14-TNF-a(dh)nn

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누리 강
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1 Journal of Radiation Industry 5 (3) : 273~277 (11) Review Paper TNF-α, IL-6, IL-8 저해를통한천연약용식물추출물의항염증특성 김용수 권희정 박종석 임윤묵 노영창 * 한국원자력연구원정읍방사선과학연구소방사선공업환경연구부 Anti-inflammatory Activity of Herbal Extracts through Inhibition of TNF-α, IL-6 and IL-8 Yong-Soo Kim, Hui-Jeong Gwon, Jong-Seok Park, Youn-Mook Lim and Young-Chang Nho* Radiation Research Division for Industry & Environment, Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, Jeongeup 5-185, Korea Abstract - This study evaluated the cytotoxicity and anti-inflammatory activities of natural herbal extracts including Houttuynia cordata and Eucommia ulmoides against human mast cell (HMC-1). Houttuynia cordata (HC) and Eucommia ulmoides (EU) were extracted with distilled water (at 75 C) and then freeze-dried for 5 days. Finally, the mixture of HC and EU were sterilized by γ-rays irradiation. Cytotoxicity of the mixture against HMC-1 cell was measured using cell counting kit-8(cck- 8) assay. In addition, inflammatory mediator cytokines such as TNF-α, IL-6 and IL-8 were evaluated by ELISA kit on the HMC-1 cells with calcimycin A23187 and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). The results showed that mixture of HC and EU had no cytoxicity and reduced TNF-α, IL-6, IL-8 response on HMC-1 cells. Key words : Houttuynia cordata, Eucommia ulimoides, Cytotoxicity, Cytokine 서 아토피성피부염은다인성인만성피부질환으로생후몇년내에가장흔하게발생하는소아기질환이다. 최근여러역학연구결과에따르면, 지난 3년간에걸쳐서산업화된국가에서아토피성피부염발병율이증가됨을보이고있다. 아토피성피부염과다른알레르기질환의관련성도광범위하게보고되었는데, 아토피성피부염의조기발생은천식의발생위험증가와관련이되었으며많은 론 * Corresponding author: Young-Chang Nho, Tel , Fax , . ycnho@kaeri.re.kr 연구자들이아토피성피부염을소위 아토피행진 의첫번째임상발현으로제시하였다 (Shultz and Hanifin 2). 한편아토피성피부염의진행이나발생에영향을미치는요인에대해서는완전히밝혀져있지않다. 아토피성피부염의원인은아마도유전적변이와환경적자극에의한피부과민성을주원인으로보고있다. 습진성병변, 소양증, 경피수분손실및피부건조증의증가를특징으로한다. 최근의연구에서피부장벽의기능이상과아토피성피부염의중증도와의관계가아토피성피부염의치료에중요성이있음을보여주고있다. 손상된피부장벽은피부를약하게하여항원의침투가용이하게하며, 항원세포와항원의상호작용을증가시킨다. 이러한현상이아 273

