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Journal of Korean Medicine Rehabilitation Vol. 24 No. 2, April 2014 pissn 1229-1854 eissn 2288-4114 Original Article 淸氣化痰丸추출물이비만쥐의지질강하, 항산화효과및전염증성 Cytokines 생산에미치는영향 이한 박원형 차윤엽상지대학교한의과대학한방재활의학교실 Effects of Cheunggihwadamhwan Extract on Lowering Lipid, Antioxidation and Production of Proinflammatory Cytokines in Rats Fed on High Fat Diet Han Lee, K.M.D., Won-Hyung Park, K.M.D., Yun-Yeop Cha, K.M.D. Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Sangji University RECEIVED March 20, 2014 REVISED April 2, 2014 ACCEPTED April 7, 2014 CORRESPONDING TO Yun-Yeop Cha, Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Sangji University, 80, Sangjidae-gil, Wonju 220-717, Korea TEL (033) 741-9260 FAX (033) 732-2124 E-mail omacha@sangji.ac.kr Objectives The purpose of this study was to investigate the effects of Cheunggihwadamhwan (CGHDH) extract on lowering lipid, antioxidation and production of proinflammatory cytokines in rats fed on high fat diet. Methods 40 Male Sprague-Dawley rats were fed on high fat diet for 8 weeks and 32 rats (above 400 g) were randomly divided into 4 groups (8 mice in each group) : control group, 100 mg/kg CGHDH group, 200 mg/kg CGHDH group, 300 mg/kg CGHDH group. We fed a control group of rats a basal diet and administered normal saline(100 mg/kg, 1 time/1 day) for 4 weeks. And We fed each experimental group of rats basal diet and administered an extract of Cheunggihwadamhwan extracts (100 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg, 1 time/ 1 day) for 4 weeks. At the end of the experiment, the rats were sacrificed to determine their chemical composition. We measured lipid in plasma and liver, concentration of proinflammatory cytokines, antioxidative activity and gene expression. The gene expression level was investigated by the way of reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results 1. Concentration of plasma FFA, plasma TG, plasma total cholesterol and plasma LDL-cholesterol showed a significant decrement in Cheunggihwadamhwan groups. However, concentration of plasma HDL-cholesterol showed a significant increment in 200, 300 mg/kg Cheunggihwadamhwan groups. 2. Concentration of liver total cholesterol and liver TG showed a significant decrement in Cheunggihwadamhwan groups. 3. Concentration of plasma TBARS showed a significant decrement in all Cheunggihwadamhwan groups. Concentration of liver TBARS showed a significant decrement in 200, 300 mg/kg Cheunggihwadamhwan groups. Concentration of liver GSH-Px, SOD and CAT showed a tendency to decrease in all Cheunggihwadamhwan groups. 4. Concentration of plasma IL-1β, plasma IL-6, TNF-α and NO, showed a tendency to decrease in all Cheunggihwadamhwan groups. Concentration of plasma IL-10 showed a tendency to increase in all Cheunggihwadamhwan groups. 5. In the analysis of reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), the gene expression of Apo-B and Apo-E in the Cheunggihwadamhwan groups showed a low expression than that of control group. The ratio of Apo-B expression per β-actin expression in the showed a significant decrement in all Cheunggihwadamhwan groups. The ratio of Apo-E expression per β-actin expression in the showed a significant decrement in 300 mg/kg Cheunggihwadamhwan groups. Conclusions According to this study, the extract of Cheunggihwadamhwan showed a positive effect of lowering lipid, antioxidation and a control of producing proinflammatory cytokines. (J Korean Med Rehab 2014; 24(2):1-13) Copyright 2014 The Society of Korean Medicine Rehabilitation Key words Cheunggihwadamhwan, Lowering lipid, Antioxidation, Inflammatory www.e-jkmr.org 1

