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정환 장
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1 식물병연구 Res. Plant Dis. 17(2) : (2011) 단보 Open Access Research in Plant Disease The Korean Society of Plant Pathology 열무에서분리한오이모자이크바이러스분리주의특성 이선주 홍진성 1 최장경 2 김은지 이긍표 * 중앙대학교식물시스템과학과, 1 서울여자대학교자연과학연구소, 2 강원대학교응용생물학과 Characterization of an Isolate of Cucumber mosaic virus from Raphanus sativus L. Sun Ju Rhee, Jin Sung Hong 1, Jang Kyung Choi 2, Eun Ji Kim and Gung Pyo Lee* Department of Integrative Plant Sciences, Chung-Ang University, Ansung , Korea 1 Institute of Natural Sciences, Seoul Women's University, Seoul , Korea 2 Department of Applied Biology, Kangwon National University, Chunchon , Korea (Received on June 22, 2011; Revised on July 12, 2011; Accepted on July 12, 2011) Cucumber mosaic virus (CMV)-like isolate was collected from Raphanus sativus (cv. Choon-hyang), which showed mosaic symptoms. The isolate was confirmed to a strain of CMV by host responses in Vigna unguiculata, Chenopodium amaranticolor and Gomphrena globosa, by viral genome composition with RT- PCR and PCR-RFLP, and by serological analysis. Symptom developed by the strain of CMV was severe in Nicotiana benthamiana, N. glutinosa, N. tabacum (cv. Samsun, cv. Xanthi), Cucumis melo (cv. Early hanover), Cucumis sativus (cv. White wonder), Capsicum annuum (cv. Chung-yang and cv. Geum-top), but mild symptom was developed in Raphanus sativus (cv. Choon-hyang), Brassica rapa ssp. pekinensis (cv. Bul-Am No. 3), and B. juncea (cv. Daenong Jukgot). Newly isolated strain of CMV could infect diverse crops including Solanaceae, Cucurbitaceae and Brassicaceae. We designated the new strain of CMV as Gn-CMV based on the novel infectivity of Brassicaceae. In double-stranded (ds) RNA analysis, Gn-CMV consisted of 3.3, 3.0, and 2.2 kb genomes likewise other strains of CMV. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) showed 28 kda of the CMV coat protein. By restriction enzyme mapping using Cac8I, ClaI and MspI of RT-PCR products indicated that Gn-CMV belongs to CMV subgroup I. Keywords : dsrna, Host range analysis, PCR-RFLP, RT-PCR, SDS-PAGE Cucumber mosaic virus(cmv) 는 Bromoviridae Cucumovirus 에속하며, 직경 29 nm의구형으로되어있고, 박과, 가지과등 85개과의 1000종이상의넓은기주범위를갖는다 (Palukaitis 등, 1992). 전세계적으로널리분포하고많은종류의작물에피해를주고있는 CMV는채소나화훼에서는가장중요한바이러스병의병원이다 (Tomlinson, 1987). CMV는게놈분자의크기에따라 RNA1, 2, 3의분절된 genome을가지며 (Palukaitis 등, 1992), 서브게놈 RNA(RNA 4) 를포함하고있다. CMV는계통에따라서는 satellite RNA를함께갖고있는 CMV도있다 (Gould 등, 1978). 세계적으로많은계통과분리주가보고되어있 *Corresponding author Phone) , Fax) ) gplee@cau.ac.kr 는 CMV는기주반응의특성과혈청학적성질, 외피단백질의 peptide 서열과 ELISA 분석, RT-PCR을이용한외피단백질유전자의제한효소절단패턴분석등에따라 subgroup I과 II로구분된다 (Choi 등, 1998; Owen과 Palukaitis, 1988). 또한 RNA3의외피단백질유전자와 5 비번역부위를통하여 subgroup IA와 IB로구분하고있다 (Roossinck 등, 1999). 무, 배추등십자화과식물에감염하고있는바이러스로는대표적으로 Potyvirus 속의 Turnip mosaic virus(tumv) 가보고되어있으며 (Tomlinson 등, 1970), Tobamovirus 속의 Ribgrass mosaic virus(rmv; Wang 등, 1997), Turnip vein clearing virus(tvcv; Lartey 등, 1993), Cr-TMV (Dorokhov 등, 1994), Chinese rape mosaic virus(crmv; Aguilar 등, 1996), TMV-Cg(Yamanaka 등, 1998) 등이보

