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1 Journal of Bacteriology and Virology Vol. 38, No. 3 p Detection of Antibodies to Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) by Agar Gel Immunodiffusion using Recombinant VP2 Protein Woo-Jin Jeon 1, Byung-Sik Chang 2, Eun-Kyoung Lee 1, Mi-Ja Park 1, Hoo-Don Joo 2, Jun-Hun Kwon 1 and Kang-Seuk Choi 1 * 1 National Veterinary Research Institute, National Veterinary Research and Quarantine ServiceAnyang, Gyeonggi, Republic of Korea; 2 JenoBiotech Inc, Chuncheon, Gangwon, Republic of Korea Received : June 16, 2008 Revised : August 25, 2008 Accepted : September 2, 2008 Infectious bursal disease virus (IBDV) causes a highly contagious and immunosuppressive disease of chicken. Agar gel immunodiffusion using IBDV antigen extracted from bursa of Fabricius of infected chicken has been used officially for diagnosis of IBDV in Korea. In this study, in order to replace the IBDV whole virus antigen with non-infectious antigen, recombinant VP2 protein (rvp2) of IBDV was produced using recombinant baculovirus expression system. Purified baculovirus-expressed rvp2 was used as an antigen in an agar gel immunodiffusion (AGID). rvp2 antigen precipitated specifically IBDV antibodies. AGID using rvp2 antigen detected anti-ibdv antibodies from 6 dpi to 28 dpi (termination of the experiment) when specific pathogen free chickens were experimentally infected with IBDV 52/70 strain. This was consistent with result by AGID using IBDV antigen, virus neutralization test (VNT) and a commercial ELISA kit (except for one serum). The sensitivity of rvp2 was the same with that of IBDV antigen when field sera (n=324) were tested by AGID. However, AGID using rvp2 antigen detected maternal antibodies from broiler chickens (n=20) on a broiler farm up to 15 days old, although the detection rate of the AGID was relatively low compared to a commercial ELISA kit. Our results indicate that IBDV whole virus antigen from IBDV infected chickens would be replaced with recombinant VP2 protein as an antigen for AGID. Key Words: AGID, Antibody detection, Infectious bursal disease, VP2 서 닭전염성F낭병 (infectious bursal disease, IBD) 은닭의대표적인면역억제성전염병중하나이다. 어린연령 (3주령이전 ) 의병아리에감염될경우폐사율은낮지만 F낭 (bursa of Fabricius) 의미성숙 B세포를파괴시킴으로서심 * Corresponding author: Kang-Seuk Choi, DVM, MS, PhD. Veterinary Research Institute, National Veterinary Research & Quarantine Service 335 Jungang-ro, Manan-gu, Anyang-si, Gyeonggi , Republic of Korea. Phone: , Fax: choiks@nvrqs.go.kr ** This work was supported by a grant (M-AD ) from National Veterinary Research & Quarantine Service. 론 한면역억제를유발하여다른질병에대한피해를증가시키고다른예방백신의백신효과를감소시킬수있다. 또한, 3주령내지 6주령의닭에감염될경우병의경과가매우빨라감염 3일내지 4일에급격한폐사를유발한다 (18,27). 이질병의병인체는 Birnaviridae과 Avibirnavirus속에속하는전염성F낭병바이러스 (infectious bursal disease virus, IBDV) 이다. IBDV genome은이중나선 RNA (double stranded RNA) 형태로두개의 segments (segment A와 segment B) 로구성되어있다 (2,5). Segment A ( 약 3.3 kb) 는일부부위가서로 overlap되는두개의 ORF로구성되어있는반면, segment B는약 2.9 kb 크기로단일 ORF로되어있다. IBDV 구조단백질 VP2, VP3 및 VP4는 segment 149