이한 박원형 차윤엽 서론»»» 비만이란섭취한에너지가신체활동과성장에필요한에너지량보다많아서초과된에너지가체지방조직으로과잉축적되어대사장애를유발하는질환을의미한다 1). 비만은고혈압, 당뇨병, 심혈관계질환, 퇴행성질환을야기한다고알려져있으며 2), 지방조직이과잉으로축적되면간의지방산출납기능에이상을일으켜간질환이유발될수도있다 3). 최근과잉으로축적된체지방조직의생리학적기능에대한연구에서는 tumor necrosis factor alpha (TNF-α), plasminogen activator inhibitor type-1 (PAI-1), leptin 및 interleukin-6 (IL-6) 등의다양한생리활성물질들이체지방조직에서도생산이되며 4,5), 이러한생리활성물질들은인슐린저항성, 염증반응에관여하여생체를질병상태로유도할수있다고보고했다 6,7). 또한비만과관련된대사성질환들은생체내에각종 cytokine 들과염증성매개물질들이비정상적으로증가하게되어만성염증상태가나타난다고보고되었다 8). 결과적으로비만으로인해과잉으로축적된체지방조직은이미알려진각종성인병의병인을제공함은물론이고, 생체염증상태를유도하여전신의생체기능을저하시켜생명활동전체에영향을나타내는주요요인이된다. 따라서비만은임상현장에서보다적극적으로다루어져야할질환이다. 한의학에서는비만을肥, 肥人, 肥貴人등으로표현하였으며 9), 기름진음식의과다섭취로인한脾胃運化失調및이로인한濕痰瘀血과七情所傷, 肝氣鬱滯등을비만의원인으로보았다 10). 이를근거로지속적으로비만에대해한의학적연구가진행되고있으며, 특히한약처방및본초에대한연구가다양하게이루어지고있다. 현재까지太陰調胃湯 11,12), 體減薏苡仁湯 13) 14,15), 防風通聖散등의처방에대해연구가되었으며, 마황 16), 창출 17), 의이인 18) 등단미제가비만에미치는효과에대해서도연구가이루어지고있다. 淸氣化痰丸은 東醫寶鑑 에수록된처방으로일체痰飮및食積, 酒積으로痰이생겨몹시막힌것을치료한다고기록되어있다 19). 비만에대한한의학적변증연구를살펴보면痰飮과食積이중요한비만유발요인임을알수있으며 20,21), 이에淸氣化痰丸이비만치료에임상적유효성이있을것으로유추할수있으나, 현재까지淸氣化痰丸에대한연구가이루어지지않고있다. 따라서본연구는비만의예방과치료효과를개선하기위한기초연구의 일환으로비만을유도한흰쥐에게淸氣化痰丸을투여한후, 생체지질구성및농도, 항산화기능및염증반응상태의지표가될수있는전염증성 cytokine 의생산을조사했다. 재료및방법»»» 1. 실험동물, 실험군및비만유도 평균체중이 203.27±5.31 g의 Sprague-Dawely 계수컷 40두에게고지방식이 (Table I) 를 8주간급여한후, 체중이 400 g 이상인 32두를선발하여, 평균체중이유사하게대조군 (100 mg/kg 생리식염수 ), 처리 1군 (100 mg/kg 淸氣化痰丸추출물 ), 처리 2군 (200 mg/kg 淸氣化痰丸추출물 ) 및처리 3군 (300 mg/kg 淸氣化痰丸추출물 ) 으로나누어각처리군당 8두씩임의배치하였다. 본실험은상지대학교보건과학대학제약공학과연구실에서진행되었으며, 실험동물윤리에관한규정을준수하였다. 2. 식이급여 시험기간 4주동안기본식이 (Table I) 를각처리군간섭취량차이가 5% 이내가되도록균등급여하였다. 물은 Table I. Composition of Experimental Diets Ingredients (%) Basal diet High fat diet Casein 20.0 20.0 α-corn starch 35.0 30.0 Sucrose 11.0 10.0 Lard 4.0 25.0 Corn oil 1.0 5.0 Mineral mix 1) 3.5 3.5 Vitamin mix 2) 1.0 1.0 Cellulose powder 23.5 5.2 DL-methione 0.3 0.3 1) Mineral mix. (g/kg diet): CaCO3, 29.29; CaHPO4 2H2O, 0.43; KH2PO4, 34.30; NaCl, 25.06; MgSO4 7H2O, 9.98; Feric citrate hexahydrate, 0.623; CuSO4 5H2O, 0.516; MnSO4 H2O, 0.121; ZnCl2, 0.02; KI, 0.005; (NH4)6 MO7O24 4H2O, 0.0025. 2) Vitamin mix. (mg/kg diet): Thiamine-HCl, 12; Riboflavin, 40; Pyridoxin-HCl, 8; Vitamin-B12, 0.005; Ascorbic acid, 300; D-biotin, 0.2; Menadione, 52; Folic acid, 2; D-calcium pantothenate, 50; P-aminobenzoic acid, 50; Nicotinic acid, 60; Cholin choloride, 2000 (IU/kg diet); Rethinyl acetae, 5000 (IU/kg diet); Cholecalciferol, 250 (IU/kg diet). 2 J Korean Med Rehab 2014;24(2):1-13

