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현석 오
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1 생약학회지 Kor. J. Pharmacogn. 44(2) : (2013) HaCaT 각질형성세포에서홍조류인단박 (Ceramium boydenii) 의 STAT1 활성억제를통한 MDC/CCL22 생성억제효과 강나진 1 강경진 2 한상철 2 현은아 2 구동환 1 고영상 1,2 고미희 3 현진원 1,2 강희경 1,2 유은숙 1,2 * 1 제주대학교일반대학원의생명 신약개발학과, 2 제주대학교의학전문대학원의학과, 3 제주생물종다양성연구소 Ceramium boydenii, a Red Alga, Inhibits MDC/CCL22 Production Via Suppression of STAT1 Activation in HaCaT Keratinocyte Na-Jin Kang 1, Gyeung-Jin Kang 2, Sang-Chul Han 2, Eun-A Hyun 2, Dong-Hwan Koo 1, Young-Sang Koh 1,2, Mi-Hee Ko 3, Jin Won Hyun 1,2, Hee-Kyoung Kang 1,2, and Eun-Sook Yoo 1,2 * 1 Department of Biomedicine & Drug Development, Jeju National University, Jeju , Korea 2 Department of Medicine, Jeju National University School of Medicine, Jeju , Korea 3 Jeju Biodiversity Research Institute, Jeju Technopark, Jeju , Korea Abstract Ceramium boydenii belongs to euphorbia humitusa of red algae, and is distributed along the coast of Jeju island. This study was conducted to examine the anti-inflammatory effect and action mechanism of C. boydenii in the human keratinocyte cell line HaCaT. The 80% EtOH extract of C. boydenii inhibits the production of MDC (macrophage derived chemokine), an inflammatory chemokine, induced by IFN-γ and TNF-α in a concentration dependent manner. It also suppressed the phosphorylation and nuclear translocation of STAT1, a key transcription factor in IFN-γ and TNF-α signaling pathway, at the effective concentrations. These results suggest that C. boydenii demonstrates the anti-inflammatory activity via the suppression of STAT1 activation and has the significant value as an anti-inflammatory source. Key words Ceramium boydenii, HaCaT, MDC, STAT1 Chemokine 은작은분자의단백질로서, 백혈구상호전달조절에의해면역반응과염증반응에서주요한역할을한다고알려져있다. 이러한 chemokine 은아미노산서열에서 2 가지 cystein 그룹의상대적인위치에따라 4 가지하부그룹 (CC-, CXC-, CX₃C-, C- chemokines) 으로나누어진다. 1-3) Macrophage-derived chemokine (MDC/CCL22) 은 CC chemokine receptor 4 (CCL4) 에결합하는 CC chemokine 에속하며, T helper 2 cell (Th2 cell) 에선택적으로발현한다. MDC 와 CCL4 의상호작용은악화된조직으로 Th2 세포의이주에서중요한역할을하며, 염증부분으로 Th2 lymphocyte 의이주를선택적으로조절한다. 특히염증성피부질환인아토피피부염환자에서 MDC 의혈청또는혈장농도가상당히높았고, 아토피피부염의심각성에따라 MDC 의농도가증가된것이보고되었다. 이와일치하게, 아토피피부염환자의손상된피부에서각질형성세포에의해 MDC * 교신저자 ( ) : eunsyoo@jejunu.ac.kr (Tel): 가발현이증가되었다고보고되었다. 3-5) 각질형성세포는표피장벽의주된요소로서, 세포에자극이들어왔을때선천면역반응에서패턴인식수용체, cytokine, chemokine 과같은선천면역 mediator 로부터외부의이물질또는위험자극을인식하는필수적인역할을한다. 6-8) Interferon-γ (IFN-γ) 는항바이러스면역, 세포사멸, 세포주기퇴화를포함한다양한세포활성을조절하는 cytokine 이다. 피부에서 IFN-γ 는염증과면역반응에서중추적인역할을한다. 특히, 많은 chemokine 의발현을유도한다. 9) Tumor necrosis factor (TNF) 는형질전환세포로부터유도될수있는세포독성반응과동물에서종양의퇴행을유도하는기능을기반으로한다기능적 cytokine 이다. 이러한 TNF 는면역, 염증, 인슐린저항성, 혈관형성등을촉진한다고알려져있다. 10) IFN-γ 와 TNF-α 는각질형성세포에노출되었을때많은양의 cytokine 과 chemokine 의발현을유도하고, 피부에서염증부위로단핵구 /T 세포의침투를증가시킨다고보고되었다. 11) 154

Vol. 44, No. 2, 2013 155 Fig. 1. A photo of Ceramium boydenii. Janus kinase/signal transducer and activator of transcription (Jak/STAT) 신호전달기전은면역기능, 세포성장인자, 세포분화등을포함하여다수의중요한생물학적인반응을조절한다.