2 150 W-J Jeon, et al. A (larger ORF) 에의해, IBDV 비구조단백질 VP1과 VP5는 segment A (smaller ORF) 및 segment B에의해각각발현된다. 이중 VP2 단백질은바이러스입자표면외피를구성하는주요캡시드단백질로서숙주에서바이러스중화항체반응을유도하는주된구조단백질이다 (3,6,7). 현재까지 IBDV는 serotype I과 serotype II 두가지의혈청형이존재하며, 그중 serotype I만이닭에서병증을유발한다 (11~13,20,24,27). IBDV serotype I은독력과항원성에따라서 classical, very virulent, antigenic variant, intermediate plus, intermediate, mild phenotypes 등으로분류된다 (28,29). 특히, very virulent type은독력이 classical type에비해현격히증가된병원성변이주로, 1986년유럽에서분리된이후다수의유럽및아시아등에서닭에큰피해를입히고있는실정이다 (18,27). 국내의경우 1980년대 classical virulent IBDV (1), 1992년닭에서 very virulent IBDV의최초발생이보고된바있으며 (17), 현재까지도 IBDV, 특히 very virulent IBD는국내양계에서의경제적피해를유발하는주요요인으로작용하고있다 (14~16). 어린연령의병아리에서 IBD 피해예방을위하여종계면역및모체이행항체소실후백신접종전략을사용하고있다 (18,26). 현재 IBDV 항체를검출하는방법에는 virus neutralization test (VNT), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), agar gel immunodiffusion (AGID) 등이주로사용되고있다 (12,19). 이중 AGID는고가의실험장비나고난도의실험기술없이도질병의진단을용이하게할수있다는장점이있기때문에백신접종또는야외감염닭에서 IBDV 항체검출법으로오랫동안널리사용되어왔다 (4). 현재 AGID 진단액은실험감염 specific pathogen free (SPF) 닭의 F낭을채취한다음유제 (homogenization) 하여제조한 IBDV 항원 ( 조직유래항원, tissue-derivated antigen) 을사용하고있다 (9). 그러나이러한 AGID 항원생산은 SPF 닭을사용하여생산하므로엄격한동물실험위생관리가요구되고, 고가의 SPF 닭을사용하므로항원제조생산단가가높으며, 닭을안락사시켜 F낭조직을채취하여생물학적안전캐비넷 (class II safety cabinet) 에서항원을제조하기때문에제조공정이까다롭다. 또한, IBDV는환경저항성이매우강하므로일단동물사육시설에오염될경우소독조치를실시하더라도시설내병원체를완전히제거하는데어려움이있기때문에 IBD 항원제조용도이외의다른실험용도로동물사육시설을 사용할수없다는문제점이있어왔다. 또한, 동물보호법이전면시행 ( ) 됨에따라동물사용을줄이거나대체가능한 in vitro 진단제제개발이시급히필요한실정이다. 본연구에서는실험감염닭을이용하여 IBDV 항원을제조하는종래의방법을개선하기위하여유전자재조합 baculovirus를이용하여곤충세포에서 IBDV VP2 단백질을인공적으로생산하였다. 또한인공합성 VP2 단백질항원을이용하여 AGID 진단항원으로서의유효성을조사하였다. 재료및방법 1. 공시바이러스본연구를위하여 IBDV는 52/70 strain (classical virulent type), P4 strain (classical virulent type), D78 strain (intermediate type) 및국내분리주 Kr/D62/06 strain (very virulent type) 이사용되었다. IBDV P4 strain은 Agri-Bio Corp (Spring, TX, USA) 로부터, D78 strain은 Intervet사 (Boxmeer, The Netherlands) 에서구입하였으며, IBDV 52/70 strain은 Veterinary Laboratories Agency (VLA, Weybridge, UK) 로부터제공받았다. 중화시험에이용되는 Edgar strain (classical virulent type) 은미국 National Veterinary Service Laboratories (NVSL, Ames, IA, USA) 에서제공받았다. 각 IBDV는실험에사용하기전 10일령 SPF 발육계란의 chorioallantoic membrane (CAM) 에계란당 0.1 ml씩접종하여 37, 7일간배양하고 4 에서 chilling한다음 CAM을회수하였다. 회수된 CAM에 0.1 M PBS, ph 7.4를첨가하여동결및융해를 3회반복하여유제한다음 3,000 g에서 10 분간원심분리하여상층액을회수하였다. IBDV 함유상층액은발육계란에서 endpoint titration으로감염역가를측정하고, 실험에사용하기전까지 -70 에보관하였다. 2. AGID 진단액 IBDV 항원 AGID 진단액표준항원으로국립수의과학검역원조류질병과에서실험감염시킨 SPF 닭의 F낭을유제하여제조한가축방역사업용조직유래항원 (Lot. No. 감보로병 07-01) 을사용하였다. 즉, IBDV P4 strain ( ~ EID 50 / 0.1 ml) 을 3~4주령 SPF 닭의점안및총배설강 (cloaca) 내로각각수당 50 μl씩접종한다음, 감염 3일내지 4일후닭의 F낭을무균적으로채취하였다. 채취된 F낭은

