식품의기준및규격고시에따른식품의미생물시험방법 ( 축산물공전통합 )

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1 식품의기준및규격고시에따른식품의미생물시험방법 ( 축산물공전통합 )

2 Microbiology for Clinical Food & Beverage Pharmaceutical Environmental Verterinary Culture Media (Dehydrated and Prepared Media) Quality Control Organism (Quanti-Cult Plus, Culti-Loops) Antimicrobial Susceptibility Testing Environmental Monitoring Atmosphere Generation Diagnostics Oxoid and Remel, specialty microbiology brands of the Thermo Fisher Scientific Corporation, have been synonymous with microbiology for the last 50 years, and trusted sources of microbiological expertise. We truly value delivering quality products developed by microbiologists, for microbiologists. As we continue to see laboratories search for new sources of automation and more advanced technologies, we are committed to developing solutions that not only address these challenges, but ultimately advance the world of microbiology. As part of a renewed focus on technology for microbiology laboratories, the Oxoid and Remel product lines are being brought together under the Thermo Scientific brand, part of Thermo Fisher Scientific. Combining these recognized microbiology brands with the industry-leading Thermo Scientific product portfolio, Thermo Scientific products are bringing more to microbiology, through powerful technologies designed to meet the evolving needs of microbiologists around the world. Commitment to service by management and staff, combined with technical support via field-based Technical Consultants and in-house technical support staff, allows our business to continually improve the products and services provided to the Canadian marketplace. Recent expansion of the Oxoid brand prepared media manufacturing facility and distribution centres was centered on ensuring that we continue to build on our present position as market leader, providing a range of high quality, innovative products backed by industr leading service levels. Thermo Scientific clinical, food and pharmaceutical products provide the ultimate in reliable performance for quality results delivered by the experts in the science of microbiology! Tel Fax 일반문의 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com OXOID REMEL 제품설명서찾기 제품성적서찾기 2 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

3 미생물시험법목차 제7.4.1 ~ 제7.4.3 일반사항, 기구및재료, 시험용액의제조... 4~5 제7.4.4 배지및시액... 6 제 세균수 제 세균발육시험 제 대장균군 제 대장균 (Escherichia coli) 제 유산균수 제 진균수 ( 효모및사상균수 ) 제 살모넬라 (Salmonella spp.) 제 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 제 장염비브리오 (Vibrio Parahaemolyticus) 제 클로스트리디움퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 제 리스테리아모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 제 장출혈성대장균 (Enterohemorrhagic E. coli) 제 여시니아엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica) 제 바실러스세레우스 (Bacillus cereus) 제 캠필로박터제주니 / 콜리 (Campylobacter jejuni/coli) 제 클로스트리디움보툴리눔 (Clostridium botulinum) 제 엔테로박터사카자키 (Enterobacter sakazakii [Cronobacter spp.]).. 59 제 탄저균 (Bacillus anthracis) 제 결핵균 제 브루셀라 (Brucella) 부록미생물배양배지사용법과주의사항 부록식품안전을위한 ISO 방법 부록배지및시약가이드 부록기체생성시스템 (AGS) 선택안내 부록 Oxoid Chromogenic Media, Brilliance TM... 89!! 본자료는식품의약품안전처의 " 식품의기준및규격 " 을기반하여개정고시제 호 ( ) 를반영하여제작하였으며, 사용자의편의를위해식품공전의배지및시액에해당하는 ThermoFisher 의제품또는대체하여사용할수있는제품을표시한참고용자료입니다. 반드시, 식품공전및제품매뉴얼을함께참고하시기바랍니다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 3

4 제 7.4.1~2 일반사항, 기구및재료 미생물학적검사를위해서는반드시모든과정이무균적으로수행되어야하며동시에시험과정중의교차오염을방지하기위해실험실내는항상청결을유지하여야한다. 4.1 일반사항 검체의채취가. 검체채취기구는미리핀셋, 시약스푼등을몇개씩건열및화염멸균을한다음검체 1건마다바꾸어가면서사용하여야한다. 나. 검체가균질한상태일때에는어느일부분을채취하여도무방하나불균질한상태일때에는여러부위에서일반적으로많은양의검체를채취하여야한다. 다. 미생물학적검사를하는검체는잘섞어도균질하게되지않을수있기때문에실제와는다른검사결과를가져올경우가많다. 라. 미생물학적검사를위한검체의채취는반드시무균적으로행하여야한다. 마. 미생물규격이 n, c, m, M으로표현된경우, 정하여진시료수 (n) 만큼검체를채취하여각각을시험한다. 바. 소, 돼지의도체표면에서시료채취시는금속, 알루미늄호일또는골판지등으로된시료채취틀이필요하다. 금속틀을재사용할경우소독수에담근후증류수로세척및건조시켜사용하고알루미늄호일, 골판지등은종이로포장하여멸균한후 1회용으로사용한다. 사. 소및돼지등의도체는표면 (10 cm 10 cm) 의 3개부위에서채취하여검사하는것을원칙으로하고부득이한경우에 1개부위 ( 흉부표면 ) 에서채취하여검사할수도있으며, 닭의도체는 1마리전체를세척하여검사함을원칙으로한다. 아. 기타제반사항은제9. 검체의채취및취급방법을참고하여따른다 확인시험가. 균의확인시험에서각종생화학시험은국제적으로공인된 kit 또는장비를이용할수있다. 나. 식중독균정량검사시계수된집락수가규격치이하일경우확인시험을생략할수있다 기구및재료가. 무균대 (Clean bench) 나. 고압멸균기 (Autoclave) 다. 원심분리기 (Centrifuger) 라. 교반기 (Stirrer) 마. 건조기 (Dry Oven) 바. 배양기 (Incubator), CO2 배양기, 혐기배양 Jar 사. 항온수조 (Water Bath, 자동온도조절기능함유 ) 아. 균질기 (Stomacher 또는 Homogenizer) 자. 냉동및냉장고 (-70 Freezer 포함 ) 차. 초순수제조장치 (Ultra Pure Water System) 카. 집락계산기 (Colony Counter) 타. 수소이온농도측정기 (ph meter) 파. 피펫 (1 ml, 5 ml, 10 ml 등 ) 하. 시험관 (Test Tube, mm 등 ) 거. 발효관 (Durham tube, Smith tube) 너. 페트리접시 (Petridish) 더. 광학현미경 (Optical microscope) 러. 슬라이드 / 커버글라스머. 알콜램프, 백금이, 백금선등버. 표준항혈청 ( 대장균, 살모넬라, 리스테리아등 ) 4 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

5 제 시험용액의제조 서. Guinea pig( g), 마우스 (12 15 g) 4.3 시험용액의제조 가. 미생물검사용시료는 25 g(ml) 을대상으로검사함을원칙으로한다. 다만시료량이적은불가피한경우그이하의양으로검사할수도있다. 나. 미생물정성시험을할때 5 개시료에서각각채취한 25 g(ml) 을검사하거나 5 개시료에서 25 g(ml) 씩채취하여섞은 (pooling) 125 g(ml) 을검사할수있다. 다. 채취한검체는희석액을이용하여필요에따라 10 배, 100 배, 1,000 배등단계별희석용액을만들어사용할수있다. 라. 희석액은멸균생리식염수, 멸균인산완충액등을사용할수있다. 단, 별도의시험용액제조법이제시되는경우그에따른다. 마. 검체를용기포장한대로채취할때에는그외부를물로씻고자연건조시킨다음마개및그하부 5~10 cm의부근까지 70% 알코올탈지면으로닦고, 화염멸균한후냉각하고멸균한기구로개봉, 또는개관하여 2차오염을방지하여야한다. 바. 지방분이많은검체의경우는 Tween 80과같은세균에독성이없는계면활성제를첨가하는것이좋다. 사. 실험을실시하기직전에잘균질화하고검사검체에따라다음과같이시험용액을제조한다. 1) 액상검체 : 채취된검체를강하게진탕하여혼합한것을시험용액으로한다. 2) 반유동상검체 : 채취된검체를멸균유리봉또는시약스푼등으로잘혼합한후그일정량 (10~25 ml) 을멸균용기에취해 9배양의희석액과혼합한것을시험용액으로한다. 3) 고체검체 : 채취된검체의일정량 (10~25 g) 을멸균된가위와칼등으로잘게자른후희석액을가해균질기를이용해서가능한한저온으로균질화한다. 여기에희석액을가해서일정량 (100~250 ml) 으로한것을시험용액으로한다. 4) 고체표면검체 : 검체표면의일정면적 ( 보통 100 cm2) 을일정량 (1~5 ml) 의희석액으로적신멸균거즈와면봉등으로닦아내어일정량 (10~100 ml) 의희석액을넣고강하게진탕하여부착균의현탁액을조제하여시험용액으로한다. 5) 분말상검체 : 검체를멸균유리봉과멸균시약스푼등으로잘혼합한후그일정량 (10~25 g) 을멸균용기에취해 9배양의희석액과혼합한것을시험용액으로한다. 6) 버터와아이스크림류 : 버터와아이스크림류는 40 이하의온탕에서 15분내에용해시켜 10 25mL를취한후희석액을가하여 ml로한것을시험용액으로한다. 7) 캡슐제품류 : 캡슐을포함하여검체의일정량 (10~25 g) 을취한후 9배양의희석액을가해균질기등을이용하여균질화한것을시험용액으로한다. 8) 냉동식품류 : 냉동상태의검체를포장된상태그대로 40 이하에서될수있는대로단시간에녹여용기, 포장의표면을 70% 알코올솜으로잘닦은후상기가.~사. 의방법으로시험용액을조제한다. 9) 칼 도마및식기류 : 멸균한탈지면에희석액을적셔, 검사하고자하는기구의표면을완전히닦아낸탈지면을멸균용기에넣고적당량의희석액과혼합한것을시험용액으로사용한다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 5

6 제 배지 미생물시험을위한배지조제시이미상품화된배지의사용이가능하며, 사용할경우각제조사별조제법을따를수있다. 배지성상은뒷편의부록을참조하세요. 번호 식품공전상배지명 Oxoid/Remel 제품명 ** 또는성분명 제품번호 웹설명서 1 표준한천배지 (Plate Count Agar) Standard Plate Count Agar APHA, 500g CM0463B 2 유당배지 (Lactose Broth) Lactose Broth, 500g CM0137B 3 BGLB 배지 (Brilliant Green Lactose Bile Broth) 4 두배농도 BGLB 배지 5 Endo 한천배지 (Endo Agar) 6 EMB 한천배지 (Eosin Methylene Blue Agar) 7 보통배지 (Nutrient Broth) 8 보통한천배지 (Nutrient Agar) Brilliant Green Bile 2% Broth, 500g * MUG Supplement, 50mg x 10vials Brilliant Green Bile 2% Broth, 500g * 2 배농도로조제 Endo Agar Base, 500g Basic Fuchsin Indicator,10g Eosin Methylene Blue Agar (Levine), 500g Lab-Lemco Broth (Nutrient Broth), 500g Lab-Lemco Agar (Nutrient Agar), 500g CM0031B BR0071E CM0031B CM0479B BR0050A CM0069B CM0015B CM0017B QR 코드스캔시서로간섭이있으면, 나머지부분을가린후스캔하세요. 9 데스옥시콜레이트유당한천배지 (Desoxycholate Lactose Agar) Desoxycholate Lactose Agar (DCLA), 500g CM1081B 10 EC 배지 (EC Broth) EC Broth, 500g CM0853B 11 BCP 첨가평판측정용한천배지 (Plate Count Agar with Bromocresol Purple) 포테이토덱스트로즈한천배지 (Potato Dextrose Agar) Potato Dextrose Agar, 500g 10% 주석산 * 대체추천 : Lactic Acid 10%, 10x1mL CM0139B - SR0021H 6 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

7 제 배지 미생물시험을위한배지조제시이미상품화된배지의사용이가능하며, 사용할경우각제조사별조제법을따를수있다. 배지성상은뒷편의부록을참조하세요. 번호 식품공전상배지명 Oxoid/Remel 제품명 ** 또는성분명 제품번호 웹설명서 13 티오클리콜린산염배지 (Fluid Thioglycollate Medium) Thioglycollate Medium USP, 500g CM0173B 14 난황첨가만니톨식염한천배지 (Mannitol Salt Agar with Egg Yolk) Mannitol Salt Agar, 500g Egg Yolk Emulsion, 100ml CM0085B SR0047C 15 BL 한천배지 (BL Agar) Alkaline 펩톤수 (Alkaline Peptone Water) TCBS 한천배지 (Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose Agar) LIM 반유동배지 (Lysine Indole Motility Medium) VP 반유동배지 (Voges- Proskauer broth) 20 Purple Broth Base 21 Moeller Basal 배지 (Moeller Basal Broth) Alkaline Peptone Water, 500g Cholera Medium TCBS, 500g MIL Medium, 20x5ml ( 생배지 ) CM1028B CM0333B R ( 참고 ) MRVP Medium, 500g CM0043B Purple Broth Base, 500g Lab-Lemco Powder (Beef Extract), 500g R LP0029B - - QR 코드스캔시서로간섭이있으면, 나머지부분을가린후스캔하세요. 22 ONPG 배지 (O-nitrophenyl-β -D-galacto-pyranside Broth) ONPG Broth, 1ml x 20ea ONPG Broth, 2ml x 500ea * 참고 : ONPG Discs, 50 discs R EB0169A DD0013T 23 TSB 배지 (Tryptic Soy Broth) Tryptone Soya Broth, 500g CM0129B 24 3% Ogawa 배지 TOS-MUP 배지 Liver 한천배지 (Liver Agar) 클로스트리디움퍼프린젠스한천배지 (Clostridium perfringens Agar) Selenite F 배지 (Selenite F Broth) Selenite F Broth Base, 500g Sodium Biselenite, 100g CM0395B LP0121A ThermoFisher Scientific Microbiology Division 7

8 제 배지 미생물시험을위한배지조제시이미상품화된배지의사용이가능하며, 사용할경우각제조사별조제법을따를수있다. 배지성상은뒷편의부록을참조하세요. 번호 식품공전상배지명 Oxoid/Remel 제품명 ** 또는성분명 제품번호 웹설명서 29 SS 한천배지 (Salmonella Shigella Agar) SS Agar, 500g CM0099B 30 MacConkey 한천배지 (MacConkey Agar) MacConkey Agar No.3, 500g CM0115B Desoxycholate Citrate 한천배지 (Desoxycholate Citrate Agar) TSI 사면배지 (Triple Sugar Iron Agar) Cooked Meat 배지 (Cooked Meat Medium) GAM 배지 (Gifu Anaerobic Medium) Listeria 증균배지 (Listeria Enrichment Broth) UVM Modified Listeria 증균배지 (UVM Modified Listeria Enrichment Broth) Fraser Listeria 배지 (Fraser Listeria Broth) Desoxycholate Citrate Agar (Hynes), 500g Triple Sugar Iron Agar, 500g Cooked Meat Medium, 500g CM0227B CM0277B CM0081B - - Listeria Enrichment Broth, 500g Listeria Selective Enrichment Supplement, 10vials Listeria Enrichment Broth Base (UVM formulation), 500g Listeria Primary Selective Enrichment Supplement (UVMⅠ), 10vials Fraser Broth Base, 500g Fraser Supplement, 10vials CM0862B SR0141E CM0863B SR0142E CM0895B SR0156E QR 코드스캔시서로간섭이있으면, 나머지부분을가린후스캔하세요. 38 Oxford 한천배지 (Oxford Agar) Listeria Selective Agar Base (Oxford), 500g Listeria Selective Supplement (Oxford), 10vials CM0856B SR0140E 39 LPM 한천배지 (Lithium Chloride Phenylethanol Moxalatam Agar) LPM Agar Base, 500g Moxalactam Selective Supplement, 10vials R R Tryptic Soy 한천배지 (Tryptic Soy Agar) Tryptone Soya Agar, 500g CM0131B 8 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

9 제 배지 미생물시험을위한배지조제시이미상품화된배지의사용이가능하며, 사용할경우각제조사별조제법을따를수있다. 배지성상은뒷편의부록을참조하세요. 번호 41 식품공전상배지명 TSC 한천배지 (Tryptose- Sulfite-Cycloserine Agar) Oxoid/Remel 제품명 ** 또는성분명 Perfringens Agar Base (TSC/SFP), 500g Perfringens (TSC) Supplement, 10vials Egg Yolk Emulsion, 100ml 제품번호 CM0587B SR0088E SR0047C 웹설명서 42 mec 배지 (mec Broth) EC Broth (Reduced Bile Salt), 500g Novobiocin Supplement, 10vials CM0990B SR0181E MacConkey Sorbitol 한천배지 (MacConkey Sorbitol Agar) PSBB 배지 (Peptone Sorbitol Bile Broth) CIN 한천배지 (Cefsulodin Irgasan Novobiocin Agar) MYP 한천배지 (Mannitol Egg Yolk Polymyxin agar) 47 HUNT 배지 (Hunt Broth) 48 Modified Campy blood Free 한천배지 (Modified Campy blood Free Agar) Sorbitol MacConkey Agar, 500g CM0813B - - Yersinia Selective (CIN) Agar Base, 500g Yersinia Selective Supplement, 10vials MYP Agar Base, 500g Polymyxin B Supplement, 10vials Egg Yolk Emulsion, 100ml Nutrient Broth No.2, 500g Campylobacter Growth Supplement (FBP), 10vials Yeast Extract Powder, 500g Laked Horse Blood, 100ml Supplement A(1리터기준 ) : Sodium Cefoperazone 0.032g, Trimethoprim Lactate 0.015g, Vancomycin 0.01g, Amphotericin B 0.002g Supplement B(1리터기준 ) : Sodium Cefoperazone 0.032g, Trimethoprim Lactate 0.015g, Vancomycin 0.01g, Rifampicin 0.005g Campylobacter Blood-Free Selective Agar Base (CCDA Agar), 500g Yeast Extract Powder, 500g CCDA Selective Supplement, 10vials CM0653B SR0109E CM0929B SR0099E SR0047C CM0067B SR0232E LP0021B SR0048C - - CM0739B LP0021B SR0155E QR 코드스캔시서로간섭이있으면, 나머지부분을가린후스캔하세요. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 9

10 제 배지 미생물시험을위한배지조제시이미상품화된배지의사용이가능하며, 사용할경우각제조사별조제법을따를수있다. 배지성상은뒷편의부록을참조하세요. 번호 식품공전상배지명 Oxoid/Remel 제품명 ** 또는성분명 Heart Infusion Broth, 500g 제품번호 CM1032B 웹설명서 Abeyta-Hunt blood 한천배지 (Abeyta-Hunt blood Agar) TPGY 배지 (Trypticase Peptone Glucose Yeast Extract Broth) Liver-Veal 난황한천배지 (Liver-Veal Egg Yolk Agar) 혐기성난황한천배지 (Anaerobic Egg Yolk Agar) Agar Technical No.2, 500g Yeast Extract Powder, 500g Laked Horse Blood, 100ml Supplement(1 리터기준 ): Sodium Cefoperazone g, Rifampicin g, Amphotericin B g LP0012B LP0021B SR0048C Egg Yolk Emulsion, 100ml Yeast Extract 5.0g / Tryptone 5.0 g / Proteose Peptone 20.0 g / Sodium Chloride 5.0 g / Agar 20.0 g, per liter Egg Yolk Emulsion, 100ml - SR0047C LP0021B / LP0042B / LP0085B / LP0005B / LP0012B SR0047C 53 세균수건조필름배지 Ⅰ 대장균군건조필름배지 Ⅰ 대장균건조필름배지 Ⅰ 펩톤수 (Peptone Water) Peptone Water, 500g CM0009B QR 코드스캔시서로간섭이있으면, 나머지부분을가린후스캔하세요. 57 RV 배지 (Rappaort-Vassiliadis Broth) Rappaport-Vassiliadis (RV) Enrichment Broth, 500g CM0669B 58 XLD 한천배지 (Xylose Lysine Desoxycholate agar) XLD Medium, 500g CM0469B 59 EE 배지 (Enterobacteriaceae Enrichment Broth) EE Broth (Buffered Glucose Brilliant Green Bile Broth), 500g CM0317B 60 CESA 한천배지 (Chromogenic Enterobacter sakazakii Agar) Brilliance Enterobacter sakazakii Agar (DFI), 500g CM1055B 10 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

11 제 배지 미생물시험을위한배지조제시이미상품화된배지의사용이가능하며, 사용할경우각제조사별조제법을따를수있다. 배지성상은뒷편의부록을참조하세요. 번호 식품공전상배지명 Oxoid/Remel 제품명 ** 또는성분명 제품번호 웹설명서 61 VRBG 한천배지 (Violet Red Bile Glucose Agar) Violet Red Bile Glucose Agar, 500g CM0485B E. sakazakii 한천배지 (E. sakazakii Agar) Baird-Parker 한천배지 (Baird-Parker Agar) - - Baird-Parker Agar Base, 500g CM0275B Egg Yolk Tellurite Emulsion, 100ml SR0054C Bismuth Sulfite 한천배지 (Bismuth Sulfite Agar) PALCAM 한천배지 (Polymyxin Acriflavin LiCl Ceftazidime Esculin Mannitol Agar) TC-SMAC 한천배지 (Tellurite Cefixime- Sorbitol MacConkey Agar) Baird-Parker PRF 한천배지 (Baird-Parker RPF Agar) 68 Bolton 배지 (Bolton Broth) Bismuth Sulphite Agar, 500g PALCAM Agar Base, 500g PALCAM Selective Supplement, 10vials Sorbitol MacConkey Agar, 500g C-T (Cefixime Tellurite) Supplement, 10vials Baird-Parker RPF Agar Base, 500g RPF Supplement, 10vials [ 또는생배지세트 ] Baird-Parker RPF Agar(BO0290J, 10x90ml) & Supplement(SR0122A, 10vials) Bolton Broth Base, 500g Bolton Broth Selective Supplement, 10vials (Cefoperazone 20.0mg, Vancomycin 20.0mg, Trimethoprim 20.0mg, Cycloheximide 50.0mg, per liter) Laked Horse Blood, 100ml [SR0183E 대체추천 ] Modified Bolton Broth Selective Supplement, 10vials (Cefoperazone 20.0mg, Vancomycin 20.0mg, Trimethoprim 20.0mg, Amphotericin B 10.0mg, per liter) CM0201B CM0877B SR0150E CM0813B SR0172E CM0961B SR0122A BO0290J- SET CM0983B SR0183E SR0048C SR0208E 69 세균수건조필름배지 Ⅱ - - QR 코드스캔시서로간섭이있으면, 나머지부분을가린후스캔하세요. 70 대장균군건조필름배지 Ⅱ 대장균건조필름배지 Ⅱ - - ThermoFisher Scientific Microbiology Division 11

12 제 배지 미생물시험을위한배지조제시이미상품화된배지의사용이가능하며, 사용할경우각제조사별조제법을따를수있다. 배지성상은뒷편의부록을참조하세요. 번호 72 식품공전상배지명 MMGM (Minerals Modified Glutamate medium) Oxoid/Remel 제품명 ** 또는성분명 Minerals Modified Glutamate medium, 500g 제품번호 CM0607G Ammonium Chloride - 웹설명서 73 BCIG 한천배지 (5-Bromo- 4-Chloro-3-Indolyl-β -D-Glucuronide (BCIG) Agar) TBX Agar, 500g CM0945B 74 mtsb 배지 Preston 한천배지 (Preston Agar) Campy Cefex 한천배지 (Campy Cefex Agar(CCA)) Tryptone Soya Broth Modified (mtsb), 500g Novobiocin Supplement, 10vials Campylobacter Agar Base, 500g Preston Campylobacter Selective Supplement, 10vials (5,000IU Polymyxin B, 10mg Rifampicin, 10mg Trimethoprim, 100mg Cycloheximide, per liter) Campylobacter Growth Supplement, 10vials Laked Horse Blood, 100ml [SR0117E 대체품 ] Modified Preston Campylobacter Supplement, 10vials (5,000IU Polymyxin B, 10mg Rifampicin, 10mg Trimethoprim, 10mg Amphotericin B, per liter) Brucella Agar, 500g Campylobacter Growth Supplement, 10vials Cycloheximide 0.1% solution, 100ml CM0989B SR0181E CM0689B SR0117E SR0232E SR0048C SR0204E R SR0232E SR0222C Cefoperazone - [cycloheximide + cefoperazone 대체추천 ] CCDA Selective Supplement, 10vials (Amphotericin B 10mg/liter + Cefoperazone 32mg/liter) SR0155E QR 코드스캔시서로간섭이있으면, 나머지부분을가린후스캔하세요. [ 또는생배지 ] Campy-Cefex Agar, 10plates R ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