淸氣化痰丸추출물이비만쥐의지질강하, 항산화효과및전염증성 Cytokines 생산에미치는영향 Table II. Composition of Cheunggihwadamhwan and Amount Herbal name Crude drugs name Amount (g) 南星 Arisaematis Rhizoma 50 半夏 Pinelliae Rhizoma 50 神麴 Massa Medicata Fermentata 37.5 麥芽 Hordei Fructus Germiniatus 37.5 陳皮 Citri Unshii Pericarpium 25 枳實 Aurantii Immaturus Fructus 25 白朮 Atractylodis Macrocephalae Rhizoma 25 白茯笭 Hoelen 25 蘇子 Perillae Semen 25 蘿葍子 Raphani Semen 25 瓜蔞仁 Trichosanthes kirilowii 25 香附子 Cyperi Rhizoma 25 山査肉 Crataegi Fructus 25 白荳蔲 Amomi Cardamomi Fructus 25 靑皮 Citri Unshii Pericarpium 12.5 乾葛 Puerariae Radix 12.5 黃連 Coptidis Rhizoma 12.5 黃芩 Scutellariae Radix 20 海粉 Notarchi Leachii Ovum 17.5 Total amount 500 자유롭게마실수있도록했다. 3. 淸氣化痰丸추출물및투여 본실험에사용한淸氣化痰丸의처방은 東醫寶鑑 에준하였고, 약재는상지대학교부속한방병원약제과에서구입했다. 淸氣化痰丸 500 g ( 건조중량 )(Table II) 을냉각수환류하에 5시간, 3회추출하고여과, 감압농축하여, 에탄올추출물 109 g을만들었다. 약물투여는처리군별정량을매일오후 5시경에 zonde needle 을이용하여경구투여하였다. 4. 채혈및간장채취 실험종료일에 12시간절식을시킨후, 심장천자법에의해약 5~6 ml의혈액을채취하였다. 채취한혈액은분석항목별로처리하여보관하였다. 채혈을마친후, 간장을채취하여각각의분석항목별처리방법에따라처리한후, -80 o C에냉동보관하였다. 5. 시료분석 1) 혈장및간장의지질농도및구성혈장의 Total cholesterol, Triglyceride (TG), LDL-cholesterol 및 HDL-cholesterol 농도는혈액자동분석기 (Boehringer Manheim, 독일 ) 에의해분석하였으며, 혈장 Free Fatty Acid (FFA) 함량은 V-NEFA Kit ( 일수제약, 일본 ) 를이용한효소법에의해측정하였다. 간장의 Total cholesterol 및 TG량은정량용 Kit (Wako Co., 일본 ) 를이용하여분석하였다. 2) 혈장및간장의 Thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) 농도혈장의 TBARS 량은혈장을분리하여, 37 o C에서 120분간배양후 Buege 와 Aust 22) 의방법에의해정량하였다. 간장의 TBARS 량은간장절편 1~2 g을 0.9% 생리식염수로세척, 혈액을제거한후, 1.15% KCl 수용액과혼합하여 10% homogenate 를만들었다. 0.1 ml의 homogenate 를 8.0% sodium dodecyl sulfate 0.2 ml, 20% acetic acid solution (ph 3.5) 1.5 ml, 0.8% TBA solution 1.5 ml를첨가하고, 총 4 ml가되도록증류수를넣은다음 95 o C water bath에서 1시간동안가열하였다. 가열한시험관을흐르는수돗물에서냉각시킨후, 증류수 1 ml와 n-butanol과 pyridine (15:1, v/v) 혼합용액 5 ml를가하고 voltex하였다. 1,500 g에서 10분간원심분리한후상층액 (n-butanol : pyridine 층 ) 을 532 nm에서흡광도를측정하였다. 표준물질로는 TMP (1,1,3,3-tetraamitoxypropane) 를사용하였고, lipid peroxide 수준은 nm MDA (malondialdehyde) 로표시하였다. 3) 간장 Glutathione peroxidase (GSH-Px) 활성치간장의 GSH-Px 활성은 Levander 등 23) 방법에준해분석하였다. 간장절편을생리식염수로세척, 혈액을제거시킨후, 0.15 M Kcl 수용액과함께 homogenizer 로 20% homogenate 가되도록마쇄하여 9,000 g에서 15분간원심분리하였다. 상층액을 15,000 g에서 1시간동안원심분리한후, 상층액을단백질의함량이 100~200μg 이되도록취하여분석했다. 원심분리시의온도는 4 o C를유지하였으며, 조제한시료를 stock solution (K buffer, 40 www.e-jkmr.org 3

이한 박원형 차윤엽 mm glutathione, KH buffer, ml당 1 Unit의 glutathione reductase) 에넣어 37 o C에서 10분간항온시킨후, 20 mm NADPH 를첨가하여다시 2분동안방치시켰다. 그리고 15 mm t-butyl hydroperoxide 를가하여그반응을 340 nm에서 1분간흡광도가감소하는속도를측정하였다. GSH-Px 활성도의 unit는 mg protein당 1분동안 NADPH 가 NADH 로산화되는 nm수로나타내었다. 4) 간장 Superoxide dismutase (SOD) 활성치 Flohe 등 24) 의방법으로측정했다. 본실험에서는 ferricytochrome C의환원이방해되는정도를 550 nm에서 30 초간격으로 3분간비색정량한후 ferricytochrome C의환원을 50% 방해하는 SOD의양을 1 unit로하여분당활성정도를나타내었다. 5) 간장 Catalase (CAT) 활성치간장 0.2 g을 20배의 25 mm KH 2 PO 4 -NaOH buffer (ph 7.0) 에넣어균질화시키고 homogenate 를같은 buffer로 60배희석한후 ice bath 상태에서 ultrasonicator (Heat System Ultrasonics. Inc., Ultrasonic Propessor W-385) 로 15초씩 2회반복하고, 시료를 Spectrophtometer (550 nm) 에서흡광도를측정한후, formaldehyde 를표준용액의표준곡선으로활성을계산하였다 25). 6) 혈장 Glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) 및 Glutamic pyruvic transaminase (GPT) 활성치혈장 GOT 및 GPT 활성치는혈액자동분석기 (Boehringer Manheim, 독일 ) 로측정했다. 하여 -80 o C에냉동보관하였다. Cytokines (IL-1β, TNFα, IL-6 및 IL-10) 정량은시판 Kit (Biosource International, USA) 를이용했다. TNF-α의최저측정농도는 0.7 pg/ml이며, 다른 Cytokines 들은 3~8 pg/ml이다. 8) 혈장 Nitric oxide (NO) 농도혈장 NO 농도는분석용 Kit (DOJINDO, NO Assay Kit, 일본 ) 를이용하여측정했다. 9) RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction) 분석 TRI reagent (Sigma alderich Co.) 