteria 서 결핵은현재세계적으로높은유병률을보이는전염성질환으로우리나라의경우, 외국에비해매우높은유병률을나타내어국가적차원에서문제시되고있다 [1-3]. 결핵의정확한진단을 접수 : 1999 년 8 월 23 일접수번호 : KJCP1330 수정본접수 : 1999 년 10 월 18 일교신저자 : 최윤미우 134-791 서울시강동구둔촌동 6-2 한국보훈병원임상병리과전화 : 02-2225-1448, Fax: 02-2225-1448 론 위해서는임상검체로부터결핵균을검출하여동정하는일이필수적이다. 다른감염질환에비해특히결핵의경우, 치료방향을결정하는데있어서검사결과에대한의존도가높은질환임에도불구하고, 일반미생물의검출성적에비해민감도와특이도가만족스럽지못하며검사결과를얻기까지는일반적으로두달이상의기간이필요하다. 고 [4] 는결핵환자를전문으로진료하는임상의들입장에서이에따른어려움을설문조사하여보고한바있다. 미국의경우, 에이즈감염환자의증가와더불어결핵이다시증가추세에있어감염확산의방지를위해신속한검사결과를요구하고있으며이에결핵균배양에액체배지사용을권하 56
결핵균배양기기 BACTEC MGIT 960 System 의평가 57 고있다 [5]. 이에따라결핵균검사를실시하는많은검사실이기존의고체배지법에서액체법으로전환한후결핵환자관리에있어서괄목할만한질적향상을보여줬다 [6-10]. 우리나라에서는 BACTEC 460 기기 (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, Md., USA) 가액체배지법에의한결핵균검출기기로소개되어널리이용되었다 [11, 12]. 액체배지를이용하여일반배양기에서의배양기간을단축시키며결핵균과비정형결핵균을구별할수있으나방사선동위원소를사용하여결핵균의성장을감지하기때문에따르는폐기물처리문제, 액체배지병마개를바늘로찔러균성장을확인해야하기때문에생길수있는전이오염의가능성, 고가의장비가필요하다는점등으로인하여현재는거의이용되고있지않다 [13]. 최근에위와같은문제점을개선시켜방사선동위원소대신형광활성으로결핵균의성장을외부에서감지하는액체배지가개발되었다. 현재시판중인것으로 Mycobacterium Growth Indicator Tube (MGIT, Becton Dickinson, Sparks, Md, USA) 가있으며고가의장비없이도수작업으로결핵균의성장유무를쉽고빨리알수있어그이용경험을많이보고하고있다 [14-16]. 본연구는우리나라에서는처음으로도입된 24시간배양이가능하면서균성장에따른산소소모량에따라형광을활성화시켜균성장을감지하는 BACTEC MGIT 960 system (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, Md., USA) 에서 MGIT를이용해결핵균배양을실시하였다. 10개월간결핵균배양이의뢰된모든검체에대하여위의방법과함께전통적인고체배지법을병행실시하여그성적을비교평가하였다. 재료및방법 1. 연구대상 1998년 8월부터 1999년 5월까지한국보훈병원임상병리과에결핵균배양검사가의뢰된총 1,690 검체를대상으로하였다. 핵균배양을실시하였다 [17]. 3. 항산균염색침사를유리슬라이드에도말한후 Ziehl-Neelsen법으로항산균염색을실시하였다. 200배시야에서전영역을검색하고 1,000 배에서확인하는방식으로 10분이상관찰하여 American Thoracic Society의기준에따라 1+ 이상을양성으로판정하였다 [18]. 4. 결핵균배양전처리된검체의침사를 3% Ogawa 배지에접종하여 37 에서배양하였고, 1주에한번씩 8주동안균집락을관찰하였다. 또한 oleic acid, bovine albumin, dextrose, catalase가첨가된 OADC (Becton Dickinson, USA) 와 polymyxin B 6,000 units, amphotericin B 600 g, nalidixic acid 2,400 units, trimethoprim 600 g, azlocillin 600 g이포함된 PANTA 용액 (Becton Dickinson, USA) 을섞어그중 0.8 ml와전처리된객담의침사 0.5 ml를 modified Middlebrook 7H9 broth base, glycerol, casein peptone과 fluorescent indicator가첨가된 7 ml의 MGIT에넣은후 MGIT 960 system에서배양하였다. 60분마다 algorithm에의해균성장유무가자동검색되며 6주까지배양관찰된다. 남은침사는혈액한천배지에접종해다음날오염여부를관찰하였다. MGIT 960 system에서균성장의양성경보음이울리면배양중인 MGIT를꺼내침사로항산균염색을실시하여항산균유무와잡균오염여부를알아보았다. 