3 AGID using Recombinant IBDV VP2 151 PBS로 50% (v/v) 유제액이되도록유제하였다. 그후동결및융해를 3회반복하여유제한다음 3,000 g에서 40분간원심분리한다음상층액을수확하였다. 수확한상층액은 formalin을최종농도 0.1% (v/v) 되게첨가하여 37, 24시간교반하였다. 그후 formalin을동일농도로첨가하여동일한방법으로처리하는방법으로 2회더반복함으로서 IBDV를불활화하였다. 불활화한 IBDV 유제상층액은지질제거목적으로동량의 chloroform을섞어준다음, 물리적으로흔든후 7,500 rpm에서 40분간원심분리한다음상층액을회수하였다. IBDV 역가측정을위해상층액은 2배계단희석하여 AGID하에서 48시간관찰하였다. 제조한 IBDV 원액검사를위해무균시험, 불활화확인시험, 항원특이성및동정시험을실시하고, 최종적으로 1 vial당 100수분씩 (100 doses/vial) 일정용기에분병하여생산하였다. 3. 표준면역혈청및단클론항체영국 VLA에서제공받은 IBDV 닭면역혈청을 IBD 표준양성혈청으로사용하였다. IBDV 특이단클론항체 R63 및 B29 (9) 는각각 IBDV VP2 및 VP3 단백질에특이적으로반응하는단클론항체로서, American Tissue Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA) 사로부터구입하였다. 그이외에, avian poxvirus, avian adenovirus, avian encephalomyelitis virus, infectious bronchitis virus (Mass serotype), Newcastle disease virus에대한표준면역혈청은미국 NVSL로부터, avian rotavirus, chicken anemia virus, avian leucosis virus, reticuloendotheliosis virus, Marek disease virus에대한표준면역혈청은 SPAFAS사 (Norwich, CT, USA) 로부터분양받았다. 4. 닭혈청시료 IBDV 실험감염닭또는모체이행항체보유병아리로부터주기적으로채혈하여국립수의과학검역원조류질병과에서보관중인혈청을사용하였다. 실험감염닭유래혈청 41점은국립수의과학검역원동물실험계사에서 IBDV 52/70 strain을 3주령 SPF 닭 10수에인공감염 (eye drop, EID 50 / 수 ) 시킨후 0, 3, 6, 9, 14, 28일에, 일반육계 (broiler) 병아리혈청은국내소재한육계농장으로부터 1, 3, 9, 15, 20, 26, 30, 36일령에각각 20수씩채혈하여분리한혈청 160점이다 (Table 1). 야외혈청에대한재조합 VP2 단백질을이용한 AGID의유효성평가를위 하여 3개농장 1일령초생추혈청 155점, 6개농장 25일령내지 34일령의육계출하계혈청 119점, 그리고 6개농장종계 18주령내지 75주령의육용종계혈청 50점등총 324점을무작위로선정하여사용하였다 (Table 2). 육계농장의경우 14일령에 intermediate plus형의 IBD 생독백신을음수로 1회접종한농장이며, 육용종계농장의경우채혈이전에최소 2회이상의생독백신 (10일내지 14일령생독, 3주령내지 4주령에생독 ) 을접종한농장이었다. 모든검사혈청시료는 56 에서 30분간비동화처리한후실험에사용하였다. 5. IBDV genomic RNA 추출, cdna 합성및 VP2 단백질유전자증폭 IBDV genomic RNA는 IBDV Kr/D62/06주함유 CAM 유제액을 TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 을사용하여제조사의매뉴얼에따라추출하였다. IBDV VP2 단백질유전자의 cdna 합성및증폭은 one-step RT-PCR kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) 를사용하여제조사의매뉴얼에따라실시하였다. 즉, 서열3 (5'-GAA TTC ATG ACG AAC CTG CAA GAT-3') 의 forward primer 및서열4 (5'-AGA TCT CTA CCT TAG GGC CCG GAT TAT-3') 의 reverse primer를 one-step RT-PCR kit용반응 tube에첨가한다음, 50 에서 30분간 reverse transcription을실시하였다. 그후 95 15분간열처리한후 95 20초, 55 1분, 72 에서 2분을 1사이클로하여 PCR 증폭기 (PE 9600; Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA) 에서 30 사이클반복하여유전자증폭을실시하고, 마지막으로 72 5분간 DNA 합성을연장하였다. 상기에서기술한 forward primer와 reverse primer의염기서열은 IBDV D78주의 VP2 유전자염기서열 (Genbank accession no. AF499929) 을기준으로합성하였다. 또한유전자클로닝의효율성을위하여서열1의 5'-말단시작코돈 (ATG) upstream에 EcoR I 제한효소반응부위를, 서열2의 5'-말단종료코돈 (TGA) upstream 에 Bgl II 제한효소반응부위를각각추가하였다. 상기의 RT-PCR 법으로증폭된 cdna 증폭산물은 agarose electrophoresis를실시하여증폭산물의크기를확인하고, VP2 단백질유전자 DNA 증폭산물은 gel extraction kit (Qiagen) 를이용하여 agarose gel로부터추출하였다. 추출한 VP2 유전자 cdna를 pgem-teasy vector (Promega, Madison, WI, USA) 의 multicloning site에삽입하여 "pgemt/ibdvp2" 을제작하였다. 클로닝벡터내 IBDV VP2 유전자의삽입여