로 total RNA를추출하였다. cdna 합성은 M-MLV Reverse transcriptase Kit (Promega) 를사용하여 5 mg/ml total RNA로하였다. 합성된 cdna 는각각의 rat Apo-B, Apo-E, leptin 및 β- actin genes의 primer (Table III) 를이용하여 PCR을수행하였다. PCR의 reaction mixture 는 3 μl 10 Ex-Taq buffer, 2.5 μl dntp mixture (2.5 mm each), 0.5 μl Ex-Taq polymerase (5 units/μl, TaKaRa), 2 μl forward 및 reverse primers ( 각각 100 pm/μl), 1 μl cdna template 및 21 μl의증류수를혼합한 30 μl이며, PCR 반응은 94 o C에서 5분, 94 o C에서 30초간 denaturation 35 cycles, 57~60 o C에서 30초간 annealing, 72 o C에서 45초간 extension, 마지막으로 72 o C에서 10분간 extension 을실시했다. PCR products 는 1.5% agarose gel (0.1 mg/ml ethidium bromide) 을이용하여전기영동을하였으며, size marker 로 GeneRuler DNA ladder mix. (Fermentas, #SM0333) 를사용하였다. 7) 혈장 Cytokines 농도 혈장 Cytokines 정량용시료는채혈직후, 혈장을분리 Table III. The Primers Used in RT-PCR and the Estimated Size of the Amplified Fragments RNA Apolipoprotein B: 170 bp Apolipoprotein E: 300 bp Leptin: 458 bp β-actin: 348 bp Primer sequences(5'to 3') 5'-AGA AAG AGA ACA AAG CAG AGA TTG TGG-3' 5'-CAT GCT CCA TTC TCA CAT GTT TA-3' 5'-GTG GGC AAA CCT AAT GGA GA-3' 5'-GCT GAA GCT GTG TGG AAT CA-3' 5'-GTG GCT TTG GTC CTA TCT GTC CTA TG-3' 5'-TCA GGG CTA AGG TCC AAC TGT TGA AG-3' 5'-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA-3' 5'-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3' 4 J Korean Med Rehab 2014;24(2):1-13

淸氣化痰丸추출물이비만쥐의지질강하, 항산화효과및전염증성 Cytokines 생산에미치는영향 6. 통계처리 실험결과는 SPSS(ver. 18.0) 통계프로그램을이용하여 one-way ANOVA 검정을수행하였으며, 각처리군간의유의성검정은 Duncan's multiple range test에의해 p <0.05 수준에서실시했다. 결과»»» 1. 혈장 Free fatty acid (FFA) 및 Triglyceride (TG) 농도 혈장 FFA 농도는대조군과비교하여淸氣化痰丸추출물처리군모두가낮은값을나타내었으며, 200 mg/kg 淸氣化痰丸추출물처리군과 300 mg/kg 淸氣化痰丸추출물처리군에서통계적으로유의하게낮았다. TG 농도는대조군보다淸氣化痰丸추출물처리군모두가낮은값을보였으며, 淸氣化痰丸추출물의급여량이증가함에따라감소하였다 (Table IV). 2. 혈장 Cholesterol 농도 혈장 Total cholesterol 농도와 LDL-cholesterol 농도는淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다유의하게낮았다. 혈장 HDL-cholesterol 농도는淸氣化痰丸추출물처리군이대조군보다높은값을나타내었으며, 200 mg/ Kg 淸氣化痰丸추출물처리군과 300 mg/kg 淸氣化痰丸추출물처리군은대조군보다유의하게높았다 (Table V). 3. 간장 Total cholesterol 및 Triglyceride (TG) 농도 간장 Total cholesterol 농도및 TG 농도는淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다유의하게낮았다 (Table VI). 4. 혈장및간장 Thiobabituric acid reactive substance (TBARS) 농도 혈장 TBARS 농도는淸氣化痰丸추출물처리군모두가 Table IV. Effects of Cheunggihwadamhwan Ext. on Plasma FFA and Triglyceride Concentration in Rat Fed High Fat Diet Treatment FFA (ueql) Triglyceride (mg/dl) Control 791.87±20.15 c 261.72±18.67 c 100 mg/kg CGHDH ext. 768.53±25.30 c 232.90±22.76 b 200 mg/kg CGHDH ext. 702.63±19.70 b 204.54±12.71 a 300 mg/kg CGHDH ext. 664.71±32.38 a 193.22±13.28 a a,b,c : Means in the same column with different superscripts are significantly different (p<0.05). CGHDH: Cheunggihwadamhwan. Table VI. Effects of Cheunggihwadamhwan Ext. on Liver Total Cholesterol and Triglyceride Concentration in Rat Fed High Fat Diet Treatment Total cholesterol Triglyceride (mg/g) (mg/g) Control 18.78±1.14 c 18.88±1.50 c 100 mg/kg CGHDH ext. 16.21±1.14 b 16.24±1.71 b 200 mg/kg CGHDH ext. 15.06±2.56 ab 14.14±1.06 a 300 mg/kg CGHDH ext. 13.05±1.28 a 12.57±0.48 a a,b,c : Means in the same column with different superscripts are significantly different (p<0.05). CGHDH: Cheunggihwadamhwan. Table V. Effects of Cheunggihwadamhwan Ext. on