13 제 배지 미생물시험을위한배지조제시이미상품화된배지의사용이가능하며, 사용할경우각제조사별조제법을따를수있다. 배지성상은뒷편의부록을참조하세요. 번호 식품공전상배지명 Oxoid/Remel 제품명 ** 또는성분명 Blood Agar Base No. 2, 500g 제품번호 CM0271B 웹설명서 Blaser's Campylobacter 한천배지 (Blaser's Campylobacter Agar(BCA)) Preston 배지 (Preston broth) 79 혈액한천배지 (Blood Agar) 80 Lowenstein-Jensen 사면배지 Laked Horse Blood, 100ml Campylobacter supplement A (Cefoperazone, Trimethoprim lactate, Vancomycin, Amphotericin B) * 유제품의경우사용가능 [Campylobacter supplement A 대체추천품 ] Campylobacter Selective Supplement (Blaser-Wang), 10vials (Cephalothin 15.0mg, Trimethoprim 5.0mg, Vancomycin 10.0mg, Amphotericin B 2.0mg, Polymyxin B 2,500IU, per liter) Nutrient Broth No. 2, 500g Preston Campylobacter Selective Supplement, 10vials (5,000IU Polymyxin B, 10mg Rifampicin, 10mg Trimethoprim, 100mg Cycloheximide, per liter) Laked Horse Blood, 100ml Campylobacter Growth Supplement, 10vials [SR0117E 대체품 ] Modified Preston Campylobacter Selective Supplement, 10vials (5,000IU Polymyxin B, 10mg Rifampicin, 10mg Trimethoprim, 10mg Amphotericin B, per liter) Blood agar base, 500g Defibrinated sheep blood, 25ml Lowenstein Jensen(L-J) Base, 500g SR0048C - SR0098E CM0067B SR0117E SR0048C SR0232E SR0204E CM0055B SR0051B R Glycerol - Homogenized whole egg - QR 코드스캔시서로간섭이있으면, 나머지부분을가린후스캔하세요. Middlebrook 7H10 Agar, 500g R Glycerol - 81 Middlebrook 7H10 한천배지 OADC Enrichment, 100ml [ 또는생배지 ] Middlebrook 7H10 Agar, 20 slant tubes R R08562 ThermoFisher Scientific Microbiology Division 13

14 제 배지 미생물시험을위한배지조제시이미상품화된배지의사용이가능하며, 사용할경우각제조사별조제법을따를수있다. 배지성상은뒷편의부록을참조하세요. 번호 식품공전상배지명 Serum Dextrose 배지 (Serum Dextrose broth) Serum Dextrose 한천배지 (Serum Dextrose Agar) Brucella 한천배지 (Brucella Agar) Brucella 배지 (Brucella Broth) 피루베이트고형배지 (pyruvate-based solid medium) Oxoid/Remel 제품명 ** 또는성분명 Tryptose, 500g Lab-Lemco powder (Beef extract), 500g Sodium Chloride Bacteriological, 500g Filtered horse serum, 100ml (* heat-inactivation 필요 ) Dextrose Bacteriological, 500g Peptone Bacteriological, 500g 제품번호 LP0047B LP0029B LP0005B SR0035C LP0071B LP0037B Meat Extract - Sodium Chloride Bacteriological, 500g Agar Technical (Agar No.2), 500g LP0005B LP0012B Fetal bovine serum - Dextrose Bacteriological, 500g Bacitracin(25 units/ml), Vancomycin (20 μg /ml), Polymyxin B(5 units/ml, Nalidixic acid(5 μg / ml), Cycloheximide(100 μg /ml) Brucella Agar, 500g LP0071B - R defibrinated bovine serum - Brucella Broth, 500g R defibrinated bovine serum 웹설명서 QR 코드스캔시서로간섭이있으면, 나머지부분을가린후스캔하세요. 87 MRS 배지 MRS Agar, 500g CM0361B Tetrathionate Broth (USA), 500g CM0671B 88 Tetrathionate 배지 (Tetrathionate Broth) Iodine for Tetrathionate Broth, 100ml Brilliant Green for Tetrathionate, 100ml R R RVS 배지 (Rappaport- Vassiliadis Soya peptone Broth) Rappaport-Vassiliadis Soya Peptone Broth, 500g CM0866B 90 BG Sulfa 한천배지 (Brilliant Green Sulfa Agar) Brilliant Green Sulfa Agar, 500g R ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

15 제 배지 미생물시험을위한배지조제시이미상품화된배지의사용이가능하며, 사용할경우각제조사별조제법을따를수있다. 배지성상은뒷편의부록을참조하세요. 번호 식품공전상배지명 Oxoid/Remel 제품명 ** 또는성분명 제품번호 웹설명서 91 HE 한천배지 (Hektoen Enteric Agar) Hektoen Enteric Agar, 500g CM0419B 92 XLT4 한천배지 (XLT4 Agar) 93 LIA 사면배지 (Lysine Iron Agar) 94 EC-MUG 배지 95 Lauryl Sulfate Tryptose (LST) Broth XLT-4 Agar XLT-4 Selective Supplement Lysine Iron Agar, 500g EC Broth with MUG, 500g EC Broth, 500g MUG Supplement, 50mg x 10vials Lauryl Tryptose Broth (Lauryl sulphate broth), 500g ( 필요시 ) MUG Supplement, 10vials ( LST-MUG) ( 또는 ) Lauryl Tryptose Broth with MUG, 500g (=LST-MUG) CM1061B SR0237C CM0381B CM0979B CM0853B BR0071E CM0451B BR0071E CM0980B 96 Violet Red Bile Agar (VRBA) Violet Red Bile (Lactose) Agar, 500g CM0107B QR 코드스캔시서로간섭이있으면, 나머지부분을가린후스캔하세요. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 15

16 제 시액 번호식품공전상시액명 Oxoid/Remel 제품명 ** 또는성분명 제품번호 웹설명서 1) 멸균인산완충희석액 (BPD: Butterfield's Phosphate Buffered Dilution Water) Phosphate buffer, Butterfield's, 1000ml (or 10x100ml) ( 참고 ) Ringer Solution Tablets, 100tabs (1 tab for 500ml) 링거용액 ( 참고 ) Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A), 100tabs (1 tab for 100ml) 인산염완충용액 R (R112519) BR0052G BR0014G 2) 멸균생리식염수 (Saline : Sodium chloride (0.85%) solution) Saline Tablets, 100tabs 1 tablet 으로 500ml 을제조. BR0053G 3) 뉴만염색액 (NewMan Stain) - - 4) BTB-MR 지시약 - - 5) 젤라틴 - 인산완충액 6) Nitrite 지시약 7) 펩톤식염완충액 (BPW, Buffered Peptone Water) 8) 난황액 9) 0.1% Peptone Solution (ph 7.0 +/- 0.2) Gelatin Bacteriological, 500g LP0008B Disodium phosphate 별도첨가 - Nitrate Reagent A, 25ml Nitrate Reagent B, 25ml Buffered Peptone Water, 500g ( 참고 1) Egg Yolk Emulsion, 100ml ( 참고 2) Egg Yolk Suspenstion, 100ml Peptone Bacteriological, Neutralized, 500g ph 7.0 +/- 0.2 for 2% solution Peptone Bacteriological, 500g ph 6.2 +/- 0.2 for 2% solution R21239 R21242 CM0509B SR0047C R LP0034B LP0037B QR 코드스캔시서로간섭이있으면, 나머지부분을가린후스캔하세요. 10) Ninhydrin 용액 Ninhydrin Reagent, 25ml BactiDrop Ninhydrin, 0.75mlx50amp R21238 R ) Ziehl-Neelsen 염색액 TB Ziehl-Neelsen Carbolfuchsin, 250ml TB Decolorizer, 250ml TB Methylene Blue, 250ml 또는 TB Brilliant Green, 250ml R40102 R40106 R40110 / R ) 루골솔루션 (iodine/ potassium iodide solution) ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

17 제 세균수 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) 희석액멸균인산완충희석액 ( 시액 1) : R 멸균생리식염수 ( 시액 2) : BR0053G Ringer Solution Tablets, 100tabs (BR0052G) Phosphate Buffered Saline, Dulbecco A (BR0014G) 표준한천배지 ( 배지 1) : CM0463B 세균수측정법은일반세균수를측정하는표준평판법, 건조필름법또는자동화된최확수법 (Automated MPN) 을사용할수있다 일반세균수가. 표준평판법표준한천배지에검체를혼합응고시켜배양후발생한세균집락수를계수하여검체중의생균수를산출하는방법이다. 1) 시험조작 ❶ 3.3. 제조법에따라시험용액을준비하고, 10 배단계희석법으로희석한각단계희석액을준비한다. 검액을가하지아니한동일희석액 ( 대조시험액 ) 은시험조작의무균여부를확인한다. ❷ 각시험용액 1ml 씩을멸균페트리접시 ( 시험용액당 2 매이상 ) 에첨가한다. ❸ 제조하여약 43~45 로유지한표준한천평판배지 ( 배지 1) 약 15 ml 를무균적으로분주한다. 페트리접시뚜껑에부착하지않도록주의하면서조용히회전하여좌우로기울이면서검체배지를잘혼합하여응고시킨다. ❹ 배지 3~5 ml 를가하여중첩시키고응고시킨다. ( 확산집락발생억제 ) 검체를취하여배지를가할때까지의시간은 20 분이상경과하여서는아니된다. ❺ 응고시킨페트리접시는뒤집어 35±1 에서 48±2 시간 ( 시료에따라서 30±1 또는 35 ±1 에서 72±3 시간 ) 배양한다. 집락수의계산은확산집락이없고 1 개의평판당 15~300 개의집락을생성한평판을택하여집락수를계산하는것을원칙으로한다. 검액을가하지아니한동일희석액 1ml 를대조시험액으로하여시험조작의무균여부를확인한다. 2) 집락수산정배양후생성된집락수를신속히계산한다. 부득이할경우에는 5 에보존시켜 24시간이내에산정한다. 집락수의계산은확산집락이없고 ( 전면의 1/2이하일때에는지장이없음 ) 1개의평판당 개의집락을생성한평판을택하여집락수를계산하는것을원칙으로한다. 전평판에 300개초과집락이발생한경우 300에가까운평판에대하여밀집평판측정법에따라계산한다. 전평판에 15개미만의집락만을얻었을경우에는가장희석배수가낮은것을측정한다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 17

18 제 ) 세균수의기재보고 세균수 표준평판법에있어서검체 1 ml 중의세균수를기재또는보고할경우에그것이어떤제한된것에서발육한집락을측정한수치인것을명확히하기위하여 1 평판에있어서의집락수는상당희석배수로곱하고그수치가표준평판법에있어서 1 ml 중 (1 g 중 ) 의세균수몇개라고기재보고하며동시에배양온도를기록한다. 숫자는높은단위로부터 3 단계에서반올림하여유효숫자를 2 단계로끊어이하를 0 으로한다. 구분 집락수 1) 15~300CFU/plate인경우 2) 15CFU/plate 미만인경우 희석배수 희석배수 1:100 1:1,000 CFU/g(mL) 구분 1:10 1: ,000 집락수 CFU/g(mL) 120 N = ( ) / {((1x2)+(0.1x2))x10-2 } = 537/0.022 = 24,409 = 24,000 N = (14+10) / ((1x2)x10-1 ) = 24/0.2 = 120 N= 검체 g 또는 ml 당세균집락수 C = 모든평판에계산된집락수의합 n1 = 첫번째희석배수에서계산된평판수 n2 = 두번째희석배수에서계산된평판수 d = 첫번째희석배수에서계산된평판의희석배수 4) 식육의세균수산출방법 소및돼지도체의경우균수는도체표면적당집락수 (CFU/ cm 2 ) 로서환산되어야한다. 희석배수 10( 배지접종량이 0.1 ml일경우 ) 집락수 25( 재료채취용량 )/10 cm 10 cm (1개부위채취인경우, 단 3 개부위를채취할경우는 300 cm 2 로나누어준다 ) 로산출한다. 닭의경우는 ml당으로집락수를환산한다. 기타시료는집락수 희석배수로 ml당또는 g당세균수를산출한다. 나. 건조필름법 : 공전참고 다. 자동화된최확수법 (Automated MPN) 우유류, 유당분해우유, 가공유류 ( 유음료제외 ), 조제유류, 분유류, 소도체, 돼지도체, 닭도체, 오리도체에한한다 총균수주로원유중오염된세균을측정하기위하여일정량의원유를슬라이드그라스위에일정면적으로도말하고건조시켜염색한후현미경으로검경하고염색된세균수를측정한다. 측정된세균수를현미경시야면적과의관계에따라검체중에존재하는세균수를측정하는방법 ( 직접현미경법 : Breed method) 이다. 자세한사항은공전참고 18 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

19 제 세균발육시험 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) 희석액멸균인산완충희석액 ( 시액 1) : R 멸균생리식염수 ( 시액 2) : BR0053G Ringer Solution Tablets, 100tabs (BR0052G) Phosphate Buffered Saline, Dulbecco A (BR0014G) 티오글리콜린산염배지 ( 배지 13) : CM0173B 통, 병조림, 레토르트등멸균제품에서세균의발육유무를확인하기위한것이다. 가. 가온보존시험 ❶ 시료 5 개를개봉하지않은용기 포장그대로배양기에서 35~37 에서 10 일간보존한다. ❷ 상온에서 1 일간추가로방치한후관찰한다. ❸ 용기 포장이팽창또는새는것은세균발육양성으로하고가온보존시험에서음성인것은다음의세균시험을한다. 나. 세균시험세균시험은가온보존시험한검체 5관에대해각각시험한다. ❹ 검체 5 관 ( 또는병 ) 의개봉부의표면을 70% 알코올탈지면으로잘닦고개봉한다. ❺ 검체 25 g 을희석액 225 ml 에가하여균질화시킨다. ❻ 이액의 1 ml 를멸균시험관에채취하고희석액 9 ml 에가하여잘혼합한것을시험용액으로한다. ❼ 시험용액 1 ml 씩을 5 개의티오글리콜린산염배지 ( 배지 13) 에접종한다. ❽ 35~37 에서 48±3 시간배양한다. ❾ 5 관중어느하나라도세균증식이확인되면세균발육양성으로한다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 19

20 제 대장균군 (coliforms) 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) 희석액멸균인산완충희석액 ( 시액 1) : R 멸균생리식염수 ( 시액 2) : BR0053G Ringer Solution Tablets, 100tabs (BR0052G) Phosphate Buffered Saline, Dulbecco A (BR0014G) 배지유당배지 ( 배지 2): CM0137B BGLG 배지 ( 배지 3): CM0031B Endo 한천배지 ( 배지 5): CM0479B + BR0050A EMB 한천배지 ( 배지 6): CM0069B 보통한천배지 ( 배지 8): CM0017B 데스옥시콜레이트유당한천배지 ( 배지 9): CM1081B VRBA 평판배지 ( 배지 96) : CM0107B MacConkey 한천배지 ( 배지 30) : CM0115B 그람염색시약 : Gram Stain Kit, Enhanced, 250ml, 5btl (R40240): 배경적색을감소시켜작은그람음성미생물의대비를향상 Gram Stain Kit (Crystal Violet, Decolorizer, Iodine, Safranin, Tray), 250ml x 4bt (R40080) 20 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

21 제 대장균군 (coliforms) 대장균군은 Gram 음성, 무아포성간균으로서유당을분해하여가스를발생하는모든호기성또는통성혐기성세균을말한다. 대장균군시험에는대장균군의유무를검사하는정성시험과대장균군의수를산출하는정량시험이있다 정성시험가. 유당배지법유당배지를이용한대장균군의정성시험은추정시험, 확정시험, 완전시험의 3단계로나눈다. ❶ 3.3 제조법에따라시험용액을준비하고발효관을준비한다. ❷ 시험용액 10 ml 를 2 배농도의유당배지 ( 배지 2) 에, 시험용액 1 ml 및 0.1 ml 를유당배지 ( 배지 2) 에각각 3 개이상씩가한다. 1) 추정시험 ❸ 시험용액을접종한유당배지를 35~37 에서 24±2 시간배양한다. ❹ 발효관내에가스발생유무를확인한다. 가스가발생하면추정시험양성이다. 가스가발생하지않은경우, 배양을계속하여 48±3 시간까지관찰한다 가스발생이있을때에는추정시험양성이며다음의확정시험을실시한다. 가스가발생하지않았을때에는추정시험음성이다. 2) 확정시험 ❺ 추정시험에서가스발생한유당배지발효관으로부터 BGLB 배지 ( 배지 3) 에접종한다. ❻ 35~37 에서 24±2 시간동안배양한후가스발생여부를확인한다. 가스가발생하지아니하였을때에는배양을계속하여 48±3 시간까지관찰한다. * BGLB 배지에서 35~37 로 48±3 시간동안배양하였을때배지의색이갈색으로되었을때에는반드시완전시험을실시한다. ❼ 가스발생을보인 BGLB 배지로부터 Endo 한천배지 ( 배지 5) 또는 EMB 한천배지 ( 배지 6) 에분리배양을위해접종한다. ❽ 35~37 에서 24±2시간배양한후집락을확인한다. 전형적인집락이발생되면확정시험양성으로한다. Endo 한천배지금색금속성광택의짙은붉유당분해균 ( 대장균 ) 은색집락 EMB 한천배지녹색의금속성광택의보라색집락 유당분해균 ( 대장균군 ) 붉은색 / 분홍색집락 보라색점액성집락 유당비분해균 무색반투명집락 무색반투명집락 3) 완전시험대장균군의존재를완전히증명하기위하여위의평판상의집락이그람음성, 무아포성의간균임을확인하고, 유당을분해하여가스의발생여부를재확인한다. ❾ 확정시험의 Endo 한천배지나 EMB 한천배지에서전형적인집락 1 개또는비전형적인집락 2 개이상을각각유당배지 ( 배지 2) 발효관과보통한천배지 ( 배지 8) 에동시에접종한다. ❿ 35~37 에서 48±3 시간동안배양한다. ⓫ 가스발생이일어난유당배지발효관에해당되는한천배지의집락에대해서다음시험을한다. 그람염색 그람음성, 무아표성간균 완전시험양성 대장균군양성 ThermoFisher Scientific Microbiology Division 21

22 제 대장균군 (coliforms) 나. BGLB 법 ❶ 3.3 제조법에따라시험용액을준비하고발효관을준비한다. 대량의시험용액을가할필요가있을때에는대량의배지를넣은발효관을사용한다. ❷ 시험용액 1~0.1 ml 를 2 개씩 BGLB 배지 ( 배지 3) 발효관에가한다. ❸ 시험용액을접종한 BGLB 배지발효관을 35~37 에서 48±3 시간배양한다. ❹ 발효관내에가스발생유무를확인한다. 가스가발생하면양성이며확정시험을실시한다. * 배지를흔들때거품모양의가스의존재도인정한다. 가스가발생하지않았을때에는음성이다. 확정시험 ❺ 가스발생을보인 BGLB 배지로부터 Endo 한천배지 ( 배지 5) 또는 EMB 한천배지 ( 배지 6) 에분리배양을위해접종한다. ❻ 35~37 에서 24±2시간배양한후집락을확인한다. 전형적인집락이발생되면확정시험양성으로한다. Endo 한천배지금색금속성광택의짙은붉유당분해균 ( 대장균 ) 은색집락 EMB 한천배지녹색의금속성광택의보라색집락 유당분해균 ( 대장균군 ) 붉은색 / 분홍색집락 보라색점액성집락 유당비분해균 무색반투명집락 무색반투명집락 완전시험대장균군의존재를완전히증명하기위하여위의평판상의집락이그람음성, 무아포성의간균임을확인하고, 유당을분해하여가스의발생여부를재확인한다. ❼ 확정시험의 Endo 한천배지나 EMB 한천배지에서전형적인집락 1 개또는비전형적인집락 2 개이상을각각유당배지 ( 배지 2) 발효관과보통한천배지 ( 배지 8) 에동시에접종한다. ❽ 35~37 에서 48±3 시간동안배양한다. ❾ 가스발생이일어난유당배지발효관에해당되는한천배지의집락에대해서다음시험을한다. 그람염색 그람음성, 무아표성간균 완전시험양성 대장균군양성 22 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

23 제 대장균군 (coliforms) 나. 데스옥시콜레이트유당한천배지법 ❶ 3.3 제조법에따라시험용액을준비하고일련의 10 배단계희석액을준비한다. ❷ 시험용액 1 ml 와 10 배단계희석액 1 ml 씩을멸균페트리접시 2 매이상씩에무균적으로취한다. ❸ 약 43~45 로유지한데스옥시콜레이트유당한천배지 (DCLA, 배지 9) 또는 VRBA 평판배지 ( 배지 96) 약 15 ml 를무균적으로분주한다. 페트리접시뚜껑에부착하지않도록주의하면서회전하여검체와배지를잘혼합한후응고시킨다. ❹ 그표면에동일한배지또는보통한천배지를 3~5 ml 를가하여중첩시킨다. ❺ 35~37 에서 24±2 시간배양한후집락을관찰한다. 전형적인암적색의집락이관찰되면확정시험을실시한다. 의심스러운집락의경우에도확정시험을실시한다. DCLA VRBA 유당분해균 ( 대장균 ) Bile 침전이있는암적색집락 Bile 침전이있는붉은색집락 유당분해균 ( 대장균 Bile 침전이약간있거나혹은없 Bile 침전이있는암적색집락군 ) 는붉은색집락 유당비분해균 무색집락 무색집락 확정시험 ❻ 전형적인암적색의집락을인정하였을때에는 1 개이상의집락을, 의심스러운집락일경우에는 2 개이상을분리배양을위해다음의배지들중하나에접종한다. Endo 한천배지 ( 배지 5) EMB 한천배지 ( 배지 6) MacConkey 배지 ( 배지 30) ❼ 35~37 에서 24±2시간배양한후집락을확인한다. 전형적인집락이발생되면확정시험양성으로한다. Endo 한천배지 EMB 한천배지 MacConkey 배지 유당분해균 ( 대장균 ) 금색금속성광택의짙은붉은색집락 녹색의금속성광택의보라색집락 Bile 침전이있는붉은색집락 유당분해균 ( 대 Bile 침전이있는붉은붉은색 / 분홍색집락보라색점액성집락장균군 ) 색집락 유당비분해균 무색반투명집락 무색반투명집락 담황색집락 완전시험대장균군의존재를완전히증명하기위하여위의평판상의집락이그람음성, 무아포성의간균임을확인하고, 유당을분해하여가스의발생여부를재확인한다. ❽ 확정시험의 Endo 한천배지, EMB 한천배지, 또는 MacConkey 배지에서전형적인집락 1 개또는비전형적인집락 2 개이상을각각유당배지 ( 배지 2) 발효관과보통한천배지 ( 배지 8) 에동시에접종한다. ❾ 35~37 에서 48±3 시간동안배양한다. ❿ 가스발생이일어난유당배지발효관에해당되는한천배지의집락에대해서다음시험을한다. 그람염색 그람음성, 무아표성간균 완전시험양성 대장균군양성 ThermoFisher Scientific Microbiology Division 23

24 제 대장균군 (coliforms) 정량시험 가. 최확수법최확수란이론상가장가능한수치를말하여동일희석배수의시험용액을배지에접종하여대장균군의존재여부를시험하고그결과로부터확률론적인대장균군의수치를산출하여이것을최확수 (MPN) 로표시하는방법이다. 최확수는연속한 3단계이상의희석시료 (10, 1, 0.1 또는 1, 0.1, 0.01 또는 0.1, 0.01, 0.001) 를각각 5개씩 ( 별표 1) 또는 3개씩 ( 별표 2) 발효관에가하여배양후얻은결과에의하여검체 1 ml중또는 1 g중에존재하는대장균군수를표시하는것이다. 예로검체또는희석검체의각각의발효관을 5개씩사용하여다음과같은결과를얻었다면최확수표에의하여시험검체 1 ml중의 MPN은 70으로된다. 이때접종량이 1, 0.1, 0.01 ml일때에는 70/10=7로한다. 10, 1, 0.1 ml일때에는 70/100=0.7로한다. 시힘용액접종량 0.1 ml 0.01 ml ml MPN 가스발생양성관수 시험용액접종이 4단계이상으로행하여졌을때에는다음표와같이취급한다. 예 가스발생양성관수 유효숫자 1mL 0.1mL 0.01mL 0.001mL 1mL 0.1mL 0.01mL 0.001mL I II III IV 예 I, II : 5개양성을표시한최소접종량부터시작한다. 예 III : 양성을인정한접종량을중간으로한다. 예 IV : 최소유효접종량보다 1단계적은접종량에서양성을인정한때에는양성을인정한수를최소유효접종량의양성관수에더한다 (0.001 ml 단계의양성관의수를 0.01단계의양성관의수에더함 ) 1) 유당배지법 ❶ 3.3 제조법에따른시료액을연속 10배단계희석하여 3단계이상희석시료 (10, 1, 0.1 또는 1, 0.1, 0.01 또는 0.1, 0.01, 0.001) 를준비한다. * 시험용액을가한배지의전부또는대부분에서가스발생이인정되거나또최소량을가한배지의전부또는대부분이가스가발생되지않도록접종량과희석도를고려하여야한다. ❷ 시험용액 5 개또는 3 개씩을유당배지 ( 배지 2) 발효관에접종한다. 단, 10mL 을접종할때는두배농도유당배지를사용하고, 0.1mL 이하를접종할때는 10 배희석단계액을각각 1mL 씩사용한다. ❸ 추정, 확정, 완전시험을행하고대장균군의유무를확인한다음최확수표로부터검체 1 ml 또는 1 g 중의대장균군수를구한다. 2) BGLB 법 ❶ 3.3 제조법에따른시료액을연속 10 배단계희석하여 3 단계이상희석시료 (10, 1, 0.1 또는 1, 0.1, 0.01 또는 0.1, 0.01, 0.001) 를준비한다. * 시험용액을가한배지의전부또는대부분에서가스발생이인정되거나또최소량을가한배지의전부또는대부분이가스가발생되지않도록접종량과희석도를고려하여야한다. ❷ 시험용액 5 개또는 3 개씩을 BGLB 배지 ( 배지 3) 발효관에접종한다. 단, 10mL 을접종할때는두배농도유당배지를사용하고, 0.1mL 이하를접종할때는 10 배희석단계액을각각 1mL 씩사용한다. ❸ 각발효관에대하여 BGLB 배지에의한정성시험법에따라행하고대장균군의유무를확인한다음최확수표로부터검체 1 ml 또는 1 g 중의대장균군수를구한다. 24 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