4 152 W-J Jeon, et al. 부는자동염기서열분석기 (ABI 377, Foster City, CA, USA) 를사용하여삽입된유전자의염기서열을비교분석함으로써 VP2 유전자 cdna의올바른삽입여부를확인하였다. 6. 재조합 baculovirus expression vector 제작상기의 pgemt/ibdvp2 construct를 EcoR I 및 Bgl II로처리하여해당 DNA 단편을추출하였다. 한편, 베큘로바이러스발현벡터 pachlt A TM (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 역시, 동일한제한효소로절단한다음상기의 VP2 DNA 단편을 polyhedrin promoter (P PH ) 가있는유전자부위의 downstream에위치한 multicloning site내삽입하여, IBDV VP2 유전자가삽입된재조합베큘로바이러스발현벡터인 pachlt/ibdvp2를제작하였다. 7. 재조합 baculovirus 제작 IBDV VP2 유전자가삽입된재조합 baculovirus (Bac/ IBDVP2) 는 Baculogold TM baculovirus expression system (BD Biosciences) 을이용하여제조사의매뉴얼에따라작성하였다. 즉, 단층배양된 Spodoptera frugiperda (Sf9) cell에상기의 pachlt/ibdvp2 construct와 Baculogold TM baculovirus linear DNA (BD Biosciences) 를 co-transfection 시킨후 27 에서 5일간배양하면서 cytopathic effects (CPE) 출현여부를관찰하였다. 그후 transfection시킨 cell supernatant 를수확하고 plaque assay을실시하여순수하게 recombinant baculovirus를분리하였다. 그후, 몇개의 plaque를채취하여 Sf9 cell에접종하여 27 에서 4일간배양하여 CPE 출현여부를관찰하고, 감염 Sf9 cell을단클론항체 R63 (ATCC) 과 IBDV 고도면역닭혈청으로 VP2 단백질발현여부를확인하여 recombinant baculovirus Bac/IBDVP2 를제작하였다. 또한감염세포로부터추출한재조합 IBDV VP2 단백질은 12% SDS-PAGE 후 Western blot법으로단클론항체 R63과의반응여부를조사하여확인하였다. 8. IBDV VP2 융합단백질생산세포배양용 150-cm 2 flask에배양된 Sf9 cell monolayer에 100 M.O.I (multiplicity of infection) 의 recombinant baculovirus Bac/IBDVP2를감염시킨후 27 에서 6일간배양하였다. 그후, flask내감염세포들을수확하여 4 에서 3,000 rpm, 10분간원심분리하여상층액을버리고세포 침전물은 1/10 volmume 의 0.1 M PBS에부유시켰다. 재조합 IBDV VP2 융합단백질을함유한세포침전물을 flask 5개당 10 ml 되게 0.01 M PBS, ph 7.4에현탁한후얼음에서 30분간반응시키면서 sonication (10초처리, 10초휴식, 총 10분간 ) 을실시하여세포를파쇄하였다. 그런다음, 파쇄된세포부유액을 4 13,000 rpm에서 20분간원심분리한후상층액을수확하였다. 수확한재조합 IBDV VP2 융합단백질은사용전까지 -20 에보관하였다. 9. 재조합 VP2 융합단백질의정제재조합 IBDV VP2 단백질을정제하기위하여우선 NTA column (BD sciences) 에 5 ml NTA-agarose를충전하고 0.1 M PBS로 3회세척하였다. 그후 1 binding buffer (20 mm sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 10 mm imidazole, ph 7.4) 50 ml를 column에 loading하여 equilibration 하도록하였다. 그후상기에서준비한재조합 IBDV VP2 단백질 10 ml를 column에분당 2 ml씩 loading하였다. 그후 wash buffer (20 mm sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 20 mm imidazole, ph 7.4) 으로 3회 column을세척하였다. 그후 1 elution buffer (20 mm sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 500 mm imidazole, ph 7.4) 를 column에 loading하고 elution 하여각 fraction을 conical tube에수확하였다. 각 fraction 별 BCA TM protein assay reagent (Pierce, Rockford, IL, USA) 로단백질량을정량하여단백질량 200 μg/ml 이상인 fraction 을회수하여 12% SDS-PAGE로 VP2 단백질을확인하였다. VP2 단백질이포함된각 fraction을 pooling한다음 0.1 M PBS에서 dialysis를실시하였다. 그후단백질을 BCA로정량하여재조합 IBDV VP2 융합단백질의항원성확인실험에사용하였다. 10. IBDV 및 recombinant VP2 단백질의정량 IBDV와 recombinant VP2 단백질의정량은 sandwich ELISA법으로실시하였다. 우선, carbonate/bicarbonate buffer, ph 9.6으로희석한단클론항체 R63 ( 최종희석농도 4 μg/ ml) 을 Nunc Maxisorp ELISA plate에 well당 50 μl씩첨가하여 37 에서 1시간동안부착시켰다. 그후세척용완충용액 (0.01 M PBS % Tween 20) 으로 3회반복세척한후항원검사용시료를 well당 50 μl씩첨가하여 37 에서 1시간동안반응시켰다. 세척용완충용액으로 3회반복세척한후항-IBDV 표준혈청 (1:1,000 희석 ) 을 well당 50 μl씩첨가하여 37 에서 1시간동안반응시켰다. 세척용

