43(4)-13(063)(p ).fm

Size: px

Start display at page:

Download "43(4)-13(063)(p ).fm"

예희 미
5 years ago
Views:

1 The Korean Journal of Microbiology, Vol. 43, No. 4, December 2007, p Copyrightc2007, The Microbiological Society of Korea Human Immunodeficiency Virus (HIV) 검출을위한초고속이단계 PCR 진단법 이동우 김을환 유미선 김일욱 윤병수 * 경기대학교자연과학대학생명과학과 인간면역결핍바이러스 (Human Immunodeficiency Virus; HIV) 진단을위한초고속실시간 PCR 법을개발하였다. 검출대상의 DNA 염기서열은 495 염기 HIV-1 특이 env 유전자 (gi_ ) 및 294 염기 HIV-2 특이 env 유전자 (gi_ ) 를사용하였다. 초고속실시간 PCR 은 microchip 에 6μl 의 PCR 용액을탑재하는 Genspector TM (Samsung, Korea) 을사용하였으며, PCR 의각회전중단지두단계 (denaturation, annealing/extension) 를극단적으로짧은시간을주어수행하게하였다. 융점분석을포함한 30 회전의 PCR 검색시간은총 7 분 30 초이내에완료되었으며, HIV-1 특이 117 염기와 HIV-2 특이 119 염기의 PCR 산물은최소 개의각 env 유전자로부터 30 회전의 2 단계초고속 PCR 에의해성공적으로증폭시킬수있었다. 이러한초고속실시간 PCR 법은 HIV 의빠른검색뿐아니라, 다른병원체의빠른검색에도유용하게적용될수있을것이다. Key words HIV, human immunodeficiency virus, two step PCR, ultra-rapid real-time PCR 후천성면역결핍증후군 (acquired immunodeficiency syndrome; AIDS) 은전세계적으로가장중요한공중보건문제중에하나이다 (5). 후천성면역결핍증후군의병인체인 HIV (human immunodeficiency virus) 는 retrovirus로써, T 림프구, 마크로파지, 뇌세포등에주로감염되며, 잠복기를거친후, 이들세포의용해를일으키고, 결국면역계의손상을야기시킨다 (16). 다른 retrovirus들에의한질병과는달리피감염자가상대적으로긴생존기간을가지는 AIDS에서는피감염자가감염사실을분명히인지하여타인에게전파되는것을스스로차단하게하는것이매우중요하다. 일반적바이러스검색법과같이 HIV의검색에서도바이러스배양, Immuno Fluorescence Assay (IFA), Enzyme Linked Immunosorbant Assay (ELISA) 등이사용되고있으며, 이중바이러스배양법은민감도가높고정확하지만상대적으로배양등에많은시간을필요로하고, IFA와 ELISA는상대적으로빠른시간내에진단이가능하지만, 바이러스배양법에비해민감도와특이성이떨어지는것으로알려져있다 (13). 또한 branched DNA (b-dna), nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) 과같은방법들은 HIV 입자의정량적인측정을위해유용하게사용되고있으나 (11), 이러한방법들도판정까지의검사시간에상대적으로많은시간을필요로한다. 이들에비해 PCR 방법은높은민감도를가지고다량의검체를특이적이고도빠르게진단할수있다는장점이있으며, PCR *To whom correspondence should be addressed. Tel: , Fax: bsyoon@kyonggi.ac.kr 기술이발달함에따라여러가지 PCR 방법들이계속개발되어왔다 (4). 그중 real-time PCR은 PCR 산물의양적변화를형광시약을이용하여실시간으로측정할수있기에, 또한전기영동에의한시각적분석시간을줄이고, 보다민감하게 PCR 산물의정량적측정이가능하기에 (15), 근래바이러스를포함한다양한질병진단및특정유전자의검사등에 real-time PCR의적용에의한검사법이매우폭넓게응용되고있다 (2, 14). 진단에있어서검사에소요되는시간은피검사자가검사결과를인지하는데매우중요한요소이다. 일반적으로 AIDS감염자의 25~43% 만이, 그리고비감염자의 33~48% 만이그들의진단결과를통보받았다고보고되고있다 (1). 이러한 AIDS 진단결과에대한피검사자의낮은인지도는검체의채취부터진단결과통보까지이르는시간이현실적으로매우긴것이주된원인이며, 이는주로 1시간미만의즉석진단이기술적이유로불가능하기때문이라사료된다. 피검사자가자신의검사결과, 즉감염여부를인지하지못하는것은감염자자신의의지및공중보건이지향하는바와달리 HIV 감염을보다확산시키는결과를초래한다. 따라서신속한진단그리고검사결과의신속한통보는감염된개개인이그들의 AIDS 감염여부를정확하게인지하게하며즉시진료를받을수있도록하고, 더나아가 HIV 전파를감소시킬수있을것으로기대되고있다 (6, 12). 이와같이즉석진단을지향하는신속한 AIDS 진단법의필요성은큰기대를모으고있으나, 가장민감도가높은것으로기대되고있는 real-time PCR에근간을둔 AIDS 진단법에서도보통 1시간수준의 PCR 시간을필요로하고있기에즉석진단에이르기까지큰기술적장애가되고있었다. 이는기존의 real-time PCR 기기들이 96 well tube에적합한 thermal-block을사용하기 264