25 제 대장균군 (coliforms) 나. 데스옥시콜레이트유당한천배지법 ❶ 3.3 제조법에따른시험용액과각 10배단계희석액을준비한다. ❷ 데스옥시콜레이트유당한천배지법의정성시험법을따르고대장균군의유무를결정한다. ❸ 균수산출은제 일반세균수에따른다. 다. 건조필름법공전참조 라. 자동화된최확수법 (Automated MPN) 우유류, 유당분해우유, 가공유류 ( 유름료제외 ), 발효유류, 가공치즈, 조제유류, 분유류, 건조저장육류, 식육추출가공품, 알가열성형제품검사에한한다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 25

26 제 대장균 (Escherichia coli) 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) 희석액멸균인산완충희석액 ( 시액 1) : R 멸균생리식염수 ( 시액 2) : BR0053G Ringer Solution Tablets, 100tabs (BR0052G) Phosphate Buffered Saline, Dulbecco A (BR0014G) 0.1% Peptone solution( 시액 9): LP0034B 또는 LP0037B 배지 EC 배지 ( 배지 10): CM0853B EMB 한천배지 ( 배지 6): CM0069B 유당배지 ( 배지 2): CM0137B 보통한천배지 ( 배지 8): CM0017B BCIG 한천배지 ( 배지 73): CM0945B 또는 < 생배지 > PO5109A MMGM 배지 ( 배지 72) : CM0607G + ammonium chloride EC-MUG 배지 ( 배지 94) : CM0979B ( 또는 CM0853B + BR0071E) BGLB-MUG 배지 : 배지 3(CM0031B) + BR0071E LST-MUG 배지 : CM0980B ( 또는배지 95(CM0451B) + BR0071E) MacConeky 한천배지 ( 배지 30): CM0115B 그람염색 Gram Stain Kit, Enhanced, 250ml, 5btl (R40240): 배경적색을감소시켜작은그람음성미생물의대비를향상 Gram Stain Kit (Crystal Violet, Decolorizer, Iodine, Safranin, Tray), 250ml x 4bt (R40080) Indole 시험 Microbact Spot Indole (DMAC), 10ml (MB1448A) 또는 Indole Reagent, Kovac's, 25ml/bottle (R21227) 또는 BactiDrop Indole, Kovac's, 0.75mlx50ampules (R21522) Methyl Red 시험 MRVP Medium, 500g (CM0043B) Methyl Red Reagent, 25ml/bottle (R21236) VP 시험 MRVP Medium, 500g (CM0043B) Voges-Proskauer A reagent, 12ml (R21200) + Voges-Proskauer B reagent, 25ml (R21281) 또는 BactiDrop Voges-Proskauer A, 0.75mlx50ampules (R21560) + BactiDrop Voges-Proskauer B, 0.75mlx50ampules (R21562) Citrate 시험 Simmons Citrate Agar, 500g (CM0155B) 생화학적동정키트 : MicroBact GNB12E : microplate format: 80 tests (MB1130A), 160 tests(mb1073a) 또는 MicroBact GNB12A : strip format: 60 tests(mb1132a), 120 tests (MB1076A) + Oxidase Strips (MB0266A) + MicroBact Reagent Set D (MB1082A) for GNB systems + MicroBact Mineral Oil, 50ml (MB1093A) RapID ONE System, 20panels/kit (R ) + RapID Inoculation Fluid, 2mlx20tubes (R ) + RapID Spot Indole Reagent, 15mlx1vial (R ) 크로모제닉배지 Brilliance E. coli/coliform Agar, 500g (CM0956B) : 식품및환경검체에서기타대장균군과대장균을분별 Brilliance E. coli/coliform Selective Agar, 500g (CM1046B) : 식품및물검체에서기타대장균군과대장균을검출및계수 26 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

27 제 대장균 (Escherichia coli) 대장균의시험법에는최확수법및건조필름법에의한정량시험과일정한한도까지균수를정성으로측정하는한도시험법이있다 정성시험 가. 한도시험 ❶ 3.3 제조법에따른시험용액을준비한다. ❷ 시험용액 1mL 을 3 개의 EC 배지 ( 배지 10) 발효관에접종한다. ❸ 44.5±0.2 에서 24±2 시간배양후가스발생을관찰한다. 가스발생발효관은추정시험양성. 가스발생인정되지않으면음성. ❹ 추정시험양성의발효관으로부터 EMB 배지 ( 배지 ) 에접종한다. ❺ 35~37 에서 24±2시간배양한후전형적인집락을관찰한다. EMB 한천배지유당분해균 ( 대장균 ) 녹색의금속성광택의보라색집락유당분해균 ( 대장균군 ) 보라색점액성집락유당비분해균무색반투명집락 ❻ 전형적인집락을유당배지발효관및보통한천배지에각각접종한다. ❼ 유당배지에접종한것은 35~37 에서 48±3 시간배양하고, 보통한천배지에접종한것은 35~37 에서 24±2 시간배양한다. ❽ 유당배지에서가스발생을인정하였을때에는이에해당하는보통한천배지에서배양된집락을취하여다음시험을한다 : 그람염색실시하여그람음성, 무아포성간균을확인하고, 생화학시험실시하여대장균양성으로판정 ThermoFisher Scientific Microbiology Division 27

28 제 대장균 (Escherichia coli) 정량시험가. 최확수법 1) 제1법 ❶ 3.3 제조법에따른시험용액을연속한 3단계이상의희석시료 (10, 1, 0.1 또는 1, 0.1, 0.01 또는 0.1, 0.01, 0.001) 를준비한다. ❷ 희석시료를각각 5 개또는 3 개의 EC 배지 ( 배지 10) 발효관에접종한다. * 시험용액 10 ml 를첨가할경우배농도의배지 10 ml 를이용한다. ❸ 44.5±0.2 항온수조에서 24±2 시간배양후가스발생을관찰한다. 가스발생을인정한발효관을대장균 (E. coli) 양성이라고판정하고별표 1 또는별표 2 최확수표에따라검체 1 ml 또는 1 g 중의대장균수를산출한다. 2) 제 2 법 시험용액의제조 ❶ 패각을제거한검체 200 g 에 0.1% peptone solution( 시액 9) 200mL 을첨가하여마쇄한다. ❷ 마쇄액 20 ml 과동일한희석액 ( 시액 9) 80 ml 을혼합하여최종 10 배희석한것을시험용액으로사용한다. * 시험용액은필요에따라 100 배, 1,000 배등으로희석하여사용할수있다. 추정시험 ❸ 시험용액 10 ml 을 5 개의 2 배농도 MMGM 배지 ( 배지 72) 가들어있는시험관에접종하고, 시험용액 1 ml 및 0.1 ml 을각각 5 개의 MMGM 배지가들어있는시험관에접종한다. ❹ 37±1 에서 24±2 시간배양하고, 시험관내의배지의색깔을확인한다. 노란색으로되었을때추정시험양성으로하며확정시험을실시한다. 확정시험 ❺ 추정시험에서양성으로확인된 MMGM 시험관배양액을 BCIG 한천배지 ( 배지 73) 에분리배양을위해접종한다. ❻ 44±1 에서 24±2 시간배양후전형적인집락을관찰한다. 청녹색의 (blue-green) 전형적인집락이발생되면대장균 (E. coli) 양성이라고판정하고별표 1 최확수표에따라검체 100 g 중의대장균수를산출한다. 28 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

29 제 대장균 (Escherichia coli) 3) 유가공품 식육가공품 알가공품가 ) 최확수법 ❶ 3.3 제조법에따른시료액을연속 10 배단계희석하여 3 단계이상희석시료 (10, 1, 0.1 또는 1, 0.1, 0.01 또는 0.1, 0.01, 0.001) 를준비한다. * 시험용액을가한배지의전부또는대부분에서가스발생이인정되거나또최소량을가한배지의전부또는대부분이가스가발생되지않도록접종량과희석도를고려하여야한다. ❷ 시험용액 5 개또는 3 개씩을 BGLB 배지 ( 배지 3) 발효관에접종한다. 단, 10mL 을접종할때는두배농도유당배지를사용하고, 0.1mL 이하를접종할때는 10 배희석단계액을각각 1mL 씩사용한다. ❸ 시험용액을접종한 BGLB 배지발효관을 35~37 에서 48±3 시간배양한다. ❹ 발효관내에가스발생유무를확인한다. 가스가발생하면양성이다. * 배지를흔들때거품모양의가스의존재도인정한다. 가스가발생하지않았을때에는음성이다. ❺ BGLB 가스생성양성인시험관으로부터다음의배지들중하나에접종한다. EC-MUG 배지 BGLB-MUG 배지 LST-MUG 배지 ❻ 44.5 에서 24 시간배양한후자외선조사하에결과를관찰한다. 자외선조사하에푸른형광이관찰되는시험관을대장균양성으로판정하고최확수표 ( 별표 1 또는별표 2) 에근거하여대장균수를산출한다. 나 ) 대장균확인시험최확수법에서가스생성과형광이관찰된것을대장균추정시험양성으로판정하며확인시험을실시한다. ❶ 추정시험양성으로판정된시험관으로부터다음배지들중하나에이식한다. EMB 배지 MacConkey Agar ❷ 37 에서 24 시간배양하여전형적인집락을관찰한다. EMB agar : 녹색금속성광택을가진보라색집락 MacConkey agar : Bile 침전이있는붉은색집락 ❸ 그람염색, MUG 시험, IMViC 시험, 유당으로부터가스생성시험등을검사하여최종확인한다. 대장균은 MUG 시험에서형광이관찰되며, 가스생성, 그람음성의무아포간균이며, IMViC 시험에서 의결과를나타내는것은대장균 (E. coli) biotype 1 로규정한다. 나. 건조필름법식품공전참고 다. 자동화된최확수법 (Automated MPN) 자연치즈, 식육추출가공품, 닭도체, 오리도체에한한다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 29

30 별표 1 30 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

31 별표 1 ThermoFisher Scientific Microbiology Division 31

32 별표 2 32 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

33 별표 2 ThermoFisher Scientific Microbiology Division 33

34 제 유산균수 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) 희석액멸균생리식염수 ( 시액 2) : BR0053G 펩톤식염완충액 ( 시액 7): CM0509B 배지 MRS 배지 ( 배지 87): CM0361B BL한천배지 ( 배지 15) BCP첨가평판측정용배지 ( 배지 11) TOS-MUP배지 ( 배지 25) 혐기성배양제품 수용량 (90mm plate 기준 ) 12 개 12 개 15 개 용기 (Jar) 및용량혐기성대기생성 (generator) 혐기성표시기 (indicator) AnaeroJar 2.5L (AG0025A)* Rectangular AnaeroBox 2.5L (AB0025A)** Anaerobic Jar 3.5L (HP0011A) 3 * AnaeroGen 2.5L, 10sachets (AN0025A) AnaeroGen 3.5L, 10sachets (AN0035A) Anaerobic indicator, 100tests (BR0055B) AnaeroGen W-Zip Compact, 10 pouches + 10 sachets 4개 (AN0010W) 4 * * 최대 12개 90mm-plates ** 크기 =100x130x190mm, 최대 12개 90mm-plates 또는 21개 55mm-plates. 3* 최대 15개 90mm-plates 4* 용기 pouche( 지퍼방식 ) 및대기생성 sachet 포함. 최대 4개 90mm-plates( 파우치당 ). 34 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

35 제 유산균수 유산균수 ❶ 검사시료 g(ml) 에 9 배희석액 ( 멸균생리식염수 ( 시액 2) 또는펩톤식염완충액 ( 시액 7)) 을가하여 ml 가되게하고균질화한다 (10-1 용액 ) ❷ 시험용액 (10-1 용액 ) 1 ml 에희석액을가하여 10 ml 가되게하고 10-2 시험용액을만든후동일하게조작하여희석한다. MRS 배지 ( 배지 87)( 또는 BCP 첨가평판측정용배지 ( 배지 11)) 를사용할경우, 일반세균수의표준평판법에준하여시험한다. ❸ 각희석시험용액 1ml 을 2 장이상의멸균페트리디쉬에넣는다. ❹ 제조하여 로유지한 MRS 배지 15ml 를넣고잘섞어굳힌다. BL 한천배지 ( 배지 15) 를사용할경우, 각희석시험용액 0.1 ml 씩을 BL 한천배지 ( 배지 15) 2 매이상에접종하여멸균초자봉으로도말한다. 시료가접종된페트리디쉬는 에서 48 72±3 시간혐기배양 ( 발효유류의경우호기배양가능 ) 한다. 배양후생성된집락수를측정하고희석배수를곱하여검사시료 g 당균수를산출한다. ❺ 동일배지 3-5ml 를더넣어중첩시킨다. * 검체를취한후배지를첨가할때까지의시간이 20 분이넘지않도록주의한다.) ❻ 에서 48 72±3 시간혐기배양 ( 발효유류의경우호기배양가능 ) 한다. ❼ 1 개평판당 개의집락을생성한평판을선택하여집락수를계산하고, 측정된집락수를희석배수를곱하여검사시료 g 당균수를산출한다 유산간 구균및비피더스균 이시험법은유산간 구균단순첨가 ( 함유 ) 제품 ( 과자류, 코코아가공품류또는초콜릿류, 기타음료, 우유류, 아이스크림류등 ) 이거나유산간 구균과비피더스균을구분하여산정해야하는경우에한한다. 유산간 구균 비피더스균 BCP 첨가평판측정용배지 ( 배지 11) 를사용하는경우, 일반세균수의표준평판법에준하여시험하며, 에서 48 72±3 시간호기또는혐기배양한후발생한황색의집락을유산균으로계수한다. TOS-MUP 배지 ( 배지 25) 를사용하는경우, 일반세균수의표준평판법에준하여시험하고, 에서 48 72±3 시간혐기배양한다. 모든시험에서는시험용액을가하지아니한동일희석액 0.1 ml 를대조시험액으로하여시험조작의무균여부를확인한다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 35

36 제 진균수 ( 효모및사상균수 ) 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) 희석액멸균인산완충희석액 ( 시액 1) : R 멸균생리식염수 ( 시액 2) : BR0053G Ringer Solution Tablets, 100tabs (BR0052G) Phosphate Buffered Saline, Dulbecco A (BR0014G) 배지포테이토덱스트로오즈한천배지 ( 배지 12): CM0139B + 10% 주석산 ( 또는추천 10% Lactic acid, SR0021H) 시험방법 진균수의측정방법은 일반세균수가. 표준평판법에준하여시험한다 ❶ 3.3. 제조법에따라시험용액을준비하고, 10 배단계희석법으로희석한각단계희석액을준비한다. 검액을가하지아니한동일희석액 ( 대조시험액 ) 은시험조작의무균여부를확인한다. ❷ 각시험용액 1ml 씩을멸균페트리접시 ( 시험용액당 2 매이상 ) 에첨가한다. ❸ 제조하여약 43~45 로유지한덱스트로오즈한천배지 ( 배지 12) 약 15 ml 를무균적으로분주한다. 페트리접시뚜껑에부착하지않도록주의하면서조용히회전하여좌우로기울이면서검체와배지를잘혼합하여응고시킨다. ❹ 배지 3~5 ml 를가하여중첩시키고응고시킨다. ( 확산집락발생억제 ) 검체를취하여배지를가할때까지의시간은 20 분이상경과하여서는아니된다. ❺ 응고시킨페트리접시는뒤집어 25 에서 5~7 일간배양한다. 발생한집락수를계산하고그평균집락수에희석배수를곱하여진균수로한다. 36 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

37 제 살모넬라 (Salmonella spp.) 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) 1 차증균배지펩톤식염완충액 ( 시액 7): Buffered Peptone Water (CM0509B) Ferrous sulfate 첨가 TSB: ferrous sulfate + TSB( 배지 23)(CM0129B) 2차증균배지 Tetrathionate 배지 ( 배지 87): CM0671B + R R RV(Rappaport-Vassiliadis) 배지 ( 배지 57): CM0669B RVS 배지 ( 배지 88): CM0866B 분리배양배지 XLD 한천배지 ( 배지 58): CM0469B BG Sulfa 한천배지 ( 배지 87): R Bismuth Sulfite 한천배지 ( 배지 64): CM0201B Desoxycholate Citrate 한천배지 ( 배지 31): CM0227B Hektoen Enteric 한천배지 ( 배지 90) : CM0419B XLT4 한천배지 ( 배지 91): CM1061B + SR0237C 생화학단일시험시험항목제품명및제품번호 TSI 사면배지 ( 배지 32) Triple Sugar Iron (TSI) Agar, 500g (CM0277B) LIA 사면배지 ( 배지 92) Lysine Iron Agar, 500g (CM0381B) Gram Stain Kit (Crystal Violet, Decolorizer, Iodine, Safranin, Tray), 250ml x 4bt 그람염색 (R40080) Microbact Spot Indole (DMAC), 10ml (MB1448A) Indole 시험또는 Indole Reagent, Kovac's, 25ml/bottle (R21227) 또는 BactiDrop Indole, Kovac's, 0.75mlx50ampules (R21522) MRVP Medium, 500g (CM0043B) Methyl Red 시험 Methyl Red Reagent, 25ml/bottle (R21236) MRVP Medium, 500g (CM0043B) VP 시험 VP A reagent, 12ml (R21200) + VP B reagent, 25ml (R21281) 또는 BactiDrop VP A, 0.75ml x 50ampules (R21560) + BactiDrop VP B, 0.75ml x 50ampules (R21562) Citrate 시험 Simmons Citrate Agar, 500g (CM0155B) Urea Agar Base (Christensen Agar Base), 500g (CM0053B) + Urea 40% Solution, Urea 시험 10vials (SR0020K) Lysine Decarboxylase Lysine Decarboxylase Broth Tablets, 100tabs (CM0308S) 시험 Malonate시험 - KCN 시험 - 생화학동정키트 MicroBact GNB12E : microplate format: 80 tests (MB1130A), 160 tests(mb1073a) 또는 MicroBact GNB12A : strip format: 60 tests(mb1132a), 120 tests (MB1076A) + Oxidase Strips (MB0266A) + MicroBact Reagent Set D (MB1082A) for GNB systems + MicroBact Mineral Oil, 50ml (MB1093A) RapID ONE System, 20panels/kit (R ) + RapID Inoculation Fluid, 2mlx20tubes (R ) + RapID Spot Indole Reagent, 15mlx1vial (R ) ThermoFisher Scientific Microbiology Division 37

38 제 살모넬라 (Salmonella spp.) 라텍스신속응집키트 Wellcolex Colour Salmonella Kit, 50T(R ) : O항원 Group 구별 (A, B, C, D 1, E/G, Vi) 응집검사키트 Oxoid Salmonella Test Kit, 100T(DR1108A) : H항원에반응. H항원구별없음 응집혈청 Salmonella O Agglutinating Sera ( 카달로그 , 64~65페이지참조 ) Salmonella H Agglutinating Sera ( 카달로그 , 64페이지참조 ) 분자진단 : Thermo Scientific SureTect Real-Time PCR Assay (AOAC validated) SureTect Salmonella spp. kit (96T/Kit) 38 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

39 제 가. 증균배양 살모넬라 (Salmonella spp.) 1) 식품및식육 2) 소, 돼지도체 3) 닭, 오리도체 4) 식용란 ❶ 시료 25 ml(g) 에 225 ml 의펩톤식염완충액 (BPW: Buffered Peptone Water) 을첨가한다. ❷ 36±1 에서 18~24 시간배양한다. ❸ - ❹ - ❶ 제 세균학적시험법가. 시료채취및방법 1) 도체가 ) 소및나 ) 돼지의시료채취방법에따라멸균가아제나스폰지로시료를채취한후멸균백에넣고 50 ml BPW 를넣은다음균질화시킨다. ❷ 36±1 에서 18~24 시간배양한다 ❸ - ❹ - ❶ 제 세균학적시험법가. 시료채취및방법 1) 도체다 ) 닭의시료채취방법에따라채취한시료 30 ml을취하여 30 ml BPW에넣은다음균질화시킨다. ❷ 36±1 에서 18~24 시간배양한다 ❸ - ❹ - ❶ 식용란 20 개를채취하여제 세균학적시험법가. 시료채취및조제에따라소독한후말린식용란을깨서멸균비닐백에넣어서준비한다음 ( 달걀을깰때는위생장갑를껴야하며샘플마다위생장갑를바꾸어준다.) 손으로난황과난백이섞이도록균질화를시킨다. ❷ 준비된시료는상온 (20~24 C) 에서 96±2 시간동안정치한다. ❸ 25 ml 을채취하여 225 ml 의 ferrous sulfate supplemented TSB(35 mg ferrous sulfate + 1,000 ml TSB) 와섞어균질화를시킨후 60±5 분동안상온에두고균질화를시키고 test paper 를사용하여 ph 를측정한다. ph 조절이필요하다면 6.8±0.2 로조절한다. ❹ 이용액은 36±1 에서 18~24 시간증균한다. ❺ 배양액을 10ml Tetrathionate 배지에 1ml 을첨가함과동시에 10ml 의 RV 배지또는 RVS 배지중하나에 0.1ml 을첨가한다. ❻ 35~37 (Tetrathionate 배지 ) 및 41.5~42.5 (RV 배지또는 RVS 배지 ) 에서 20~24hr 증균배양한다. 나. 분리배양 ❼ 각각의증균배양액을 XLD Agar( 배지 58) 및 BG Sulfa 한천배지 ( 배지 90)[ 또는 Bismuth Sulfite 한천배지 ( 배지 64), Desoxycholate Citrate 한천배지 ( 배지 31), HE 한천배지 ( 배지 91), XLT4 한천배지 ( 배지 92)] 에도말한다. ❽ 36±1 에서 20~24시간배양한후, 의심집락을관찰한다. 의심집락은 5개이상취하여확인시험을실시한다. 배지 의심집락성상 XLD Agar 가운데가검거나검지않은붉은집락 BG Sulfa 한천배지 분홍색-흰색집락 Bismuth Sulfite 한천배지 금속성광택이있고, 가운데가검거나혹은검지않은녹색집락 Desoxycholate Citrate 한천배지 가운데가검거나혹은검지않은담황색집락 HE 한천배지 중심에검은색이있거나없는청록색집락 XLT4 한천배지 검정또는중심에검은색이있는적색집락 다. 확인시험 생화학적시험 ❾ 의심스러운집락에대해 TSI Agar( 배지 32) 또는 LIA 사면배지 ( 배지 93) 에천자하여 37±1 에서 20~24 시간배양한다. TSI: 바닥 - 노란색 ( 산 ) and/or 균열 ( 가스생성 ) 사면 - 변화없음 or 적색 ( 염기성 ) H 2 S 생성여부 : 검정 ( 생성 ) or 변화없음 ( 무생성 ) LIA: 바닥 - 보라색 ( 염기 ) 사면 - 보라색 ( 염기 ) H2S 생성여부 : 검정 ( 생성 ) 응집시험 균종확인이필요한경우살모넬라진단용항혈청을사용한응집반응결과에따라균종을결정한다. ⓬ O 혼합혈청시험다가 O 항혈청을사용하여슬라이드응집반응검사를실시한후살모넬라 O 인자혈청시험즉 A, B, C, D, E 군등의인자항혈청으로슬라이드응집반응을실시하여 O 혈청형을결정한다. ❿ TSI 및 LIA 검사결과살모넬라균으로추정되는균에대해서는그람염색으로그람음성의간균임을확인하고, ⓫ Indole(-), MR(+), VP(-), Citrate(+), Urease(-), Lysine(+), KCN(-), malonate(-) 시험등의생화학적검사를실시하여살모넬라양성유무를판정한다. ⓭ H 인자혈청시험편모 (H) 항혈청즉 a, b, c, d, e, h, g, k, l, r, y, 1.2, 1.3, 1.5, 1.6 등에대해시험관응집반응을실시하여결정한다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 39