5 AGID using Recombinant IBDV VP2 153 완충용액으로 3회반복세척한후 horseradish peroxidase (HRP) 가부착된 anti-chicken immunoglobulins antibody (100 ng/ml, Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, USA) 를 well당 50 μl씩첨가하여 37 에서 1시간동안반응시켰다. 세척용완충용액으로 3회반복세척한후 TMB용액 (Sigma, St. Louis, MO, USA) 을 well당 50 μl 씩첨가하여 10분간실온에서발색시킨다음반응중지용액 (0.05 M sulfuric acid) 을 well당 50 μl씩첨가하여발색을중지시켰다. Optical density (OD) 는 ELISA reader (Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA) 를이용하여 A450 에서측정하였다. 대조양성항원 (positive antigen) 흡광도는 IBDV D78 strain ( EID 50 /ml) 의흡광도로하였다. 각검사시료의 ELISA unit는 S/P ratio (sample/positive, 검사시료의 OD값 / 대조양성항원 OD값 ) 에혈청희석배수를곱한값으로계산하였다. 11. Agar Gel Immunodiffusion (AGID) 에의한 IBDV 항체검출 AGID는국제수역사무국에서권장하는방법에따라실시하였다. 본연구에서생산한재조합 VP2 단백질항원과비교실험을위하여 AGID용 IBDV 조직유래항원 (Lot. No ) 을표준항원으로포함하였다. 열탕으로완전히용해시킨한천겔용액 (1% Noble agar, 8% NaCl, 2% PEG8000, 100 ml distilled water, ph 7.2) 을 petri dish (87 15 mm) 에 20 ml 첨가하여실온에서고형화시켜 AGID plate를제조하였다. 검사결과의판정은항원항체반응에의하여 well 사이에침강대가형성된경우양성으로판정하였다. 12. ELISA kit에의한 IBDV 항체검출 AGID법과 IBDV 항체검출법의비교분석을위하여 IBDV 항체검출용 ELISA를실시하였다. ELISA는 Flock- Check IBD-XR kit (IDEXX, Portland, ME, USA) 를이용하여제조사에서제시한방법에따라실시하였다. 즉, IBD 항원이 coating되어있는 ELISA plate에 dilution buffer 로 1:500배희석한혈청을 well당 100 μl씩첨가하여실온에서 30분간반응시켰다. 그다음 ELISA plate를증류수로 3회세척한다음 goat anti-chicken immunoglobulinhorseradish peroxidase conjugate 용액 (Kirkegaard & Perry Laboratories) 을 well당 100 μl씩첨가하여실온에서 30분간반응시켰다. 그후 ELISA plate를증류수로 3회세척 하고 TMB 용액을 well당 100 μl씩첨가하여 15분간발색시켰다. 그후 stop solution을 well당 100 μl씩첨가하여발색반응을중지시키고 650 nm에서흡광도를측정하였다. 검사시료의흡광도는 S/P ratio로환산하였으며, ELISA 역가는 kit에서제공하는술식 [log 10 Titer = 1.09 (log 10 S/P) +3.36] 에의하여계산하였으며, ELISA 역가가 396 이상일때항체양성으로판정하였다. 13. 바이러스중화시험법 (VNT) 에의한 IBDV 항체검출바이러스중화시험은 96-well microtitre plates에서실시하였다. 실험전 56 에서 30분간비동화처리한혈청을사용하였다. Microtitre plate에서 alpha-mem (GibcoBRL, Grand Island, NY, USA) 배양액으로 2배계단희석한비동화혈청 50 μl와동량의 IBDV (Edgar strain, 100 TCID 50 / 50 μl) 용액을혼합하여실온에서 30분간반응시켰다. 그후 chicken embryofibroblast (CEF) cells ( cells/ml) 을 well당 200 μl씩첨가하여 37 CO 2 incubator에서 5일간배양하였다. 중화항체역가는 CPE 형성이억제된최대혈청희석배수의역수로하였다. 결과 1. Recombinant baculovirus에의한 IBDV VP2 단백질발현국내유행강병원성 IBDV Kr/D62/06주의 VP2 유전자를발현하는 recombinant baculovirus "Bac/IBDVP2" 는 IBDV VP2 유전자를함유하는 recombinant expression vector "pachlt/ibdvp2" 와 Baculogold TM baculovirus linear DNA 를 Sf9 cell에서 co-transfection 시킴으로서성공적으로제작되었다. Bac/IBDVP2 감염 Sf9 세포는 IBDV 특이단클론항체 R63과항IBDV 고도면역닭혈청으로형광염색한결과강한형광반응을보였으나, 정상 Sf9 세포는동일항체로검사한결과형광염색반응을나타내지않았다 (Fig. 1). 또한, Bac/IBDVP2 감염 Sf9 세포에서추출한단백질을 SDS-PAGE 법으로분석결과약 50 kda의분자량을가지고있었으며, 이단백질은 Western blot법에서 IBDV VP2 특이단클론항체 R63에대하여강한양성반응을나타내었으나, IBDV VP3 특이단클론항체 B29 에대하여는반응성이관찰되지않았다 (Fig. 2). 따라서, 상기의결과들을종합해볼때 Sf9 세포에서재조합 baculovirus (Bac/IBDVP2) 에의하여발현된단백질은