2 274 김용수 권희정 박종석 임윤묵 노영창 토피성피부염을유발한다고보고되어있다 (Elias et al. 1999). 아토피성피부염에대한현재까지알려진치료방법은면역억제제, 스테로이드제, 항히스타민제가사용되고있으나, 이들의장기간사용시부작용이문제점으로대두되고있다 (Furukawa et al. 4). 예로부터일부동양권나라에서는어성초, 두충등천연약용식물추출물을이용하여아토피성피부염을치료하는데사용되어왔다. 어성초 (Houttuynia cordata Thunb.) 는삼백초과의다년생초본으로약모밀 (Houttuynia cordata Thunberg) 로불려지며, 그늘지고물기가많은곳에서잘자라고주로한국과중국, 일본, 히말라야, 북미그리고자바에분포되어있다. 어성초라는명칭은잎에서특유의비린내가나기때문에붙여진것으로다양한생리활성물질들은함유하고있어해독및이뇨에효과가있으며, 백일해, 기관지염, 간염, 폐렴등의증상완화에효과가있다고알려져있다. 특히어성초는아토피, 항알레르기등피부질환의개선목적으로많이사용되어왔으며, 최근에는건강보조식품으로써그사용이증가하고있다 (Shin et al. 6). 예로부터민간에서는발효엑기스를암치료등에이용하여왔으며, Seo 등이어성초핵산추출물이암세포주에미치는항암효과에대해보고하였다 (Seo et al. 3). 그외에도항돌연변이효과 (Choi et al. 1994), 항균효과 (Song et al. 3) 및어성초즙과분말이고지방, 고콜레스테롤혈증쥐의혈청지질및지질성분에미치는영향 (Sung et al. 1998) 등에대한보고가다수발표되었다. 두충 (Eucommia ulimoides) 은두충나무과에속하는 1 과 1속 1종의낙엽교목으로서높이 15 m, 지름 cm까지자란다. 원산지는중국의호북, 사천성등지로알려져있으며우리나라중부이남지역어디에서나잘서식하며특히계곡이나산녹지대또는토질이좋고수분이적절한곳에서잘자라며약용가치가높아전국적으로많이재배되고있다. 두충및두충차의약리활성에관한연구로는활성산소종의소거작용 (Hsieh et al. ) 및항산화효과 (Yen et al. ) 가보고되고있으며콜라겐합성을촉진시키는효과 (Li et al. 1998), 알파글루코시다아제를억제하는기전에의거한항당뇨효과 (Watanabe et al. 1997), 암발생저해효과 (Nakamura et al. 1997), 항보체효과 (Oshima et al. 1998) 등이보고되고있다. 이처럼천연약용식물의효능이입증되고있으나각약용식물의혼합물에대한세포독성평가및아토피피부염완화및치료에관한자세한보고는없는실정이다. 따라서본연구에서는이들각각을열수추출한뒤, cell counting kit-8 (CCK-8) assay를통해추출액의세포독성및사이토카인을비교측정하여, 향후아토피성피부염 완화및치료에활용해보고자하였다. 추출물들의세포독성및사이토카인을측정하기위해비만세포 (HMC-1) 를사용하였다. 1. 시약및재료 재료및방법 Cell counting kit-8 (CCK-8) 은 Dojindo사 (Kumamoto, Japan) 제품을이용하였다. Cell culture -dish, 96-well plate, 24-well plate는 NUNC사 (Naperville, IL, USA) 제품을이용하였고, Iscove s Modified Dulbecco s Medium (IMDM), Dulbecco s phosphate Bufferd saline (DPBS), Penicillin Streptomycin, Fetal Bovine Serum (FBS), Pen Strep- Penicillin Streptomycin은 GIBCO BRL (Grand Island, NY, USA) 제품을이용하였다. Calcimycin A23187, PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) 은 Sigma-Aldrich co. (St. Louis, Mo, USA) 제품을이용하였다. Human TNF-α, IL-6, IL-8 ELISA kit는 R&D system (Minneapolis, MN USA) 제품을이용하였다. 어성초와두충은 ShinHeung science (Daejeon, Korea) 를통해서구입하여사용하였다. 2. 추출물제조방법 추출용매로는 3차증류수를이용하였다. 어성초, 두충을각각 1 :, 8 : 2, 5 : 5, 2 : 8, : 1의조성비율로 3차증류수 1l를가하여 75 C 에서 24시간동안열수추출하였다 (Table 1). 여기서얻은추출물을냉동건조 (-55 C, 5일 ) 시켜분말로만든후 25 kgy (1 kgy hr -1 ) 로방사선멸균하였다. 3. 세포배양 비만세포 (HMC-1) 는한국세포주은행 (Seoul, Korea) 으로부터구입하였고, 세포배양액은 HMC-1 cell을 IMDM 에 1% FBS, unit ml -1 의 penicillin과 unit ml -1 의 streptomycin을첨가한것을사용하였다. 배양은배양기를이용하여 37 C, 5% CO 2 상태를유지하였다. Table 1. Composition of herbal extracts mixtures Group Houttuynia cordata Eucommia ulmoides I 1 II 8 2 III 5 5 IV 2 8 V 1

천연약용식물추출물의항염증특성 275 4. 세포독성실험추출물의세포독성여부확인은 CCK-8 assay를이용하여측정하였다. HMC-1 cell을 96-well plate에 1 1 5 cells well -1 이되도록분주하고 37 C, 5% CO 2 상태로 24 시간배양하였다. 배양후 96-well plate에분주된 HMC-1 cell은추출물을 mg ml -1,.