2 Vol. 43, No. 4 HIV 검출을위한초고속이단계 PCR 진단법 265 때문이며, thermal-block은 PCR의 3단계온도변화에적정온도로신속하게변화하는것과 block내균일하게적정온도를전달하는것에구조적문제점이있었기때문이다. 따라서상기의 thermal block을채용한 PCR 기기에서일반적으로사용되고있는 30회전의 PCR 시간을획기적으로감소시키는것은현실적으로어려우며, 실제로 PCR 용액내에 3단계의 PCR 설정온도를전달시키기위하여 thermal-block과기존의 PCR tube는일정한시간적한계가있는것으로알려져있다 (3). 보다빠른실시간 PCR을수행하기위하여열전도성이우수한실리콘과유리재질로제작된, micro-chip을기반으로한새로운 real-time PCR 기기가개발되었으며, 이는 1μl의 PCR 용액을사용하고, 실험적으로증명된빠른온도변화시간 (lamping time) 의구현을통해신속한 PCR이가능하게하였다 (3). Lee 등 (9) 은상기의 micro-chip을기반으로한 real-time PCR 기기를사용하고, 합성 HIV DNA를주형으로하여, 30회전의 1 μl-pcr로써 12~14분만에 HIV 특이유전자의존재를진단할수있는방법을개발하였고, 이런방식의빠른 PCR법을초고속 PCR (ultra-rapid PCR) 이라명명하였다. 또한 avian influenza virus (AIV) 를대상으로한 Kim 등 (8) 의연구는합성 AIV 특이염기서열 10 3 개 DNA분자를주형으로하여, 최단 12분 28초만에 AIV 특이염기서열에대한 30회전 PCR 증폭이가능함을보여주었다. 이러한연구들은우선일반 PCR에비하여초고속 PCR이실험에소요되는시간을획기적으로단축시킬수있음을보여주었고, PCR 용액내의분자들또한초고속에상응하는분자의운동, 즉 DNA 및 primer의 denaturation, annealing, Taq polymerase에의한중합반응등을충분히빠르게수행할수있음을추측하게하였다. 또한초고속 PCR을보다초고속으로진보시키기위하여 PCR 시간단축을위한기기의성능개선뿐아니라초고속에걸맞은최적 PCR 조건의확립이보다긴요할수있음을시사하였다. 병원체에대한유전자검사로써초고속 PCR법은우선병원체에대한즉석검사에보다근접할수있도록보다시간단축을추구하여야할것이며, 정확성과민감도를보다개선할수있도록개발되어야할것이다. 따라서, 본연구에서는초고속 PCR의시간을보다단축하기위하여, 합성 HIV-1 및 HIV-2 특이염기서열을주형으로이단계 (two step) PCR법을초고속 PCR에적용하였고이를최적화하였으며, 이를통하여융점분석시간을포함한 30회전의 HIV 특이초고속 PCR검출법에서최소 7분 24초의검출시간을기록하였기에이를보고하는바이다. 재료및방법 HIV1 및 HIV2 특이기질및검색용 primers 본연구에서사용한 PCR 검사용기질은 Lee 등 (9) 의연구에서설계및합성된 HIV1 및 HIV2 특이기질인 pbx-hiv1과 pbx-hiv2를사용하였다. pbx-hiv1과 pbx-hiv2는 HIV가다양한유전적변이를일으키는특성을가지고있기에미국생명공학정보센터 (National Center for Biotechnology Information) 에보고된 45종의 HIV1 env 유전자와 33종의 HIV2 env 유전자의염기서열을비교분석하여가장상동성이높은부분을선정한것이며, 이를인공유전자합성법인 long-nucleotide extension법 (7) 을사용하여제작하고클론화한것이다 (9). 또한상기의 HIV 특이기질에대한검색용 primer들도이등의연구 (9) 에서사용한 primer들을그대로사용하였으며, 이들 primer에대한정보는 Table 1에나타내었다. 초고속삼단계 PCR에서 annealing 온도증가의효과일반적 PCR에서사용되고있는각회전 (cycle) 의 3단계 (step), 즉 denaturation, annealing, polymerization을, 2단계 PCR (two steps PCR), 즉 denaturation, annealing 및 polymerization으로개선하고, 이를초고속 PCR에적용시키기위하여, 본연구에서는 annealing 온도상승에따른초고속삼단계 PCR에서 DNA 증폭효과를측정하였다. PCR의조성은최종반응액 6μl 내에 HIV1에대한 template DNA인 pbx-hiv1 ( copies), 10 pmole의 HIV1-dF primer, 10 pmole의 HIV1-dR primer, 2 greenstar master mix (Genetbio, Korea) 로조성하였으며 HIV2에대하여는 copies의 pbx-hiv2, 10 pmole의 HIV2-dF, 10 pmole의 HIV2- dr, 2 greenstar master mix로조성하였다. Real-time PCR 기기는 Genspector TM TMC-1000 (Samsung, Korea) 을사용하였으며, 차후모든 real-time PCR 반응은동일한기기를사용하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94 o C 30초를수행하고, denaturation 94 o C 1초, annealing 56~72 o C 1초, extension 72 o C 3초과정을 30회반복하였으며, 이후융점분석 (melting point analysis) 은 75~85 o C 구간을 lamping rate 0.1 o C/sec의속도로 1 o C 간격으로측정하여 Tm값을결정하였다. 초고속이단계 PCR과초고속삼단계 PCR의비교 HIV1 및 HIV2 특이기질을대상으로 annealing 온도를최적화시킨이단계초고속 PCR과 3단계초고속 PCR을각각수행하여각초고속 PCR의특성을비교하였다. PCR 조성은삼단계 PCR과이단계 PCR 모두최종반응액 6 μl 내에 HIV1의 template DNA인 pbx-hiv1 ( copies), 10 pmole의 HIV1-dF, 10 pmole의 HIV1-dR, 2 greenstar master mix (Genetbio, Korea) 로조성하였으며 HIV2에대하여는 template로 copies의 pbx-hiv2를, primer쌍으로 10 pmole의 HIV2-dF, 10 pmole의 HIV2-dF를사용하고나머지는같은조성으로하였다. 반응조건은 three step PCR의경우 predenaturation 94 o C 30초를수행하고, denaturation 94 o C 1초, annealing 67 o C (HIV-1의경우 ), 68 o C(HIV-2 의경우 ) 1초, extension 72 o C 3초과정을 30회반복하였으며, two step PCR은 pre-denaturation 94 o C 30초를수행하고, denaturation 94 o C 1초, annealing 및 extension으로 67 o C (HIV1), 68 o C (HIV2) 3초과정을 30회반복하였다. Melting point analysis는삼단계 PCR과이단계 PCR 모두 75~85 o C 구간을 lamping rate 0.1 o C/sec의속도로 1 o C 간격으로측정하여 Tm값을결정하였다.