6 154 W-J Jeon, et al. A B C Figure 1. Immunofluorescence staining of IBDV VP2 protein expression. The Sf9 cells infected with recombinant baculovirus (Bac/IBDVP2) were stained using chicken anti-ibdv antiserum (A), IBDV-specific monoclonal antibody R63 (B) and IBDV antibody negative chicken serum (C). A B Figure 2. Analysis of purified IBDV VP2 protein expressed from Sf9 cells by recombinant baculovirus (Bac/IBDVP2). A: SDS-PAGE analysis of purified IBDV VP2 protein fractions F1 (103 μg/ml), F2 (665 μg/ml), F3 (275 μg/ml) and F4 (98 μg/ml); B: Western blot analysis of purified IBDV VP2 protein fraction F2 using IBDV VP2-specific monoclonal antibody R63 (lane 1) and VP3-specific monoclonal antibody B29 (lane 2). IBDV VP2 단백질인것으로판단된다. 또한, 재조합 VP2 단백질은 Bac/IBDVP2를감염시킨 Sf9 세포를감염 4일후에수확하여, 150 cm 2 flask당 2 ml 씩총 10 ml되게추출한다음, NTA column으로정제하여총 4 fractions를수확하여단백질을정량하였다. 그결과각 fraction별단백질량은 faction 1은 103 μg/ml, fraction 2는 665 μg/ml, fraction 3은 275 μg/ml, fraction 4는 98 μg/ ml이었다. 이들중 200 μg/ml 이상의단백질량을가진 fraction 2와 fraction 3을 pooling하였다. Pooling한단백질을정량한결과제조항원은 470 μg/ml이었다. 2. 재조합 VP2 단백질의 AGID 적정항원량결정재조합 VP2 단백질의적정항원량의표준화를위하여 sandwich ELISA 방법으로 ELISA 흡광도와 VP2 단백질량을비교측정하였다. 대조항원 IBDV D78 strain의경우감염역가 (EID 50 /ml) 와 ELISA OD값간의상관성은최소한 EID 50 /ml의감염량 (X) 범위내에서 ELISA 흡광도 (Y) 간에는높은상관성 (r 2 =0.946) 을나타내었으며, 회귀곡선 (regression curve) 식은 Y = X 이었다 (Fig. 3A). IBDV VP2 단백질량을표준화하기위하 여흡광도와 IBDV VP2 단백질량을 S/P ratio와 ELISA unit (EID 50 /ml 대비 IBDV VP2 단백질량 ) 로환원시킨결과, 1.0에서 5.4의 S/P ratio (Y) 범위에서 ELISA unit (X) 와높은상관성 (r 2 =0.946) 이었으며, 이때의회귀곡선공식은 Y = X 이었다. 본연구에서생산정제한 IBDV VP2 발현단백질의경우단백질농도가 12 ng/ml 에서 1.5 μg/ml의범위에서 ELISA 흡광도와상관성을나타내었으며 (Fig. 3B), 이회귀곡선공식을활용하여 IBDV VP2 단백질항원량을 ELISA unit로측정한결과, 4.8± ELISA unit였다. AGID 조직유래항원 (Lot No.07-01) 의경우 4.6± ELISA unit의항원농도를보였다. 진단항원으로서의재조합 VP2 단백질의적정항원량을설정하기위하여 IBDV 표준양성혈청을이용한 endpoint titration AGID를실시하였다. 그결과, 재조합 VP2 단백질 (4.8± ELISA unit) 은최소 16배희석배수에서도표준양성혈청과침강대를형성하였다. 이를기초로재조합 VP2 단백질의 AGID 진단항원으로서의적정단백질량을 ELISA unit로설정하였다. 상기적정단백질량조건에서재조합 VP2 단백질이 IBD 이외의

7 AGID using Recombinant IBDV VP2 155 A B Figure 3. Titration of IBDV (A) or recombinant IBDV VP2 protein (B) by sandwich ELISA using monoclonal antibody R63 and anti-ibdv chicken serum. Table 1. Detection of anti-ibdv antibodies in SPF chickens following experimental infection by AGID assays AGID DPI ELISA a VNT b IBDV rvp2 0 0/10 c 0/10 0/10 0/10 3 0/4 0/4 0/4 0/4 6 6/6 5/6 5/6 5/6 9 6/6 6/6 6/6 6/6 14 7/7 7/7 7/7 7/7 28 7/7 7/7 7/7 7/7 a Serum with ELISA titers of 396 was considered positive. b Serum with VN titers of 8 was considered positive. c No. Positive/No. tested 조류전염병병원체에대하여특이성을가지고있는지를 AGID법으로조사하였다. 그결과, 재조합 VP2 단백질은 avian pox virus, avian adenovirus, avian rota virus, infectious laryntracheitis virus, infectious bronchitis virus (Mass serotype), Marek's disease virus, avian encephalomyelitis virus, Newcastle disease virus에대한표준면역혈청과 agar gel상에서어떠한침강대 ( 항원- 항체반응 ) 를형성하지않았다. 