40 제 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) 희석액멸균인산완충희석액 ( 시액 1) : R 멸균생리식염수 ( 시액 2) : BR0053G Ringer Solution Tablets, 100tabs (BR0052G) Phosphate Buffered Saline, Dulbecco A (BR0014G) 배지 10% NaCl 첨가 TSB 배지 : LP0005B + TSB배지 ( 배지 23)(CM0129B) 난황첨가만니톨식염한천배지 ( 배지 14): CM0085B + SR0047C Baird-Parker 한천배지 ( 배지 63): CM0275B + SR0054C Baird-Parker(RPF) 한천배지 ( 배지 67): CM0961B + SR0122A 또는 < 생배지세트 : BO0290J-SET> BO0290J(Baird-Parker RPF Agar, 90mlx10bt) + SR0122A 보통한천배지 ( 배지 8): CM0017B 그람염색시약 Gram Stain Kit, Enhanced, 250ml, 5btl (R40240): 배경적색을감소시켜작은그람음성미생물의대비를향상 Gram Stain Kit (Crystal Violet, Decolorizer, Iodine, Safranin, Tray), 250ml x 4bt (R40080) Coagulase 시험용제품 Coagulase Plasma Lyophilized (Rabbit Plasma w/edta), 5ml x 6vials (R21060) Staphylase Test, 100T (DR0595M) : clumping factor(coagulase) 의존재를검출 생화학적동정키트 MicroBact Staph 12S, 20tests (MB1561A) + MicroBact Staph Fast Blue Reagent, 2x10ml (MB1588A) + Sterile Mineral Oil (MB1093) RapID Staph Plus system, 20tests (R ) + RapID Inoculation Fluid (R ) (2 ml/tube, 20tubes) + RapID Nitrate A Reagent (R ) (15 ml/btl) + RapID Nitrate B Reagent (R ) (15 ml/btl) 황색포도상구균확인라텍스신속키트 (Coagulase, Protein A, polysaccharide antigen 확인 ) Staphytect Plus, 100T (DR0850M) : 라텍스시약이병에담긴액체형 ; clumping factor(coagulase), Protein A, specific capsular polysaccharides 모두가일치할때만응집이일어남. Dryspot Staphytect Plus, 120T (DR0100M) : 라텍스시약이카드에건조되어있는 Dryspot 제품 40 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

41 제 정성시험 가. 증균배양 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) ❶ 검체 25 g 또는 25 ml 를취하여 225 ml 의 10% NaCl 을첨가한 TSB 배지 ( 배지 23) 에가한다. ❷ 35~37 에서 18~24 시간증균배양한다. 나. 분리배양 ❸ 증균배양액을다음배지들중하나에접종한다. 난황첨가만니톨식염한천배지 ( 배지 14) Baird-Parker 한천배지 ( 배지 63) Baird-Parker(RPF) 한천배지 ( 배지 67) ❹ 35~37 에서 18~24 시간배양한후, 의심집락은확인시험을실시한다. 다. 확인시험 난황첨가만니톨식염한천배지 Baird-Parker 한천배지 Baird-Parker(RPF) 한천배지 황색불투명집락을나타내고주변에혼탁한백색환이있는집락 (18시간배양시직경 1-1.5mm, 48시간배양시직경 3mm정도의검은색의윤기있는볼록한집락이며가장자리는가느다란흰색이며그주위를투명한구역이둘러싸고있다.) 투명한띠로둘러싸인광택이있는검정색집락불투명한환으로둘러싸인검정색집락 ❺ 분리배양된평판배지상의집락을보통한천배지 ( 배지 8) 에옮기고 35~37 에서 18~24 시간배양한후 ❻ 순수배양된집락을그람염색을실시하여포도상의배열을갖는그람양성구균을확인한후 ❼ coagulase 시험을실시하며 24 시간이내에응고유무를판정한다. * Baird-Parker(RPF) 한천배지에서전형적인집락으로확인된것은 coagulase 시험을생략할수있다. ❽ Coagulase 양성으로확인된것은생화학시험을실시하여판정한다 정량시험 가. 균수측정 ❶ 검체 25 g 또는 25 ml 를취한후, 225 ml 의희석액을가하여 2 분간고속으로균질화한다. ❷ 균질화한것을시험용액으로하여 10 배단계희석액을만든다. ❸ 각단계별희석액을 Baird-Parker 한천배지 ( 배지 63) 3 장에 0.3 ml, 0.4 ml, 0.3 ml 씩총접종액이 1 ml 이되게도말한다. * 사용된배지는완전히건조시켜사용하고접종액이배지에완전히흡수되도록도말한후 10 분간실내에서방치시킨다. ❹ 35~37 에서 48±3 시간배양한다음의심집락을계수한다. 투명한띠로둘러싸인광택의검정색집락 (18 시간배양시직경 1-1.5mm, 48 시간배양시직경 3m 정도의검은색의윤기있는볼록한집락이며가장자리는가느다란흰색이며그주위를투명한구역이둘러싸고있다.) 나. 확인시험 ❺ 계수한평판에서 5 개이상의전형적인집락을선별하여 정성시험다. 확인시험에따라시험을실시한다. 다. 균수계산 확인동정된균수에희석배수를곱하여계산한다. 예를들어 10-1 희석용액을 0.3 ml, 0.3 ml, 0.4 ml 씩 3 장의선택배지에도말배양하고, 3 장의집락을합한결과 100 개의전형적인집락이계수되었고 5 개의집락을확인한결과 3 개의집락이황색포도상구균으로확인되었을경우시험용액 1 ml 에는황색포도상구균의수는 (3/5) = 600 이다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 41

42 제 장염비브리오 (Vibrio parahaemolyticus) 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) 희석액멸균인산완충희석액 ( 시액 1) : R 멸균생리식염수 ( 시액 2) : BR0053G Ringer Solution Tablets, 100tabs (BR0052G) Phosphate Buffered Saline, Dulbecco A (BR0014G) 배지 Alkaline 펩톤수 ( 배지 16): CM1028B TCBS 한천배지 ( 배지 17): CM0333B 보통한천배지 ( 배지 8): CM0017B 보통배지 ( 배지 7): CM0015B NaCl: Sodium chloride bacteriological, 500g, LP0005B TSI 사면배지 ( 배지 32): Triple Sugar Iron (TSI) Agar, 500g (CM0277B) LIM 반유동배지 (Lysine Indole Motility Medium)( 배지 18): MIL Medium, 20x5ml (R061350) ( 생배지 ) Indole 시험 Microbact Spot Indole (DMAC), 10ml (MB1448A) 또는 Indole Reagent, Kovac's, 25ml/bottle (R21227) 또는 BactiDrop Indole, Kovac's, 0.75mlx50ampules (R21522) VP 시험 MRVP Medium, 500g (CM0043B) Voges-Proskauer A reagent, 12ml (R21200) + Voges-Proskauer B reagent, 25ml (R21281) 또는 BactiDrop Voges-Proskauer A, 0.75mlx50ampules (R21560) + BactiDrop Voges-Proskauer B, 0.75mlx50ampules (R21562) Mannitol 이용성시험 Purple Broth Base( 배지20)(R454352, 500g) + 1% Mannitol Arginine 및 Ornithine 분해시험 Moeller Basal Broth( 배지 21) + 1%Arginine 또는 1% Ornithine ONPG 시험 ONPG Broth, 1ml x 20, R 또는 ONPG Broth, 2ml x 500, EB0169A 또는 ONPG Discs, 50T (DD0013T) Oxidase 시험 : Oxidase Strips, 50tests (MB0266A) 또는 BactiDrop Oxidase 0.75mlx50ampules (R21540) 생화학동정키트 MicroBact GNB24E : microplate format: 40tests(MB1131A), 80tests(MB1074A) + Oxidase Strips, 50tests (MB0266A) + MicroBact Reagent Set D (MB1082A) for GNB systems + MicroBact Mineral Oil, 50ml (MB1093A) RapID NF Plus Panel: 20 panels(r ) + RapID Inoculation Fluid (R ) (1 ml x 20tubes) + RapID Nitrate A Reagent (R )(15 ml x 1Bottle) + RapID Spot Indole Reagent (R )(15 ml x 1Bottle) 42 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

43 제 정성시험 가. 증균배양 장염비브리오 (Vibrio parahaemolyticus) ❶ 검체 25 g 또는 25 ml 를취하여 225 ml 의 Alkaline 펩톤수 ( 배지 16) 를가한다. ❷ 35~37 에서 18~24 시간증균배양한다. 나. 분리배양 ❸ 증균배양액을 TCBS 한천배지 ( 배지 17) 에접종하여분리배양한다. ❹ 35~37 에서 18~24 시간배양하고의심집락을관찰한다. 직경 2~4 mm 인청록색의서당 (sucrose) 비분해집락에대하여확인시험을실시한다. 다. 확인시험 ❺ 분리배양된평판배지상의집락을다음의배지에각각접종한다. TSI 사면배지 ( 배지 32) LIM 반유동배지 ( 배지 18) 2% NaCl 을첨가한보통한천배지 ❻ 35~37 에서 18~24 시간배양한다. ❼ 장염비브리오로의심되는집락을확인한다. TSI 사면배지 사면부가적색 (alkaline), 고층부는황색 (acid), 가스가생성되지않음 ( 균열없음 ) LIM 반유동배지 바닥이보락색 (Lysine Decarboxylase 양성 ), Indole 생성 (indole시약을가하면위쪽이붉은색을띰 ), 운동성양성 ( 찌른부위주변으로퍼져서성장한다 ) 의심집락을 oxidase 시험한다 : Oxidase 양성장염비브리오로추정된균은 NaCl 을가한 Alkaline 펩톤수 ( 배지 16) 에의한내염성시험 : 0% 및 10% NaCl 을가한 Alkaline 펩톤수 : 발육음성 3% 및 8% NaCl 을가한 Alkaline 펩톤수 : 발육양성 VP 시험 : 음성 Mannitol 이용성시험 : 산생성 ( 배지가노란색을띰 ) Arginine 및 Ornithine 분해시험 : Arginine 분해음성, Ornithine 분해양성 ONPG 시험 : 음성 3% NaCl 을가한보통배지 (Nutrient Broth) 성장시험 : 42 에서발육양성 생화학동정키트 MicroBact GNB24E 또는 RapID NF Plus ThermoFisher Scientific Microbiology Division 43

44 제 정량시험 가. 균수측정 장염비브리오 (Vibrio parahaemolyticus) ❶ 검체 25 g 또는 25 ml 를취한후, 225 ml 의희석액을가하여 2 분간고속으로균질화하여시험용액을준비한다. 시험용액을 10 배단계희석액을만든다. ❷ 각단계별희석액을 TCBS 한천배지 ( 배지 17) 3 장에 0.3 ml, 0.4 ml, 0.3 ml 씩총접종액이 1 ml 이되게도말한다. 사용된배지는완전히건조시켜사용하고접종액이배지에완전히흡수되도록도말한후 10 분간실내에서방치시킨다. ❸ 35~37 에서 18~24 시간배양한다음청록색의서당비분해집락을계수한다. 나. 확인시험 ❹ 계수한평판에서 5 개이상의전형적인집락을선별하여 2% NaCl 을첨가한보통한천배지 ( 배지 8) 에접종한다. ❺ 35~37 에서 18~24 시간배양한다. ❻ 형성된집락에대해서다음의배지에각각접종한다. TSI 사면배지 ( 배지 32) LIM 반유동배지 ( 배지 18) 2% NaCl 을첨가한보통한천배지 ( 배지 8) ❼ 35~37 에서 18~24 시간배양한다. ❽ 장염비브리오로의심되는집락을확인한다. TSI 사면배지 사면부가적색 (alkaline), 고층부는황색 (acid), 가스가생성되지않음 ( 균열없음 ) LIM 반유동배지 바닥이보락색 (Lysine Decarboxylase 양성 ), Indole 생성 (indole시약을가하면위쪽이붉은색을띰 ), 운동성양성 ( 찌른부위주변으로퍼져서성장한다 ) 의심집락을 oxidase 시험한다 : Oxidase 양성장염비브리오로추정된균은 NaCl 을가한 Alkaline 펩톤수 ( 배지 16) 에의한내염성시험 : 0% 및 10% NaCl 을가한 Alkaline 펩톤수 : 발육음성 3% 및 8% NaCl 을가한 Alkaline 펩톤수 : 발육양성 VP 시험 : 음성 Mannitol 이용성시험 : 산생성 ( 배지가노란색을띰 ) Arginine 및 Ornithine 분해시험 : Arginine 분해음성, Ornithine 분해양성 ONPG 시험 : 음성 3% NaCl 을가한보통배지성장시험 : 42 에서발육양성 생화학동정키트 MicroBact GNB24E 또는 RapID NF Plus 다. 균수계산 확인동정된균수에희석배수를곱하여계산한다. 44 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

45 제 클로스트리디움퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) 희석액멸균인산완충희석액 ( 시액 1) : R 멸균생리식염수 ( 시액 2) : BR0053G Ringer Solution Tablets, 100tabs (BR0052G) Phosphate Buffered Saline, Dulbecco A (BR0014G) 배지 Cooked Meat 배지 ( 배지 33): CM0081B 카나마이신 : Kanamycin Sulphate Supplement, 10mg x 10vials (SR0092E) 난황첨가 TSC 한천배지 ( 배지 41): CM0587B + SR0088E + SR0047C 난황첨가 Clostridium perfringens 한천배지 ( 배지 27) 보통한천배지 ( 배지 8): CM0017B 그람염색 Gram Stain Kit, Enhanced, 250ml, 5btl (R40240): 배경적색을감소시켜작은그람음성미생물의대비를향상 Gram Stain Kit (Crystal Violet, Decolorizer, Iodine, Safranin, Tray), 250ml x 4bt (R40080) GAM 배지 ( 배지 34) BTB-MR 지시약 ( 시액 4) 혐기성배양제품 수용량 (90mm plate 기준 ) 12개 12 개 15 개 용기 (Jar) 및용량혐기성대기생성 (generator) 혐기성표시기 (indicator) AnaeroJar 2.5L (AG0025A)* Rectangular AnaeroBox 2.5L (AB0025A)** Anaerobic Jar 3.5L (HP0011A) 3 * AnaeroGen 2.5L, 10sachets (AN0025A) AnaeroGen 3.5L, 10sachets (AN0035A) Anaerobic indicator, 100tests (BR0055B) AnaeroGen W-Zip Compact, 10 pouches + 10 sachets 4개 (AN0010W) 4 * * 최대 12개 90mm-plates ** 크기 =100x130x190mm, 최대 12개 90mm-plates 또는 21개 55mm-plates. 3* 최대 15개 90mm-plates 4* 용기 pouche( 지퍼방식 ) 및대기생성 sachet 포함. 최대 4개 90mm-plates( 파우치당 ). ThermoFisher Scientific Microbiology Division 45

46 제 정성시험법 가. 증균배양 클로스트리디움퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) ❶ 3.3 제조법에따른시험용액 1 ml 를 Cooked Meat 배지 ( 배지 33) 의아랫부분에접종하여 35~37 에서 18~24 시간동안혐기배양한다. 나. 분리배양 ❷ 증균배양액을다음배지들중하나에접종한다. 카나마이신을 200 μg/ml 의농도로가한난황첨가 TSC 한천배지 ( 배지 41) 카나마이신을 200 μg/ml 의농도로가한난황첨가 Clostridium perfringens 한천배지 ( 배지 27) ❸ 35~37 에서 18~24 시간혐기배양하고의심집락을관찰하고확인시험을실시한다. 카나마이신및난황첨가 TSC 한천배지카나마이신및난황첨가 Clostridium perfringens 한천배지 다. 확인시험 불투명한환을가지는황회색집락직경 2mm 정도의약간돌기된유황색으로주변에불투명한백색환이있는집락 ❹ 분리배양된평판배지상의집락을보통한천배지 ( 배지 8) 2 장에각각접종한다. ❺ 1 장은 35~37 에서 18~24 시간혐기배양하고, 1 장은 35~37 에서 18~24 시간호기배양한다. ❻ 호기배양에서균의비발육을확인하고, 혐기배양집락을그람염색을실시한다 : 그람양성간균 ❼ 그람양성간균으로확인된집락은 glucose, lactose, inositol, raffinose 를 1% 가한 4 종의 GAM 배지 ( 배지 34) 에옮긴다. ❽ 35~37 에서 1~2 일간배양하여운동성의유무를관찰한다 : 운동성이없다. ❾ 3 일간배양후, BTB-MR 지시약 ( 시액 4) 을가한다 : 붉은색으로변하는것을양성으로판정한다. ❿ Glucose, lactose, inositol 과 raffinose 를분해하며운동성이없는것을확인하면 Lecithinase 억제시험을실시한다. 난황이포함된 TSC 한천배지 ( 배지 41) 에접종하여 35~37 에서 24 시간혐기배양한후 2~4 mm 의불투명한환을가지는황회색집락을양성으로판정한다. 46 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

47 제 클로스트리디움퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 정량시험 가. 균수측정 ❶ 검체 25 g 또는 25 ml 를취하여 225 ml 의희석액을가한후 1~2 분간저속으로균질화한후 10 배단계희석액을만든다. ❷ 시험용액및단계별희석액 1 ml 씩을 2 매이상의멸균페트리접시에무균적으로분주하고, 43~45 로유지한난황을첨가하지않은 TSC 한천배지 ( 배지 41) 10~15 ml 를가하여좌우로돌리면서잘혼합한후응고시킨다. ❸ 응고된배지위에다시동일한배지 10 ml 를가하여중첩시킨후 35~37 에서 24±2 시간혐기배양한다. ❹ 150 개이하의전형적인불투명환이있는검은색집락이확인된평판을선별하여각집락수를계수한다. 나. 확인시험 ❺ 계수한평판에서 5 개이상의전형적인집락을선별하여보통한천배지 ( 배지 8) 2 장에각각접종한다. ❻ 1 장은 35~37 에서 18~24 시간혐기배양하고, 1 장은 35~37 에서 18~24 시간호기배양한다. ❼ 호기배양에서균의비발육을확인하고, 혐기배양집락을그람염색을실시한다 : 그람양성간균 ❽ 그람양성간균으로확인된집락은 glucose, lactose, inositol, raffinose 를 1% 가한 4 종의 GAM 배지 ( 배지 34) 에옮긴다. ❾ 35~37 에서 1~2 일간배양하여운동성의유무를관찰한다 : 운동성이없다. ❿ 3 일간배양후 BTB-MR 지시약 ( 시액 4) 을가한다 : 붉은색으로변하는것을양성으로판정한다. ⓫ Glucose, lactose, inositol 과 raffinose 를분해하며운동성이없는것을확인하면 Lecithinase 억제시험을실시한다 : 난황이포함된 TSC 한천배지 ( 배지 41) 에접종하여 35~37 에서 24 시간혐기배양한후 2~4 mm 의불투명한환을가지는황회색집락을양성으로판정한다. 다. 균수계산 확인동정된균수에희석배수를곱하여계산한다. 예로 10-4 에서 85 개의전형적인집락이계수되었고, 이중 5 개의집락을확인한결과 4 개의집락이클로스트리디움퍼프린젠스로동정되었을경우 85 (4/5) 10,000=680,000 으로계산한다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 47

48 제 리스테리아모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) 증균배양배지 Listeria 증균배지 ( 배지 35): CM0862B + SR0141E UVM-modified Listeria 증균배지 ( 배지 36): CM0863B + SR0142E Fraser Listeria 배지 ( 배지 37): CM0895B + SR0156E 분리배양배지 Oxford 한천배지 ( 배지 38): CM0856B + SR0140E LPM 한천배지 ( 배지 39): R R PALCAM 한천배지 ( 배지 65): CM0877B + SR0150E Tryptic Soy 한천배지 ( 배지 40): CM0131B Yeast Extract: Yeast Extract Powder, 500g (LP0021B) 그람염색 Gram Stain Kit, Enhanced, 250ml, 5btl (R40240): 배경적색을감소시켜작은그람음성미생물의대비를향상 Gram Stain Kit (Crystal Violet, Decolorizer, Iodine, Safranin, Tray), 250ml x 4bt (R40080) 라텍스신속응집키트 : Oxoid Listeria Test Kit, 100T (DR1126A) 생화학적동정키트 : MicroBact Listeria 12L, 20T (MB1128) + Hemolysis Reagents(MB1249A) RapID CB Plus system (R ) + Innoculation Fluid, (R ) + Nitrate A Reagents (R ), Nitrate B Reagents (R ) β-용혈검사 Blood Agar Base, 500g (CM0055B) + Horse Blood Defibrinated, 100ml (SR0050C) 운동성검사 SIM Medium, 500g (CM0435B) ISO 조성크로모제닉배지 (ALOA) Chromogenic Listeria Agar (ISO), 500g (CM1084B) + OCLA (ISO) Selective Supplement, 10vials (SR0226E) + OCLA (ISO) Differential Supplement, 10vials (SR0244E) Thermo Scientific SureTect Real-Time PCR Assay (AOAC validated): 본사문의요망 SureTect Listeria monocytogenes kit (96T/Kit) SureTect Listeria spp. kit (96T/Kit) PikoReal 24 Real-Time PCR Instrument SureTect Software 및노트북컴퓨터 7 일소요되는리스테리아실험을 2 일만에끝내는방법 --> 부록 Listeria Precis TM 48 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

49 제 리스테리아모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 가. 증균배양 가공식품및수산물 ❶ 검체 25 g(ml) 를취하여 225 ml 의 Listeria 증균배지 ( 배지 35) 를가한다. ❷ 30 에서 48 시간배양한다. ❸ - ❹ - 유가공품, 식육가공품, 알가공품, 식육및가금류 ❶ 검체 25g(mL) 을 Listeria 증균배지 ( 배지 35) 또는 UVM-modified Listeria 증균배지 ( 배지 36) 225 ml 에접종한다. ❷ 30 에서 24±2 시간동안증균배양한다. ❸ 배양액 0.1 ml 을 10ml 의 Fraser broth( 배지 37) 에접종한다. ❹ 35~37 에서 시간 2 차증균을실시한다. 나. 분리배양 ❺ 증균배양액을다음배지들중하나에접종한다. Oxford 한천배지 ( 배지 38) LPM 한천배지 ( 배지 39) PALCAM 한천배지 ( 배지 65) ❻ 에서 24~48 시간배양한다. ❼ 의심집락이확인한다. 배지 Oxford 한천배지 ( 배지 38) LPM 한천배지 ( 배지 39) PALCAM 한천배지 ( 배지 65) 의심집락검은색환이있는갈색집락둥근유리모양의회색 / 푸른색집락검은색환이있고움푹들어간모양의갈색 / 검은색집락 ❽ 의심집락을 0.6% yeast extract 가포함된 Tryptic soy 한천배지 ( 배지 40) 에접종한후, 30 에서 24~48 시간배양한다. 다. 확인시험 ❾ 그람염색후그람양성간균이확인되면 ❿ hemolysis, motility, catalase, CAMP test 와 mannitol, rhamnose, xylose 의당분해시험을실시한다. 이결과 β-hemolysis 양성, catalase 양성, motility 양성을나타내며, CAMP test 결과 Staphylococcus aureus(atcc 25923) 에서양성, Rhodococcus equi(atcc 6939) 에서음성으로나타나는동시에당분해시험결과 mannitol 비분해, rhamnose 분해, xylose 비분해의결과를보일경우 Listeria monocytogenes 양성으로판정한다. 생화학동정키트 MicroBact Listeria 12L RapID CB Plus ThermoFisher Scientific Microbiology Division 49

50 제 장출혈성대장균 (Enterohemorrhagic Escherichia coli) 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) 배지 mtsb 배지 ( 배지 74): CM0989B + SR0181E TC-SMAC 배지 ( 배지 66): CM0813B + SR0172E BCIG 한천배지 ( 배지 73): < 분말배지 >CM0945B; < 생배지 >PO5109A 보통한천배지 ( 배지 8): CM0017B 그람염색 Gram Stain Kit, Enhanced, 250ml, 5btl (R40240): 배경적색을감소시켜작은그람음성미생물의대비를향상 Gram Stain Kit (Crystal Violet, Decolorizer, Iodine, Safranin, Tray), 250ml x 4bt (R40080) 생화학적동정키트 : MicroBact GNB12E : microplate format: 80 tests (MB1130A), 160 tests(mb1073a) 또는 MicroBact GNB12A : strip format: 60 tests(mb1132a), 120 tests (MB1076A) + Oxidase Strips (MB0266A) + MicroBact Reagent Set D (MB1082A) for GNB systems + MicroBact Mineral Oil, 50ml (MB1093A) RapID ONE System, 20panels/kit (R ) + RapID Inoculation Fluid, 2mlx20tubes (R ) + RapID Spot Indole Reagent, 15mlx1vial (R ) 대장균 O157:H7 확인라텍스키트 RIM TM E.coli O157:H7 Latex Test, 50tests (R24250) Wellcolex E.coli O157:H7, 50tests (R ) 대장균 O157 확인라텍스키트 Oxoid Escherichia coli O157 Latex Test, 100tests (DR0620M) Dryspot E. coli O157, 120tests (DR0120M) * E.coli O157:H7 은 Sorbitol 분해를못하여 Sorbitol MacConkey Agar(CM813B) 에서흰색집락을보이므로, 이배지와조합으로 O157:H7 을추정가능하다. 크로모제닉배지 Sorbitol MacConkey Agar w/bcig, 500g (CM0981B): E.coli O157 검출을위한선택배지 Brilliance ESBL Agar Plate (PO5302A) ESBL 항생제내성을가진대장균분리배양 분자진단 : Thermo Scientific SureTect Real-Time PCR Assay (AOAC validated) SureTect E. coli O157:H7 kit (96T/Kit) (PT0400A) 50 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