3 천연약용식물추출물의항염증특성 세포독성실험추출물의세포독성여부확인은 CCK-8 assay를이용하여측정하였다. HMC-1 cell을 96-well plate에 cells well -1 이되도록분주하고 37 C, 5% CO 2 상태로 24 시간배양하였다. 배양후 96-well plate에분주된 HMC-1 cell은추출물을 mg ml -1,.3 mg ml -1,.6 mg ml -1, 1.2 mg ml -1, 1.8 mg ml -1, 2.4 mg ml -1, 2.7 mg ml -1, 또는 3mg ml -1 의농도로처리하여 37 C, 5% CO 2 상태로 24시간동안배양한후세포독성을측정하였다. 5. 항염증반응실험비만세포는 24-well plate에 cells well -1 이되도록분주하고 PMA 5 nm ml -1 와 A μm ml -1 을처리한후7시간동안배양후, 세포배양액을취하여사이토카인을측정하였다. 수거된배지는측정전까지 4 C 에서보관하고, TNF-α, IL-6, IL-8 함량은 R&D Systems ELISA kit를사용하여측정하였으며, 각사이토카인의함량은표준물질의반응으로부터얻어진표준곡선을이용하여환산하였다. 응과관계되어있으며, 탈과립을유도하는물질인 PMA 와 A23187에의해비만세포가활성화된다고보고되어있다 (Metcalfe et al. 1981). 특히외부자극으로부터활성화된비만세포는다양한히스타민과프로테아제를분비하여혈관을확장하고, 염증유발물질인다양한사이토카인의분비를자극한다. 비만세포로부터분비되는사이토카인들은알레르기염증의초기와후기반응을유발하고만성염증반응을지속시키는데중요한역할을한다 (Galli et al. 8). 특히활성화된비만세포로부터후천적으로생성되는 leukoreiene, platelet activating factor prostaglandin (PG) 등은혈관투과성과점액분비물을증가시키고, 부종을유발하고, 기도내염증세포의침윤등을유발함으로써실제알레르기천식과직접연관되는것으로알려져있다 (Brown et al. 8). 각추출혼합물이비만세포에미치는세포독성을알아보기위하여실시한실험결과모든그룹에서 3. mg ml -1 의농도에서 79.5% 이상으로독성이없음을나타내었다 (Fig. 1). 5.6 mg ml -1 이상의농도에서는 79% 이하의세포독성을나타났다. 따라서그룹 I, II, III, IV, V은 3. mg ml -1 의농도에서항염증반응실험을진행해야할것으로판단되었다. 결과및논의 1. 추출혼합물의세포독성평가비만세포는알레르기반응의유발에필수적인세포로알려져있다. 비만세포는세포질내과립을풍부하게가진면역세포로서결체조직과점막에존재하며알레르기염증반응에관여한다. 비만세포는 IgE가매개하는면역반 2. 추출혼합물의항염증반응본연구에서열수추출한천연약용식물에의해염증매개물질인사이토카인의생성이억제되는것을확인하였다. TNF-α의경우그룹I, II, III, IV, V의사이토카인저감율은각각 7.7%, 19.1%, 28.8%, 5.%, 62.6% 로두충의함량비율이높아질수록사이토카인의생성이억제되는것을확인하였다 (Fig. 2). 하지만 IL-8의경우, 그룹 I, II, 1 1 Viability (%) Concentration (mg ml -1 ) Fig. 1. Cytotoxicity test of herbal extracts mixtures on HMC-1 cell line.

276 김용수 권희정 박종석 임윤묵 노영창 TNF-α inhibition (%) IL-8 inhibition (%) Fig. 3. Effects of extracts on the production of IL-8 in A23187 and PMA stimulated HMC-1 cells. IL-6 inhibition (%) 9 7 5 3 1 Fig. 2.

Effects of extracts on the production of IL-6 in A23187 and PMA stimulated HMC-1 cells. III, IV, V의사이토카인저감률은각각 51.8%, 46.7%, 35.%, 3.7%, 21.5% 로어성초의함량비율이높아질수록사이토카인의생성이억제되는것을확인하였다 (Fig. 3).

결 본연구에서는열수추출한어성초와두충천연약용식물성분을방사선멸균한후세포독성과항염증작용을측정하였다. 각각의천연약용식물의추출물은효능이입증되었으나각약용식물의혼합물에대해서는독성평가및아토피성피부염에미치는영향에관한보고가없기에본연구를실시하였다. 그결과, 비만세포에서는 3. mg ml -1 이하의농도에서독성이없는것으로나타났고, 항염증반응에서는유의적인값을확인할수가있었다.