2 Vol. 44, No. 2, Fig. 1. A photo of Ceramium boydenii. Janus kinase/signal transducer and activator of transcription (Jak/STAT) 신호전달기전은면역기능, 세포성장인자, 세포분화등을포함하여다수의중요한생물학적인반응을조절한다. Jak/STAT 신호전달기전은자극에의하여 cytokine이 corresponding 수용체와결합했을때활성화되고, 면역반응과관련된타겟유전자에대해세포표면에서수용체로부터신호전달이일어난다. 활성화된 STAT 단백질은세포질에서핵으로이동되고, 그들의프로모터와결합하여자가조절메커니즘에의해그들자신의발현을촉진함으로써다양한염증과관련된유전자 (Thymus and activation regulated chemokine; TARC/CCL17, intercellular adhesion molecule 1; ICAM-1, Suppressor of cytokine signaling proteins; SOCSs 등 ) 의발현을직접적으로유도한다 ) 홍조식물문비단풀과 (Ceramiaceae) 에속하는단박 (Ceramium boydenii) 은우리나라서남해안과제주도에분포하고, 조간대의모자반류나다른해조류에착생하여서식한다 (Fig. 1). 단박은주로한천원료로사용한다고알려져있다. 14) 단박의약리활성이나활성성분에대해서는거의알려진바없으며, 2008년특허에서 peroxisome proliferatoractivated receptor (PPAR) 를조절하여비만과당뇨를예방또는치료가능하다고보고되었다. 15) 본연구팀은제주도연근해에서채취가능한해조류의 80% 에탄올추출물에대하여 HaCaT 각질형성세포에서염증성 chemokine인 MDC 생성억제효과를지속적으로검색하고있다. 그결과, 단박추출물의효과가우수하여그활성기전을밝히고자본연구를수행하였다. 재료및방법 시약및기기 Human interferon-γ (hifn-γ, recombinant E. coli), tumor necrosis factor-α, fetal bovine serum (FBS) 과 Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM) 은 Invitrogen (Grand Island, NY, USA) 에서구입하였다. 또한, MDC 생성은 Human MDC ELISA duoset kit(r&d system, St.Louis, MO, USA) 를구입하여사용하였다. Anti- STAT1 항체는 Becton Dickison (Sandiego, CA, USA) 에서구입하였고, Anti-phospho-STAT1 항체는 Cell signaling (Beverly, MA, USA) 에서구입하여사용하였다. 그리고 β- actin은 Sigma사로부터구입하여사용하였다. 또한기타시약들은모두특급시약을사용하였다. 실험재료 본연구에사용한해조류 80% 에탄올추출물시료는제주생물종다양성연구소에서분양받았으며, 단박추출물 (JBRI 20349) 은처음 dimethyl sulfoxide (DMSO) 에녹이고세포배양배지로농도에맞게희석하여사용하였다. 세포배양 사람각질형성세포주인 HaCaT 세포는제주대학교의학전문대학원조문제교수로부터분양받았고, 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS; Gibco BRL) 과 1% 의 Antibiotic-Antimycotic (GIBCO, Grand Island, NY) 를첨가한 Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM, USA) 을세포배양액으로사용하여 37 o C, 5% CO 2 로유지되는배양기에서배양하였다. 세포의계대배양은세포배양접시 (culture dish) 면적의약 80% 정도를차지할때까지배양한후, 0.05% 의 trypsin을사용하여세포를배양플라스크로부터분리하였다. 그다음 10% FBS와 1% Antibiotic- Antimycotic이포함된배양액으로 trypsin을중화한후, 원심분리하여계대배양하였다. 세포생존율평가 단박추출물에의한세포독성정도를평가하기위하여 HaCaT 각질형성세포 ( cells/ml) 를 96 well plate에동일하게분주한후세포를 37 o C, 5% CO 2 항온기에서 18시간동안배양하였다. 