51 제 장출혈성대장균 (Enterohemorrhagic Escherichia coli) 본시험법은대장균 O157:H7 과대장균 O157:H7 이아닌베로독소생성대장균 (VTEC, Verotoxinproducing E. coli) 을모두검출하는시험법이다. 장출혈성대장균의낮은최소감염량을고려하여검출민감도증가와신속검사를위한스크리닝목적으로증균배양후배양액 (1~2 ml) 에서베로독소유전자확인시험을우선실시한다. 베로독소 (VT1 그리고 / 또는 VT2) 유전자가확인되지않을경우불검출로판정할수있다. 다만, 베로독소유전자가확인된경우에는반드시순수분리하여분리된균의베로독소유전자보유유무를재확인한다. 베로독소가확인된집락에대하여생화학적검사를통하여대장균으로동정된경우장출혈성대장균으로판정한다. 가. 증균배양 ❶ 검체 25g(25mL) 을취하여 225mL mtsb( 배지 74) 를가한후 ❷ 35~37 에서 24시간증균배양한다. 나. 분리배양 ❸ 장출혈성대장균의분리를위해 TC-SMAC 배지 ( 배지 66) 와 BCIG 한천배지 ( 배지 73) 에각각접종하여 ❹ 35~37 에서 18~24시간배양하고의심집락을확인한다. TC-SMAC배지 sorbitol을분해하지않은무색집락직경 2mm 정도의약간돌기된유황색으로주변에불투 BCIG 한천배지청록색집락 다. 확인시험 ❺ 의심집락각 5 개이상을취하여보통한천배지에옮겨 * 전형적인집락이 5 개이하일경우취할수있는모든집락에대하여확인시험을실시한다. ❻ 35~37 에서 18~24 시간배양한다. ❼ 배양후집락에대하여베로독소유전자 PCR 확인시험을수행한후 ❽ 베로독소양성집락을대상으로그람음성간균을확인하고 ❾ 생화학시험을실시하여대장균으로확인된경우장출혈성대장균으로판정한다. MicroBact GNB12E ( 또는 MicroBact GNB12A 또는 RapID ONE system) 라. 베로독소유전자확인시험 : 식품공전참조 마. 대장균 O157:H7의확정이필요할경우, ❿ 다. 확인시험으로장출혈성대장균으로판정된균주에대하여 O157과 H7 혈청형을라텍스응집키트등을사용하여결정한다. 제조사가제시하는시험방법에따라진행한다. ⓫ 최종적으로 1] 베로독소유전자 (VT1 또는 / 그리고 VT2) 양성, 2] O157 및 H7 혈청확인, 3] 대장균으로확인되었을때 O157:H7 으로판정한다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 51

52 제 여시니아엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica) 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) PSBB 배지 ( 배지 44) 0.5% KOH 가함유된 0.5% 식염수 : KOH + Sodium Chloride Bacteriological, 500g(LP0005B) MacConkey 한천배지 ( 배지 30): CM0115B CIN 한천배지 ( 배지 45): CM0653B + SR0109E TSI 한천배지 ( 배지 32): CM0277B Urea 시험 Urea Agar Base (Christensen Agar Base), 500g (CM0053B) + Urea 40% Solution, 10vials (SR0020K) Citrate 시험 Simmons Citrate Agar, 500g (CM0155B) Motility 시험 SIM Medium, 500g (CM0435B) 그람염색 Gram Stain Kit, Enhanced, 250ml, 5btl (R40240): 배경적색을감소시켜작은그람음성미생물의대비를향상 Gram Stain Kit (Crystal Violet, Decolorizer, Iodine, Safranin, Tray), 250ml x 4bt (R40080) 시험방법 가. 증균배양 ❶ 검체 25 g 또는 25 ml 를취하여 225 ml 의 PSBB 배지 ( 배지 44) 에가한다. ❷ 10 에서 10 일간배양한다. 나. 분리배양 ❸ 증균배양액 0.1 ml 를 0.5% KOH 가함유된 0.5% 식염수 1 ml 에가하여수초간섞는다. ❹ 이용액을 MacConkey 한천배지 ( 배지 30) 와 CIN 한천배지 ( 배지 45) 에각각접종한다. ❺ 30 에서 24±2 시간배양하고의심집락을확인한다. MacConkey 한천배지 : 유당을비분해하는집락 CIN 한천배지 : 중심부가짙은적색을보이는집락 다. 확인시험 ❻ 의심집락을골라각각 TSI 사면배지 ( 배지 32) 의사면과고층부에접종하여, ❼ 35~37 에서 18~24 시간배양후성상을확인한다. 고층부와사면 : 노란색 (acid), 균열없음 ( 가스생성없음 ) 황화수소가발생하지않음 ( 검지않음 ) ❽ 의심균주를선택하여 SIM Medium 에서 25, 37 에서운동성시험을실시한다. 여시니아엔테로콜리티카는 37 에서는운동성을나타내지않고 25 에서운동성을가지는특성이있다. ❾ urea(urea Agar), citrate(simmons Citrate Agar) 시험등을한다 urea 시험양성, citrate 시험음성이며, ❿ 그람음성간균일때양성으로판정한다. 52 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

53 제 바실러스세레우스 (Bacillus cereus) 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) 멸균인산완충희석액 ( 시액 1) : R 멸균생리식염수 ( 시액 2) : BR0053G Ringer Solution Tablets, 100tabs (BR0052G) Phosphate Buffered Saline, Dulbecco A (BR0014G) MYP 한천배지 ( 배지 46): CM0929B + SR0099E + SR0047C 보통한천배지 ( 배지 8): CM0017B 그람염색 Gram Stain Kit, Enhanced, 250ml, 5btl (R40240): 배경적색을감소시켜작은그람음성미생물의대비를향상 Gram Stain Kit (Crystal Violet, Decolorizer, Iodine, Safranin, Tray), 250ml x 4bt (R40080) β-용혈검사 Blood Agar Base, 500g (CM0055B) + Horse Blood Defibrinated, 100ml (SR0050C) VP 시험 MRVP Medium, 500g (CM0043B) Voges-Proskauer A reagent, 12ml (R21200) + Voges-Proskauer B reagent, 25ml (R21281) 또는 BactiDrop Voges-Proskauer A, 0.75mlx50ampules (R21560) + BactiDrop Voges-Proskauer B, 0.75mlx50ampules (R21562) Nitrate 시험 Nitrate Broth, 20x5ml (R061532) 또는 Buffered Nitrate Motility Medium, 24x10ml (BO1069E) Nitrate A reagent, 25ml (R21239) + Nitrate B reagent, 25ml (R21242) 또는 BactiDrop Nitrate A, 0.75mlx50ampules (R21536) + BactiDrop Nitrate B, 0.75mlx50ampules (R21538) 크로모제닉배지 Brilliance Bacillus Cereus Agar, 500g (CM1036B) + Brilliance Bacillus Cereus Selective Supplement, 10vials (SR0230E) ThermoFisher Scientific Microbiology Division 53

54 제 바실러스세레우스 (Bacillus cereus) 정성시험 가. 분리배양 ❶ 검체 25 g 또는 25 ml 를취하여 225 ml 의희석액을가하여균질화여검액을준비한다. ❷ 검액을 MYP 한천배지 ( 배지 46) 에접종하여 30 에서 24 시간배양하고의심집락을관찰한다. 혼탁한환 (lecithinase 생성 ) 을갖는분홍색집락 * 이때명확하지않을경우 24 시간더배양하여관찰한다. 나. 확인시험 ❸ MYP 한천배지에서전형적인집락을선별하여보통한천배지 ( 배지 8) 에접종하고 30 에서 24 시간배양한다. ❹ 순수배양된집락을그람염색을실시하여포자를갖는그람양성간균을확인하고, ❺ 확인된균은 nitrate 환원능, VP, β-hemolysis, tyrosine 분해능, 혐기배양시의포도당이용등의생화학시험을실시한다. Nitrate 환원 VP 양성 Blood Agar 에서 β- 용혈 Tyrosine 분해 혐기배양시포도당이용 ❻ 추가로 30, 24 시간그리고상온, 2~3 일추가배양하여곤충독소단백질 (Insecticidal crystal protein) 생성확인시험도실시한다. * 이시험법은 Bacillus cereus 와 Bacillus thuringiensis 를구분하는시험법으로, 보통한천배지에 30, 24 시간그리고상온, 2 3 일추가배양한후직접또는염색하여현미경관찰결과 ( 1000 배 ), 곤충독소단백질이확인되면 Bacillus thuringiensis 로한다 정량시험 가. 균수측정 ❶ 검체 25 g 또는 25 ml 를취한후, 225 ml 의희석액을가하여 2 분간고속으로균질화하여시험용액을준비한다. 시험용액을 10 배단계희석액을만든다. ❷ MYP 한천평판배지 ( 배지 46) 에단계별희석용액 0.2 ml 씩 5 장을도말하여총접종액이 1 ml 이되게한후 ❸ 30 에서 24±2 시간배양한후의심집락을관찰한다. 집락주변에 lecithinase 를생성하는혼탁한환이있는분홍색집락을계수한다. 나. 확인시험 ❹ 계수한평판에서 5 개이상의전형적인집락을선별하여보통한천배지 ( 배지 8) 에접종하고 30 에서 24 시간배양한다. ❺ 순수배양된집락을그람염색을실시하여포자를갖는그람양성간균을확인하고, ❻ 확인된균은 nitrate 환원능, VP, β-hemolysis, tyrosine 분해능, 혐기배양시의포도당이용등의생화학시험을실시한다. Nitrate 환원 VP 양성 Blood Agar 에서 β- 용혈 Tyrosine 분해 혐기배양시포도당이용 ❼ 추가로 30, 24 시간그리고상온, 2~3 일추가배양하여곤충독소단백질 (Insecticidal crystal protein) 생성확인시험도실시한다. * 이시험법은 Bacillus cereus 와 Bacillus thuringiensis 를구분하는시험법으로, 보통한천배지에 30, 24 시간그리고상온, 2 3 일추가배양한후직접또는염색하여현미경관찰결과 ( 1000 배 ), 곤충독소단백질이확인되면 Bacillus thuringiensis 로한다. 다. 균수계산 54 확인동정된균수에희석배수를곱하여계산한다. 예로 10-1 희석용액을 0.2 ml 씩 5 장도말배양하여 5 장의집락을합한결과 100 개의전형적인집락이계수되었고 5 개의집락을확인한결과 3 개의집락이바실러스세레우스로확인되었을경우 100 (3/5) 10= 600 으로계산한다. ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

55 제 캠필로박터제주니 / 콜리 (Campylobacter jejuni/coli) 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제7.4.4 배지및시액참조 ) Hunt 배지 ( 배지 47) : CM0067B + LP0021B + SR0048C + SR0232E 선택첨가제 ( 시험방법의검체에맞게선택 ) : Supplement A, Supplement B Bolton 배지 ( 배지 68): CM0983B + SR0183E( 또는 SR0208E) + SR0048C Preston 액체배지 ( 배지 78): CM0067B + SR0117E( 또는 SR0204E) + SR0232E + SR0048C Modified Campy Blood Free 한천배지 ( 배지 48): CM0739B + LP0021B + SR0155E Abeyta-Hunt 한천배지 ( 배지 49) : CM1032B + LP0011B + LP0021B + SR0048C + Supplement Preston 한천배지 ( 배지 75) : CM0689B + SR0117E( 또는 SR0204E) + SR0232E + SR0048C Campy Cefex 한천배지 (CCA)( 배지 76)): R SR0232E + SR0222C* + Cefoperazone 또는 < 생배지 > Campy-Cefex Agar, 10plates, R * SR0222C + Cefoperazone 대체추천품 : SR0155E Blaser's Campylobacter 한천배지 (Blaser's Campylobacter Agar(BCA)( 배지 77): CM0271B + SR0048C + Camylobacter Supplement(A)** ( 유제품의경우사용가능 ) ** Campylobacter Supplement(A) 대체추천품 : SR0155E 대비염색 : Crystal Violet (R40052) Catalase 검사 : 과산화수소수 Oxidase 시험 : Oxidase Strips, 50T (MB0266A) 또는 BactiDrop Oxidase 0.75mlx50 앰플 (R21540) 황화수소시험 : Triple Sugar Iron (TSI) Agar, 500g (CM0277B) Nalidixic acid 항생제감수성검사 : Nalidixic acid 30μg, 5x50Discs (CT0031B) Cephalothin 항생제감수성검사 : Cephalothin 30μg, 5x50Discs (CT0010B) Hippurate 시험 : Hippurate Disk, 25discks (R21085) + Ninhydrin Reagent, 25ml (R21238) ( 또는 BactiDrop Ninhydrin, 0.75mlx50 앰플 (R21534)) 생화학신속키트 : O.B.I.S. campy, 60T (ID0800M): Gram-lysis 및 L-ALA 테스트 ; Campylobacter spp. 에대한민감도 100%, 특이도99.6% 라텍스신속응집키트 : DrySpot Campylobacter Test Kit, 50T (DR0150M) : C. jejuni, C. lari, C. coli, C. upsaliensis 를검출. 크로모제닉배지 : Brilliance CampyCount Agar, 10plates (PO1185A): C. jejuni 및 C. coli의선택배양및계수 미호기성 (5% O 2, 10% CO 2, 85% N 2 ) 배양제품 수용량 (90mm plate 기준 ) 12 개 12 개 15 개 용기 (Jar) 및용량미호기성대기생성 (generator) 미호기성표시기 (indicator) AnaeroJar 2.5L (AG0025A)* Rectangular AnaeroBox 2.5L (AB0025A)** Anaerobic Jar 3.5L (HP0011A) 3 * CampyGen 2.5L, 10 sachets (CN0025A) CampyGen 3.5L, 10 sachets (CN0035A) - 4 개 W-Zip Seal Pouches, 20 pouches (AG0060C) 4 * * 최대 12 개 90mm-plates ** 크기 =100x130x190mm, 최대 12 개 90mm-plates 또는 21 개 55mm-plates. 3* 최대 15 개 90mm-plates 4* 지퍼방식의파우치. 최대 4 개 90mm-plates( 파우치당 ). CampyGen Compact, 20 sachets (CN0020C) ThermoFisher Scientific Microbiology Division 55

56 제 캠필로박터제주니 / 콜리 (Campylobacter jejuni/coli) 가. 증균배양 식품및식육 유가공품 소, 돼지도체 닭, 오리도체 ❶ 검체 25 g(ml) 를다음중하나의배지 100ml 에넣어균질화한다. Bolton 배지 ( 배지 68) Preston 배지 ( 배지 75) HUNT(+Campylobacter supplement (A)( 배지 47) ❷ 35~37 에서 4~5 시간동안미호기적으로 1 차증균한다. ❸ HUNT 배지사용시, Cefoperazone 용액 (0.8 g/100 ml) 0.4 ml 를첨가한다. ❶ 검체 25 g(ml) 를다음중하나의배지 100ml 에넣어균질화한다. Bolton 배지 ( 배지 68) Preston 배지 ( 배지 75) HUNT(CEB) (+Campylobacter supplement (B)( 배지 47) ❷ 35~37 에서 4~5 시간동안미호기적으로 1 차증균한다. ❸ HUNT(CEB) 배지사용시, Rifampicin 용액 (0.125 g/100 ml) 0.4 ml 를첨가한다. ❶ 제 세균학적시험법가. 시료채취및방법 1) 도체가 ) 소및나 ) 돼지의시료채취방법에따라멸균가아제나스폰지로시료를채취한후멸균백에넣고 25 ml BPW 를넣은다음균질화를시킨후, ❷ 혈액을첨가하지않은 2XBolton 배지 (2XBF-BEB) 25 ml 를넣고, ❸ 미호기적조건으로 42±1 에서 48±2 시간배양한다. ❹ - ❶ 제 세균학적시험법가. 시료채취및방법 1) 도체다 ) 닭의시료채취방법에따라채취한시료 30 ml 에혈액을첨가하지않는 2XBolton 배지 (2XBF-BEB) 30 ml 를넣고균질화한후, ❷ 미호기적조건에서 42±1 48±2 시간배양한다. ❸ - ❹ - ❹ 42±1 에서 24~48 시간미호기적으로 2 차증균한다. ❹ 42±1 에서 24~48 시간미호기적으로 2 차증균한다. 나. 분리배양 ❺ 증균배양액을다음중하나의배지에접종한다. Modified Campy blood free 한천배지 ( 배지 48) Abeyta-Hunt Blood 한천배지 ( 배지 49) Preston 한천배지 ( 배지 72) CCA 한천배지 ( 배지 73) BCA 한천배지 ( 배지 74) ❻ 42 에서 24~48 시간미호기적으로암소에서배양한후, 의심집락을확인한다. Modified Campy blood free 한천배지상에서원형또는불규칙한형태로서반투명한흰색또는투명한집락, Abeyta-Hunt 한천배지 ( 배지 49) 상에서무지개빛광택집락, Preston 한천배지에서는부드러운모서리를가진불규칙한원모양을형성하는반투명의흰색집락 ( 일부균주는황갈색또는약한핑크색집락을형성 ), CCA 및 BCA 한천배지에서는불규칙한가장자리를가지고점액이있으며회색인평평한집락 (24~48 시간배양후용혈은나타나지않으며분홍색이나노란 - 회색집락이나타나기도한다 ) 을선별한다. 다. 확인시험 ❼ 의심집락을선별하여항생제를넣지않은 Abeyta-Hunt 한천배지등분리배양에사용한한천배지에신속히접종하여 ❽ 42 에서 24~48 시간배양한다. ❾ 배양된집락을취하여, 암시야또는위상차현미경으로검경하거나또는대비염색하여지그재그모양을관찰한다. 이때대비염색은 10 ml 식염수에 2 방울의 crystal violet 을혼합한용액을이용한다. ❿ 현미경상으로확인된균에대하여 catalase 및 oxidase 양성임을확인한다. ⓫ 확인된균에대하여, 캠필로박터제주니는 hippurate 분해양성, 황화수소비생성, nalidixic acid 감수성, cephalothin 내성, 25 에서비생육, 42 에서생육여부등을확인하며, ⓬ 캠필로박터콜리는 hippurate 분해음성, nalidixic acid 감수성, cephalothin 내성, 25 에서비생육, 42 에서생육여부등생화학시험을실시한다. 56 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

57 제 클로스트리디움보툴리눔 (Clostridium botulinum) 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) 젤라틴인산완충액 ( 시액 5): LP0008B + Disodium phosphate Cooked Meat 배지 ( 배지 33): CM0081B TPGY 배지 (Trypticase Peptone Glucose Yeast Extract Broth) ( 배지 50) 혐기성난황한천배지 (Anaerobic Egg Yolk Agar)( 배지 52) : LP0021B + LP0042B + LP0085B + LP0005B + LP0012B + SR0047C Liver-Veal 난황한천배지 (Liver-Veal Egg Yolk Agar) ( 배지51) GAM 배지 (Gifu Anareobic Medium) ( 배지 34) 그람염색 Gram Stain Kit, Enhanced, 250ml, 5btl (R40240): 배경적색을감소시켜작은그람음성미생물의대비를향상 Gram Stain Kit (Crystal Violet, Decolorizer, Iodine, Safranin, Tray), 250ml x 4bt (R40080) Nitrate 시험 Nitrate Broth, 20x5ml (R061532) 또는 Buffered Nitrate Motility Medium, 24x10ml (BO1069E) Nitrate A reagent, 25ml (R21239) + Nitrate B reagent, 25ml (R21242) 또는 BactiDrop Nitrate A, 0.75mlx50ampules (R21536) + BactiDrop Nitrate B, 0.75mlx50ampules (R21538) 혐기성배양제품 수용량 (90mm plate 기준 ) 12 개 12 개 15 개 용기 (Jar) 및용량혐기성대기생성 (generator) 혐기성표시기 (indicator) AnaeroJar 2.5L (AG0025A)* Rectangular AnaeroBox 2.5L (AB0025A)** Anaerobic Jar 3.5L (HP0011A) 3 * AnaeroGen 2.5L, 10sachets (AN0025A) AnaeroGen 3.5L, 10sachets (AN0035A) Anaerobic indicator, 100tests (BR0055B) AnaeroGen W-Zip Compact, 10 pouches + 10 sachets 4개 (AN0010W) 4 * * 최대 12개 90mm-plates ** 크기 =100x130x190mm, 최대 12개 90mm-plates 또는 21개 55mm-plates. 3* 최대 15개 90mm-plates 4* 용기 pouche( 지퍼방식 ) 및대기생성 sachet 포함. 최대 4개 90mm-plates( 파우치당 ). ThermoFisher Scientific Microbiology Division 57

58 제 클로스트리디움보툴리눔 (Clostridium botulinum) 가. 증균배양 ❶ 고형또는반고형물검체는동량의젤라틴인산완충액 ( 시액 5) 을첨가하고균질화하여시험용액으로하며, 액상검체는그대로사용한다. ❷ 1~2 g 또는 1~2 ml 의검체를 15ml 의다음의배지중하나에접종하여하고해당조건에서배양한다. 2 개의 Cooked Meat 배지 ( 배지 33) : 35~37 에서 7 일간배양 2 개의 TPGY 배지 ( 배지 50) : 26 에서 7 일간배양 * 접종전각배지는 10~15 분간중탕하여탈산소한후신속히냉각하여사용하며, * 검체는배지아래부분에천천히접종하고교반하지않는다. ❸ 배양 7 일후검경하여전형적인클로스트리디움을관찰한다. 관찰되면다음의분리배양을실시하고, 관찰되지않는경우에는추가적으로 10 일간더배양한다. 나. 분리배양 ❹ 증균배양액 1~2 ml 와동량의여과제균한알코올을잘혼합하여실온에서 1 시간방치한후다음배지중하나에접종한다. 혐기성난황한천배지 ( 배지 52) Liver-Veal 난황한천배지 ( 배지 51) ❺ 35~37 에서 48±3 시간혐기적으로배양한후, 의심집락을확인한다. 배양후융기되거나평평하며, 표면이매끈하거나거친집락으로, 약간퍼져있거나불규칙하다. 경우에따라서는집락주위에혼탁한환이생긴다. 다. 확인시험 의심되는집락 10 개정도를확인시험한다. ❻ 분리균에대하여 Gram 양성의간균과균체말단에아포가형성되는것을관찰하고, ❼ 호기조건으로 35~37 에서 2~3 일간배양하였을경우균이발육되지않는것을확인한다. ❽ 0.1% 의 glucose 를첨가한 GAM 배지 ( 배지 34) 에접종하여 35~37 에서 1~4 일간배양하여운동성이있는것을양성으로판정하며, ❾ 질산염환원능이없으므로 glucose 0.1%, KNO 3 0.3% 를가한 GAM 배지 ( 배지 34) 에접종하여 35~37 에서 2 일간배양한후 Nitrite 지시약 ( 시액 6) 을가하였을경우색의변화가없어야한다. ❿ 우유를 ph 6.8 되도록조정하여, FeSO ~0.1 g 을첨가한배지에균을접종하여 35~37 에서배양한후우유를분해하는것을양성으로판정 ( 각독소 type 에따라분해능이다름 ) 한다. 라. 독소확인시험 마우스실험, 고시참조 58 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

59 제 크로노박터 (Cronobacter spp.) 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) EE 배지 ( 배지 59): CM0317B CESA 한천배지 ( 배지 60): CM1055B VRBG 한천배지 ( 배지 61): CM0485B E. sakazakii 한천배지 ( 배지 62) Tryptic Soy 한천배지 ( 배지 40): CM0131B 생화학동정키트 Microbact TM GNB 24E, 40tests(MB1131A), 80tests(MB1074A) + Oxidase Strips, 50tests (MB0266A) + MicroBact Reagent Set D (MB1082A) for GNB systems + MicroBact Mineral Oil, 50ml (MB1093A) RapID ONE Panel, 20 panels (R ) + RapID Inoculation Fluid-2ml, 20tubes (R ) + RapID Spot Indole Reagent, 15ml x 1Btl (R ) Oxidase 검사 : Oxidase Strips, 50T (MB0266A) 또는 BactiDrop Oxidase 0.75mlx50 앰플 (R21540) Lysine decarboxylase 시험 : Lysine Decarboxylase Broth Tablets, 100tabs (CM0308S) 가. 증균배양 ❶ 검체 5 관에서검체각 60 g 을무균적으로채취하여 540 ml 의멸균증류수에가한후 ❷ 35~37 에서 18~24 시간증균배양한다. ❸ 증균배양액 10 ml 를 90 ml 의 EE 배지 ( 배지 59) 에첨가하여 ❹ 35~37 에서 18~24 시간 2 차증균배양한다. 나. 분리배양 ❺ 증균배양액을다음배지중하나에도말한다. CESA 한천배지 ( 배지 60) E. sakazakii 한천배지 ( 배지 62) ❻ 35~37 에서 24±2 시간배양한후, 의심집락을관찰한다. 다. 확인시험 CESA 한천배지 청록색 E. sakazakii 한천배지 장파장의자외선 (366nm) 조사하에형광집락 ❼ 5 개의전형적인집락을취하여 Tryptic soy 한천배지 ( 배지 40) 에옮긴다. ❽ 25 에서 48~ 72 시간배양한후, 황색집락을선별하여생화학적시험을실시한다. 해당집락에대한생화학적시험결과, Oxidase(-), L-Lysine decarboxylase(-), L-Ornithine decarboxylase(+), L-Arginine dihydrolase(+), sucrose(+), dulcitol(-), adonitol(-), raffinose(+), D-sorbitol(-), x-methyl-d-glucoside(+), D-arabitol(-) 일경우 Cronobacter spp. 양성으로판정한다. 또는 MicroBact GNB 24E ( 또는 RapID ONE Panel) 생화학동정키트사용 ThermoFisher Scientific Microbiology Division 59