Plasma Total Cholesterol, HDL-cholesterol and LDL-cholesterol Concentration in Rat Fed High Fat Diet Treatment Total Cholesterol (mg/dl) HDL-cholesterol (mg/dl) LDL-cholesterol (mg/dl) Control 170.34±9.15 c 21.26±2.17 a 38.60±4.44 c 100 mg/kg CGHDH ext. 138.16±8.97 b 23.27±1.94 ab 29.40±2.72 b 200 mg/kg CGHDH ext. 126.70±8.89 ab 24.67±2.95 b 24.25±2.08 a 300 mg/kg CGHDH ext. 121.29±9.76 a 26.44±2.16 b 21.44±1.85 a a,b,c : Means in the same column with different superscripts are significantly different (p<0.05). CGHDH: Cheunggihwadamhwan. www.e-jkmr.org 5

이한 박원형 차윤엽 대조군보다유의하게낮았다. 간장 TBARS 농도는 200 mg/kg 淸氣化痰丸추출물처리군과 300 mg/kg 淸氣化痰丸추출물처리군이대조군보다유의하게낮았다 (Table VII). 5. 간장 Glutathione peroxidase (GSH-Px), Superoxide dismutase (SOD) 및 Catalase (CAT) 활성치 GSH-Px, SOD 및 CAT 활성치는淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다높은경향을나타내었다. GSH- Px, CAT 활성치는 200 mg/kg 淸氣化痰丸추출물처리군과 300 mg/kg 淸氣化痰丸추출물처리군이대조군보다유의하게높았으며, SOD 활성치는 300 mg/kg 淸氣化痰丸추출물처리군만이대조군보다유의하게높은값을나타내었다 (Table VIII). 6. 혈장 Glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) 및 Glutamic pyruvic transaminase (GPT) 활성치 혈장 GOT 및 GPT의활성치는전처리군간에유의한차이를나타내지않았다 (Table IX). 7. 혈장 Cytokines 농도혈장 interleukin-1β (IL-1β) 농도는淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다유의하게낮은값을나타내었다. 혈장 IL-6 및 TNF-α 농도는淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다낮은값을나타내었으며, 200 mg/kg 淸氣化痰丸추출물처리군과 300 mg/kg 淸氣化痰丸추출물처리군이대조군보다유의하게낮았다. 혈장 interleukin-10 (IL-10) 농도는 200 mg/kg 淸氣化痰丸추출물처리군과 300 mg/kg 淸氣化痰丸추출물처리군이대조군보다유의하게높았다 (Table X). 8. 혈장 Nitric oxide (NO) 농도혈장 NO 농도는淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다유의하게낮은값을나타내었다 (Table XI). 9. Apo-B, Apo-E 및 Leptin gene expression Apo-B 및 Apo-E 는정상군과비교하여비만군이높은 Table VII. Effects of Cheunggihwadamhwan Ext. on Plasma and Liver TBARS Concentration in Rat Fed High Fat Diet Treatment Plasma TBARS Liver TBARS (nmoles MDA/ml) (nmoles MDA/g) Control 30.24±1.87 c 21.06±1.28 b 100 mg/kg CGHDH ext. 27.26±2.36 b 20.00±1.05 b 200 mg/kg CGHDH ext. 23.49±1.98 a 14.73±1.80 a 300 mg/kg CGHDH ext. 21.81±2.18 a 13.59±1.80 a a,b,c : Means in the same column with different superscripts are significantly different (p<0.05). CGHDH: Cheunggihwadamhwan. Table IX. Effects of Cheunggihwadamhwan Ext. on Plasma Glutamic Oxaloacetic Transaminase (GOT) and Plasma Glutamic Pyruvic Transaminase (GPT) Activity in Rat Fed High Fat Diet Treatment GOT GPT (Karmen unit) (Karmen unit) Control 31.41±3.45 NS 27.78±3.06 NS 100 mg/kg CGHDH ext. 32.90±4.63 NS 28.34±2.60 NS 200 mg/kg CGHDH ext. 33.45±4.46 NS 24.23±2.88 NS 300 mg/kg CGHDH ext. 30.51±2.40 NS 24.90±2.14 NS NS : Not significantly different (p>0.05). CGHDH: Cheunggihwadamhwan. Table VIII. Effects of Cheunggihwadamhwan Ext. on Antioxidase Activity in Rat Fed High Fat Diet Treatment GSH-Px (nmoles/min/mg protein) SOD (unit/mg protein) CAT (μmoles(h 2O 2)/min/mg protein) Control 122.95±8.36 a 11.14±0.80 a 56.74±3.58 a 100 mg/kg CGHDH ext. 127.61±4.75 a 11.10±1.79 ab 60.75±2.19 a 200 mg/kg CGHDH ext. 140.41±5.63 b 12.72±1.04 ab 66.36±5.01 b 300 mg/kg CGHDH ext. 144.99±6.11 b 13.51±0.53 b 69.18±3.06 b a,b : Means in the same column with different superscripts are significantly different (p<0.05). CGHDH: Cheunggihwadamhwan. 6 J Korean Med Rehab 2014;24(2):1-13