3. 실험감염닭에서의 IBDV 항체검출여부조사 SPF 닭에 IBDV를실험감염시킨후주기적으로채혈하여재조합 VP2 단백질항원을이용한 AGID법으로혈 청검사를실시하고, 그결과를다른 IBDV 혈청검사법과비교하였다 (Table 1). 그결과, IBDV (52/70 strain) 를공격접종한 SPF 닭에서감염후 6일째부터 IBDV 항체를재조합 VP2 단백질을이용하여검출할수있었으며, 실험최종일인 28일까지지속적으로 IBDV 항체를검출할수있었다. 이러한결과는 IBDV 항원을이용한 AGID법의결과와도일치하였다. VNT 및 IDEXX-ELISA kit 검사결과와비교분석하였을때 VNT의경우중화항체가 8배이상또는 ELISA 양성혈청 ( 혈청 1점제외 ) 에서모두 AGID 검사결과와일치하였다. 4. 야외농장유래닭혈청에서의 IBDV 항체검출 1일령초생추혈청 155점, 육계출하계혈청 119점, 그리고육용종계혈청 50점등총 324점을대상으로재조합 VP2 단백질항원을이용한 AGID법으로혈청검사를실시하고, 그결과를기존 IBDV 항원을이용한 AGID의혈청검사결과와비교하였다 (Table 2). 그결과재조합 VP2 단백질항원을이용한 AGID법은 324점중 323점에서 IBDV 항체를검출할수있었다. 또한, 기존 IBDV 항원을이용한 AGID의검사결과와완전히일치하였다. 5. 병아리에서의 IBDV 모체이행항체의경시적검출국내한종계장에서갓부화된 boiler 20수로부터주기

8 156 W-J Jeon, et al. Table 2. Detection of anti-ibdv antibodies in SPF chickens following experimental infection by AGID assays Group Age 적으로채혈하여일령별모체이행항체검출여부를재조합 VP2 단백질을이용하여 AGID법으로조사하고, 그결과를연령별 ELISA titer와비교분석하였다. ELISA 검사결과를항체역가의측면에서분석해보면 1일령에 7000이었던계군평균 ELISA 역가는약 3.5일의반감기를가지고 15일때까지지속적으로떨어지는패턴을보였으며, 15일령이후에는계군평균항체가가 ELISA 항체양성판정기준치인 ELISA titer 396 이하를나타내었다 (Fig. 4). AGID 검사결과 1일령이후항체검출율이 15 일까지지속적으로하락하여 15일령이지난이후에는 AGID에의한항체가검출되지않았다. 반면 ELISA의양성율은 9일령까지 100% 양성율을유지하다가 26일령까지지속적으로항체양성율이떨어지다가그이후연령에서는모체이행항체가검출되지않았다. ELISA 음성혈청 94점은모두 AGID에서음성반응을나타내었다. 그러나, ELISA 양성 (ELISA titer 396 이상 ) 혈청 66점중 11 점은 AGID에서항체음성반응을보였으며, 이들혈청 11 점중 10점은 400배이상 1500배이하수준의 ELISA titer를보였다. 고 Serum no. tested 본연구에서재조합 baculovirus에의해재조합 VP2 단백질을 Sf9 세포에서생산하였으며, 생산된재조합 VP2 단백질은감염닭을이용하여생산제조한기존의조직유래항원대체가능성을조사하였다. 현재까지재조합 VP2 단백질생산에관한연구결과들이여러연구자들에의해보고되었으나, 이들보고대부분이 IBDV 피해예방을위한 subunit 백신개발의목적이었다 (8,10,21~ 찰 IBDV AGID rvp2 Broiler 1 day old 155 (3) a 155/155 b 155/155 Boiler Broiler breeder 25 to 34 days old 18 to 75 months old 119 (6) 119/ / (5) 49/50 c 49/50 c a Number in parenthesis represents number of farm tested. b No. Positive/No. tested. c One serum with negative result in AGID using rvp2 antigen was also negative for AGID using IBDV antigen. Positive ratio, % Age (days old) AGID, % positive ELISA, % positive Mean ELISA antibody titer Figure 4. Detection of anti-ibdv maternal antibodies in broiler measured by AGID test using recombinant IBDV VP2 protein. 23,25). 그동안재조합 VP2 단백질을 IBDV 항체검출용 진단항원으로서활용한보고가매우드물다는점에서본연구에서진단항원으로서의재조합 VP2단백질의효능확인및적용은그의의가크다하겠다. VP2 단백질은 IBDV의캡시드를구성하는주요바이러스구조단백질로서, 숙주에서 humoral immune response 를유발하는주된바이러스단백질부위이기때문에본연구에서재조합 VP2 단백질을진단항원의 target으로설정하였다. 본연구에서는대장균이닭에서흔하게감염되는세균이라는점을감안해볼때기존연구에서많이적용한대장균발현체계는비특이반응 (non-specific reaction) 을유발할수있다는점을감안하여대장균발현체계대신에 baculovirus 발현체계를이용하여 VP2 단백질을생산하였다. 본연구에서 5개의 150-cm 2 flask를이용하여 450 ml의진단액항원을제조하였는데, 이때생산된진단액양은약 90,000수분의 AGID 진단항원량에해당되었다. 그러므로, Sf9 세포배양법에의한재조합 VP2 단백질항원생산은그발현단백질량의측면에서볼때 AGID 진단항원으로서생산하는것또한가능하다는것을보여준다. 본연구의재조합 VP2 단백질진단항원의제조방법은여러가지측면에서조직유래항원의제조방법에비 해여러가지장점이있다. 첫째, 재조합 VP2 단백질항원은전염성이없기때문에병원체취급제한등의문제없이도일반실험실에서도안전하게생산할수있다. 둘째, 기존조직유래 IBDV 항원의제조공정이약 5주정도소요 ( 안전기간 1주 + 감염시험 1주 + 조직항원추출 1주 + 자가검정 2주 ) 되는데반해, 재조합 VP2 단백 ELISA titer