60 제 탄저균 (Bacillus anthracis) 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) 멸균인산완충희석액 ( 시액 1) : R 멸균생리식염수 ( 시액 2) : BR0053G Ringer Solution Tablets, 100tabs (BR0052G) Phosphate Buffered Saline, Dulbecco A (BR0014G) 혈액한천배지 ( 배지 79): CM0131B + SR0051B 그람염색 Gram Stain Kit, Enhanced, 250ml, 5btl (R40240): 배경적색을감소시켜작은그람음성미생물의대비를향상 Gram Stain Kit (Crystal Violet, Decolorizer, Iodine, Safranin, Tray), 250ml x 4bt (R40080) 실험방법 가. 배양및균분리 ❶ 검체 25 g 또는 25 ml 에희석액 50 ml 을가하여분쇄혼합한뒤, ❷ 62.5±0.5 항온수조에서 30~60 분간가열처리한다. ❸ 배양된유제를 10 배단계희석하여 ❹ 각희석액으로부터 100 μl 를취하여혈액한천배지 ( 배지 79) 에도말하여 ❺ 37 에서 24 시간배양한후, 의심집락을확인한다. 탄저균은그균의특이한회백색의축모상혹은곰보유리모양의집락을형성하며혈액한천배지에서는용혈성이거의없고액체배지에서는침전하여발육하며상층부는투명하고균막을형성하지않는다. 의심되는집락을도말하여염색하면그람양성의대간균으로서양단이직각으로갈라져있고낚시대모양의연쇄상을나타낸다. 나. 동물시험 다른방법으로도탄저균을분리해내지못하는경우, 동물접종시험을고려할수있다 에서 15 분간가열한후다자란마우스의피하에 0.05~0.1 ml 접종한다. Guinea pig 의양쪽하퇴부근육에 0.2 ml 씩총 0.4 ml 접종한다. 양성인경우 48~72 시간내에폐사한다. 이를해부하여병리학적소견을관찰하고도말하여협막염색을실시하여협막형성균을검경으로확인한후다시균을분리동정한다. 폐사된동물의혈액으로부터균을분리배양할수있다. 다. PCR 반응을통한병원성시험 고시참조. 60 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

61 제 결핵균 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) 멸균인산완충희석액 ( 시액 1) : R 멸균생리식염수 ( 시액 2) : BR0053G Ringer Solution Tablets, 100tabs (BR0052G) Phosphate Buffered Saline, Dulbecco A (BR0014G) Lowenstein-Jensen 사면배지 ( 배지 80): R glycerol + homogenized whole egg Middlebrook 7H10 한천배지 ( 배지 81): R R < 또는생배지 > Middlebrook 7H10 Agar, 20 slants (R08562) 피루베이트고형배지 (pyruvate-based solid medium) ( 배지 86) Ziel-Neelsen 시험 : TB Ziehl-Neelsen Carbolfuchsin stain, 250ml/Bottle (R40102) + TB Decolorizer (R40106) + TB Methylene Blue(R40110) 또는 TB Brilliant Green(R40100) Nitrate 시험 Nitrate Broth, 20x5ml (R061532) 또는 Buffered Nitrate Motility Medium, 24x10ml (BO1069E) Nitrate A reagent, 25ml (R21239) + Nitrate B reagent, 25ml (R21242) 또는 BactiDrop Nitrate A, 0.75mlx50ampules (R21536) + BactiDrop Nitrate B, 0.75mlx50ampules (R21538) Niacin 생성시험 : Niacin Reagent Strip, 25strips/vial (R21090) 가. 배양전확인법및균배양후균분리검사 ❶ 우유와같은액상의검체는그대로사용하고, 식육및식육가공품은검체 25 g에희석액 225 ml을가한후유제액을제조하여사용한다. ❷ 액상검체또는유제액 25 ml를 3,000 rpm에서 30분간원심분리한다. ❸ 상층부를새로운시험관에취하고, 침전물에서 1 백금이를취하여도말표본을만들고 Ziel-Neelsen법으로항산성염색을실시하여항산성균을검경으로확인한다. ❹ 상층부에는동량의 8% NaOH액을, 침전물에는그의약 10배량의 4% NaOH액을가하여잘혼합한후 ❺ 각각 0.1 ml씩을 Lowenstein-Jensen 사면배지 ( 배지 80) 또는 Middlebrook 7H10 한천배지 ( 배지 81) 에접종한후 37 에서 8주간배양한다. 배양기간동안배양유무를육안으로관찰한다. ❻ 배양이육안으로관찰되면 slide glass 에균를도말하여 Ziehl-Neelsen 법으로항산성염색을실시하여항산성균을검경으로확인한다. * 결핵균의성장은일반적으로 3~6 주배양동안관찰된다. 특이적으로느린성장패턴과균모양으로결핵균을잠정적으로진단할수있다. 나. 확인검사 1) 생화학적검사모든분리균주는결핵균동정을위해생화학적검사 ( 나이아신생산과나이트레이트환원 ) 또는특이유전자동정에의한확인이필요하다. 적절한피루베이트고형배지 ( 배지 86, pyruvate-based solid medium) 에서결핵균의균은담황색이다. 결핵균은 37 에서느리게성장하며, 22 또는 45 에서는성장하지않는다. 2) PCR 시험방법고시참조 다. 동물실험 고시참조 ThermoFisher Scientific Microbiology Division 61

62 제 브루셀라 (Brucella spp.) 필요한시액및배지 ( 자세한사항은제 배지및시액참조 ) 멸균인산완충희석액 ( 시액 1) : R 멸균생리식염수 ( 시액 2) : BR0053G Ringer Solution Tablets, 100tabs (BR0052G) Phosphate Buffered Saline, Dulbecco A (BR0014G) Brucella 배지 ( 배지 85): R defibrinated bovine serum TSB 배지 (Tryptic Soy Broth)( 배지 23): CM0129B Serum Dextrose 배지 ( 배지 82) : LP0047B + LP0029B + LP0005B + SR0035C + LP0071B Serum Dextrose 한천배지 ( 배지 83) Liver 한천배지 (Liver agar) ( 배지 26) Brucella 한천배지 ( 배지 84): R defibrinated bovine serum MacConkey 한천배지 ( 배지 30): CM0115B 그람염색 Gram Stain Kit, Enhanced, 250ml, 5btl (R40240): 배경적색을감소시켜작은그람음성미생물의대비를향상 Gram Stain Kit (Crystal Violet, Decolorizer, Iodine, Safranin, Tray), 250ml x 4bt (R40080) 혈액배지배양 : 혈액한천배지 ( 배지 79): CM0055B + SR0051B Oxidase 검사 : Oxidase Strips, 50T (MB0266A) 또는 BactiDrop Oxidase 0.75mlx50 앰플 (R21540) Catalase 검사 : 과산화수소수 Nitrate 시험 Nitrate Broth, 20x5ml (R061532) 또는 Buffered Nitrate Motility Medium, 24x10ml (BO1069E) Nitrate A reagent, 25ml (R21239) + Nitrate B reagent, 25ml (R21242) 또는 BactiDrop Nitrate A, 0.75mlx50ampules (R21536) + BactiDrop Nitrate B, 0.75mlx50ampules (R21538) Urea 시험 : Urea Agar Base (Christensen Agar Base), 500g (CM0053B) + Urea 40% Solution, 10x5mL (SR0020K) 62 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

63 제 브루셀라 (Brucella spp.) 가. 배양및균분리 ❶ 검체 25 g 또는 25 ml 을 amphotericin B 1 μg /ml, vancomycin 20 μg /ml 가첨가된 225mL 의다음의배지중하나에넣은후균질화한다. Serum Dextrose 배지 ( 배지 82), TSB 배지 ( 배지 23) Brucella 배지 ( 배지 85) ❷ 5~10% 의 CO 2 가스주입이되는 37 배양기에서 6 주동안배양하면서주마다배지에도말하여확인한다. * 다만, 검체가심하게오염되었거나브루셀라균이매우낮은농도로오염되었을가능성이클경우에동물실험을할수있다. 나. 동물실험 우유의경우는 25 ml 를 3,000 rpm 으로 30 분간원심분리하여유지부와침전물을직접도말배양하고두마리이상의 guinea pig(250~300 g 체중 ) 에 3~5 ml 씩을피하또는찰과상을입은피부에, 세마리이상의마우스 (12~ 15 g) 의정맥또는복강내에 0.25~0.5 ml 씩을주사한다. 고체시료는시료 25 g 에희석액 225 ml 를가한후유제액을조제하여직접도말배양하고또한유제액을멸균가아제로여과한후그여액또는 1,000 rpm 에서 5 분간원심분리하여얻은상층액을실험동물에접종한다. 실험동물접종 3 주후에채취한혈청에대해브루셀라항체가형성되었는지여부를검사하고비장에서브루셀라균을분리배양한다. 다. 확인검사 1) 생화학적검사 ❸ 다음중하나의브루셀라균의분리용배지에접종한다. Serum Dextrose 한천배지 ( 배지 87) Liver 한천배지 ( 배지 26) Brucella 한천배지 ( 배지 84) ❹ 5~10% 탄산가스조건하에 37 에서 3~5 일간배양하고집락을관찰한다. 형성된집락은소원형으로서다소융기되어있고투명한빛깔이있으며착색되어있지않으나시일이경과된집락은약간불투명하고갈색을띤회백색을보인다. ❺ 염색하여검경하면그람음성의단간균으로구균처럼보인다. ❻ 액체배지에서 37 로 24 시간배양하면균일혼탁하게발육하고 10 일이상경과하면더욱혼탁하여지면서적조한균덩어리 (clamp) 가균막과같이표면으로부터관벽에엉긴다. ❼ 이균은운동성이없으며당류도거의분해하지않고혈액배지에서자라지만용혈성이없다. ❽ MacConkey 한천배지 ( 배지 30) 에서성장하지않으며, urease 양성, oxidase 양성, catalase 양성, 질산염환원양성등생화학적시험결과로최종판정한다. 2) PCR 시험방법고시참조 ThermoFisher Scientific Microbiology Division 63

64 미생물배양배지사용법과주의사항 배지에대한일반적인주의사항분말배지는흡습성이강하고습기, 열, 빛에민감합니다. 겨울철실험실의낮과밤의온도차이에의해서도영향을받을수있습니다. 병에기재된유효기한은개봉전사용가능기간이며, 개봉후에는온도, 습도등여러가지조건에의해배지가변성될수있으니유의해야합니다. 병에적혀있는보관조건을확인하고반드시지켜주십시오. 분말배지는개봉후물리적인상태가유지되는지확인하기위해일정기간마다면밀히시험해야하며여전히건조분말상태일때만사용해야합니다. 선택배지및유효기간이짧은배지는개봉후표준균주를사용해성능확인시험을실시해야합니다. 분말배지의보관기간을최대화하기위해서는반드시습기가많은곳을피해보관해야합니다. 분말배지를녹이는방법 실험실에입고된날짜를적어둡니다. 라벨에적힌대로보관합니다. 보통직사광선과고압증기멸균기븐, 건조오븐등열이발생하는기구에서떨어진건조한곳에서 25 정도의조건으로보관합니다. 2-8 라고적혀있는제품은냉장보관합니다. 라벨에적힌유효기간을확인합니다. 흡습성이강한일부품목은다른제품에비해유효기간이훨씬짧습니다. 제조번호대로순서혹은유효기한순으로사용합니다. 사용중인배지를다사용하기전에새병을개봉하지마십시오. 개봉일자를병에적어둡니다. 사용한후에는반드시뚜껑을단단히닫았는지확인하고지정된보관장소에보관합니다. 평소사용하는양에알맞은규격의제품을주문합니다. 병을자주개봉할수록보관중에배지가변질될수있습니다. 건조분말상태가아니거나, 색깔이변했거나, 어떤식으로든정상이아닌것으로보이는배지는사용하지마십시오. 개봉후분말배지의유효기간은? OXOID 분말배지의라벨에적혀있는유효기간은제품을개봉하지않은상태일때의기간입니다. 보통총유효기간은 3-5 년입니다. 일단개봉하면분말배지와펩톤, 가수분해물의총유효기간은자동적으로감소합니다. 유효기간은얼마나자주병을개봉하고대기조건이어떤지에따라달라집니다. 특히흡습성이강한제품은개봉후 6 개월이내에변질될수도있습니다. 배지를제조하는방법은각병의라벨및매뉴얼에적혀있습니다. 일반적으로일주일분량씩만들어서쓰는것이좋습니다. 증류, 탈이온, 역삼투등으로만든물을사용합니다. 반드시구리등의유독한금속이온이없어야합니다. 물의 ph 를확인해보고, 5.5 이하이면끓여서 CO2 를제거한후다시확인합니다. 물의전도율이 15μS 이하여야합니다. 사용하기전에유리제품을잘헹궈서사용합니다. 배지제조량의두배정도의크기의용기에서배지를만듭니다. 각제품의라벨에적힌사용방법을따릅니다. 바람과습기가없는곳에서배지를개봉합니다. 분말을흡입하거나피부에장시간접촉하지않도록주의합니다. 분말구름 이생기지않도록주의하며빠르고정확하게분말의무게를측정합니다. 되도록빨리배지를다시밀봉합니다. ( 클린벤치또는적절한배기시설이있는벤치에서무게를재는것이좋습니다.) 필요한물의반만넣고몇분간흔들어섞은후나머지물로벽에붙은배지가루를씻어내며넣습니다. 물이든높이보다위쪽에붙어있는분말은고압증기멸균되지않아오염을유발할수있으므로이과정은매우중요합니다. Agar 가없는배지는보통살살흔들어섞어주면녹습니다. Agar 가들어있는배지는고압증기멸균하기전에끓여 agar 를녹여주어야합니다. 배지를끓을때까지가열하되, 태우거나과열하면안됩니다. 고압증 64 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

65 미생물배양배지사용법과주의사항 기멸균하면안되는배지는이정도의열을가한후페트리디쉬나기타용기에분주하면됩니다. 대부분의배지는 121 에서 15 분간고압증기멸균하여최종멸균해야합니다. 분말배지의 ph 는이미조정되어있으므로생배지의최종 ph 는 25 로식혔을때라벨에적혀있는수치를따르게됩니다. 멸균하기전에 ph 를조정하면안됩니다. ph 보정은멸균후에합니다. 고압증기멸균전에배지를꼭끓여야하나요? OXOID 에서는고압증기멸균전에배지를끓일것을권장합니다. 모든분말에완전히용해된것을확인해야하기때문입니다. 분말이완전히녹아한천이배지에골고루분포되어있음을확인해야하며, 만약분말이물보다높은곳에남아있을때발생할수있는멸균후오염을최소화하기위해서입니다. 멸균전에모든분말이완전히녹았다는것이확인된다면멸균전가열과정은생략할수있습니다. OXOID 배지에대한고압증기멸균 (Autoclave) 121 에서 15분이라는표준척도에따라고압증기멸균하는배지를멸균할때는다음과같은사항을고려해야합니다. 최적의성능을보장하기위해서반드시배지제조사의설명서를주의하여확인해야합니다. OXOID 배양배지의멸균방법에대한시간과온도조건은 1 리터를기준으로존재하는열에내성이있는세균에대한시험을통해얻은결과에근거하여설정되었습니다. 멸균하는동안가해지는열의양은존재가능한대부분의미생물을없애기에필요한양보다훨씬큽니다. 119~123 를벗어난온도에서행해진멸균은멸균상태와성능이적합한지적절한품질관리시험을통해확인합니다. 당함유량이높거나, sodium desoxycholate, bile salts 등의억제제가들어있는배지는열에더민감합니다. 과열할경우최종배지의 ph 가떨어 집니다. 1 리터이상을제조할때는고압증기멸균하기전에미리가열하여 agar 가녹도록해야합니다. 배지가젤라틴을포함하고있거나고압증기멸균하기전에최종용기에배지를분주해야하는것이아니면, 이보다적은양의배지는보통가열할필요가없습니다. 고압증기멸균에적당한용기는바닥이넓은플라스크입니다. 벽이얇은병은피해야합니다. 배지손실을최소화하기위해용기는적당한공간이필요합니다. Autoclave 에표시되는멸균온도가배지의온도를나타내는것은아닙니다. Autoclave 의온도변화시간은최대한짧아야만합니다. 멸균사이클은적절한열침투시간을고려해야만합니다. 예를들어배지 1 리터는 121 에도달한 autoclave 챔버에서 15 분안에 121 에도달해야합니다. Autoclave 의부하량과 agar 를포함한배지의상대적으로낮은열전도율이고려되어야합니다. Autoclave 의온도탐침은밸브나배수구쪽에위치하는것이가장좋습니다. 이부분이챔버의가장시원한부분이기때문에가열과정의변화를가장잘나타냅니다. Autoclave 를벨리데이션할때는해당제조사와상담해야합니다. 배지를만들때전자레인지를사용해도되나요? OXOID 는다음과같은이유로배지를멸균하거나다시녹일때전자레인지를사용하는것을권장하지않습니다. 고르게가열되지않을수있습니다. 배지의세로면을따라뜨거운부분이생길수있고그부분이심하게가열되어용기가폭발할수있습니다. 전자레인지멸균은오직수분이있을때만가능합니다. 용기내부의윗부분이사전에멸균되지않았다면사후오염의원인이될수있습니다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 65

66 미생물배양배지사용법과주의사항 녹인첨가제를보관해도되나요? 일단녹인첨가제는모두사용하는것을권장합니다. 첨가제를금방녹여서사용한후남았을경우에는 -20 에냉동보관합니다. 이렇게보관한경우용액은세달정도까지안정성을유지합니다. 얼렸던용액은딱한번해동해서즉시사용해야합니다. 실험실마다냉동속도와용액의양등이달라변수가많기때문에이러한방법에대해시험한구체화된데이터는없습니다. 또한일부첨가제는이러한방법을사용하는것이적합하지않습니다. 이런방법을자주사용한다면각사용자마다얼렸던용액과방금녹인첨가제에대해성능에대한평가가필요합니다. 고체배지를다시녹이는방법 고압증기멸균이가능한대부분의배지는고압증기멸균법으로다시녹일수있습니다. 과열을줄이기위해서는증기로찌는것이가장좋습니다. 과열되면 ph 가떨어질수있고최종배지의겔강도가감소할수있습니다. 배지를 100ml 기준으로 분간증기로가열하면완전히녹습니다. 증기가열이불가능하면 121 에서 5-15 분간고압증기멸균할수도있습니다. 선택배지는재용해하면안됩니다. 많은종류의선택제제가열에민감하므로배지를추가로가열하면배지의선택성이감소할수있습니다. 항생제첨가물은기초배지를다시녹인후첨가할수있습니다. 재용해한배지는성능시험하는것을권장합니다. 생배지보관방법 생배지의성능은제조후저하될수있으며, 그속도는배지구성물질의안정성에따라다릅니다. 최적의유효기간은제조후보관기간동안미생물 학적시험을하여결정해야합니다. 보관조건이다르므로이러한시험은각각의실험실에서진행해야할필요가있을것입니다. 페트리디쉬에분주한배지는파라필름등으로감거나밀봉된용기에넣어뒤집은상태로어두운곳에서 2-8 냉장보관합니다 ( 배지가얼지않도록주의합니다 ). 위와같은조건에서일반적인유효기간은다음과같습니다. 혈액이없는영양배지 : 2-4 주혈액배지 : 7 일불안정한첨가물이든혈액배지 : 2-5 일대부분의선택배지 : 5-7 일 Baird Parker Agar 같은일부배지는불과몇일이라도보관함에따라일부 staphylococci 에대한선택성이증가함을보입니다. 이와비슷하게 Bismuth Sulphite Agar 도제조후 48 시간이내에선택성이증가합니다. 병에분주한단순한비선택액체배지, 희석액, 고체배지는일단제조하여멸균하면시원하고어두운곳에서 6 개월까지보관할수있습니다. 그러나 Buffered Peptone Water 를장기보관하면, 사용한물이순수하지않을경우침전물이생길수있습니다. 선택배지는 2-8 에서 3 주이상보관하면안됩니다. 일부선택액체배지 ( 예를들어 Selenite Broth) 는약간더안정하여어두운곳에서 2-3 달까지보관이가능하기도합니다. 선택고체배지는다시녹이면안되기때문에병타입으로보관할수없습니다. 생배지의폐기방법 접종한배지는잠재된위험성을가진미생물을포함하고있을가능성이큽니다. 그러므로공인된방법에따라안전하게폐기해야합니다. 오염된검체나접종한배지는훈련된직원들만취급해야합니다. 오염되었거나사용한모든기구는안전하게폐기또는멸균해야합니다. 121 에서 60 분간고압증 66 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

67 미생물배양배지사용법과주의사항 기멸균해야합니다. 고압증기멸균후배지는일반적인폐기물처리또는소각과정을통해폐기합니다. Selenite 를포함한배지는특별폐기물로처리해야합니다. 만약특정한배지에대한처리방법에대해궁금하다면각지역의폐기물처리기구와상담합니다. 배지의 ph 시험방법 가열하는시간과온도가과하지않도록주의한다. 과열은제품의최종 ph 에영향을미칠수있다. 명시된 ph 를살짝벗어난경우배지가올바르게작용하는지증명하기위한벨리데이션은승인요구조건에적합하기에충분해야한다. 그와더불어각실험실은해당제조사에이러한점에대해적절한조언을구한다. 배지제조에는증류수또는탈이온수를사용해야합니다. 또한전도율이 15μS을넘지않고, ph가 5.5 이하이거나 7.7 이상이어서는안됩니다. 탈이온과정이부적절할경우공정중사용된산잔여물이배지의최종 ph 를떨어뜨릴수있습니다. 생배지의 ph 는실온 (25 ) 에서최종형태의상태일때시험해야합니다. 그러므로한천배지는고체상태이므로측정을용이하게하기위해 ph 탐침이편평한것을사용하는것이좋습니다. 온도보정은권장하지않습니다. OXOID 실험실에서는 BDH double-junction flat-tipped combination electrode 같은전극을추천합니다. ph는제품라벨에적힌범위내에있어야합니다. 배지에첨가제, 혈액, 혈청, 난황액등이첨가될때 ph 범위는모든첨가제가첨가된완전한배지에적용합니다. 명시된 ph 를벗어난경우다음을고려해야합니다. 물의 ph 가너무낮거나높은지확인한다. 필요하다면알칼리 (NaOH) 나산 (HCl) 으로물의 ph를보정한다. 대기에서 CO 2 를흡수하지않도록방지하기위해사용한물은되도록신선해야한다. 순수의 ph 를확인하기위해소량의 KCl 을넣어이온을제공해 ph 를읽을수있도록할수있다. 사용한유리용기가배지제조에적당하고적절한품질을가지고있는지확인한다. 소다유리를피하고유리기구를잘헹구어산성세제를중화시킨다. 배지의 ph를고압증기멸균전에보정하지않는다. 생배지의품질관리시험배지의성능특징이기준에적합한지확인하고배지제조법이성공적인지판단하기위해각사용자들은품질관리시험을실행해야합니다. 각제조분별로성능이적합하고전형적인세균성능이나오는지적어도최소한의시험프로그램을적용합니다. 1. ph 시험 : 25 에서최종제품으로시험하여제품라벨에주어진범위에있는지확인한다. 범위를벗어나는제품은폐기한다. 2. 멸균시험 : 각배치 (batch) 의대표시료를 에서 2-5일간배양한다. 일반적으로 100 플레이트정도거나그이하는 3-5% 의제품을시험하고그이상이라면 10 개를무작위로취해시험한다. 배양후어떠한미생물배양의증거도없어야한다. 시험이끝난후모든멸균시험시료는폐기한다. 3. 성능시험 : 보관균주와 / 또는신선균주로표준접종과정에따라정량및정성시험을하여제품의성능을시험한다. 지난배지 (batch) 와함께시험하여두배치 (batch) 의성능을서로비교한다. 4. 안정성 : 배지를보관하면서주기적으로위의시험을시행하여최적의결과를보이는지시험한다. 만약제조사의권장사항을모두지켰는데도배지가예상결과를보이지않으면다음의순서를따릅니다. 1. 문제점의성질및배지제조방법을검토한다. 2. 제품을받은날짜와제조번호를기록한다. 3. 제조사에문의한다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 67