淸氣化痰丸추출물이비만쥐의지질강하, 항산화효과및전염증성 Cytokines 생산에미치는영향 Table X. Effects of Cheunggihwadamhwan Ext. on Plasma Cytokines Concentration in Rat Fed High Fat Diet Treatment IL-1β(pg/ml) IL-6 (pg/ml) TNF-α(pg/ml) IL-10 (pg/ml) Control 31.48±1.38 c 41.36±3.57 b 35.96±4.76 b 11.67±1.24 a 100 mg/kg CGHDH ext. 27.00±2.96 b 37.80±2.50 b 33.34±3.24 b 12.66±1.31 ab 200 mg/kg CGHDH ext. 23.63±2.05 a 29.91±1.37 a 26.52±2.23 a 14.08±0.69 b 300 mg/kg CGHDH ext. 23.14±2.73 a 26.07±5.50 a 24.52±2.28 a 15.68±1.35 c a,b,c : Means in the same column with different superscripts are significantly different (p<0.05). CGHDH: Cheunggihwadamhwan. Table XI. Effects of Cheunggihwadamhwan Ext. on NO Concentration in Rat Fed High Fat Diet Treatment NO Control 31.53±3.20 c 100 mg/kg CGHDH ext. 27.90±2.93 b 200 mg/kg CGHDH ext. 24.03±2.45 a 300 mg/kg CGHDH ext. 22.69±1.65 a a,b,c : Means in the values with different superscripts are significantly different (p<0.05). CGHDH: Cheunggihwadamhwan. Nor Con 100 200 300 Fig. 2. The ratio of Apo-B/β actin in RT-PCR gene expression. a,b,c,d : Means with different superscripts are significantly different (p<0.05). Nor: Normal group, Con: Control group, 100: 100 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext., 200: 200 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext., 300: 300 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext. Fig. 1. RT-PCR analysis for Apo-B, Apo-E and Leptin gene expression. Nor: Normal group, Con: Control group, 100: 100 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext., 200: 200 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext., 300: 300 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext. gene expression 을나타내었으나, 비만군에서는대조군과비교하여淸氣化痰丸추출물처리농도가증가함에따라낮은 gene expression 을나타내었다. Leptin gene expression 은정상군보다비만군모두가높은 gene expression 을나타내었으며, 비만군간에서는淸氣化痰丸추출물처리농도에따른확연한차이를볼수없었다 (Fig. 1). β-actin expression에대한 Apo-B의 gene expression 비율은淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다유의하게낮은값을나타내었다 (Fig. 2). β-actin expression 에대한 Apo-E 의 gene expression 비율은 300 mg/kg 淸氣化痰丸추출물처리군이대조군보다유의하 Nor Con 100 200 300 Fig. 3. The ratio of Apo-E/β actin in RT-PCR gene expression. a,b,c : Means with different superscripts are significantly different (p<0.05). Nor: Normal group, Con: Control group, 100: 100 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext., 200: 200 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext., 300: 300 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext. www.e-jkmr.org 7

이한 박원형 차윤엽 Nor Con 100 200 300 Fig. 4. The ratio of Leptin/β actin in RT-PCR gene expression. a,b,c : Means with different superscripts are significantly different (p<0.05). Nor: Normal group, Con: Control group, 100: 100 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext., 200: 200 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext., 300: 300 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext. 게낮은값을나타내었다 (Fig. 3). β-actin expression에대한 Leptin 의 gene expression 비율은대조군을비롯한전처리군모두가일관성있는결과를나타내지않았다 (Fig. 4). 고찰»»» 최근체지방조직의기능에대한연구에서지방조직들이생체에너지축적기능과더불어생체내분비대사에도직접적으로관여하고있으며, 그로인해체지방조직이기존의연구대상이었던비만관련질환들의범주를초월하는다양한질환들과도관련이있음을시사해주었다 26-28). 따라서비만과질환의상관관계를에너지대사는물론이고생체기능전반과관련지어보다더광범위하게고려하여할필요성이인지되었다. 