그다음기존의배지를제거하고, IFN-γ와 TNF-α (10 ng/ml) 와 serial dilution 한 3.13, 6.25, 12.5, 25 µg/ml 농도의단박추출물을 no serum DMEM 배지에세포에동시처리하여 24시간동안배양하였다. 배양이끝난후, 각각의배지에 MTT solution (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 을 10 µl씩넣고 2시간동안 37 o C, 5% CO 2 항온기에서배양하였다. 그다음각 well의배지를제거하고, 각 well당 DMSO를 50 µl씩넣고, VersaMax ELISA microplate reader (Molecular Devices, CA, USA) 로 540 nm에서흡광도를측정하였다. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) HaCaT 각질형성세포 ( cells/ml) 를 96 well plate에접종하고, 세포를 18시간동안 37 o C, 5% CO 2 배양기에서전배양하였다. 그후배지를제거하고 IFN-γ와 TNF-α (10 ng/ml) 와단박추출물 (3.13, 6.25, 12.5, 25 µg/ml) 을 no serum DMEM 배지에희석하여동시처리하였고, 24시간동안배양하였다. 세포배양액내 MDC 생성은각 well의상층액을이용하여 human MDC/CCL22 ELISA kit를사용

3 156 Kor. J. Pharmacogn. 하여측정하였다. 표준곡선 (standard curve) 은 human MDC 를이용하여 1,000 pg/ml에서부터 1/2씩순차적으로희석하였다 (serial dilution). 결과값측정시광학밀도는 450 nm 파장에서 VersaMax ELISA microplate reader로분석하였다. Western Blot Analysis HaCaT 각질형성세포를 60 mm culture plate에 cells/ml로접종하여 10% FBS, 1% Antibiotic-Antimycotic이있는 DMEM 배지를이용하여 18 시간동안전배양하였다. 배양후배지를제거하고 plate에각각단박추출물 3.13, 6.25, 12.5 µg/ml의농도로처리된배지를처리하여 2시간동안전처리하였다. 그후각조건에맞게 IFN-γ와 TNF-α (10 ng/ml) 를처리하여 15분동안자극하였다. 이렇게처리된세포를차가운 phosphate buffered saline (PBS) 를사용하여 2번세정후, protein lysis buffer (basic lysis buffer: 50 mm Tris-HCl (ph7.5), 150 mm NaCl, 1% Nonident P-40, 2 mm EDTA, 1 mm EGTA, 1 mm NaVO 3, 10 mm NaF, 1 mm DTT, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 25 µg/ml leupeptin) 를처리하고얼음위에서 30분동안 lysis하였다. 그후 cell lysates 을튜브에담고, 원심분리 (15000 RPM, 4 o C, 15분 ) 하여 cell down한후상등액만분리하여 western blot analysis에사용하였다. 단백질농도는 bovine serum albumin (BSA) 을사용하여표준화하였고, 단백질정량은 bradford assay (Bio-rad, Herculers, CA, USA) 를사용하여측정하였다. 동량의 lysate 를 8% mini gel sodium dodecyl sulfate poly-acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 에 loading하여변성분리한후, PVDF membrane (Bio-Rad) 에 100mA로약 2시간동안이식 (transfer) 하였다. 단백질이옮겨진 membrane 은 5% skim milk blocking buffer (5% skim milk+tbs+0.1% Tween 20) 로 1시간동안실온에서 blocking하였고, 이어서각각의 1차항체 (STAT1 1:1000, pstat1 1:1000, β-actin 1:5000) 를 1% BSA/TTBS (TBS+0.1% Tween 20) 용액에희석하여처리한다음상온에서 30분반응시킨후 4 o C, overnight (O/N) 하였다. 