2 212 이선주 홍진성 최장경 김은지 이긍표 고되어있다. 본연구는 2008년강원도강릉시외곽지역의텃밭에재식되어있는열무 (Raphanus sativus L.) 에서모자이크병징을나타내는잎을채집하여단일바이러스를분리하고, 이를여러가지검정실험을통하여새로운계통의 CMV로동정하였고, 그특성을보고하고자한다. 바이러스의분리. 모자이크증상을보이는열무의잎을채취하여 0.01 M의인산완충액 (ph 7.0) 으로마쇄하여 Chenopodium amaranticolor, Gomphrena globosa와 Nicotiana benthamiana에접종하였다. 접종 7일후전신감염된 N. benthamiana를 C. amaranticolor에접종한후, 단일국부병반을 2회분리하여 N. benthamiana에접종하여증식하여공시바이러스원으로사용하였다. 이병엽에서다음과같은방법으로 total RNA를추출하였다. 약 0.4 g의감염잎을액체질소로동결시켜마쇄한후 RNA 추출 buffer(10% sodium dodecylsulfate(sds), 0.5 M EDTA, 1 M Tris (ph8.0), β-mercaptoethanol) 800 µl와 phenol 800 µl를첨가하고상온에서 5분간정치시켰다. 반응액은 12,000 rpm, 4 o C에서 10분간원심분리하여상등액 700 µl를취하였다. 여기에동량의 PCI(phenol: chloroform: isoamyl alcohol = 10: 49: 1, v/v/v) 분주후 voltexing하였고 5분간상온에서정치시켰다. 이를 12,000 rpm, 4 o C, 10분간원심분리하여상등액을취하였고이과정을 2회반복했다. 이상등액에동량의 chloroform을첨가한후 15초교반하여원심분리한후상등액을취하고, 동량의 isopropanol 을첨가하여 15분간상온에서반응시켰다. 이를원심분리한후 75% ethanol 1 ml 첨가하여수세한뒤 0.1% DEPC water 30 µl에녹여서바이러스검정에사용하였다. 바이러스의검정은 Chen 등 (2007) 이제시한 CMV-specific primer set을이용한 RT-PCR을통하여 CMV임을확인하였으며, CMV의대표적인검정식물인 Vigna unguiculata, C. amaranticolor와 G. globosa에의반응, 혈청학적분석등을통하여분리한바이러스가 CMV의한계통임을판단할수있었다. 이논문에서는열무에서분리한 CMV 분리주를 Gn-CMV로명명하여이하실험에사용하였다. 또한 N. benthamiana에증식시켜보관중인 Y-CMV와 Pf- CMV를대조바이러스로공시하였다. 기주식물반응및병징특성. Gn-CMV에대한기주범위및접종엽과상엽의병징에관한실험결과를 Table 1 에정리하였다. 채집한열무의잎을마쇄하여접종하였을때, C. amaranticolor에서국부병반을확인하였으며, 접종 5일째부터 N. benthamiana에서전형적인모자이크병징이나타났다. 분리된 Gn-CMV를증식시킨 N. benthamiana 의감염잎을다양한지표식물에즙액접종하였다. 그결과 N. benthamiana와 N. glutinosa, N. tabacum의접종상 Table 1. Reaction of indicator plants by mechanical inoculation of the Gn-CMV Host plants Symptoms a Gn-CMV Y-CMV Pf-CMV Nicotiana benthamiana /M(yM) /ym /M N. tabacum Xanthi-nc /ym /ym /M N. glutinosa /ym /ym /M Capsicum annuum Geum-top /M /M /M Chenopodium amaranticolor L/ L/ L/ Vigna unguiculata L/ L/ L/ Gomphrena globosa L/M L/M L/M Raphanus sativus Choon-hyang /mm / / Brassica juncea Daenong Jukgot /mm / / Brassica rapa ssp. pekinensis Bul-Am No. 3 /mm / / Cucumis sativus White wonder /M /M /M Cucumis melo Early hanover /M /M /M a Inoculated leaf/upper leaf, M: mosaic, mm: mild mosaic, ym: yellow mosaic, L: local lesion, : symptomless or not infected. 위엽에서약간의황백화현상과함께전형적인모자이크병징이나타났으며, 고추, 오이, 멜론에서역시접종후 7일이내에상위엽에서강한모자이크의병징을확인할수있었다. 열무에서는약한모자이크병징을보였고, 배추와적갓에서는뚜렷한병징을나타내지는않았으나, 상엽의즙액을국부병반기주인동부에접종하였을때, 접종후 1일째국부병반이나타냄으로서 Gn-CMV의배추와적갓에무병징감염되고있음을판별할수있었다 (Fig. 1). 또한 CMV 특이프라이머를사용하여 RT-PCR 을수행하여병징발현을확인하기어려운기주에대한 Gn-CMV의감염성을확인하였다. Gn-CMV의경우기주식물반응및병징특성을보았을때일반적인 CMV의기주범위를갖고있으면서동시에십자화과식물에서는병징이거의없이바이러스의증식이이루어지고있는특성을보였다. Ds-RNA 및외피단백질분석. 열무에서분리한 Gn- CMV의계통및게놈 RNA에대한분자크기및종류를알아보기위하여 Y-CMV 및 Pf-CMV에감염된 N. benthamiana 의잎으로부터 Morris와 Dodds(1979) 의방법으로이중가닥 RNA(double stranded RNA: dsrna) 를추출하였다. 추출된 dsrna를 native polyacrylamide gel에서전기영동하여확인한결과대조구인 Y-CMV, Pf-CMV와마찬가지로 3종류의게놈 RNA와 satellite RNA를확인할수있었다 (Fig. 2). DsRNA의패턴으로보아 Gn-CMV가대조 CMV 와마찬가지로 satellite RNA를포함하는 CMV의한계