3 266 Dong-Woo Lee et al. Kor. J. Microbiol 이단계초고속 PCR 에서 denaturation 온도감소효과 이단계초고속실시간 PCR에서 denaturation 온도가낮을수록실험소요시간을보다단축할수있을것으로판단되었으며, 이단계초고속 PCR에서 denaturation 온도의감소가 DNA 증폭에미치는효과를측정하였다. PCR의조성은최종반응액 6μl 안에 HIV1의특이 template DNA인 pbx-hiv1 ( copies), 10 pmole의 HIV1-dF, 10 pmole의 HIV1-dR, 2 greenstar master mix (Genetbio, Korea) 로조성하였으며 HIV2에대하여는 copies의 pbx-hiv2, 10 pmole의 HIV2-dF, 10 pmole의 HIV2-dR, 2 greenstar master mix로조성하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94 o C 30 초를수행하고, denaturation 88~94 o C 1초, annealing 및 extension으로 67 o C (HIV-1의경우 ), 68 o C (HIV-2 의경우 ) 각기 3초과정을 30회반복하였으며, 이후융점분석은앞의실험과같은조건으로수행하였다. 의최적조건 의최적조건을확립하기위하여 primer 농도별, MgCl 2 농도별, Taq polymerase 농도별 PCR에미치는영향을측정하였다. 우선 PCR 조성에서최적의 primer 농도를구하기위하여해당 primer쌍을각각 10 pmole, 20 pmole, 30 pmole, 40 pmole 로조정하고, primer를제외한나머지조성은 copies의 template DNA와 2 greenstar master mix로하여동일조건에서초고속 PCR을수행하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94 o C 30 초를수행하고, denaturation 90 o C 1초, annealing 및 extension으로 67 o C (HIV-1), 68 o C (HIV-2) 3초과정을 30회반복하였으며융점분석은앞의실험과동일하게수행하였다. 최적 MgCl 2 농도를구하기위하여 primer 농도별이단계실시간 PCR을통하여얻어진최적 primer 농도를기준으로, 최종부피 6μl에 copies의 template DNA와각 10 pmole의 forward/reverse primer, 2 greenstar master mix로조성하고, 각각의반응액에최종농도 2.0 mm, 2.5 mm, 3.0 mm, 3.5 mm이되도록 MgCl 2 를첨가하였다. 반응온도조건은 primer 최적조건을구한실험과동일한조건으로수행하였다. 또한, 얻어진최적 primer 농도와 MgCl 2 농도에서최적 Taq polymerase 농도를측정하기위해최종부피 6μl에 copies의 template DNA와 10 pmole 농도의 forward/reverse primer, 2 greenstar master mix로조성하고, 각각의반응액에 0.6 U, 1.0 U, 1.4 U, 1.8 U의 Taq polymerase가포함되도록하였으며, 반응조건은앞의실험과동일하게수행하였다. 의민감도측정 본연구에서확립한이단계초고속실시간 PCR의제반최적조건을사용하여 HIV 특이유전자를검출할수있는최소한계를측정하였다. HIV1 및 HIV2 특이유전자를 1 pg ( copies) 에서 1 fg ( copies) 까지단계별희석하여각기 PCR용액의조성에사용하였으며, 해당 primer쌍각 10 pmole, 2 greenstar master mix를첨가하여최종부피 6μl가되도록조성하였다. 이 PCR용액에서 MgCl 2 의최종농도는 2.0 mm이었으며, 6 μl의 PCR용액중 0.6 U Taq polymerase가포함되도록 master mix를새롭게조성하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94 o C 30초를수행하고, denaturation 90 o C 1초, annealing-extension으로 67 o C (HIV-1), 68 o C (HIV-2) 3초과정을 30회반복하였으며, 융점분석은 75~85 o C 구간을 lamping rate 0.2 o C/sec의속도로 1 o C 간격으로측정하여 Tm값을결정하였다. 의재현성 본연구에서확립한이단계초고속실시간 PCR의제반최적조건을사용하여 HIV 특이유전자의농도별재현성을측정하였다. PCR의조성은최종반응액 6μl 내에 10 pg ( copies) 에서 10 fg ( copies) 까지의 pbx-hiv1 DNA를포함시켰고, 또한 10 pmole의 HIV1-dF, 10 pmole의 HIV1-dR, 2 greenstar master mix로조성하였으며 HIV-2에대하여는 10 pg ( copies) 에서 1 fg ( copies) 의 pbx-hiv2를각기사용하였으며, 10 pmole의 HIV2-dF, 10 pmole의 HIV2-dR, 2 greenstar master mix로조성하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94 o C 30초를수행하고, denaturation 90 o C 1초, annealingextension으로 67 o C (HIV-1), 68 o C (HIV-2) 3초과정을 30회반복하였으며, 융점분석은전의실험과동일하게하였고, 이를 3회반복하여 Ct값및 Tm값의평균을측정하였다. 결과및고찰 초고속삼단계 PCR 에서 annealing 온도증가의효과 초고속실시간 PCR을사용한 HIV 검출법의기존연구 (9) 는삼단계 PCR법을사용하였고, 30회전의 PCR검출에서 12분대의실험시간이소요되는것으로보고되었다. 초고속실시간 PCR을보다초고속으로수행하기위하여이단계 PCR법의적용은보다효과적일것으로예측되었으며, 이를위하여삼단계 PCR에서 annealing 온도의상승이초고속실시간 PCR에미치는영향을측정하였다. HIV-1 특이유전자를기질로한실험에서 annealing 온도의설정범위는일반적인 extension 온도인 72 o C까지, 즉 62 o C에서 72 o C 까지로측정하였으며, HIV-2 특이유전자의경우 56 o C 에서 72 o C까지를측정하였다. HIV-1 및 HIV-2 특이유전자를증폭시키는 30회전의초고속 PCR에서양자모두 annealing 온도를증가시킬수록초고속 PCR 에필요한총소요시간은크게단축되는것이확인되었다. 그러나 HIV-1 의경우 70 o C, 72 o C의 annealing 온도에서의초고속 PCR은 Ct값이측정되지아니하였으며, Tm값도 72 o C에서는측정