그다음상온에서 20분반응시켰고 TTBS로 10분씩 3회세정한후, 2차항체로는 horseradish peroxide (HRP) 가결합된항-래빗 (anti-rabbit IgG) 과항-마우스 (anti-mouse IgG) 항체를 1:5000으로희석하여처리한후실온에서 1시간 30분동안반응시켰다. 면역반응이완료된 membrane은 TTBS로 5회세정후, WEST-ZOL plus western blot detection system (intron Biotechnology, Korea) 을이용하여발광시킨다음 X-ray 필름에감광시켜확인하였다. 레이저초점주사현미경 (Confocal Laser Scanning Microscopy) 검사 HaCaT 각질형성세포 ( cells/ml) 를 6-well plate에유리커버글라스를넣고접종하여 18시간동안전배양하였다. 그후, 단박추출물을 6.25, 12.5 µg/ml 의농도로 2시간전처리한다음 IFN-γ와 TNF-α (10 ng/ml) 로세포를 30분동안자극하였다. 그다음배지를제거한후에세포가있는유리커버글라스에 3.5% paraformaldehyde (PFA) 를넣어 30분동안세포를고정시켰고, 과량의 aldehyde 를제거하기위하여 0.1M glycine을 15분간처리하였다. 그다음 0.1% Triton X-100을 10분동안처리하였고, 3% BSA/0.1% triton X-100/PBS 를처리하여 1시간동안반응시켰다. 세포와항체를반응시키기위하여 1차항체인 anti- STAT1 를 1:200으로희석하여처리하여 4 o C에서 overnight 하였다. 다음으로는세포를세정한후에, DyLight488 conjugated donkey anti-rabbit secondary antibody를 1:300 으로희석하여처리하여 30분동안어두운곳에서반응시켰다. 그다음세포를세정하였고, 핵염색과유리커버글라스에 mounting을위하여 VECTASHIELD Mounting Media with DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) 을처리하였고, 매니큐어를사용하여커버글라스를 sealing 하였다. FV500 Confocal microscopy (OLYNPUSM Tokyo, Japan) 로형광반응을관찰하였다. 통계처리 본연구의통계처리는 Student s t-test 분석을이용하여검정했으며, 값은평균과표준편차로나타냈다. Western blot에서측정한 density는 Image J을사용하여확인하였다. 결과및고찰 각질형성세포에서세포생존능에대한단박추출물의효과 세포생존능을측정하는것은조직배양과세포독성연구에서중요하다. 16) 세포에단박추출물을처리하여활성평가에들어가기앞서, 단박추출물이세포독성에의하여염증성 chemokine 생성이억제될가능성을배제하기위해 MTT assay 방법을사용하였다. 세포에 IFN-γ 와 TNF-α (10 ng/ml) 와함께단박추출물을각각의농도별로처리하여 24 시간동안배양한후 MTT assay 로세포생존능을측정하였다. 그결과단박추출물을처리한각각의농도에서세포에서독성이나타나지않음을확인할수있었다 (Fig. 2- A). 따라서이후의활성평가실험은 25 µg/ml 이하의농도에서실시하였다. 즉 25 µg/ml 이하의농도에서나타나는단박추출물의활성은세포사멸에의해 chemokine 생성이감소하여나타나는것이아니라단박추출물의고유한효과에의하여나타나는것임을의미한다. 각질형성세포에서 IFN-γ 와 TNF-α 로유도되는 MDC 생성에대한단박추출물의효과 MDC/CCL22 는수지상세포, B 세포, 대식세포, 각질형성세포, 그리고상피세포에서지속적으로생성되며, 특히건강한피부와비교했을때아토피피부염의표피층인각질형성세포에서 MDC/CCL22 를발현한다. 17,18) 특히 IFN-γ 또는 IFN-γ 와 TNF-α 로자극한각질형성세포에서 MDC 생성이증가한다고보고되었다. 19,20)

Vol. 44, No. 2, 2013 157 염증성 chemokine 인 MDC 에대한단박추출물의억제효능을확인하기위하여 HaCaT 각질형성세포에단박추출물 (3.13, 6.25, 12.5, 25 µg/ml) 과 IFN-γ 와 TNF-α (10 ng/ml) 을처리하여 24 시간동안배양하고, 배지에서 MDC 의농도를 ELISA 로측정하였다.