9 AGID using Recombinant IBDV VP2 157 질진단항원의제조기간은 1주정도소요되므로항원제조소요기간이약 4주정도단축하게된다. 셋째, 재조합 VP2 단백질진단항원은제조공정이기존조직항원에비해제조공정이간단하기때문에세포배양이가능한일반실험실에서제조가가능하다. 넷째, 진단항원을제조하는데있어서현행 IBDV 진단항원제조공정과달리제조과정에서 SPF 닭을사용하지않으므로특수동물실험시설의사용문제나동물실험윤리등과같은논란을피할수있다. 재조합단백질항원을 AGID 진단액의목적으로생산하기위해서제조단계에서의표준화된항원품질관리가요구된다는점을고려하여본연구에서제조항원내재조합단백질의표준화된정량을위하여 sandwich ELISA 를확립하였다. 여기에사용된 sandwich ELISA는단백질항원에결합한 VP2특이단클론항체의반응량을측정하는방법을사용함으로서각제조항원내함유된 VP2 단백질농도를측정하고자하였다. 본연구의재조합 VP2 단백질적정단백질량은 ELISA unit로설정하였는데, 이농도의재조합 VP2 단백질은 Table 1에서보는바와같이 AGID에서조직유래 IBDV 항원과동일한항체검출민감도를가지고있는것으로조사되었으며, ELISA unit 농도또한유사 (4.6± ELISA unit) 하였다. 이것은재조합 VP2 단백질항원과조직유래항원내함유된 VP2 단백질의농도가유사한수준임을말해주는것으로판단된다. AGID 항체검출민감도와관련하여, Table 1에서보는바와같이 8배이상의 IBDV 중화항체 (VN) 역가를가진혈청은모두 AGID 양성반응을나타내어 VNT와유사한민감도를보였다. 다만, 본연구에서는현재북미대륙등에서유행하고있는항원성변이주에대한평가는국내발생사례가없어바이러스시료확보의어려움때문에이루어지지않았다. 이러한항원성변이주와닭에서발생하는기존 IBDV간에는동일한혈청형이지만, 항원적인차이가일부존재하는것으로알려져있다는점을감안한다면, 항원성변이주항체시료에있어서는기존 IBDV 또는기존 IBDV 유래재조합 VP2 단백질항원을이용하는 AGID가항원성변이주를이용한 VNT에비해다소민감도는낮아질것으로판단된다. 향후항원성변이주항체에대한재조합 VP2 단백질항원을이용한 AGID의평가가필요하다. 본연구의 AGID를 IBDV 항체검출 ELISA kit와비교 하여보았을때 Fig. 4에서보는바와같이재조합 VP2 단백질항원을이용한 AGID는 ELISA kit에비해다소항체검출민감도가낮은것으로판단된다. Table 1 및 Table 2에서보는바와같이 AGID에서재조합 VP2 단백질항원이 IBDV 항원과동일한 IBDV 항체검출민감도를가지고있다는점을감안해볼때, AGID의낮은민감도는재조합 VP2 단백질항원의특성에기인한것이라기보다는진단하는방법상의차이에서초래되었을가능성이높다고본다. 그러므로, 재조합 VP2 단백질항원을이용한 ELISA법을개발할경우동일항원을이용한 AGID보다 IBDV 항체검출민감도는향상될것으로판단된다. 향후재조합 VP2 단백질항원을이용한 IBDV 항체검출용 ELISA 개발을진행하여 IBDV 항체검출용검사법으로서의유효성을평가해볼예정이다. 참고문헌 1) 이영옥, 김순재, 최정옥, 전무상, 박근식 : 국내종계의 infectious bursal disease virus의감염상황및분리주의생물학적특성. 농사시험보고서 ( 축산, 가축위생편 ). 23: , ) Böttcher B, Kiselev NA, Stel'Mashchuk VY, Perevozchikova NA, Borisov AV, Crowther RA: Three-dimensional structure of infectious bursal disease virus determined by electron cryomicroscopy. J Virol 71: , ) Brandt M, Yao K, Liu M, Heckert RA, Vakharia VN: Molecular determinants of virulence, cell tropism, and pathogenic phenotype of infectious bursal disease virus. J Virol 75: , ) Cullen GA, Wyeth PJ: Quantitation of antibodies to infectious bursal disease. Vet Rec 97: 315, ) Delmas B, Kibenge FSB, Leong JC, Mundt E, Vakharia VN, Wu JL: Birnaviridae. pp In Virus Taxonomy. Eighth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA (Ed), Academic Press, London, ) Fahey KJ, Erny K, Crooks J: A conformational immunogen on VP-2 of infectious bursal disease virus that induces virusneutralizing antibodies that passively protect chickens. J Gen Virol 70: , ) Fahey KJ, McWaters P, Brown MA, Erny K, Murphy VJ, Hewish DR: Virus-neutralizing and passively protective monoclonal antibodies to infectious bursal disease virus of

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