열무에서분리한오이모자이크바이러스의특성 213 Fig. 1. Symptoms on host plants by mechanical inoculation of Gn-CMV isolated from Raphanus sativus. (A) N. tabacum (cv. Samsun), (B) N. glutinosa, (C) N. tabacum (cv. Xanthi), (D) N.

White wonder), and (I) to (K) local lesions on V. unguiculata inoculated with the sap of Gn-CMV inoculated N. benthamiana, B. rapa ssp. pekinensis (cv. Bul-Am No. 3), and B. juncea (cv.

3 열무에서분리한오이모자이크바이러스의특성 213 Fig. 1. Symptoms on host plants by mechanical inoculation of Gn-CMV isolated from Raphanus sativus. (A) N. tabacum (cv. Samsun), (B) N. glutinosa, (C) N. tabacum (cv. Xanthi), (D) N. tabacum (cv. Xanthi-nc), (E) Raphanus sativus (cv. Choon-hyang), (F) Capsicum annuum (cv. Geum-top), (G) Cucumis melo (cv. Early hanover), (H) Cucumis sativus (cv. White wonder), and (I) to (K) local lesions on V. unguiculata inoculated with the sap of Gn-CMV inoculated N. benthamiana, B. rapa ssp. pekinensis (cv. Bul-Am No. 3), and B. juncea (cv. Daenong Jeokgot), respectively. Arrow indicates sap inoculation. Fig. 2. Polyacrylamide gel electrophoresis of dsrna isolated from N. benthamiana infected with Gn-CMV, Y-CMV and Pf- CMV, respectively. Mock: inoculation with 0.05 M phosphate buffer. Aliquot of dsrna purified by CF-11 cellulose is electrophoresed in 6% polyacrylamide gel and stained with ethidium bromide. 통임을확인할수있었으며, 이는바이러스의감염여부와분절게놈을갖고있는바이러스를간편하게확인할수있는유용한수단으로써이용될수있다는보고 (Dodds, 1993) 와일치하며, satellite RNA 존재여부를쉽게판단할수있을것으로판단되었다. 특히기주식물반응에서황화증 상을보이는기주의경우직접적인관련성은확인되지않았으나 satellite RNA가기주의병징변화에영향을미친다는기존의보고 (Choi 등, 2001) 를통하여 satellite RNA 에의한병징의변화로예상되었다. 한편 Gn-CMV의외피단백질의특성을확인하기위해바이러스가감염된 N. benthamiana로부터단백질을추출한후 CMV 항혈청 (anti- CMV) 를사용하여 Western blot 분석을실시하였다. 그결과 Gn-CMV, Y-CMV 및 Pf-CMV 모두 CMV의외피단백질크기인약 28 kda 분자량을갖는밴드가확인되었다 (Fig. 3). 이들결과를통하여열무로부터분리된바이러스는 CMV의한계통으로동정되었다. RT-PCR 및제한효소지도분석. Gn-CMV의감염여부와특성을확인하기위하여 RT-PCR 과제한효소절단패턴 (RFLP) 분석을실시하였다. 우선 RT-PCR 에사용된 primer는 Chen 등 (2007) 의논문을참고하여제작하였고, 수행조건은다음과같다. cdna 2 µl, rtaq buffer(10x) 5 µl, dntp(2.5 mm) 2 µl, primer(10 pmol) 1 µl, rtaq 1 µl 첨가한뒤멸균된증류수로최종반응액 50 µl로하였다. PCR 반응은 94 o C 5분, 94 o C 30초, 56 o C 40초, 72 o C 50초, 72 o C 10분 35 cycles 반응조건으로증폭하였다. 증폭시킨 PCR