또한중합효소연쇄반응을실시하여 Mycobacterium tuberculosis complex ( 이하 M. tuberculosis로약함 ) 유무를최종확인하였다. 양성경보음이없는 MGIT는기기내에서 6주간배양후꺼내모두항산균염색을실시한후폐기처리하였다. 5. 중합효소연쇄반응을이용한결핵균동정 2. 검체전처리오염되지않은검체에대해서는액체배지 (MGIT) 와고체배지 (3% Ogawa, Eiken, Japan) 사면에직접접종하였고, 오염된검체는다음과같은전처리과정을거친후접종하였다. 50 ml의원추형시험관에검체와동량의 2% NaOH 용액 (4% NaOH 용액과 2.9% sodium citrate 용액을동량섞어서제조함. 최종농도는 1% 가됨 ) 과 N-acetyl-L-cysteine (NALC) 을객담의상태에따라양을조절하여넣은후혼합하였다. 15분간실온에방치후 0.067 M의인산완충액 (ph 6.8) 으로 50 ml 까지채워냉장원심분리기의 3,000 g에서 15분간원침하였다. 침사에 1 ml의인산완충액을넣어혼합한후항산균염색과결 기기에서양성이나온 MGIT는원침하여침전물로항산균염색과중합효소연쇄반응을실시하였다. 중합효소연쇄반응을위한단계는다음과같다. 침사를세척한후 InstaGene matrix (Bio-Rad, USA) 와혼합하였다. 56 에서 30분간방치후 100 에서 10분간끓였다. 15,000 rpm에서 10분간원침하여상층액을중합효소연쇄반응에이용하였다. 분리된 DNA를한쌍의시발체 (10 pmol/l) 와함께중합효소연쇄반응액이동결건조된 premix tube ( 바이오니아, Korea) 에넣어총량이 20 L가되도록증류수를넣었다. 자동온도조절기 (GeneAmp 9600, Perkin Elmer, USA) 에서 94 에서 1분, 68 에서 3초, 72 에서 1분간 40회주기로반응시켰다. 사용된시발체는 insertional element IS986을증폭시킬수있는부위 [19] 로바이오니아에의뢰해제작
58 최윤미 이명희 하였다. 중합효소연쇄반응후산물을 2% 한천배지에서전기영동하여 541 base pair의띠가관찰되면 M. tuberculosis 가존재하는것으로판독하였다. 6. 통계처리 두배양방법간의분리율및오염률비교는 SPSS 프로그램 (window version 8.0) 으로 chi-square test 검정을하였고, 검출시간의비교는 paired Wilcoxon test로검정하였다. 통계적유의수준은 P value 0.05 이하로하였다. 결 총 1,690개의검체중 181 검체 (10.7%) 에서 Mycobacteria가배양되었는데이들중객담이 170 검체로그대부분을차지하였으며객담의양성배양률도 13.5% 로농이나다른체액의양성 Table 1. Specimen types and recovery of mycobacteria Specimen types No. of specimens No. (%) of positive specimens 과 Respiratory 1,258 170 (13.5) Body fluid 249 8 (3.2) Pus 99 1 (1.0) Others* 84 2 (2.4) Total 1,690 181 (10.7) *include stools, urines, unknown specimens. 배양률 1-3.2% 에비해월등히높았다 (Table 1). 검출된 Mycobacterium 중 M. tuberculosis 가 83.4%, 비정형결핵균이 16.6% 였다. Mycobacterium이분리된 181 검체중 MGIT 960 system에서배양된경우가 174 검체 (96.1%), 고체배지에서배양된경우가 73 검체 (40.3%), 양쪽에서모두배양된경우가 66 검체 (36.5%), MGIT 960 system에서만배양된경우는 108 검체 (59.7%), 고체배지에서만배양된경우는 7 검체 (3.9%) 였다 (Table 2). 위의결과를바탕으로 MGIT와고체배지에서의검출률비교를 chi-square로검정한결과 P value는 0.0001 이하였다. 항산균도말검사결과양성이 73건이었는데이들은모두배양검사양성이었다. 즉 MGIT에서는 73건 (100%) 모두에서, 고체배지에서는 39건 (53.4%) 에서 Mycobacterium이배양되었다. 도말음성검체 1,617건에대한배양검사결과 MGIT 101건 (6.3%), 고체배지 34건 (2.1%) 에서 Mycobacterium이배양되어총 108 검체 (6.7%) 가도말음성이면서배양양성이었다. 