4 Vol. 43, No. 4 HIV 검출을위한초고속이단계 PCR 진단법 267 되지아니하였다. 또한 HIV-2 의경우 Ct값은 56에서 72 o C까지모두측정되었으나, annealing 온도 72 o C의초고속 PCR에서 Ct 값이크게증가된것을볼수있었다 (Fig. 1). 초고속 PCR에서 annealing 온도를증가시킬수록초고속 PCR 에필요한총소요시간은크게단축되는것은 denaturation 온도와 annealing 온도의차가좁혀지기때문에각회전에서온도이동에소요되는시간이각기감소되었기때문으로해석되었다. 한편, Ct값이측정되지아니한 HIV-1 의 70 o C의 annealing 온도에서의초고속 PCR은 PCR 생성물의양을의미하는형광강도가동실험의 25 cycle 부분에서부터증가되는것이확인되었으나, 72 o C에서의같은실험의경우 30회전이후에도형광값의변화를확인할수없었다 ( 자료미제시 ). 이는실험에사용된 HIV-1 특이염기서열과 HIV1-dF 및 HIV1-dR primer 쌍의염기서열간 annealing의강도가이온도및초고속의시간조건에서효과적인 annealing이되지않는다는것을의미하는것으로해석되었다. HIV-1 특이유전자를증폭시키는 30회전의초고속 PCR에서최적 annealing온도는우선가장낮은 Ct값과가장높은 Tm값을보여준 65 o C로나타났으나, 본연구에서는초고속 PCR의목적 Table 1. Sequence of HIV env specific detection primers (Lee et al., 2007) Name Sequence (5'-3') nt a GC% GC%3' b Amplicon HIV1-dF cgcctcaatagccctcagca 20 60% 70% 117 bp HIV1-dR ttgggagcagcaggaagcac 20 60% 60% HIV2-dF cagccagccaacgaaggaac 20 60% 50% 119 bp HIV2-dR cccgatcaagaggcgagtca 20 60% 60% a nucleotides GC% of half primer in 3' direction 을추구하기위하여 annealing 온도 65 o C에서나타난 Ct값보다 0.4 회전이증가되었으나, 최종반응시간에서약 35초를단축시킨 annealing 온도 67 o C를최적온도로선정하였다. 한편 HIV-2 특이유전자를증폭시키는 30회전의초고속 PCR 에서최적 annealing 온도는가장낮은 Ct값을보여준 68 o C로나타났으며, 그이상의 annealing 온도에서초고속 PCR은 PCR 산물의생성량이크게감소되고또한 Ct값이크게증가하여초고속 PCR에적합하지아니한것으로판단되었다. 본연구에서사용된 primer들은염기의길이, GC% 및 amplicon의크기가모두일정한 primer들이며 (Table 1), 이런 primer들도초고속 PCR에서 HIV-1 과 HIV-2 의경우와같이다른 annealing 강도를보이는것은 primer 쌍의염기서열간의차이로해석되며, 초고속 PCR에적합한 primer의염기서열은더연구될필요가있을것으로판단되었다. Fig. 1. Effects of annealing-temperature in HIV specific ultra-rapid real-time PCR. (A) Annealing-temperature gradient ultra-rapid PCR for HIV1. Ct values could not be calculated with 30 cycled PCR in the annealing temperature between 70 o C and 72 o C. Tm was also not estimated in 72 o C of annealing. (B) Annealing-temperature gradient ultra-rapid PCR for HIV2. Ct values rapidly increased around 72 o C of annealing. Optimum temperatures for annealing were determined on 67 o C (HIV 1) and 68 o C (HIV2) in HIV specific ultra-rapid real-time PCR, respectively. 이단계초고속 PCR과삼단계초고속 PCR의비교초고속삼단계실시간 PCR을통하여얻어진최적의 annealing 온도에서초고속이단계 PCR의결과와초고속삼단계 PCR의결과를비교하였다. 우선, 융점분석 (Melting-temperature analysis) 과 30회전의 PCR 을포함한전체검색시간에서초고속이단계 PCR이초고속삼단계 PCR보다 30초내외의시간을단축할수있는것으로측정되었다. 한편, 반복된실험에서동일한초고속 PCR에서도총검색시간이약 4초수준의차이가나는것이발견되었으며, 이는초고속 PCR 기기의적정온도보정과정에서미세한시간차가증폭되기때문에발생되는시간적오차로판단되었다. HIV1 및 HIV2 특이서열을각기대상으로한실험모두에서이단계초고속 PCR과삼단계초고속 PCR의 Ct값은실험오차범위의차이만을보였으며, 이는이단계와삼단계 PCR간의 DNA 증폭효과에서는차이가없는것으로해석되었다. 한편 Tm값에서도 HIV-1 과 HIV-2 의실험모두, 이단계초고속 PCR과삼단계초고속 PCR은실험오차범위의작은차이만을보였으며, 이역시이단계및삼단계초고속 PCR에서 DNA 증폭효과에서는별다른차이가없는것으로해석되었다. 본실험에서초고속 PCR 기기를통하여적용된삼단계초고속 PCR과이단계초고속 PCR의차이는, 사실각 annealing 온도에서반응시간을 2초에서 1초로줄인것이다. 결과적으로초고