Lane 1: mock-inoculated, lane 2: Gn-CMV, lane 3: Y-CMV, lane 4: Pf-CMV, and lane M: molecular weight marker. Arrow indicates 28 kda of coat protein.

4 214 이선주 홍진성 최장경 김은지 이긍표 Fig. 3. SDS-PAGE and Western blot of N. benthamiana inoculated with Gn-CMV, Y-CMV, and Pf-CMV. (A) Total proteins were analyzed by electrophoresis on a 12% SDS-polyacrylamide gel and stained with Coomassie brilliant blue, (B) Western blotting using an antiserum to Fny-CMV. Lane 1: mock-inoculated, lane 2: Gn-CMV, lane 3: Y-CMV, lane 4: Pf-CMV, and lane M: molecular weight marker. Arrow indicates 28 kda of coat protein. 반응산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였 고 RNA1, RNA2와 RNA3는 각각 CaC8I, ClaI 그리고 MspI를 이용하여 Gn-CMV의 subgroup을 확인하였다. Chen 등(2007)이 제시한 CMV 검정 프라이머와 서브그룹을 확 인할 수 있는 제한효소절단패턴 분석을 통하여 Gn-CMV 를 동정하고자 하였다. RT-PCR 결과 Gn-CMV RNA1은 600 bp, RNA2는 510 bp, RNA3는 625 bp의 밴드가 각각 증폭되었으며, 이를 각각 CaC8I, ClaI, MspI으로 절단하 여 분석한 결과 RNA1은 600 bp, RNA2는 40, 130, 430 bp, RNA3는 290, 335 bp의 절단 패턴을 나타내었다(Fig. 4). 분절게놈을 갖고 있는 Gn-CMV의 RNA1, RNA2, RNA3 모두 subgroup I 으로 분류됨을 확인하였다. 특히 분절게 놈을 갖는 바이러스는 조건에 따라 서로 재조합하는 경 우가 있어 이를 구분하기 위해서는 각각의 RNA에 대한 염기서열을 결정하여 분석해야 하는 번거로움이 있는데 이들 각 게놈 영역에 대한 PCR-RFLP 분석은 CMV의 각 게놈이 재조합 형태인지를 구분하고 CMV의 서브그룹을 결정하는데 있어 간편하게 활용될 수 있을 것으로 판단되었다. 요 Fig. 4. CMV detection and PCR-RFLP anlaysis from the RTPCR products of CMV-infected N. benthamiana. (A) RT-PCR detection using CMV RNA1, 2, and 3 specific primers. Lane 1 and 2: 600 bp fragment of RNA1, lane 3 and 4: 510 bp fragment of RNA2, and lane 5 and 6: 625 fragment of RNA3. (B) Restriction pattern of three strains of CMV on 3% agarose gel. Each RT-PCR product of RNA 1, 2, and 3 of CMV was digested by Cac8I, ClaI, and MspI, respectively. Lane 1, 3, and 5: RNA1, 2, and 3 of Gn-CMV, lane 2, 4, and 6: RNA1, 2, and 3 of Y-CMV, respectively. 약 모자이크증상을 나타내는 열무로부터 Cucumber mosaic virus의 한 계통을 분리하고 특성을 조사하였다. Vigna unguiculata, Chenopodium amaranticolor and Gomphrena globosa에서 분리 바이러스의 기주반응과 dsrna 분석, RT-PCR 검정, PCR-RFLP, 혈청학적 분석을 통하여 CMV 의 한 계통임을 확인하였다. 이 CMV 계통을 다양한 지 표식물에 접종하였을 때, Nicotiana benthamiana와 N. glutinosa, N. tabacum, 고추, 오이 그리고 멜론에서는 전