또한항산균도말음성이면서 MGIT에서도 Mycobacterium이배양되지않았는데고체배지에서만 Mycobacterium이배양된검체도 7건이있었다 (Table 3). MGIT 960 system에서양성이나오지않아 6주간배양한검체는모두침사로항산균염색을실시한결과, 양성은하나도발견되지않았다. Mycobacterium이검출되기까지소요된평균검출시간은 MGIT 960 system이 11.1일 ( 범위 : 2.1-33.0일, 중앙값 : 10.5일 ) 이었고, 육안관찰한고체배지는 31.6일 ( 범위 : 10-53일, 중앙값 : 33일 ) 이었다 (P value <0.0001). 이중 M. tuberculosis 가검출 Table 2. Distribution of isolates recovered in each culture system and in combination system Total No. (%) of isolates recovered with Total, all media MGIT 960 Solid media 960 only Solid media only Both M. tuberculosis 151 (83.4) 145 65 86 6 59 MOTT 30 (16.6) 29 8 22 1 7 All 181 (100) 174 (96.1*) 73 (40.3) 108 (59.7) 7 (3.9) 66 (36.5) Abbreviation: MOTT, Mycobacterium other than tuberculosis. *significantly different by chi-square test (P value < 0.0001) compared with solid media. Table 3. Distribution of isolates recovered in each culture system according to AFB smear Culture system AFB smear (+) (n=73) No. (%) of isolates recovered with specimens of AFB smear ( ) (n=1,617) MGIT 960 73 (100) 101 (6.3) Solid media 39 (53.4) 34 (2.1) No. of culture(+) specimens 73 (100) 108 (6.7) MGIT(+)/solid( ) 28 71 (6.3) MGIT(+)/solid contamination 6 3 MGIT(+)/solid(+) 39 27 MGIT( )/solid(+) 0 1 MGIT contamination/solid(+) 0 6
결핵균배양기기 BACTEC MGIT 960 System 의평가 59 되는데걸린시간은 MGIT 960 system이 11.5일, 고체배지가 31.0일이었고 (P value <0.0001), 비정형결핵균일경우 MGIT 960 system이 8.8일, 고체배지가 37.0일소요되었다 (P value <0.0001)(Table 4). 또한항산균도말염색결과에따른검출시간의비교에서도말양성검체는 MGIT 960에서 8.0일, 고체배지에서 29.1일이소요되었고, 도말음성검체인경우 MGIT 960에서 13.6일, 고체배지에서 34.2일이소요되었다 (Table 5). 오염률의비교에서 MGIT 960 system은 14.9%, 고체배지는 2.6% 의오염률을나타냈다 (Table 6). MGIT 960에서잡균오염된검체가검출된평균시간은 7.0일 ( 범위 : 1-43.9일, 중앙값 : 4.1일 ) 로 Mycobacterium이검출된검체의검출평균시간 (11.1 일 ) 보다짧았다 (P value <0.0001). 고 총 1,690 검체에서결핵균배양을실시한결과, 181 검체 (10.7%) 에서 Mycobacterium이배양되었고, 이중 174 검체 (96.1%) 가액체배지에서분리되어고체배지의 73건 (40.3%) 에비해월등히우수한성적을보였다. 또한항산균도말양성인검체 73건중 MGIT에서는 73건 (100%) 모두가배양되었으나, 고체배지에서는 39건 (53.4%) 에서만배양되었다. MGIT에서의결 Table 4. Mean time to detection of mycobacteria in MGIT 960 and solid media Culture system MGIT 960 11.5* 8.8* 11.1 (2.1-33.0)* Solid media 31.0 37.0 31.6 (10.0-53.0) 찰 Average No. of days (range of days) to detection of M. tuberculosis MOTT All mycobacteria