268 Dong-Woo Lee et al. Kor. J. Microbiol 속 PCR에이단계 PCR법을적용시킨것은삼단계초고속 PCR 에서보여준 Ct값과 Tm값의변화없이총실험시간만을 30초줄일수있었던것으로나타났으며, 이는이단계초고속 PCR이총검색시간의단축에서보다유리함이확인된것이다 (Fig. 2).

결과는 HIV1과 HIV2 특이서열을대상으로한실험모두에서 94 o C, 92 o C, 90 o C에서는정상적 PCR산물의증폭에의한형광값의증가를확인할수있었으나, 88 o C에서는형광값의증가, 즉 PCR 산물의증폭을관찰할수없었다.

5 268 Dong-Woo Lee et al. Kor. J. Microbiol 속 PCR에이단계 PCR법을적용시킨것은삼단계초고속 PCR 에서보여준 Ct값과 Tm값의변화없이총실험시간만을 30초줄일수있었던것으로나타났으며, 이는이단계초고속 PCR이총검색시간의단축에서보다유리함이확인된것이다 (Fig. 2). 이단계초고속 PCR에서 denaturation 온도감소효과이단계초고속 PCR에서보다검사시간을단축하기위하여, 정확한 PCR 증폭이손상되지않는범위에서가장낮은수준의 denaturation 온도를측정하고자하였다. 모든조건은이단계초고속 PCR의기본조건과동일하게수행하였으며 denaturation 온도를 88~94 o C까지 2 o C 간격으로측정하며비교하였다. 결과는 HIV1과 HIV2 특이서열을대상으로한실험모두에서 94 o C, 92 o C, 90 o C에서는정상적 PCR산물의증폭에의한형광값의증가를확인할수있었으나, 88 o C에서는형광값의증가, 즉 PCR 산물의증폭을관찰할수없었다. 또한 denaturation 온도 90~94 o C에서모든초고속 PCR의 Ct값및 Tm값은큰차이를보이지않았기에, 최소의 PCR 소요시간을보여준, 가장낮은 denaturation 온도인 90 o C를 HIV1과 HIV2 특이서열의검출을위한초고속이단계 PCR의최적 denaturation 온도로결정하였다. 실제로본실험에서 90 o C를 denaturation 온도로적용한초고 속이단계 PCR은 30회전의 PCR 실험과융점분석시간을포함하여, 94 o C를 denaturation 온도로적용한동일실험보다 40초이상소요시간감소효과를보였으며, 최종적으로 HIV1을증폭대상으로한이단계초고속 PCR의경우 30회전의 PCR 실험과융점분석시간을포함하여, 7분 32초, HIV-2 의경우 7분 24초에해당특이 DNA 검출이가능하였다 (Fig. 3). 의최적조건 의최적온도및시간의조건에서, primer 농도, MgCl 2 농도, Taq polymerase 농도등제반조성조건의영향을측정하였다 (Fig. 4). 각실험은 Ct값을기준으로특이 DNA의 PCR 증폭효과의증감으로판정하였다. 먼저 primer 농도에따른초고속 PCR의 DNA 증폭효과는 10 pmole에서 40 pmole까지의범위에는큰차이가없는것으로나타났으나, 30 pmole 이상의 primer 농도 Fig. 2. Comparison between three-step PCR and two-step PCR in ultra-rapid real-time PCR. (A) HIV1 ultra-rapid real-time PCR. Differences between two kind of PCRs were 0.06 cycle in Ct value, 0.23 o C in Tm and 23 sec in total time of 30 cycled PCR. (B) HIV2 ultra-rapid real-time PCR. Differences between PCRs were 0.65 cycle in Ct value, 0.19 o C in Tm and 31 sec in total time of PCR. Fig. 3. Effects of denaturation-temperature in HIV specific ultra-rapid real-time PCR. (A) Denaturation-temperature gradient ultra-rapid PCR for HIV1. Ct values and Tm could not be calculated with 30 cycled ultra-rapid PCR in 88 o C of denaturation. (B) Denaturationtemperature gradient ultra-rapid PCR for HIV2. Ct values and Tm were also not calculated in 88 o C of denaturation. Optimum temperature for denaturation was determined on 90 o C for HIV specific ultra-rapid real-time PCR.