특히 12.5, 25 µg/ml 의단박추출물을처리한그룹에서는 IFN-γ 와 TNF-α (10 ng/ml) 만처리한그룹과비교하였을때, 12.5 µg/ml 에서 222.9 pg/ml, 25 µg/ml 에서 176.3 pg/ml 의 MDC 생성이확인되어단박추출물로인해 MDC 생성이감소된것을확인할수있었다 (Fig. 2-B).

4 Vol. 44, No. 2, 염증성 chemokine 인 MDC 에대한단박추출물의억제효능을확인하기위하여 HaCaT 각질형성세포에단박추출물 (3.13, 6.25, 12.5, 25 µg/ml) 과 IFN-γ 와 TNF-α (10 ng/ml) 을처리하여 24 시간동안배양하고, 배지에서 MDC 의농도를 ELISA 로측정하였다. 그결과, IFN-γ 와 TNF-α (10 ng/ ml) 와단박추출물을각농도별로 (3.13, 6.25, 12.5, 25 µg/ ml) 동시처리하였을때, IFN-γ 와 TNF-α (10 ng/ml) 만처리한그룹에서 pg/ml 의 MDC 가생성된반면, 단박추출물을처리한그룹에서는 MDC 의생성이단박추출물에대하여농도의존적으로감소하는경향을보였다. 특히 12.5, 25 µg/ml 의단박추출물을처리한그룹에서는 IFN-γ 와 TNF-α (10 ng/ml) 만처리한그룹과비교하였을때, 12.5 µg/ml 에서 pg/ml, 25 µg/ml 에서 pg/ml 의 MDC 생성이확인되어단박추출물로인해 MDC 생성이감소된것을확인할수있었다 (Fig. 2-B). 관련성있는연구로서, Furukawa 등이발표한논문에서아토피피부염환자에서분리한말초혈액의단핵구세포에 서항알러지약물인 olopatadine hydrochloride 가 MDC 생성을억제하였으며, 21) 2012 년김등은 IFN-γ 와 TNF-α 로자극된 HaCaT 각질형성세포에서 Inulae Flos( 선국화 ) 가 MDC 생성을억제한다고보고하였다. 이러한결과들은면역세포에서염증관련 chemokine 인 MDC 생성을감소시키는것이알러지성질환을개선할수있음을시사한다. 각질형성세포에서 IFN-γ 와 TNF-α 로유도되는 STAT1 의활성화에대한단박추출물의효과 IFN-γ 와 TNF-α 를세포에자극시켰을때 STAT1, Nuclear factor-κb (NF-κB) 등과같은다양한신호전달경로를활성화시키며. 23,24) 이러한 STAT, NF-κB 의활성화가 MDC 등의염증성인자생성에대한주기전으로알려져있다. 25) 단박추출물에의한농도의존적인 MDC 생성억제가 STAT1 신호전달기전과관련이있는지확인하기위하여 STAT1 인산화를 western blot 으로확인하였다. HaCaT 각질형성세포에 IFN-γ 와 TNF-α (10 ng/ml) 를처리했을때, 인산화된 STAT1 이의존적으로 Fig. 2. Effect of Ceramium boydenii on the protein production of MDC in HaCaT human keratinocytes. (A) Cells were preincubated for 18 hr, and cell viability was determined from the cells treated with of Ceramium boydenii (3.13, 6.25, 12.5, 25 µg/ml) for 24 hr. Cell viability was determined by MTT assay. (B) Cells ( cells/ml) were pre-incubated for 18 hr, and MDC production was determined from the culture supernatant of cells stimulated by IFN-γ and TNF-α (10 ng/ ml) in the presence of Ceramium boydenii (3.13, 6.25, 12.5, 25 µg/ml) for 24 hr. MDC production was measured by ELISA. The measurements of MDC were done in duplicate. Data are presented as the mean±sd of three experiments. *p<0.05, **p<0.01 compared to the IFN-γ and TNF-α alone. Fig. 3. Effect of Ceramium boydenii on the phosphorylation and levels of STAT1 in IFN-γ and TNF-stimulated HaCaT human keratinocytes. (A) Cells ( cells/ml) were preincubated for 18 hr. Expression of STAT1 phosphorylation was determined in cells stimulated by LPS (1 µg/ml) for the indicated times. The phosphorylation of STAT1 