Abbreviation: MOTT, Mycobacterium other than tuberculosis. *significantly different by paired Wilcoxon test (P value < 0.0001) compared with solid media. Table 5. Mean time to detection of mycobacteria in MGIT 960 and solid media for AFB smear(+)/smear(-) isolates Culture system Average No. of days (range of days) to detection of AFB smear (+) AFB smear (-) MGIT 960 8.0 (2.1-16.1)* 13.6 (3.5-33.0)* Solid media 29.1 (16.0-45.0) 34.2 (24.0-44.0) 핵균검출을수작업으로실시한 Cornfield 등의연구 [15] 에서는결핵균검출률이 MGIT 10.4% 였고, BACTEC 460 10.9% 로 MGIT와 BACTEC에서비슷한결과를보였고도말양성검체중 MGIT 양성은 77% 였고, BACTEC 양성은 68.6% 였다. Ichiyama 등 [14] 은고체배지에서 17.0%, Septi-Chek system 에서 26%, 수작업에의한 MGIT에서 30.8% 의검출률을보고하여 MGIT에서의검출률이가장우수하였고, 도말양성검체중 MGIT 양성은 85.9%, Septi-Chek system은 81.7%, 고체배지는 63.4% 였다. Pfyffer 등 [16] 은수작업에의한 MGIT에서 9.1%, BACTEC 460 system에서 10.5%, 고체배지에서 8.3% 의검출률을보고하여 BACTEC에서의검출률이가장우수했고, 도말양성검체에서 MGIT 양성은 88.6%, BACTEC 양성은 95.7%, 고체배지에서의양성은 85.7% 였다. MGIT 960 system 을이용한 Hanna 등 [21] 의결과에서는 8.4%, BACTEC 460 system에서 7.5%, 고체배지에서 7.0% 의검출률을보고하였다. 따라서액체배지인 MGIT를이용한결과전통적인고체배지법에비해검출률에서모두우수한결과를보였다. 또한도말양성검체에서배양검출률을비교한결과에서도액체배지검출률이고체배지보다월등히우수할뿐만아니라, MGIT를 UV 램프로판독하는수작업방법보다 MGIT 960 system을이용할경우좀더우수한결과를보였다. 검출시간에서도 MGIT 960 system에서분리된결핵균의검출시간은평균 11.1일이었고, 고체배지는평균 31.6일로액체배지에서의검출시간이월등히짧음을알수있다. Hanna 등은 BACTEC 460 기기를이용한평균검출시간이 12.5일이었고, MGIT 960 system의평균검출시간은 11.8일로보고하였다 [21]. BACTEC 460에서최등 [22] 은평균 18.4일을보고하였고, 이등 [23] 은평균 19.3일을보고하여본연구의 MGIT 960 system에서의검출시간이평균일주일정도단축됨을알수있다. 또한 MGIT 960 system을사용하지않고수기법으로액체배지에서의균성장유무를판독한 Ichiyama의결과 [14] 에서는평균 16일이소요되었으며마찬가지방법으로실시한 Pfyffer 등 [16] 은평균 14일을보고하였고, 황등의경우 [24] 에는평균 15 일, Somoskovi 등 [25] 은평균 17일을보고하였다. 따라서 MGIT 960 system을이용할경우수작업에비해도말양성검체에서의균분리율도우수할뿐만아니라검출시간도단축됨을알수있었다. 본연구결과에서도말양성인경우평균 8일 ( 중앙값 : 7.5일 ) 내에결핵균이검출되었고, 도말음성인경우평균 13.6일 ( 중앙값 : 13.5일 ) 이소요되었다. 액체배지배양기간에있 Table 6. Contamination rate in MGIT 960 and solid media System % of isolates showing contamination (total requested number) All site (n=1,690) Sputum (n=1,258) Body fluid (n=249) Others* (n=183) MGIT 960 14.9 (252) 18.1 (227) 5.6 (14) 6.0 (11) Solid media 2.6 (44) 3.3 (41) 0.0 (0) 1.6 (3) Both 2.5 (42) 3.0 (38) 0.4 (1) 1.6 (3) *includes pus, urines, stools or unknown specimens.