5 열무에서분리한오이모자이크바이러스의특성 215 형적인강한모자이크병징이나타났으나, 열무, 배추, 적갓은매우약한병징을나타내는특징을보였다. 새롭게분리된 CMV 계통은가지과, 박과및배추과등광범위한작물에감염성을나타내었으며, 배추과에서의감염성차이를근거로 Gn-CMV로명명하였다. Double-stranded (ds) RNA를분리한분석에서 Gn-CMV는기보고된 CMV 계통과마찬가지로 3.3, 3.0, 그리고 2.2 kb의독립된게놈으로구성되어있었으며, SDS-PAGE와 Western blotting 분석으로통하여 28 kda의외피단백질을확인할수있었다. RT-PCR로얻어진증폭산물을 Cac8I, ClaI and MspI 을이용한 PCR-RFLP를통하여 CMV subgroup I 임을확인할수있었다. Acknowledgement This work was supported by a grant from the BioGreen 21 Program (No. PJ006996), Rural Development Administration, Republic of Korea. 참고문헌 Aguilar, I., Sanchez, F., Martin-Martin, A., Martinez-Herrera, D. and Ponz, F Nucleotide sequence of Chinese rape mosaic virus (oilseed rape mosaic virus), a crucifer tobamovirus infectious on Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 30: Chen, Y., Chen, J., Zhang, H., Tang, X. and Du, Z Molecular evidence and sequence analysis of a natural reassortant between Cucumber mosaic virus subgroup IA and II strains. Virus Genes 35: Choi, J. K., Kim, H. J., Hong, J. S., Kim, D. W. and Lee, S. Y Identification and differentiation of Cucumber mosaic virus isolates in Korea. Korean J. Plant Pathol. 14: Choi, J. K., Sung, M. Y., Jung, H. J., Hong, J. S. and Lee, S. Y Cross protection effectiveness of Cucumber mosaic virus (CMV) isolates associated with satellite RNA for prevention of CMV disease in pepper plants. Res. Plant Dis. 7: Dodds, J. A DsRNA in diagnosis. In: Diagnosis of Plant Virus Diseases, ed. by R.E.F. Matthews. pp CRC Press, Boca Raton, USA. Dorokhov, Y. L., Ivanov, P. A., Novikov, V. K., Agranovsky, A. A., Morozov, S. Y., Efimov, V. A., Casper, R. and Atabekov, J. G Complete nucleotide sequence and genome organization of a tobamovirus infecting cruciferae plants. FEBS Lett. 350: 5 8. Gould, A. R. and Symons, R. H Alfalfa mosaic virus RNA. Determination of the sequence homology between the four RNA species and a comparison with the four RNA species of Cucumber mosaic virus. Eur. J. Biochem. 4: Lartey, R. T., Hartson, S. D., Pennington, R. E., Sherwood, J. L. and Melcher, U Occurrence of a vein-clearing tobamovirus in turnip. Plant Dis. 77: Morris, T. J. and Dodds, J. A Isolation and analysis of double-stranded RNA from virus-infected plant and fungal sissue. Phytopathology 69: Owen, J. and Palukaitis, P Characterization of Cucumber mosaic virus. I. Molecular heterogenecity mapping of RNA3 in eight CMV strains. Virology 166: Palukaitis, P., Roossinck, M. J., Dietzgen, R. G. and Francki, R. I. B Cucumber mosaic virus. Adv. Virus. Res. 41: Roossinck, M. J., Zhang, L. and Hellwald, K. H Rearrangement in the 5' nontranslated region and phylogenetic analysis of Cucumber mosaic virus RNA3 indicated radialevolution of three subgroups. J. Virol. 73: Tomlinson, J. A Epidemiology and control of virus diseases of vegetables. Ann. Appl. Biol. 110: Tomlinson, J. A., Carter, A. L., Dale, W. T. and Simpsom, C. J Weed plants as sources of cucumber mosaic virus. Ann. Appl. Biol. 66: Wang, H., Culver, J. N. and Stubbs, G. R. T Structure of Ribgrass mosaic virus at 2,9 A resolution.: evolution and taxonomy of tobamoviruses. J. Mol. Biol. 269: Yamanaka, T., Komatan, H., Meshi, T., Naito, S., Ishikawa, M. and Ohno, T Complete nucleotide sequence of the genomic RNA of Tobacco mosaic virus strain Cg. Virus Genes 16:

16-15(3)-07(최장경).fm

16-15(3)-07(최장경).fm Res. Plant Dis. 15(3) : 254-258 (2009) Research in Plant Disease The Korean Society of Plant Pathology t (Lagenaria leucantha var. gourda) w IB m Cucumber mosaic virus Áy 1 Á»x 1 Á t 2 Á * w w, 1 w y w,