proteins were determined by Western blotting of whole cell lysates with the indicated antibodies. (B) cells ( cells/ml) were pretreated with Ceramium boydenii (3.13, 6.25, 12.5 µg/ml) for 2 hr. Cells were then stimulated with IFN-γ and TNF-α (10 ng/ ml) in the presence of Ceramium boydenii. The phosphorylation of Tyr701 within the sequence of STAT1 was determined in cells stimulated by IFN-γ and TNF-α for 15 min. The phosphorylation of STAT1 and the level of STAT1 and β-actin proteins were determined by Western blotting of whole cell lysates with the indicated antibodies.

158 Kor. J. Pharmacogn. Fig. 4. Effect of Ceramium boydenii on the Translocation of STAT1 in IFN-γ and TNF-α-stimulated HaCaT human keratinocytes. Cells (1.

5 158 Kor. J. Pharmacogn. Fig. 4. Effect of Ceramium boydenii on the Translocation of STAT1 in IFN-γ and TNF-α-stimulated HaCaT human keratinocytes. Cells ( cells/ml) were pre-treated with Ceramium boydenii (6.25, 12.5 µg/ml) for 2 hr. Then cells were stimulated with IFN-γ (10 ng/ml) and TNF-α (10 ng/ml) in the presence of Ceramium boydenii for 30min. Immunofluorescence stain of STAT1 was stained with FITC-rabbit anti-mouse IgG-conjugated 2nd antibody and the fluorescence was identified using confocal microscopy (FV500, OLYMPUS) and the images were acquired at constant PMT, gain, offset, magnification (40x oil immersion objective with zoom factor of 2.5) and resolution. 증가하였으며, IFN-γ와 TNF-α를 처리한지 15분에 인산화 가 가장 증가한 것을 확인하였다(Fig. 3-A). HaCaT 각질형 성세포에 단박 추출물을 6.25, 12.5, 25 µg/ml을 처리하여 2시간 동안 배양하고, IFN-γ와 TNF-α (10 ng/ml)를 15분 동안 처리한 후 단백질을 분리하여 STAT1의 인산화 정도 를 확인하였다. 결과 IFN-γ와 TNF-α 처리 후 증가된 STAT1 의 인산화는 단박 추출물 처리에 의해 농도 의존적 감소를 나타내었다(Fig. 3-B). 2011년 Kang 등은 제주 감귤 미숙과 추출물이 IFN-γ와 TNF-α로 자극된 HaCaT 각질형성세포에서 STAT1 인산화 의 억제를 통해 MDC의 생성을 저하시킨다고 보고하였으 며,26) 아토피 피부염 동물모델에서 감귤미숙과 추출물을 피 부에 도포하였을 때 다양한 아토피 증상들이 개선되었다고 26) 보고한 바 있다. 이러한 연구들로부터 염증 유발의 신호 전달경로 중 하나인 STAT1을 염증성 질환 개선 소재 탐색 의 새로운 타겟으로 생각해볼 수 있다. 각질형성세포에서 IFN-γ와 TNF-α로 활성화되는 STAT 의 핵 내 전이에 대한 단박 추출물의 효과 STAT은 핵 세 포질 수송 전사 인자로서, 활성화되지 않은 STAT1은 세포 질 내에 불활성 전구체의 형태로 격리되어 있다가 활성화 되면 tyrosine 인산화의 결과로 핵 내로 이동하여 DNA에 결합하는 친화력이 증가한다. 즉 STAT1의 DNA 결합이 증 가하면 핵에 축적되어 다양한 염증과 관련된 유전자 발현 27,28) 을 유도한다. 앞선 결과에서 단박 추출물은 IFN-γ와 TNF-α의 자극으 로 유도된 STAT1 인산화를 감소시켰다(Fig. 3). 이러한 STAT1 인산화 감소가 STAT1 단백질의 핵 내 전이 감소로 결과하는지 확인하기 위하여 공초점 현미경을 이용한 간접 면역 형광법으로 영상을 분석하였다(Fig. 4). 외부 자극이 없 는 경우, STAT1 단백질이 세포질에 발현되었고, IFN-γ와 TNF-α(10 ng/ml) 처리 후 핵 내부에 STAT1 단백질 형광 이 나타나는 것을 확인하였다. 단박 추출물을 전처리 한 경 우, IFN-γ와 TNF-α (10 ng/ml)에 의한 STAT1 단백질의 핵 내 전이가 감소된 것을 확인할 수 있었다. 특히, STAT1 인 산화를 강하게 억제했던 농도인 6.25, 12.5 µg/ml에서(fig 3) STAT1이 세포질에 강한 형광을 나타낸 것으로 보아 단 박 추출물의 STAT1 인산화 억제는 핵 내 전이감소로 연결 된다는 것을 알 수 있다. 결 론 본 연구에서는 단박 추출물의 염증억제효과 및 그 활성기