60 최윤미 이명희 어서현재는최장 6주간배양후결과를보고하고있는데, 33일배양후결핵균이검출된경우도있어적어도 5주까지는배양을해야할것으로사료된다. 잡균오염률에있어서 Hanna 등 [21] 은 MGIT 960 system에서 8.1%, BACTEC 460에서 4.9% 를보고하였고, Cornfield 등 [15] 은수작업에의한 MGIT에서 29%, BACTEC에서 5% 를보고하였다. 황등 [24] 은수작업에의한 MGIT에서 34.9%, 고체배지에서 18.5% 를보고하였다. 적정오염률의범위가 2-5% 라고할때 [26] 본연구결과고체배지에서의오염률은적정범위에포함되었으나 MGIT 960 system에서의결핵균검출률이오염균에대한억제제가첨가된고체배지에비해매우우수했지만오염율은 14.9% 로적정수준을넘어검체처리과정과첨가항생제농도의조절등점검이필요한것으로사료된다. 오염균의종류를살펴보면 Cornfield 등은주로 Pseudomonas 균종이오염균으로분리되었다고보고하였으나 [15], 본연구에서는 Gram 양성구균과 Gram 양성간균이오염균의대부분을차지했다. 따라서주로분리되는오염균의종류및빈도에따라검체처리방법을달리적용해야할것으로사료된다. 오염균처리방법으로검체전처리과정에서의 NaOH 방법이주로이용되는데 NaOH 의최종농도가 2% 이상이면결핵균도많이사멸하기때문에농도를 1% 로낮추는대신균주위의점액을빨리용해시키는 NALC를첨가하도록권하고있다 [27]. 본연구에서도 NaOH- NALC 처리방법으로전처리를하였으나오염률이높아져현재사용하고있는 4% NaOH를 6% 까지높여본결과, 동시에접종하고있는고체배지에서의결핵균성장이현저히감소됨에따라현재는다시 4% NaOH ( 최종농도는 1% 임 ) 를사용하는대신 NaOH와검체와의노출시간은 15분을그대로유지하면서혼합강도를높여전처리를실시하고있다. 따라서강력한오염균억제제가첨가된전통적인고체배지법과오염균억제제로 5가지항생제 (polymyxin B, amphotericin B, nalidixic acid, trimethoprim, azlocillin) 만첨가된액체배지법을병행해결핵균배양검사를실시할경우검체전처리과정에서부터액체용과고체용검체를따로분리해 NaOH 농도를달리처리해야좀더정확한비교가될것같다. 우리나라와같이결핵감염률이높은나라에서액체배지를사용할경우, 비용면에서고체배지에비해매우불리한입장이지만검출률도높이고, 검사결과도신속히얻음으로써빠른시간내에적절한치료가가능해져결핵환자관리의질적향상을도모할수있을것으로기대된다. 요약배경 : 결핵은세계적으로높은유병률을보이는질환으로감염확산을막기위해신속한결과보고가요구된다. 신속한결과를위해배양방법에있어서기존의고체배지에서액체배지로의 전환이이루어지고있다. 본연구는결핵균검출을위한액체배지중하나인 Mycobacterium Growth Indicator Tube (MGIT) 를이용해 MGIT 960 system에서결핵균배양및검출을실시하였다. 10개월간결핵균배양이의뢰된모든검체에대하여액체배지와고체배지를동시에사용하여그성적을비교평가하였다. 재료및방법 : 결핵균배양이의뢰된총 1,690 검체를대상으로액체배지와고체배지에배양을실시하였고항산균염색도실시하였다. 2% NaOH-NALC 방법으로검체전처리를하였으며 MGIT 960 system 또는 37 에서배양된고체배지에서자란균은항산균염색과중합효소연쇄반응에의해결핵균유무를확인하였다. 결과 : 총 1,690건중 181건에서 Mycobacterium이배양되었다. 이들중 M. tuberculosis 가 83.4% 이고, 비정형결핵균은 16.6% 이었다. 181 검체중 MGIT에서분리된검체는 174건이었고, 고체배지에서는 73건이었다. MGIT에서만분리된검체는 108건 (59.7%) 이었고, 고체배지에서만분리된검체는 7건 (3.9%) 이었다 (P value <0.0001). 전체의뢰검체중도말양성은 73건이었는데이들은 MGIT에서모두배양되었고, 고체배지에서는 39건만배양되었다. 도말음성인 1,617건중 MGIT에서 101건 (6.3%), 고체배지에서 34건 (2.1%) 이배양되었다. 검출소요시간은 MGIT가평균 11.1일, 고체배지가 31.6일이었다 (P value <0.0001). 오염률은 MGIT가 14.9%, 고체배지가 2.6% 였다. 결론 : MGIT 960 system을이용한결핵균배양및검출법은오염률이고체배지에비해높지만사용하기편리하면서검출률과검출시간에서매우우수한결과를보였다. 따라서결핵감염률이높은우리나라에서액체배지를사용할경우, 비용면에서매우불리한입장만개선된다면결핵환자관리에많은도움이될것으로사료된다. 참고문헌 1. Heifets LB. The mycobacteriology laboratory. Clin Lab Med 1996; 16: 513-25. 2. Snider DE Jr, Raviglione M, Kochi A. Global burden of tuberculosis. In: Bloom BR, ed. Tuberculosis. Washington DC: ASM press, 1994: 3-11. 3. 대한결핵협회결핵연구원 : 7차결핵실태조사발견환자추구조사결과. 1997. 4. 고윤석. 임상의의기대. 대한임상병리학회지 1997; 17( 부록 1): S26-31. 5. Centers for Disease Control and Prevention: Guidelines for preventing the transmission of Mycobacterium tuberculosis in health-care facilities. Morbid Mortal Weekly Rep 1994; 43: 1-132. 6. Tenover FC, Crawford JT, Huebner RE, Geiter LJ, Horsburgh CR,
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