6 Vol. 43, No. 4 HIV 검출을위한초고속이단계 PCR 진단법 269 값이크게증가하는것을볼수있었다. HIV-2 의경우는 MgCl 2 의농도를 2 mm에서그이상으로증가시킬수록 Ct값이증가하였으나, 그증가의정도가 HIV-1 의경우에비하여상대적으로적게나타났다. 따라서일반 PCR의경우와같이 MgCl 2 의농도는초고속 PCR에서도성공적 PCR을위한중요변수로판단되었으며, 이는 template와 primer들의염기서열에따라변화될수있음을확인하였다. 본 HIV 이단계초고속 PCR에서최적 MgCl 2 의농도는모두 2 mm로결정하였다 (Fig. 4B). 한편 Taq polymerase 농도에따른초고속 PCR의 Ct값, 즉 DNA 증폭효과에대한실험결과는 HIV-1 과 HIV-2 모두에서 Taq polymerase의농도가 0.6 unit 이상으로증가할수록 Ct값이높아지는것으로나타났으며, 결과적으로 PCR 산물의생산량이낮아지는것으로나타났다. 이는본연구에서사용된 micro-chip based PCR의반응액총량이 6μl의소량이기에, 0.6 unit이상은이미과량으로기질및 primer들의원활한활동을제한하기때문으로해석되었다 (Fig. 4C). Fig. 4. Optimum conditions of HIV specific two-step ultra-rapid realtime PCR. (A) Effects of primer concentrations. (B) Effects of MgCl 2 concentration. (C) Effects of Taq polymerase concentration. Optimum conditions of HIV specific two-step ultra-rapid real-time PCR were determinated on 10 pmole of each primers, 2.0 mm of MgCl 2 concentration, and 0.6 unit of Taq polymerase. 에서는형광의절대값, 즉 PCR 생성물의양이상대적으로조금감소되는결과를보여주었다. 또한 30 pmole 이상의 primer 농도에서 Tm값들도상대적으로조금낮아진것이관찰되었으며, 이는상대적으로적게생성된 PCR 산물들이과다투여로잔류된 primer의영향을받아 Tm의측정에서상대적으로낮게나온것으로추론되었다. Primer의과다투여가긍정적영향을보이지아니하는것을감안하여 의최적 primer의농도는 10 pmole로결정하였다 (Fig. 4A). 또한 MgCl 2 농도에따른초고속 PCR의 Ct값, 즉 DNA 증폭효과는 MgCl 2 농도에따라 Ct값이크게변화되는것으로관찰되었으며, 특히 HIV-1 의특이염기서열을증폭대상으로하였을경우, MgCl 2 의농도를 2 mm에서그이상으로증가시킬수록 Ct 의민감도 본연구를통하여확립된 의최적조건을사용하여 HIV-1 및 HIV-2 특이유전자의각검출한계를측정하였다. 초기기질의양은각특이유전자의분자량에따른분자의수를계산하였으며, 이분자수를검출한계의단위로사용하였다 (Fig. 5). 민감도측정의결과, HIV-1 또는 HIV-2 특이유전자 1 pg ( copies), 100 fg ( copies), 10 fg ( copies) 에서초고속이단계 PCR은각각의유전자를성공적으로증폭할수있었으며, 각초기기질의양에대한각 Ct값의비에서매우우수한정량성을보여주었다. 또한이초고속 PCR에소요된총검출시간도, 융점분석의시간을포함하여, 7분 24초에서 7분 35초로측정되어이단계초고속 PCR의우수성을보여주었다. 그러나 HIV1 및 HIV2 각기 1 fg ( copies) 에대한 30회전의초고속 PCR에서는 Ct값이측정되지아니하였으며, 이는본실험의초기기질의양에대한정량성에비추어 Ct값이각기 30 회전이후나타나기때문으로해석되었다. 사실본연구의초고속이단계 PCR의조건에서 PCR의회전수만 40 회전으로증가시켰을경우, 총소요시간은 9분대로증가되나민감도는각기이등의연구 (9) 와같이초기기질 0.01 fg (2.3 copies) 의 HIV1 및 HIV2의유전자를증폭시킬수있었으며, 각기 35회전이내에서 Ct값이형성되는것을볼수있었다 ( 자료미제시 ). PCR 산물에대한정성적측정의방법인융점분석 (melting point analysis) 에서 Tm값은 HIV1의경우 82.5(±0.1) o C로측정되었으며, HIV2는 82.6(±0.3) o C로측정되어, 각기동일한 PCR 산물을증폭시켰음을확인하였다. 의정확성 본연구에서개발된 HIV 특이유전자검출을위한이단계초