비만에대해한의학에서는 黃帝內經ㆍ素問 通評虛實論 에서 " 肥貴人則膏粱之疾也 " 9), 黃帝內經ㆍ靈樞 의 逆順肥瘦第三十八 에 " 年質壯大血氣充盈膚革堅固因加以邪刺此者深而留之此肥人也 ", 衛氣失常第五十九 에는 " 人有肥有膏有肉 " 29) 라하여비만에대해최초언급이있었다. 張氏類經 에서는 " 肥貴之人每多厚味夫肥者令人熱中甘者令人中滿熱蓄于內多傷其陰故爲此諸病 " 이라고하여비만 이기름진음식을먹게되어서생긴다고보았으며 30), 脾胃論 에서 " 脾胃俱實則能食而肥 " 라고하였고 31), 石室秘錄 에서는 " 肥人多痰乃氣虛也虛則氣不能運行故痰生之 " 32) 라고하여 黃帝內經 이후로도지속적으로비만을질병으로인식하고있음을알수있다. 비만의원인을한의학에서는내적요인으로는氣虛, 陽虛, 濕, 痰, 熱, 水, 瘀血, 內傷七情이있으며, 외적요인으로는活動減少, 外感濕邪, 營養過剩, 先天稟賦가있다고보았으며 33), 최근연구에서는脾虛型, 痰飮型, 陽虛型, 食積型, 肝鬱型, 瘀血型으로크게구분하고있다 20,21). 비만에대한최근한의학연구를살펴보면임상연구와실험연구가 75% 이상을차지하였고, 실험연구는모두비만이유발된실험용쥐를이용하여처방 11-15), 단미제 16-18), 한약추출물 34), 약침 35), 전침 36) 등의치료가쥐의비만에미치는효과를분석한것들이었다 37). 실험연구중한약물연구를살펴보면오등 34) 은調胃升淸湯추출액이비만을유도한쥐의지질강하, 항산화및염증반응조절에유의하게작용한다고보고하였으며, 이등 38) 은상엽이혈청중성지방, 간조직의지방축적억제작용이있다고보고하였다. 이외에도防風通聖散 14,15), 輕身解脂丸 39) 등의처방과마황 16), 홍삼 40) 등의단미제가연구되었으나淸氣化痰丸에관한연구는시행되지않았다. 淸氣化痰丸은 東醫寶鑑 에모든痰飮및食積, 酒積으로인하여발생한질환을치료한다 19) 고언급된처방으로남성, 반하, 신국, 맥아, 진피, 지실, 백출, 백복령, 소자, 나복자, 과루인, 향부자, 산사육, 백두구, 청피, 건갈, 황련, 황금, 해분으로구성되어있다. 그중에서가장많은비중을차지하고있는천남성과반하의최근연구를살펴보면, 천남성은비만쥐의당지질대사에영향을주고혈액내지질의감소에효과적이라고보고되었으며 41), 반하역시비만쥐의체중과중성지방을효과적으로감소시키고골격근내지방산화에영향을미친다고보고되었다 42). 맥아 43), 진피 44), 지실 45), 백복령 46), 산사육 47), 청피 48), 갈근 49) 역시비만억제에유효한효과가있다고보고되었으며, 이를토대로淸氣化痰丸은임상에서비만질환의치료에긍정적인효과가있을것으로사료된다. 문헌상으로도淸氣化痰丸은일체의痰飮및食積, 酒積으로인하여발생한질환을치료한다고하였으며, 痰飮과食積이비만의한의학적주요원인임을고려할때淸氣化痰丸의비만치료효과를충분히기대해볼수있다. 또한백출 50), 과루인 51), 향부자 52), 갈근 53), 황련 54), 황금 55) 은염증유발인 8 J Korean Med Rehab 2014;24(2):1-13

淸氣化痰丸추출물이비만쥐의지질강하, 항산화효과및전염증성 Cytokines 생산에미치는영향 자에영향을미쳐항염증효과가있다는연구를근거로淸氣化痰丸에항염증작용도수반될것이라생각해볼수있다. 이와같이淸氣化痰丸이임상적으로다양한방면에서활용가능한처방임에도불구하고문헌에淸氣化痰丸의효능과작용기전에대한보다자세한설명이없었고, 이에최근까지도淸氣化痰丸에대한연구가적극적으로이루어지지않았다. 따라서본연구는비만상태에서淸氣化痰丸이생체내지질합성, 항산화능및염증반응에미치는영향을알아보기위하여비만을유도한흰쥐에게淸氣化痰丸을투여한후, 생체지질구성및농도, 항산화기능및염증반응상태의지표가될수있는전염증성 cytokine의농도를조사했다. FFA, TG, Total cholesterol 및 LDL-cholesterol 농도는조직내지질축적의정도와관련이있는데 56), 본연구에서혈장 FFA, TG, Total cholesterol 및 LDL-cholesterol 농도는대조군과비교하여淸氣化痰丸추출물투여군들이하락하는경향을보였다. 또한간장 TG 및 Total cholesterol 농도모두가대조군보다淸氣化痰丸추출물투여군들이낮은값을나타내었다. 이러한결과는淸氣化痰丸이체내지질의합성과분해에영향을주고, 비만의개선에긍정적으로작용하여당뇨병및순환계질환등의성인병의발병가능성을저하시킬수있음을시사한다. HDL-cholesterol 은체내를순환하며세포내 cholesterol 을회수하여간으로이동시키는역할을하는데 57), 혈장 HDLcholesterol 농도는대조군보다淸氣化痰丸추출물투여군들이높은수치를나타내었다. 이러한결과또한 HDLcholesterol 이혈액내잔여 cholesterol 들을간장으로재순환시켜혈액내지질환경을개선시킨다는본래의기능을고려해보면淸氣化痰丸은비만체질에서지질강하에긍정적으로작용하여성인병예방및치료에효과를나타낼것으로사료된다. 생체내 Thiobabituric acid reactive substance (TBARS) 농도의증가는지질과산화물질의축적이증가하였음을나타낸다. 생체내의지질과산화물질의대부분은지질대사과정에서생성되며, 세포막파괴에직접적으로관여하여생체조직의손상을일으켜각종염증성질환, 암및노화를촉진한다 58,59). 본연구에서혈장 TBARS 농도는淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다유의하게낮았다. 간장 TBARS 농도는 200 mg/kg 淸氣化痰丸추출물처리군및 300 mg/kg 淸氣化痰丸추출물처리군이대조군보다유의하게낮았다. 이러한결과 는淸氣化痰丸추출물이생체내지질과산화물질의축적을억제하여산화장애로인한각종질환의예방과치료에긍정적으로작용할가능성을보여준다. GSH-Px, SOD 및 CAT 활성치는淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다높은경향을나타내었다. GSH-Px, SOD 및 CAT 는생체내에서항산화계효소들로분류되며, 이러한효소들의활성이증가한경우생체내에증가된산화물질들의제거가활발하게진행되었음을의미한다 60). 본연구에서혈장및간장의 TBARS 농도의하락에부합하여 GSH-Px, SOD 및 CAT 활성치가증가하였다. 혈장내 GOT 및 GPT의활성치는전처리군간에유의한차이를나타내지않았다. GOT 및 GPT의활성치는간장의장애의유무를나타내는데, 본연구의결과에서전처리군모두가정상치의범위를나타내어본연구에서처리한淸氣化痰丸추출물의농도는간장기능에이상을초래하지않았음을시사한다. Cytokine 이란여러세포에서생산되는생리활성물질들의일종이며, 염증에대한자기방어, 세포의성장, 분화와사멸, 혈관형성, 항상성회복에관여하는데 61), IL-1β 는 T-cell, B-cell, NK cell의활동성에관여하고 29), IL-6는면역기능및대사기능의조절자로작용하며, 간및지방조직에작용하여 glucose 와지질대사를조절한다 62). TNF-α 는지방세포에서합성되며, 당대사와지질대사에영향을미치는것으로알려져있다 63). IL-1β, IL-6 및 TNF-α는전염증성 cytokine 으로분류되는데 64), 본연구에서혈장 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 농도는淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다낮은경향을나타내었다. 