68 미생물배양배지사용법과주의사항 배지의성상이나성능이기준과틀릴때고려사항들 ph 값이틀리다. ph 시험을 25 이상에서시행했다. 배지에과도한열이가해졌다. ( 멸균시간이길거나, 재용해했거나, 분주하기전 50 에서너무오래방치하였다.) 배지가완전히녹지않았다. 물의품질이나쁘거나용기의선택이잘못되었다. 분말배지의보관조건이잘못되었거나유효기간이지났다배지가뿌옇거나침전이있다. 물의품질이나쁘거나용기의선택이잘못되었다. 배지에과도한열이가해졌다. ( 멸균시간이길거나, 재용해했거나, 분주하기전 50 에서너무오래방치하였다.) ph 값이허용기준과틀리다. 배지가완전히녹지않았다배지색이진하다. 배지에과도한열이가해졌다. ( 멸균시간이길거나, 재용해했거나, 분주하기전 50 에서너무오래방치하였다.) ph 값이허용기준과틀리다. 배지가완전히녹지않았다겔강도가약하다 용액에 Agar가부족한배지이다. 혼합이잘안되었다. 배지에과도한열이가해졌다. ( 멸균시간이길거나, 재용해했거나, 분주하기전 50 에서너무오래방치하였다.) 낮은 ph를가진배지를과열했다. 무게를잘못측정했거나, 사용량보다더많은물또는첨가물로희석했다균성장이나쁘다 용액에 Agar가부족한배지이다. 혼합이잘안되었다. 배지에과도한열이가해졌다. ( 멸균시간 이길거나, 재용해했거나, 분주하기전 50 에서너무오래방치하였다.) 낮은 ph 를가진배지를과열했다. 무게를잘못측정했거나, 사용량보다더많은물또는첨가물로희석했다 68 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

69 식품안전을위한 ISO 방법 소개 국제표준기구 (ISO, international Standards Organization) 는식품검사의여러관점을다루는국제표준을 19,000 개이상을발표하였다. 많은회사에서식품, 사료, 환경검체를검사하기위해 ISO 에따른방법을선택한다. 인증기관및규제당국이정한표준에부합하는방법을적용하여감염성생물의수준을통제하여공중보건을보호함으로써, 회사는증가하는고객의요구를충족시키고고객이소비하기에안전한제품을공급한다는명성을유지할수있다. 본안내는식품, 사료, 환경검체들에대해상위 16 개의가장일반적으로사용되는 ISO 표준조성에부합하는제품들을소개한다 : 1 ISO 6888 Horizontal methods for the enumeration of coagulase-positive Staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) 2 ISO 6579:2002 A1:2007 Horizontal method for the detection of Salmonella species 3 ISO Horizontal methods for the detection and enumberation of Listeria monocytogenes 4 ISO Horizontal methods for the enumeration of β-glucuronidase-positive Escherichia coli 5 ISO 7251:2005 Horizontal method for the detection and enumeration of presumptive Escherichia coli - MPN techniques 6 ISO 16654:2001 Horizontal method for the detection of Escherichia coli O157 7 ISO Horizontal methods for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae 8 ISO 4831:2006 Horizontal method for the detection and enumeration of Coliforms - MPN technique 9 ISO 4832:2006 with 2009 corrigendum Horizontal method for the enumeration of Coliforms - colony-count technique 10 ISO 7937:2004 Horizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens - colony-count technique 11 ISO Horizontal methods for the detection and enumeration of Campylobacter species 12 ISO 21871:2006 Horizontal method for the determination of low numbers of presumptive Bacillus cereus - MPN technique and detection methods 13 ISO 7932:2004 Horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus - colony-count technique at ISO 15214:1998 Horizontal method for the enumeration of mesophilic lactic acid bacteria - colony-count technique at ISO 21567:2004 Horizontal method for detection of Shigella species 16 ISO Horizontal methods for the enumeration of Yeast and moulds * 본내용의흐름도는관련제품의쉬운이해를위해간략화되어있으므로, 완전한흐름도에대한설명은지정된 ISO 표준문서를참고해야합니다. 1 ISO 6888 Horizontal methods for the enumeration of coagulase-positive Staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) Staphylococcus aureus 는위생관리에서중요하며, 장독소를생성하므로식중독의주요원인균이다. 치즈, 우유, 그리고손으로만든식품에서흔히발견되며, 사람의코및피부에서상존하는세균이기때문에분포가폭넓고식품제조사에특히중요하다. 1-1 Baird-Parker 배지를사용하는방법 (ISO : A1:2003) 검체준비 ISO 6887, ISO8261, 또는기타적절한표준에따라, Buffered Peptone Water(CM1049) 등의적절한희석액에검체를희석한다. 분리시험검체또는그희석액 0.1ml을 Baird Parker 배지 (CM1127+SR0054) 에도말한다. (1.0ml을 1개의 140mm plate 또는 3개의 90mm plate에도말해도된다 ) 24±2 시간동안 35 C 또는 37 C에서배양한다. 집락확인전형적인집락이없는경우, 24±2 시간동안더배양한다. 확인시험전형적인집락을취하여 Brain Heart Infusion Broth (CM1135) 에배양하고, Coagulase Plasma(R21050) 로 coagulase 생성시험으로확인한다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 69

70 1-2 토끼혈장피브리노겐 (RPF) 배지를사용하는방법 (ISO : A1:2003) 검체준비 적절한표준에따라, 검체를준비한다. 분리 1ml의검체또는검체희석액을 Baird Parker RPF 배지 (CM0961+SR0122) 에주입평판법으로접종한다. 18~24 시간동안 35 C 또는 37 C에서배양한다. 필요시 24시간동안추가로배양한다. 결과보고전형적인집락을계수한다. 1-3 소수균체의검출및 MPN 방법 (ISO :2003) 증균 정성시험 식품안전을위한 ISO 방법 Xg 검체를 9 Xml의 1배농도 Giolitti and Cantoni Broth(CM0523) 에첨가한다. 또는 10g 검체를 10ml의 2배농도 Giolitti and Cantoni Broth(CM0523) 에첨가한다. 증균 정량시험 정성시험과같으나사용되는배지는 potassium tellurite 가첨가된 Giolitti and Cantoni Broth(CM0523+SR0030) 이다. Agar 또는 paraffin으로시험관을밀봉한다. Agar 또는 paraffin으로시험관을밀봉한다. 24±2 시간동안 37 C에서배양한다. 24±2 시간동안 37 C에서배양한다. 음성시험관의경우 48±2시간동안추가배양한다. 음성시험관의경우 48±2시간동안추가배양한다. 분리분리 Baird Parker Agar (CM1127+SR0054) 에도말한다. 또는 Baird Parker RPF Agar (CM0961+SR0122) 에도말한다. 24±2 시간동안 37 C에서배양한다. 집락확인결과보고전형적인집락의위치를확인한다. 전형적인집락을계수한다. 확인시험전형적인집락을취하여 Brain Heart Infusion Broth (CM1135) 에배양하고, Coagulase Plasma(R21050) 로 coagulase 생성시험으로확인한다. 1-4 Brilliance TM Staph 24 Agar (ISO Validated alternative) 24시간만에계수 / ISO16140 밸리데이션완료 0 일 1 일 24±2 시간동안 37±1 C 에서배양한다. 잘분리된집락 5 개를취하여 Coagulase 응집시험 (R21050) 을한다. 검체를적절한희석액에희석한다. 희석액 0.1ml을 2회취하여, 각각 2 개의 Brilliance Staph 24 Agar 평판 (PO1186A) 에도말한다. 전형적인집락 ( 암청색 ) 을관찰및계수한다. 70 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

71 식품안전을위한 ISO 방법 2 ISO 6579:2002 A1:2007 Horizontal method for the detection of Salmonella species Salmonella 속은장내세균과에속한다. 살모넬라균은그람 - 음성, 포자무생성간균이다. 체세포및플라겔라항원에따라분류되어약 2,500 개의혈청형이존재한다. 살모넬라는가장빈번한식중독원인균중하나이며전세계적으로공중보건을위협하고있다. 식품이소비되기전에살모넬라를검출하는것은공공보건에중요하며식품산업의재정건전성과평판을유지하는데중요하다. 2-1 Salmonella species 검출 (ISO 6579:2002 A1:2007) 전-증균 (Pre-enrichment) 검체를 Buffered Peptone Water (ISO) (CM1049) 에 1:10 희석하여준비한다. 18±2 시간동안 37±1 C에서배양한다. 선택적증균 (Selective enrichiment) 배양액 0.1ml을 10ml의 RVS broth(cm0866) 에배양액 1ml을 10ml의 MKTTn 첨가한다. broth(cm1048+sr0181) 에첨가한다. 24±3 시간동안 41.5±1 C에서배양한다. 24±3 시간동안 37±1 C에서배양한다. 분리 (Isolation) XLD Agar (CM0469) 와다음의배지중하나에계대배양한다. Brilliance Salmonella Agar (CM1092+SR0194) Brilliant Green Agar (mod) (CM0329) 24±2 시간동안 37±1 C에서배양한다. 순수배양 (Purity Plate) 전형적인집락을 Nutrient Agar에도말한다. 24±3 시간동안 37±1 C에서배양한다. 생화학확인시험 (Biochemical confirmation) 혈청형확인시험 (Serological confirmation) TSI 사면배지 : TSI Agar (CM0277) Urea 시험 : Urea Agar (CM0053+SR0020) Lysine decarboxylase 시험 : Lysine Decarboxylase Broth Tablets (CM0308) VP 시험 : MRVP (CM0043) Indole 시험 : Tryptone water (CM0087)+Kovac's indole reagent(mb0209a) O- 항원 (R ) Vi- 항원 (R ) H- 항원 (R ) ThermoFisher Scientific Microbiology Division 71

72 2 일만에완료하는 Salmonella spp. 신속확인법 식품안전을위한 ISO 방법 2-2 Salmonella Precis TM Method(ISO Validated alternative) 0 일 검체 25g(mL) 을 225ml 의 ONE Broth- Salmonella 에넣어균질화한다 hr, 42 배양한다. 1 일 10μl 를 Brilliance Salmonella plate 에접종한다 hr, 37 배양한다. 2 일 의심집락을확인한다 : 보라색집락 필요한배지및시약증균배양 용량 제품번호 ONE Broth-Salmonella ( 병, 생배지 ) 10x225ml BO1096S ONE Broth-Salmonella Base 500g CM1091B + ONE Broth-Listeria Supplement 10 vials SR0242E 평판배양 Brilliance Salmonella (90mm, 생배지 ) 10 plates PO5098A Brilliance Salmonella Agar Base 500g CM1092B + Brilliance Listeria Selective Suppl. 10 vials SR0194E 확인시험 Oxoid Salmonella Test Kit 100 tests DR1108A Microbact GNB 24E 40 tests MB1131A O.B.I.S. Salmonella 60Test ID0570M RapID ONE Panel 20 panels R Gram Stain Kit 250ml x 4 R40080 Triple Sugar Iron Agar 500g CM0277B Urea Agar Base 500g CM0053B +Urea 40% Sol. (for 100mL medium) 10x5mL SR0020K Lysine Decarboxylation Broth Tablets 100 tablets (each make 5ml) CM0308S Spot Indole Reagent (DMACA) 25mL R21245 Salmonella O and H Agglutinating Sera Various Various QC Organisms - Culti-Loops Salmonella Typhimurium ATCC TM 5 loops R Staphylococcus aureus ATCC TM 5 loops R Klebsiella pneumoniae ATCC TM 5 loops R Enterococcus faecalis ATCC TM 5 loops R Escherichia coli ATCC TM 5 loops R 의심집락을취해서확인한다. Oxoid Salmonella Test Kit ( 또는기타 ISO 표준방법 ) ISO 표준으로 AFNOR 에의해검증됨 간단하고쉬운방법 - 특별한장비필요없음 1 회의 18 시간증균배양 1 회의검체이동 1 회의 24 시간평판배양 빠르고편리한확인시험 : Oxoid Salmonella Latex Test ( 또는기타 ISO 6579:2002 표준시험법 ) 결과도출까지시간절약 : 최대 5 일이필요한표준배양법에비해 2 일만에결과도출 72 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

73 식품안전을위한 ISO 방법 3 ISO Horizontal methods for the detection and enumberation of Listeria monocytogenes 리스테리아는그람 - 양성, 카탈라제 - 양성, 포자무생성, 플라겔라를가진간균이다. Listeria monocytogenes 및 Listeria ivanovii 가토양, 초목, 물에서기인하는사람의질병과지속적으로관련되어있다. 성장온도가 0~45 C 이므로차가운, 냉장의즉석섭취음식에서중요한식품유래병원균이다. 3-1 정성시험 (ISO :1996 A1:2004) 1 차증균 (Primary enrichment) Xg 또는 XmL 의검체또는검체희석액을 9 XmL 의 Half Fraser Broth (CM0895+SR0166) 에첨가한다. 24±2 시간동안 30 C 에서배양한다. 2차증균 (Secondary enrichment) 0.1ml의 1차증균배양액을 10ml의 Fraser Broth - (CM0895+SR0156) 에넣는다. 48±2 시간동안 35 C 또는 37 C에서배양한다. 24±2 시간동안 30 C에서배양한다. 선택적분리 (Selective Isolation) ALOA 배지 (CM1084+SR0226+SR0244) 와다음배지중하나에도말한다 PALCAM (CM0877+SR0150) Oxford (CM0856+SR0140 or SR0206) 24±3시간동안 37 C에서배양한다. 필요시추가로 24±3시간동안배양한다. 순수배양 (Purity Plate) 전형적인집락을취해서 Tryptone Soya Yeast Extract Agar (CM ~12g Agar(LP0012)) 에계대배양한다 18~24시간동안 35~37 C에서배양한다. Listeria spp. 확인시험 Catalase 시험 Gram 염색 : Gram Stain Set (R40080) 운동성시험 : Tryptone Soya Yeast Extract Broth (CM0862) Listeria monocytogenes 확인시험용혈시험 : Sheep Blood Agar (CM0055+SR0051 또는 BO0965) Carbohydrate Utilization CAMP 시험 3-2 정량시험 (ISO :1998 A1:2004) 1차증균 (Primary enrichment) Xg 또는 XmL의검체를 9 XmL의 Buffered Peptone Water (ISO) (CM1049) 또는 Half Fraser Broth (CM0895+SR0166) 에첨가한다. 1시간 ±5분동안 20±2 C에서현탁액을방치한다. 선택적분리 (Selective Isolation) ALOA 배지 (CM1084+SR0226+SR0244) 에도말한다 24±3시간동안 37 C에서배양한다. 순수배양 (Purity Plate) 전형적인집락을취해서 Tryptone Soya Yeast Extract Agar (CM ~18g Agar(LP0012)) 에계대배양한다 18~24시간동안 37 C에서배양한다. Listeria spp. 확인시험 Catalase 시험 Gram 염색 : Gram Stain Set (R40080) 운동성시험 : Tryptone Soya Yeast Extract Broth (CM0862) Listeria monocytogenes 확인시험용혈시험 : Sheep Blood Agar (CM0055+SR0051 또는 BO0965) Carbohydrate Utilization CAMP 시험 ThermoFisher Scientific Microbiology Division 73

74 식품안전을위한 ISO 방법 3-3 Listeria Precis method (ISO Validated alternative) 2 일만에완료하는 Listeria Monocytogenesis 신속확인법 0 일 검체 25g(mL) 을 225ml 의 ONE Broth-Listeria 에넣어균질화한다 hr, 30 배양한다. 1 일 10μl 를 Brilliance Listeria plate 에접종한다 hr, 37 배양한다. 2 일 의심집락을확인한다 : 환이있는청색 / 녹색집락 * 식육의경우, 전형적인집락이없으면, 22-26hr 더배양한다. 의심집락을취해서확인한다. O.B.I.S. mono kit ( 또는기타 ISO 표준방법 ) 필요한배지및시약 증균배양 용량 제품번호 ONE Broth-Listeria ( 병, 생배지 ) 10x225ml BO1066S ONE Broth-Listeria Base 500g CM1066B + ONE Broth-Listeria Supplement 10 vials SR0234E Buffered Peptone Water 500g CM0509B 평판배양 Brilliance Listeria (90mm, 생배지 ) 10 plates PO5165A Brilliance Listeria Agar Base 500g CM1080B + Brilliance Listeria Selective Suppl. 10 vials SR0227E + Brilliance Listeria Differential Suppl. 10 vials SR0228E 확인시험 O.B.I.S. mono Kit 60 tests ID0600M Microbact 12L 20 tests MB1128A RapID CB Plus Panel 20 panels R Gram Stain Kit 250ml x 4 R40080 Oxidase Strip 50 tests MB0266A Tryptone Soya Broth 500g CM0129B + Yeast Extract Powder 500g LP0021B + Agar Bacteriological 500g LP0011B Blood Agar Base No g CM0271B + Defibrinated Sheep Blood 25ml SR0051B Microbes for CAMP Test Staphylococcus aureus ATCC TM 10 loops R Rhodococcus equis ATCC 6939 TM 10 loops R QC Organisms - Culti-Loops TM Listeria monocytogenes ATCC 7644 TM 10 loops R Listeria innocua ATCC TM 10 loops R Escherichia coli ATCC TM 10 loops R Enterococcus faecalis ATCC TM 10 loops R ISO 표준으로 AFNOR 에의해검증됨 간단하고쉬운방법 - 특별한장비필요없음 1 회의 24 시간증균배양 1 회의검체이동 1 회의 24 시간평판배양 빠르고편리한확인시험 : O.B.I.S. mono test ( 또는기타 ISO 표준방법들 ) 결과도출시간감소 : 최대 7 일이소요되는표준배양및확인시험법에비해 2 일소요 정량시험의경우, 25g(mL) 검체를 225mL Buffered Peptone Water에넣고, 20, 1hr 배양한다. 100ul 배양액을 Brilliance Listeria plate에접종후, 37, 45-51hr 배양한다. 의심집락을계수한후집락을취하여 O.B.I.S. mono 키트 ( 또는기타 ISO 표준방법 ) 로확인한다. 검체의 CFU/g(mL) 을계산한다.! 확인시험에사용할집락의양이부족하거나다른 Listeria 종과겹친경우, 해당집락을추가로 Brilliance Listeria plate에순수배양후, 확인시험을실시한다. 74 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

75 식품안전을위한 ISO 방법 4 ISO Horizontal methods for the enumeration of β-glucuronidasepositive Escherichia coli 대장균은장내세균군 ( 군 (Enterobacteriaceae) 과에속하며많은하위그룹으로나누어진다. 분변대장균군의존재여부에대한수질검사에서지표생물로사용된다. 조리되지않은식품에서설사질환의지속적인원인이며질병의심각성에기반한가장중요한그룹은 E.coli EHEC 이며여기에는 O157:H7 균주도포함된다. 4-1 membrane 및 5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-glucuronide를이용한 44 C 배양집락계수방법 (ISO :2001) 균체회복 (Resuscitation) 1mL의검체또는검체희석액을 Mineral Modified Glutamate Agar(CM0607) 상의멤브레인에접종한다. 4±1시간동안 37 C에서배양한다. 분리 (Isolation) 멤브레인을 TBX Agar(CM0945) 으로옮긴다. 18~24시간동안 44 C에서배양한다. 4층이하높이결과보고전형적인집락을계수한다 bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-glucuronide 를이용한 44 C 배양집락계수방법 (ISO :2001) 분리 (Isolation) 이중시험으로 1mL 의검체또는검체희석액을 TBX Agar(CM0945) 에주입평판법으로접종한다. 18~24 시간동안 44 C 에서배양한다. 만일균체가스트레스를받아았을것으로의심된다면, 4 시간동안 37 C 에서배양을한후 18~24 시간동안 44 C 에서배양한다. 결과보고전형적인집락을계수한다 bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-glucuronide 를이용한 MPN 방법 (ISO :2005) MPN 10mL의액체검체또는초기현탁액을 10mL의 2 1mL의액체검체또는초기현탁액을 10mL의배농도 Minerals Modified Glutamate Broth Minerals Modified Glutamate Broth (CM0607) (CM0607) 가든시험관 3 또는 5개에각각첨가한가든시험관 3 또는 5개에각각접종한다. 다. 같은방법으로추가희석을진행한다. 24±2 시간동안 37 C에서배양한다. 24±2 시간동안 37 C에서배양한다. 확인시험 (Confirmation) 산생성을보이는시험관을 TBX agar (CM0945) 에접종한다. 22±2시간동안 44 C에서배양한다. 3단이하높이로쌓는다. MPN 계산전형적인집락을확인한다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 75

76 식품안전을위한 ISO 방법 5 ISO 7251:2005 Horizontal method for the detection and enumeration of presumptive Escherichia coli - MPN techniques 대장균은장내세균군 ( 군 (Enterobacteriaceae) 과에속하며많은하위그룹으로나누어진다. 분변대장균군의존재여부에대한수질검사에서지표생물로사용된다. 조리되지않은식품에서설사질환의지속적인원인이며질병의심각성에기반한가장중요한그룹은 E.coli EHEC 이며여기에는 O157:H7 균주도포함된다. 선택적증균 (Selective Enrichment) 전-증균 (Pre-enrichment) 1mL의초기현탁액을 9mL의 Lauryl Sulphate 검체를 1배농도및 2배농도의의 Lauryl Broth (CM0451) 에접종한다. Sulphate Broth (CM0451) 에희석하여준비한다. 또는 10mL의현탁액을 10mL의 2배농도 Lauryl Sulphate Broth (CM0451) 에접종한다. * 샘플크기에따라변경이가능하다. 24±2 시간동안 37 C에서배양한다. 24±2 시간동안 37 C에서배양한다. 음성시험관의경우, 48±2 시간동안배양한다. 음성시험관의경우, 48±2 시간동안배양한다. 양성배양체의선태적증균배양액 1 루프양을 EC Broth (CM0853) 에접종한배양액 1 루프양을 EC Broth (CM0853) 에접종한다. 다. 24±2 시간동안 44 C에서배양한다. 24±2 시간동안 44 C에서배양한다. 음성시험관의경우, 48±2 시간동안배양한다. 음성시험관의경우, 48±2 시간동안배양한다. 양성배양체의확인시험 EC Broth 배양액 1루프양을 Tryptone Water EC Broth 배양액 1루프양을 Tryptone Water (CM0087) 에접종한다. (CM0087) 에접종한다. 48±2 시간동안 44 C에서배양한다. 48±2 시간동안 44 C에서배양한다. 인돌생성확인시험 Indole Reagent (MB0209A) 를첨가하고, 적색여 Indole Reagent (MB0209A) 를첨가하고, 적색여부를관찰한다. 부를관찰한다. MPN을계산한다. 6 ISO 16654:2001 Horizontal method for the detection of Escherichia coli O157 대장균은장내세균군 ( 군 (Enterobacteriaceae) 과에속하며많은하위그룹으로나누어진다. 분변대장균군의존재여부에대한수질검사에서지표생물로사용된다. 조리되지않은식품에서설사질환의지속적인원인이며질병의심각성에기반한가장중요한그룹은 E.coli EHEC 이며여기에는 O157:H7 균주도포함된다. 선택적증균 Xg 또는 XmL의검체또는검체희석액을 9 XmL의 mtsb+novobiocin (CM0989+SR0181) 에첨가한다. 6시간동안 41.5 C에서배양하고, 추가로 12~18시간동안배양한다. 면역학적포획면역자기분리법 (immunomagnetic separation) 을이용한다. 선택적분리 CT-SMAC (CM0813+SR0172) 및다음의배지중하나에접종한다. CR-SMAC (CM1005+SR0191) Brilliance E.coli/coliform Agar (CM0956) 18~24시간동안 37 C에서배양한다. 순수배양보통배지 (Nutrient Agar) 에순수배양한다. 18~24시간동안 37 C에서배양한다. 확인시험인돌생성확인시험 : Tryptone water(cm0087) + Indole reagent (MB0209A) 혈청형시험 : E.coli O157 anti-sera 또는 E.coli O157 Latex kit (DR0620M) 76 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