4 276 김용수 권희정 박종석 임윤묵 노영창 TNF-α inhibition (%) IL-8 inhibition (%) Fig. 3. Effects of extracts on the production of IL-8 in A23187 and PMA stimulated HMC-1 cells. IL-6 inhibition (%) Fig. 2. Effects of extracts on the production of TNF-α in A23187 and PMA stimulated HMC-1 cells Fig. 4. Effects of extracts on the production of IL-6 in A23187 and PMA stimulated HMC-1 cells. III, IV, V의사이토카인저감률은각각 51.8%, 46.7%, 35.%, 3.7%, 21.5% 로어성초의함량비율이높아질수록사이토카인의생성이억제되는것을확인하였다 (Fig. 3). 황백피와두충을단독처리하였을때황백피는 IL-8의저감율이높았으며두충의경우 TNF-α의저감율이높았다. 황백피와두충의조성의변화에따라 TNF-α와 IL- 8의저감율이상반된결과를보이는데이러한추출물간 의차이는추출물에유리된성분의차이에의한것으로판단된다. 성분의분석은추후실험이더필요할것으로보인다. IL-6의경우에는모든그룹에서 9% 이상의높은억제를보였다 (Fig. 4). 결 본연구에서는열수추출한어성초와두충천연약용식물성분을방사선멸균한후세포독성과항염증작용을측정하였다. 각각의천연약용식물의추출물은효능이입증되었으나각약용식물의혼합물에대해서는독성평가및아토피성피부염에미치는영향에관한보고가없기에본연구를실시하였다. 그결과, 비만세포에서는 3. mg ml -1 이하의농도에서독성이없는것으로나타났고, 항염증반응에서는유의적인값을확인할수가있었다. 따라서이번실험에서얻어진결과를바탕으로독성이없는농도범위하에서천연약용식물의혼합물을이용하여아토피피부염을억제할수있는연구에관한새로운발판을마련할수있을것으로판단된다. 론 참고문헌 Brown JM, Wilson TM and Metcalfe DD. 8. The mast cell and implications for therapy. Clin. Exp. Allergy 38:4-18. Choi YH, Kim EY, Park KY, Rhee SH and Lee WH Antimutagenic effects of the juice and boiling water extract of Houttuynia cordata Thunb. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 23: Elias PM, Wood LC and Feingold KR Epidermal pathogenesis of inflammatory dermatoses. Am. J. Contact Dermatol. 1: Furukawa H, Nakamure K, Zheng X, Tojo M, Oyama N, Akiba H, Nishibu A, Kaneko F, Tsunemi Y, Sseki H and Tamaki K. 4. Enhanced TARC production by dust-mite allergens and its modulation by immunosuppressive drugs in PBMCs from patients with atopic dermatitis. J. Dermatol. Sci. 35: Galli SJ, Tsai M and Piliponsky AM. 8. The development of allergic inflammation. Nature 454: Hsieh CL and Yen GC.. Antioxidant actions of duzhong (Eucommia ulmiodes oliv.) toward oxidative damage in biomolecules. Life Sci. 66: Li Y, Sato T, Metori K, Koike K, Che QM and Takahashi S The promoting effects of geniposidic acid and aucubin in Eucommia ulmiodes oliver leaves on collagen synthesis. Biol. Pharm. Bull. 21:

5 천연약용식물추출물의항염증특성 277 Metcalfe DD, Kaliner M and Donlon MA The mast cell. Critl. Rev. Immunol. 3: Nakamura T, Nakazawa Y, Onizuka S, Satoh S, Chiba A, Sekihashi K, Miura A, Yasugahira N and Sasaki YF Antimutagenicity of Tochu tea (an aqueous extract of Eucommia ulmoides leaves): 1. The clastogen-suppressing effects of Tochu tea in CHO cells and mice. Mutat. Res. 388:7-. Oshima T, Takata S, Kikino H, Deyama T and Kinoshita G Anticomplementary activity of the constituents of Eucommia ulmoides bark. J. Ethnopharmacol. 23: Seo DH and Han DS. 3. Anticancer effects of hexane soluble extract of Houttuynia cordata against cancer cell lines. J. Wonkwang Dental Res. Ins. 12: Shin SE, Suh DS, Ding JL and Cha WS. 6. Chemical characterization and antibacterial effect of volatile flavor concentrate from Houttuynia cordata Thunb. Life Sci. 16: Shultz LF and Hanifin JM. 2. Epidemiology of atopic dermatitis. Immunol. Allergy Clin. North Am. 22:1-24. Song JH, Kim MJ, Kwon HD and Park IH. 3. Antimicrobial activity of fraction extracts from Houttuynia cordata root. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 32: Sung NJ, Lee SJ, Shin JH, Chung MJ and Lim SS Effects of Houttuynia cordata Thunb powder and juice on lipid composition of liver, brain and kidney in dietary Hypercholesterolemic rats. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 27: Watanabe J, Kawabata J, Kurihara H and Niki R Isolation and identification of alpha-glucosidase inhibitors from tochu-cha (Eucommia ulmiodes). Biosci. Biotech. Bioch. 61: Yen GC and Hsieh CL.. Reactive oxygen species scavenging activity of Du-zhong (Eucommia ulmiodes oliv.) and its active compounds. J. Agric. Food Chem. 48: Manuscript Received: September 7, 11 Revised: September 9, 11 Revision Accepted: September 16,

02-두충과(노영창)

02-두충과(노영창) Journal of Radiation Industry 6 (1) : 11~15 (12) Review Paper 두충과느릅혼합추출물에의한염증억제효과 권희정 신영민 정성린 박종석 노영창 임윤묵 * 한국원자력연구원첨단방사선연구소공업환경연구부 In Vitro Anti-inflammatory Activities of Herbal Extracts with Eucommia