반면에이들전염증성 cytokine 들의생산을저해하는혈장 IL-10 농도 65) 는淸氣化痰丸추출물처리량이증가함에따라증가했다. 전염증성 cytokine 들은전염증성물질들을생산하여염증상태를유도한다. 따라서생체내에전염증성 cytokine들의증가현상은염증반응이활발하게진행되고있음을말해준다 64,65). 본연구에서는淸氣化痰丸추출물처리군들에서전염증성 cytokine농도가하락하여염증반응이완화되었음을시사해주며, 이러한결과는淸氣化痰丸추출물처리군들에서 IL-10의농도가증가한결과와높은상관성이있을것으로생각된다. 또한염증매개물질인혈장 NO 농도 66,67) 도淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다낮은값을나타내어, 전염증성 cytokine 의농도경향과잘부합되었다. Apolipoprotein (Apo) 은지단백을구성하는단백성분인데, Apo-B는 LDL-cholesterol 의단 www.e-jkmr.org 9

이한 박원형 차윤엽 백질성분으로 cholesterol 의수송과세포내유리등의역할을하며 68), Apo-E 는지질대사와심혈관계질환과관련있다고알려져있으며, 관상동맥질환의발생과관련있다고보고된다 69). Apo-B 및 Apo-E 는정상군과비교하여비만군이높은 gene expression 을나타내었으나, 비만군간에서는淸氣化痰丸추출물처리농도가증가함에따라낮은 gene expression 을나타내었다. Leptin은지방조직에서분비되며 70) Leptin gene expression 은정상군보다비만군들모두가높은 gene expression 을나타내었으며, 비만군간에서는淸氣化痰丸추출물처리농도에따른확연한차이를볼수없었다. β-actin expression 에대한 Apo-B 의 gene expression 비율은淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다유의하게낮은값을나타내었다. β-actin expression에대한 Apo-E의 gene expression 비율은 300 mg/kg 淸氣化痰丸추출물처리군이대조군보다유의하게낮은값을나타내었고, β-actin expression 에대한 Leptin 의 gene expression 비율은대조군을비롯한전처리군모두가일관성있는결과를나타내지않았다. 이상의결과를종합하여볼때, 淸氣化痰丸추출물은생체내지질의합성과분해에긍정적으로작용하여지질의축적을억제하고, 항산화효과를가지며, 생체내염증반응의정도를완화시키는데긍정적인효과를나타내어각종질환의예방과치료에이용할수있을것으로생각된다. 결론»»» 본연구는비만의예방, 치료및비만과관련되어나타나는생체기능의이상현상을효과적으로개선하기위한기초연구의일환으로비만을유도한흰쥐에게淸氣化痰丸을투여한후, 생체지질합성, 항산화기능및전염증성 cytokine의생산을조사했다. 1. 혈장 FFA 농도는대조군과비교하여淸氣化痰丸추출물처리군모두가낮은값을나타내었다. 혈장 TG 농도는대조군보다淸氣化痰丸추출물처리군모두가낮은값을보였으며, 淸氣化痰丸추출물의급여량이증가함에따라감소하였다. 혈장 Total cholesterol 농도와 LDLcholesterol 농도는淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다유의하게낮았다. HDL-cholesterol 농도는淸氣 化痰丸추출물처리군이대조군보다높은경향을나타내었다. 2. 간장 Total cholesterol 농도및 TG 농도는淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다유의하게낮았다. 3. 혈장및간장 TBARS 농도는淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다낮은경향을나타내었다. GSH- Px, SOD 및 CAT 활성치는淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다높은경향을나타내었다. 4. 혈장 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 농도는淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다낮은경향을나타내었다. 혈장 IL-10 농도는淸氣化痰丸추출물처리군에서높은경향을나타내었다. 혈장 NO 농도는淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다낮은값을나타내었다. 5. Apo-B 및 Apo-E 는정상군과비교하여비만군이높은 gene expression 을나타내었으나, 비만군간에서는대조군과비교하여淸氣化痰丸추출물처리농도가증가함에따라낮은 gene expression 을나타내었다. Leptin gene expression 은정상군보다비만군들모두가높은 gene expression 을나타내었다. β-actin expression에대한 Apo-B 의 gene expression 비율은淸氣化痰丸추출물처리군모두가대조군보다유의하게낮은값을나타내었다. β-actin expression에대한 Apo-E의 gene expression 비율은 300 mg/kg 淸氣化痰丸추출물처리군이대조군보다유의하게낮은값을나타내었다. 이상의결과를종합해보면淸氣化痰丸추출물이생체지질합성, 항산화기능및전염증성 cytokine 의생산에있어서생체기능에긍정적으로작용하여비만억제, 치료및비만과관련된생체대사이상의예방과치료에효과적일것으로사료되며, 추후임상현장에서보다체계적인연구가필요할것으로생각된다. 참고문헌»»» 1. 한방재활의학과학회. 한방재활의학. 서울 : 군자출판사. 2003: 379, 357-9, 393-6. 2. 한미의학편집부. 비만관리를위한건강길잡이. 서울 : 한미의학. 2003:29-57. 3. Ali SR, Holzer RG, Osterreicher CH, Takahashi H, Karin M. Dietary and genetic obesity promote liver inflammation and tumorigenesis by enhancing IL-6 and TNF 10 J Korean Med Rehab 2014;24(2):1-13

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