6 Vol. 44, No. 2, 전을밝히고자각질형성세포인 HaCaT 세포에서염증성 chemokine 생성억제활성을평가하였다. 단박추출물은 IFN-γ 와 TNF-α 자극으로유도되는 MDC 생성을농도의존적으로억제하였으며, 이와연결되는신호전달경로인 STAT1 의인산화및핵내전이를일관성있게억제하였다. 이러한결과는단박추출물이 STAT1 경로억제를통해염증억제효과를발휘하며, 단박추출물이염증성피부질환의예방및치료에유용한소재가될수있음을시사한다. 사 이논문은교육과학기술부의재원으로한국연구재단의지원을받아수행된연구이며 (NRF-C1ABA ) 이에감사드립니다. 사 인용문헌 1. Vestergaard, C., Kirstejn, N., Gesser, B., Mortensen, J. T., Matsushima, K. and Larsen, C. G. (2001) IL-10 augments the IFN-gamma and TNF-alpha induced TARC production in HaCaT cells: A possible mechanism in the inflammatory reaction of atopic dermatitis. J. Dermatol. Sci. 26: Kagami, S., Saeki, H., Komine, M., Kakinuma, T., Nakamura, K., Tsunemi, Y., Sasaki, K., Asahina, A. and Tamaki, K.(2006) CCL28 production in HaCaT cells was mediated by different signal pathways from CCL27. Exp. Dermatol. 15: Kwon, D. J., Bae, Y. S., Ju, S. M., Goh, A. R., Youn, G. S., Choi, S. Y. and Park, J. (2012) Casuarinin suppresses TARC/ CCL17 and MDC/CCL22 production via blockade of NFkappaB and STAT1 activation in HaCaT cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417: Qi, X. F., Kim, D. H., Yoon, Y. S., Li, J. H., Jin, D., Teng, Y. C., Kim, S. K. and Lee, K. J. (2009) Fluvastatin inhibits expression of the chemokine MDC/CCL22 induced by interferon-gamma in HaCaT cells, a human keratinocyte cell line. Br. J. Pharmacol. 157: Hashimoto, S., Nakamura, K., Oyama, N., Kaneko, F., Tsunemi, Y., Saeki, H. and Tamaki, K. (2006) Macrophagederived chemokine (MDC)/CCL22 produced by monocyte derived dendritic cells reflects the disease activity in patients with atopic dermatitis. J. Dermatol. Sci. 44: Lee, H. P., Choi, Y. J., Cho, K. A., Woo, S. Y., Yun, S. T., Lee, J. T., Kim, H. J., Lee, K. H. and Kim, J. W. (2012) Effect of spa spring water on cytokine expression in human keratinocyte HaCaT cells and on differentiation of CD4(+) T cells. Ann. Dermatol. 24: Lee, H. M., Shin, D. M., Yuk, J. M., Shi, G., Choi, D. K., Lee, S. H., Huang, S. M., Kim, J. M., Kim, C. D., Lee, J. H. and Jo, E. K. (2011) Autophagy negatively regulates keratinocyte inflammatory responses via scaffolding protein p62/ SQSTM1. J. Immunol. 