7 270 Dong-Woo Lee et al. Kor. J. Microbiol Fig. 6. Reproducibility of HIV two-step ultra-rapid real-time PCR. (A) HIV1 specific ultra-rapid PCR. PCRs were triplicated with 10- fold serially diluted initial templates. Ct values and error range were calculated 28.09±0.32 cycles in 10 fg ( copies), 24.56± 0.30 cycles in 100 fg, 21.55±0.29 cycles in 1 pg, 18.25±0.05 cycles in 10 pg, respectively. R 2 is coefficient of regression. (B) HIV2-specific ultra-rapid PCR. Ct values and error range were calculated 27.45± 0.73 cycles in 10 fg ( copies), 24.91±0.14 cycles in 100 fg, 21.91±0.30 cycles in 1 pg, 19.02±0.21 cycles in 10 pg, respectively. Fig. 5. The sensitivity of HIV specific two-step ultra-rapid real-time PCR. Ultra-rapid real-time PCRs were performed with 10-fold serially diluted initial template ranging from 1 fg ( copies) to 1 pg ( copies). (A) The fluorescence (F) curves of each PCRs with initial HIV1 specific templates. The Ct values (vertical dotted lines) were calculated from the curves of -df/dt cycles in 1pg of initial template, cycles in 100 fg, cycles in 10 fg. Ct value in 1 fg could not be determined. (B) Melting temperature analysis between 75 o C and 85 o C in HIV1-specific ultra-rapid PCR. Tm values (vertical dotted lines) were calculated on 82.5±0.1 o C. Total detection times including 30 cycled PCR and melting temperature analysis was estimated 7 min and 33±2 sec. (C) The fluorescence (F) curves of each PCRs with HIV2-specific templates. The CT values (vertical dotted lines) were calculated, cycles in 1 pg of initial template, cycles in 100 fg, cycles in 10 fg. Ct value in 1 fg was not determinated. (D) Melting temperature analysis in HIV2- specific ultra-rapid PCR. Tm values were calculated on 82.5±0.3 o C. Total detection times were estimated 7 min and 25±3 sec. 고속실시간 PCR의정확성을측정하기위하여, 동일한양의초기기질을증폭대상으로하여 HIV1 및 HIV2의초고속 PCR을반복실험하였다. 사용된초기기질의양은 HIV1 및 HIV2 각기 10 pg ( copies), 1 pg ( copies), 100 fg ( copies), 1 fg ( copies) 이었으며이를각기삼반복측정하여그오차를계산하였다 (Fig. 6). 측정결과중 HIV-1 의경우, 각농도별 Ct값의평균과오차의범위는초기기질의양 10 pg에서 18.25±0.05, 1 pg에서 21.55± 0.29, 100 fg에서 24.56±0.30, 10 fg에서 28.09±0.32로측정되었으며, 회귀식은 Y=-3.194X+31.22로, 회귀상수 (R 2 ) 는 로계산되었고, Tm값은 82.5±0.2 o C로나타났다. 한편, HIV-2 의경우는회귀식이 Y=-2.829X 로, 회귀상수 (R 2 ) 는 로계산되었으며, Tm값은 82.5±0.35 o C로측정되어양자모두에서우수한재현성을보여주었다.