186: Kim, H., Han, T. H. and Lee, S. G.(2009) Anti-inflammatory activity of a water extract of Acorus calamus L. leaves on keratinocyte HaCaT cells. J. Ethnopharmacol. 122: Madonna, S., Scarponi, C., De Pita, O. and Albanesi, C.(2008) Suppressor of cytokine signaling 1 inhibits IFNgamma inflammatory signaling in human keratinocytes by sustaining ERK1/2 activation. FASEB J. 22: Guo, D., Dunbar, J. D., Yang, C. H., Pfeffer, L. M. and Donner, D. B.(1998) Induction of Jak/STAT signaling by activation of the type 1 TNF receptor. J. Immunol. 160: Ju, S. M., Song, H. Y., Lee, S. J., Seo, W. Y., Sin, D. H., Goh, A. R., Kang, Y. H., Kang, I. J., Won, M. H., Yi, J. S., Kwon, D. J., Bae, Y. S., Choi, S. Y. and Park, J. (2009) Suppression of thymus- and activation-regulated chemokine (TARC/ CCL17) production by 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose via blockade of NF-kappaB and STAT1 activation in the HaCaT cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 387: Hongqin, T., Xinyu, L., Heng, G., Lanfang, X., Yongfang, W. and Shasha, S. (2011) Triptolide inhibits IFN-gamma signaling via the Jak/STAT pathway in HaCaT keratinocytes. Phytother. Res. 25: Furukawa, M., Takaishi, H., Takito, J., Yoda, M., Sakai, S., Hikata, T., Hakozaki, A., Uchikawa, S., Matsumoto, M., Chiba, K., Kimura, T., Okada, Y., Matsuo, K., Yoshida, H. and Toyama, Y. (2009) IL-27 abrogates receptor activator of NF-kappa B ligand-mediated osteoclastogenesis of human granulocyte-macrophage colony-forming unit cells through STAT1-dependent inhibition of c-fos. J. Immunol. 183: 강제원 (1968) 한국동식물도감제 8 권식물편 ( 해조류 ). 문교부. 서울. 15. 김용기, 신운섭, 박갑만 (2008) PPAR 의작용에의해조절되는질환을예방또는치료하기위한약학조성물, PPARã 작용제, PPARα 작용제, PPAR 의작용에의해조절되는질환을예방또는개선하기위한건강식품및약학조성물의제조방법. 대한민국특허청 Jones, K. H. and Senft, J. A. (1985) An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide. J. Histochem Cytochem. 33: Qi, X. F., Kim, D. H., Yoon, Y. S., Song, S. B., Teng, Y. C., Cai, D. Q. and Lee, K. J. (2012) Bambusae caulis in liquamen suppresses the expression of thymus and activationregulated chemokine and macrophage-derived chemokine in human keratinocytes due to antioxidant effect. Evid Based. Complement. Alternat Med. 2012: ID Hirota, T., Saeki, H., Tomita, K., Tanaka, S., Ebe, K., Sakash-

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