8 Vol. 43, No. 4 HIV 검출을위한초고속이단계 PCR 진단법 271 본연구는 12분수준의진단시간을보여준 HIV 초고속 PCR 에대한기존연구 (9) 에새로이이단계 PCR법을적용하여동등의진단, 즉융점분석을포함한 30회전의 HIV 특이 DNA의 PCR 증폭이 7분대수준에서가능함을보여줄수있었다. 사실, 본연구에서보여준 7분 24초의검색시간은융점분석에필요한 100초, 즉 1분 40초가포함된것이며, 따라서 pre-denaturation을포함한 30회전의 PCR 증폭에소요된시간은정확히 5분 44초에불과한것이다. 5분-PCR을목표로한초고속 PCR은우선그소요시간으로목표에거의근접하고있으며관련기술들의발전으로더욱빠른초고속 PCR이가능할것으로예상된다. PCR을이용한병원체의유전자진단법들은일반적으로병원체의특이항원을특이항체로검색하는 immunochromatography법에비하여현장적용에서불리한것으로평가되어왔다. PCR법의민감도는일반적으로면역학적방법에비하여크게우수한것으로평가되고있으나, 특히별도의장비가필요없는 rapid kit (lateral flow immunochromatography법 ) 들은그간편성과 15분이내라는짧은진단시간, 즉신속성으로인하여일반적으로낮은민감도를보임에도불구하고현장에서선호되어왔다. 본연구에서보여준 7분대의초고속 PCR 진단법은 PCR이가지고있는높은민감도를크게희생시키지아니하며, rapid kit에서보여준 15분대의진단이라는신속성을앞지를수있는가능성을보여준것이다. PCR 기기라는특수기기를필요로한다는단점은차후수요에따른 PCR 기기의소형화개발등의노력으로쉽게극복될수있을것이라기대하며, 실시간 PCR이가지고있는또다른장점인정량성, 즉병원체의정량적진단이가능한점을감안한다면, 초고속실시간 PCR 진단법은간이진단이아닌정밀진단을현장에서바로적용시킬수있는민감하고도신속한진단방법이될수있을것이다. 본연구에서는초고속실시간 PCR법의개발에집중하여 RNA virus인 HIV의진단에필요한과정인초고속역전사반응 (reverse transcription) 을제시하지아니하였으며, 임상시료를사용한검출실험등의결과를보여주지는못하였다. 이러한후속실험들은본연구의주제인 HIV에대한초고속 PCR 진단법의현장적용에꼭필요한과정이며향후상기연구의정립으로 HIV의임상진단에초고속 PCR법이활용되기를기대하며더나아가많은 RNA virus에의한진단법에도초고속실시간 PCR법이적용되기를기대한다. 감사의말본연구는농림부농림기술개발사업 ( 과제번호 HD120) 과농촌진흥청바이오그린21사업 ( 과제번호 ) 의지원에의해수행되었으며, 지원에감사드리는바입니다. 참고문헌 1. Arens, M.Q., L.M. Mundy, D. Amsterdam, J.T. Barrett, D. Bigg, D. Bruckner, B. Hanna, H. Prince, T. Purington, T. Hanna, R. Hewitt, C. Kalinka, T. Koppes, S. Maxwell, A. Moe, M. Doymaz, M. Poulter, M.S. Tehrani, L. Simard, D.W. Carmody, J. Vidaver, C. Berger, A.H. Davis, and M.T. Alzona Preclinical and clinical performance of the efoora test, a rapid test for detection of human immunodeficiency virus-specific antibodies. J. Clin. Microbiol. 43, Baczynska, A., H.F. Svenstrup, J. Fedder, and S. Birkelund Development of real-time PCR for detection of mycoplasma hominis. BMC Microbiol. 35, Cho, Y.K., J.T. Kim, Y.S. Lee, Y.A. Kim, K. Namkoong, H.K. Lim, K.W. Oh, S.H. Kim, J.I. Han, C.S. Park, Y.E. Pak, C.S. Ki, J.R. Chio, H.K. Myeong, and C. Ko Clinical evaluation of micro-scale chip-based PCR system for rapid detection of hepatitis B virus. Biosens. Bioelectron. 21, Ellis, J.S. and M.C. Zambon Molecular diagnosis of influenza. Rev. Med. Virol. 12, Graham, N.M.H Epidemiology of acquired immunodeficiency syndrome: advancing to an endemic era. Am. J. Med. 102, Gupta, A. and V.K. Chaudhary Bifunctional recombinant fusion proteins for rapid detection of antibodies to both HIV-1 and HIV-2 in whole blood. BMC Biotechnol. 6, Han, S.H., Y.K. Lim, and B.S. Yoon Manual of methods for molecular biology, 3rd (ed.), p Kyonggi University Press, Suwon, Korea. 8. Kim, E.H., D.W. Lee, S.H. Han, S.H. Kwon, and B.S. Yoon Rapid detection method of Avian Influenza subtype H5N1 using quick real-time PCR. Kor. J. Microbiol. 43, Lee, D.W., E.H. Kim, M.S. Yoo, S.H. Han, and B.S. Yoon Ultra-rapid real-time PCR for the detection of human immunodeficiency virus (HIV). Kor. J. Microbiol. 43, Mello, A.J DNA amplification moves on. Nature 422, O Shea, J., I. Chrystie, R. Cranston, J. Mullen, K. Corbett, G. Murphy, J.V. Parry, A.D. Ruiter, and J. Banatvala Problems in the interpretation of HIV-1 viral load assays using commercial reagents. J. Med. Virol. 61, Palmer, S., A.P. Wiegand, F. Maldarelli, H. Bazmi, J.M. Mican, M. Polis, R.L. Dewar, A. Planta, S. Liu, J.A. Metcalf, J.W. Mellors, and M. Coffin New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J. Clin. Microbiol. 41, Poddar, S.K Influenza virus types and subtypes detection by single step single tube multiplex reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and agarose gel electrophoresis. J. Virol. Methods 99, Ratti, C., G. Budge, L. Ward, G. Clover, C. Autonell, and C. Henry Detection and real-time quantitation of soil-bornecereal mosaic virus (SBCMV) and polymyxa graminis in winter wheat using real-time PCR (Taqman). J. Virol. Methods 122, Wilhelm, J. and A. Pingoud Real-time polymerase chain reaction. Chem. Bio. Chem. 4, Yapijakis, C., V. Panis, N. Koufaliotis, G. Yfanti, S. Karachalios, A. Roumeliotou, and Z. Mantzavinos Immunological and molecular detection of human immunodeficiency virus in saliva, and comparison with blood testing. Eur. J. Oral Sci. 114, (Received November 29, 2007/Accepted December 17, 2007)

9 272 Dong-Woo Lee et al. Kor. J. Microbiol ABSTRACT : Ultra-Rapid Two-Step Real-Time PCR for the Detection of Human Immunodeficiency Virus (HIV) Dong-Woo Lee, Eul-Hwan Kim, Il-Uk Kim, Mi-Sun Yoo, and Byoung-Su Yoon* (Department of Life Science, Kyonggi University, Suwon , Korea) For the detection of human immunodeficiency virus (HIV), ultra-rapid real-time PCR methods were developed. The target DNA sequences were used 495 bp HIV-1-specific env gene (gi_ ) and 294 bp HIV-2-specific env gene (gi_ ). Ultra-rapid real-time PCR was performed by Genspector TM (Samsung, Korea) using microchip-based, 6 μl of reaction volume with extremely short running time in only 2 steps (denaturation, annealing/extension) in each cycle of PCR. Total reaction for 30 cycled ultra-rapid PCR detection including melting temperature analysis was completed in 7 min and 30 sec. The HIV-1-specific 117 bp-long or HIV-2-specific 119 bp-long PCR products were successfully amplified from the minimum of template, copies of each env gene using 30 cycled two-steps ultra-rapid PCR. This kind of ultra-rapid real-time PCR method would be useful not only for the rapid-detection of HIV, but also rapid-detection of other pathogens.

43(1)-4(p.23-30).fm

43(1)-4(p.23-30).fm The Korean Journal of Microbiology, Vol. 43, No. 1, March 2007, p. 23-30 Copyright 2007, The Microbiological Society of Korea Quick Real-time PCR w Avian Influenza Virus Subtype H5N1 ½ yá Áw zá«y 1 Á *»