77 식품안전을위한 ISO 방법 7 ISO Horizontal methods for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae 그람음성세균의장내세균과 (Enterobacteriaceae family) 에는 Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Shigella, Proteus, Enterobacter, Serratia, Citrobacter 가있다. 이과들은많은구성원들이사람이나동물의장내에일반적으로서식하고있기때문에식품제조업체에서는중요성이높다. 장내세균군은또한물과토양에서도발견되며보다독성이고병원성인세균의존재여부를결정하는데중요한지표생물이고제조업체의위생불량 ( 제조공정의오류또는오염된환경 ) 의지표생물로도사용된다. 7-1 전-증균과정이있는검출및 MPN법계수 (ISO :2004) 검출방법 MPN 방법전-증균 (Pre-enrichment) Xg 또는 XmL의검체를 9 XmL의 Buffered Buffered Peptone Water (ISO)(CM1049) 에검체 Peptone Water(ISO) (CM1049) 에첨가한다. 를희석하여준비한다. 18±2 시간동안 37 C에서배양한다. 18±2 시간동안 37 C에서배양한다. 선택적증균배양액 1mL을 10mL의 EE Broth (CM0317) 에접종한다. 배양액 1mL 을 10mL 의 EE Broth (CM0317) 에접종한다. 24±2 시간동안 37 C에서배양한다. 24±2 시간동안 37 C에서배양한다. 분리 VRBGA(ISO)(CM1082) 에도말하여접종한다. VRBGA(ISO)(CM1082) 에도말하여접종한다. 24±2 시간동안 37 C에서배양한다. 24±2 시간동안 37 C에서배양한다. 순수배양전형적인집락을 Nutrient Agar에계대배양한다. 전형적인집락을 Nutrient Agar에계대배양한다. 24±2 시간동안 37 C에서배양한다. 24±2 시간동안 37 C에서배양한다. 확인시험 Oxidase 시험 : BactiDrop Oxidase (R21540) Oxidase 시험 : BactiDrop Oxidase (R21540) Glucose 발효시험 Glucose 발효시험 7-2 집락계수법 (ISO :2004) 분리이중시험으로, 1ml의시험검체또는검체희석액을 VRBGA(ISO)(CM1082) 에주입평판법으로접종하고, 중첩을가한다. 24±2시간동안 37 C에서배양한다. 계수전형적인집락을계수한다. 순수배양 Nutrient Agar에계대하여순수배양한다. 18~24시간동안 37 C에서배양한다. 순수배양보통배지 (Nutrient Agar) 에순수배양한다. 24±2시간동안 37 C에서배양한다. 생화학적확인시험 Oxidase 시험 : BactiDrop Oxidase (R21540) Glucose 발효시험 ThermoFisher Scientific Microbiology Division 77

78 식품안전을위한 ISO 방법 8 ISO 4831:2006 Horizontal method for the detection and enumeration of Coliforms - MPN technique 대장균군의세균은식품및물에서위생품질의지표로일반적으로사용된다. 그람 - 음성의간균이며 35~37 C 에배양하면 lactose 를발효시켜산과기체를생성한다. 대장균군은온혈동물의분변에서발견될수있고그자체로는심각한질병을초래하지않으며쉽게배양할수있다. 이균이존재하면분변유래의다른병원성미생물이존재할수있으므로지표로이용된다. 증균 MPN 10mL의액체검체또는초기현탁액을 10mL의 1mL의액체검체또는초기현탁액을 10mL의 Lauryl Sulphate Tryptose Broth(CM0451) 의 Lauryl Sulphate Tryptose Broth(CM0451) 의 3개시험관에각각첨가한다. 3개시험관에각각첨가한다. 같은방법으로추가희석을진행한다. 24±2 시간동안 30 또는 37 C에서배양한다. 24±2 시간동안 30 또는 37 C에서배양한다. 음성시험관의경우추가 24시간배양한다. 확인시험각시험관에서 1 루프량을 10mL 의 Brilliant Green Lactose Bile Broth(CM0031) 에접종한다. 24±2 시간동안 30 또는 37 C 에서배양한다. 음성의경우추가로 24 시간배양한다. 결과보고 MPN 을계산한다. 각양성시험관 (gas and/or turbidity) 에서 1루프량을 10mL의 Brilliant Green Lactose Bile Broth(CM0031) 에접종한다. 24±2 시간동안 30 또는 37 C에서배양한다. 음성의경우추가로 24시간배양한다. 9 ISO 4832:2006 with 2009 corrigendum Horizontal method for the enumeration of Coliforms - colony-count technique 대장균군의세균은식품및물에서위생품질의지표로일반적으로사용된다. 그람 - 음성의간균이며 35~37 C 에배양하면 lactose 를발효시켜산과기체를생성한다. 대장균군은온혈동물의분변에서발견될수있고그자체로는심각한질병을초래하지않으며쉽게배양할수있다. 이균이존재하면분변유래의다른병원성미생물이존재할수있으므로지표로이용된다. 분리이중시험으로, 1mL의검체를주입평판법으로 VRBLA(ISO) Agar(CM0968) 에접종하고중첩한다. 24±2시간동안 30~37 C에서배양한다. 확인시험 Brilliant Green Bile Broth (CM0031) 의 durhams tube 시험관에접종한다. 24시간동안 30 또는 37 C에서배양한다. 기체생성에대해서관찰한다. 78 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

79 10 ISO 7937:2004 Horizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens - colony-count technique Clostridia 과에서 Clostridium perfringens 는식품에서가장일반적으로분리된다. 비운동성의 Clostridia 중에서특이한그람 - 양성의혐기성포자형성간균이다. 독소생성에따라하위분류로나누어지며, 고기요리의주요식중독원인균이다. Lactose Sulphite Medium에접종한다. 18~24시간동안 46 C에서배양수조에서호기적으로배양한다. 식품안전을위한 ISO 방법 분리 검체 1mL을페트리접시에넣는다. 44~47 C의 SC agar를넣고잘혼합한다. 10ml의 Perfringens Agar로중첩한다. 20±2시간동안 37 C에서혐기적으로배양한다. 전형적인집락을 Fluid Thioglycollate Medium (CM0173) 에접종한다. 18~24시간동안 37 C에서혐기적으로배양한다. 집락분리가안좋을경우, SC agar 에도말하고, 분리된된집락을 Fluid Thioglycollate Medium(CM0173) 에접종한다. 확인시험 결과보고 양성 (C. perfringens) 전형적인반응들을시험 Nitrate Motility Medium 과 Lactose Gelatin Medium 에접종한다. 24 시간동안 37 C 에서혐기적으로배양한다. 11 ISO Horizontal methods for the detection and enumeration of Campylobacter species Campylobacter 속은 Campylobacteraceae 과에속한다. 미호기성생물이고, 그람 - 음성, oxidase 양성, 플라겔라를가진나선모양의간균이다. 이속의 2 개의주요종인 C. jejuni 및 C. coli 는둘다가금류에서기인하는설사질환의주요원인균이다 정성시험 (ISO :2006) 선택적증균 Xg의검체를 9 XmL의 Bolton Broth (CM0983+SR0203/SR0183+SR0048) 에첨가한다. 4~6시간동안 37 C에서, 그후 44±4시간동안 41.5 C에서, 미호기적으로배양한다. 분리 mccd Agar (CM0739+SR0155) 와다음의배지중하나에접종한다. Karmali (CM0935+SR0167) Skirrow (CM0331+SR0069) Butzler (CM0331+SR0214) 44±4시간동안 41.5 C에서미호기적으로배양한다 확인시험전형적인집락을취해서 Columbia Blood Agar (CM0331+SR0051) 에접종한다. 24~48시간동안 41.5 C에서배양한다 동정 25 C( 호기적으로, 41.5 C) 에서 Brucella Broth 에서성장시험 Oxidase 시험 (MB0266A) Mueller Hinton Agar w/ Defibrinated Sheep Blood (CM SR0051) ThermoFisher Scientific Microbiology Division 79

80 11-2 정량시험 (ISO :2006) 식품안전을위한 ISO 방법 분리 mccda (CM0739+SR0155) 에접종한다. 44~48시간동안 41.5 C에서, 미호기적으로배양한다. 확인시험전형적인집락을취해서 Columbia Blood Agar (CM0331+SR0051) 에접종한다. 24~48시간동안 41.5 C에서배양한다 동정 25 C( 호기적으로, 41.5 C) 에서 Brucella Broth에서성장시험 Oxidase 시험 (MB0266A) 11-3 Brilliance TM CampyCount(ISO Validated alternative to mccda) 가금류검체에서 Campylobacter jejuni 및 C. coli의계수를위한배지 0 일 적절한희석액에검체를파쇄 / 희석. 48+/-1h, 41.5 에서미호기성배양한다. 0.1ml 씩을 2 개의 Brilliance CampyCount Agar 에접종한다. 2 일 가금류및관련검체 정확하고정량적인새로운선택성 투명한배지로인해플레이트리더기에서계수가가능 집락간군집을감소시켜개별집락의분리가향상됨. MicroVal 에의해 ISO Validation 됨. 최소 5개의잘분리된흑적색집락을취하여, O.B.I.S. Campy( 또는다른 ISO 표준방법들 ) 를사용하여확인시험 필요한배지및시약 검체희석 용량 제품번호 Buffered Peptone Water ISO 500g CM1049B Maximum Recovery Diluent (Peptone 500g CM0733B Saline Diluent) 평판배양 Brilliance CampyCount Agar (90mm, 생 10 plates PO1185A 배지 ) 확인시험 O.B.I.S. Campy 60 tests ID0800M DrySpot Campylobacter Test Kit 50 tests DR0150M 미호기성배양식품공전제 참조 QC Organisms - Culti-Loops Campylobacter coli ATCC TM 5 loops R Campylobacter jejuni ATCC TM 5 loops R Escherichia coli ATCC TM 5 loops R Staphylococcus aureus ATCC TM 5 loops R Candida albicans ATCC TM 5 loops R ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

81 식품안전을위한 ISO 방법 12 ISO 21871:2006 Horizontal method for the determination of low numbers of presumptive Bacillus cereus - MPN technique and detection methods 호기적으로성장하는포자생성, 그람 - 양성의미생물이다. 대부분쌀, 시리얼, 파스타등에발견된다. 식중독원인및식품부패능이잘알려져있다. Bacillus cereus 는 2 개의독소를생산하여비교적짧은배양시간만에구토, 설사를유발하는것으로최근에알려져있어, 특정식품에서검출관련하여엄격한통제가이루어졌다. 10mL 의초기현탁액을 2 배농도 TSP Broth (CM0129+SR0099) 시험관 3 개에현탁한다. 48±4 시간동안 30 C 에서배양한다 검체준비 Xg의검체를 9 XmL의적절한희석액에첨가한다. 1mL의초기현탁액을 1배농도 TSP Broth 3 개시험관에또는 1ml의각각의추가희석액을 1배농도 TSP Broth (CM0129+SR0099) 3개시험관에접종한다. 48±4시간동안 30 C에서배양한다 분리 PEMBA Agar(CM0617+SR0099+SR0047) 에접종하고 18~24시간동안 37 C에서배양한다, 필요하면추가로 24시간더배양한다. 또는 MYP Agar(CM0929+SR0099+SR0047) 에접종하고 18~24시간동안 30 C에서배양한다, 필요하면추가로 24시간더배양한다. 3개의의심집락을선택한다. 확인시험 PEMBA 에서선택한집락 : 용혈시험또는현미경적시험 MPN을계산한다. MYP 에서선택한집락 : 용혈시험 Tryptone Soya Agar 13 ISO 7932:2004 Horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus - colony-count technique at 30 호기적으로성장하는포자생성, 그람 - 양성의미생물이다. 대부분쌀, 시리얼, 파스타등에발견된다. 식중독원인및식품부패능이잘알려져있다. Bacillus cereus 는 2 개의독소를생산하여비교적짧은배양시간만에구토, 설사를유발하는것으로최근에알려져있어, 특정식품에서검출관련하여엄격한통제가이루어졌다. 검체준비검체종류에따라서 Xg의검체를 9 XmL의희석액에첨가한다. 분리이중시험으로, MYP Agar(CM0929+SR0099+SR0047) 2개 plate에도말한다. 18~24시간동안 30 C에서배양한다. ( 집락이명확히보이지않으면추가로 24시간배양 ) 선택한집락을 Sheep Blood Agar에접종한다. 확인시험 Sheep Blood Agar에접종하고 24±2시간동안 30 C에서배양하여용혈반응을확인한다. 용혈반응양성이면 Bacillus cereus로추정된다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 81

82 식품안전을위한 ISO 방법 14 ISO 15214:1998 Horizontal method for the enumeration of mesophilic lactic acid bacteria - colony-count technique at 30 젖산세균은탄수화물발효의주요대사최종산물로서젖산을일반적으로생성하는그람 - 음성, 산내성, 간균또는구균이다. 양조, 제빵, 식품가공에서 Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus 의산업적중요성은잘알려져있다. 하지만다른식품에이러한균들이존재하면부패등을초래할수있고어떤경우에는가벼운식중독을유발할수도있다. 검체준비검체를희석액에넣어초기현탁액을준비한다. 분리 MYP(ISO) Agar (CM1153) 에접종한다. 72±2시간동안 35 또는 37 C에서배양한다. 전형적인집락을계수한다. 15 ISO 21567:2004 Horizontal method for detection of Shigella species Shigella 는표현형적으로 E. coli 와관련이있으며유전적으로같은것으로나타난다. Shgella 의모든종은사람에병원균이며이질 (dysentery) 을초래한다. 식품유래병원균으로서 Shigella 에대한관심증가로인해검출법에서많은진보가있었고검출관련된규제도증가되었다. 선택적증균 Xg 또는 XmL을 Shigella Broth + 0.5ug novobiocin에첨가한다. 균질화하고 ph7.0±0.2로맞춘다. 16±4시간동안 41.5 C에서혐기적으로배양한다. 분리 MacConkey Agar (CM0115), XLD Agar (CM0469), Hektoen Enteric Agar(CM0419) 에접종한다. 20±4시간동안 37±1 C에서배양한다. 순수배양전형적인집락을 Nutrient Agar에계대배양한다. 20±4시간동안 37±1 C에서배양한다. 확인시험 TSI 사면배지 : TSI Agar (CM0277) Urea 시험 : Urea Agar (CM0053) Lysine decarboxylase 시험 : Lysine Decarboxylase Broth Tablets (CM0308) 82 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

83 식품안전을위한 ISO 방법 16 ISO Horizontal methods for the enumeration of Yeast and moulds 효모및사상균은자연에넓게분포되어있으며유기환경에서특히잘자란다. 효모는성장하면단일의독립된난형세포를보이는반면사상균은함께모여서길고가지를이루는균사체가된다. 일부효모및사상균은진균독소 (mycotoxin) 라불리는독성대사산물을생성하기도한다. 대부분의진균독소는식품가공및가열과정에서잘파괴되지않는다. 효모및사상균이특히감염되기쉬운식품에는곡물, 견과, 콩, 과일등이있다 물활성도 0.95 이상의제품에서집락계수방법 (ISO :2008) 검체준비검체를희석하여준비한다. 분리접종 : DRBC Agar (CM1148+SR0078, 또는 CM1149) 배양 : 5일, 25±1 C 방치 : 1~2일간햇빛을쬔다. 집락확인전형적인집락을계수한다 물활성도 0.95 이하의제품에서집락계수방법 (ISO :2008) 검체준비검체를희석하여준비한다. 분리접종 : 0.1mL의검체를 DG18 Agar (CM1148+SR0078, 또는 CM1149) 에도말, 10배희석액 0.1mL을 DG18 Agar (CM SR0078, 또는 CM1151) 에도말배양 : 5~7일, 25±1 C 방치 : 1~2일간햇빛을쬔다. 집락확인전형적인집락을계수한다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 83

84 배지및시약가이드 Sabouraud Dextrose Agar (CM0041) 혈액한천배지 (CM0055+SR0051) 난황첨가 Mannitol Salt Agar (CM0085+SR0047) Candida albicans ATCC days at C Staphylococcus aureus ATCC hr. at 36 ± 1 C, aerobic 황색포도상구균 : 베타용혈양성 St. aureus ATCC hr. at 32 ± 1 C, aerobic St. epidermidis ATCC coagulase 추정양성인 staphylococci 는밝은노란색영역에둘러싸인집락을보이는반면, 비병원성 staphylococci 는적보라색영역을가지는집락을보여준다. MacConkey 한천배지 (CM0115) Tryptone Soya 한천배지 (CM0131) + no supplement + Defibrinated Sheep blood Bismuth Sulphite 한천배지 (CM0201) Salmonella typhimurium ATCC hr. at 32 ± 1 C, aerobic 살모넬라 : 담황색집락 Staphylococcus aureus ATCC hr. at 36 ± 1 C, aerobic Salmonella spp: 금속성광택이있고중앙이검거나혹은검지않은녹색집락 Desoxycholate Citrate 한천배지 (CM0227) Salmonella typhimurium ATCC hr. at 36 ± 1 C, aerobic 살모넬라 : 가운데가검거나혹은검지않은담황색집락 Baird-Parker 한천배지 (CM0275+SR0054) Staphylococcus aureus ATCC hr. at 36 ± 1 C, aerobic 황색포도상구균 : 2-5mm의투명한환안에 3mm 정도의흰색의둥근환이있고, 직경 1-5mm의검서나회색의둥근집락 TSI 사면배지 (CM0277) 무접종대조군 Pseudomonas aeruginosa Escherihia coli Glc Lac/Suc H 2 S Gas Salmonella typhimurium Shigella flexneri Glucose 발효, (+) 밑동노란색, (-) 적색. Lactose and/or Sucrose 발효, (+) 사면노란색, (-) 적색. H 2 S 생성 (+) 사면에검정색침전, (-) 없음가스 (CO 2, H 2 S, 등 ) 생성, (+) 배지가바닥에서들어올려지거나끊어짐, (-) 없음 84 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

85 TCBS 한천배지 (CM0333) 배지및시약가이드 LIA 사면배지 (CM0381) HE 한천배지 (CM0419) Vibrio cholerae NCTC hr. at C V. parahaemolyticus: 직경 3-5mm 의청록색집락 V. cholera: 직경 2-3mm 의노란색의납작한집락 V. vulnificus: 직경 2-3mm 의청록색집락 왼쪽부터 Shigella, E.coli, Salmonella, Arizona Salmonella typimurium ( 위 ) Shigella boydii ( 아래 ) X.L.D. 한천배지 (CM0469) VRBG 한천배지 (CM0485) TSC 한천배지 (CM0587+SR0088+SR0047) Salmonella typhimurium ATCC hr. at 36 ± 1 C, aerobic Salmonella spp : 중앙이검거나혹은검지않은붉은색집락 Chronobacter spp. : 자주색집락 Salmonella typhimurium: 자주색집락 E.coli: 자주색집락 Cl. perfringens : 불투명한환을가진검은색집락 Bacillus cereus 선택배지 (PEMBA) (CM0617+SR0099+SR0047) CIN 한천배지 (CM0653+SR0109) Preston 한천배지 (CM0689+SR0117+SR0232+SR0048) Bacillus cereus ATCC Bacillus subtilis ATCC 6633 incubated: hr. at 32 ± 1 C, aerobic Yersinia enterocolitica ATCC hr. at 30 ± 1 C 가운데가붉은색을띄는 bull's eye 형태의투명한집락 Camp. jejuni : 회갈색집락 ThermoFisher Scientific Microbiology Division 85

86 배지및시약가이드 Modified Campy blood free 한천배지 (CM0739+LP0021+SR0155) TC-SMAC 한천배지 (CM0813+SR0172) Oxford 한천배지 (CM0856+SR0140) Campylobacter jejuni ATCC hr. at 42 ± 1 C, microaerophilic Camp. jejuni : 회색집락 PALCAM 한천배지 (CM0877+SR0150) Escherichia coli NCTC hr. at C, aerobic E.coli O157 : 무색집락기타 E.coli : 분홍색집락 Fraser Listeria 배지 (CM0895+SR0156) Listeria monocytogenes : 검은환을가진갈색집락 MYP 한천배지 (CM0929+SR0099+SR0047) Listeria monocytogenes : 검은환을가진옴퓩들어간형태의갈색 / 검은색집락 Listeria monocytogenes: 검은색으로변함 Bacillus cereus ATCC hr. at 30 ± 1 C, aerobic BCIG 한천배지,TBX Agar(CM0945) Baird-Parker RPF 한천배지 (CM0961+SR0122) Escherichia coli ATCC Klebsiella oxytoca NCIMB hr. at 36 ± 1 C, aerobic Staphylococcus. aureus: Coaugulase zone 으로둘러싸인검거나회색인집락 CESA 한천배지 (CM1055) XLT4 한천배지 (CM1061+SR0237) Cronobacter Screening Broth(CSB) (CM1121+SR0247) 86 Cronobacter sakazakii: 청록색집락 왼쪽 : Cronobacter 음성 Escherichia coli ATCC : 담황색집락 Salmonella spp.: 중앙이검고붉거나검은집락 오른쪽 : Cronobacter 양성 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

87 배지및시약가이드 ONPG Disc (DD0013) Oxidase Strip (MB0266A) Ninhydrin + Hippurate Disk (R21238, R21085) BactiCard 왼쪽 : ONPG 음성오른쪽 : ONPG 양성 왼쪽 : Oxidase 양성오른쪽 : Oxidase 음성 베타용혈 streptococci, Gardnerella vaginalis, Campylobacter jejuni 에의한 Hippurate 가수분해시험 ( 왼쪽양성 ) 카드형생화학적검사시약 IMViC 시험 양성변화 필요시약 Indole 시험 Voges-Proskauer 시험 Methyl Red 시험 Citrate 이용시험 Tryptophan 분해로인돌생성되어배지상층부에적색 Microbact Spot Indole (DMAC), 10ml (MB1448A) 또는 Indole Reagent, Kovac's, 25ml/bottle (R21227) 또는 BactiDrop Indole, Kovac's, 0.75mlx50ampules (R21522) glucose분해에의한 acetoin 생성으로상층부적색 VP-A reagent, 12ml (R21200) + VP-B reagent, 25ml (R21281) 또는 BactiDrop VP A, 0.75ml x 50ampules (R21560) + BactiDrop VP B, 0.75ml x 50ampules (R21562) glucose 발효에의해적색 Methyl Red Reagent, 25ml/ bottle (R21236) 필요배지 SIM Medium, 500g (CM0435B) MRVP Medium, 500g (CM0043B) 미생물 Indole VP MR Citrate Escherichia coli Shigella spp Salmonella spp Klebsiellla spp Proteus vulgaris Proteus mirabilis Citrobacter freundii Enterobacter aerogenes Cirate 가사용되어녹색의배지가파란색으로변함. Simmons Citrate Agar, 500g (CM0155B) - Latex Agglutination Test Latex Agglutination Test (Dry-Spot Type) Biochemical Full Identification Kits 1: 응집됨. 양성 2: 응집안됨. 음성 라텍스시약이슬라이드에부착건조되어있어편리성및장기간보관성이향상됨. 좌 : Microbact Kits / 우 : RapID Kits ThermoFisher Scientific Microbiology Division 87

88 기체생성시스템 (AGS) 선택가이드 수용량 (90mm plate 기준 ) 용기 (jar, container) 최대 15 개최대 12 개최대 4 개 Anaerobic Jar 3.5L (HP0011A) AnaeroJar 2.5L (AG0025A) Rectangular AnaeroBox 2.5L (AB0025A) W-zip Seal Pouches (AG0060C) Plastic Pouches (AG0020C)* 혐기성대기생성기 (generator) AnaeroGen 3.5L (AN0035A) AnaeroGen 2.5L (AN0025A) AnaeroGen Compact for pouches (AN0020D) 용기 + 생성기 X X AnaeroGen W-Zip Compact (AN0010W) AnaeroGen Compact (AN0010C)* 혐기성표시기 (indicator) Anaerobic indicator (BR0055B) 미호기성대기생성기 CampyGen 3.5L (CN0035A) CampyGen 2.5L (CN0025A) CampyGen Compact (CN0020C) CO2 풍부대기생성기 X CO2Gen 2.5L (CD0025A) CO2Gen Compact (CD0020C) * sealing clip(an0005c) 별도구매 용량등의자세한정보는카달로그를참조하세요. AG0025A 2.5 Liter HP0011A 3.5 Liter AB0025A 2.5 Liter AG0060C AG0020C AN0010W AN0010C AN0035A AN0025A AN0020D CN0020C Culti-Loops 품질관리미생물균주 Quanti-Cult Plus 88 Quanti-Cult Plus 정량균주 Culti-Loops 정성균주 10개의건조된균주 + 재구성버퍼 5개루프를제공 1vial당 1.0ml로재구성후 <100CFU/0.1ml ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

89 Oxoid Chromogenic Media - Brilliance TM 적합미생물 Oxoid Product Name Product Code 성상설명성상이미지 Bacillus cereus Brilliance TM Bacillus cereus Agar CM1036B (+SR0230E) Bacillus cereus: 청록색집락 Campylobacter jejuni Campylobacter coli Brilliance TM CampyCount Agar PO1185A* Campylobacter jejuni: 짙은붉은색집락 E. coli, Coliforms Brilliance TM E. coli/ coliform Agar CM0956B E.coli: 보라색 Coliform: 분홍색 E. coli, Coliforms Chromogenic Coliform Agar PO5317A* E. coli: 검청 / 자주색 E. aerogenes: 장미빛적색 P. aeruginosa: 무색 Brilliance TM E. coli/ E. coli, Coliforms coliform Selective Agar CM1046B PO5176A* E.coli: 보라색 Coliform: 분홍색 E. coli TBX((TRYPTONE BILE X-GLUCURONIDE) Agar CM0945B PO5109A* E. coli: 청 / 녹색 K. pneumoniae: 담황색 E. coli O157 Sorbitol MacConkey Agar w/bcig CM0981B (+SR0172E) E. coli O157: 무색 E. coli (glucuronidase +): 청 / 분홍색 Cronobacter sakazakii Brilliance TM Enterobacter sakazakii Agar (DFI) CM1055B Cronobacter(Enterobacter) sakazakii: 청록색집락 Cronobacter sakazakii Enterobacter sakazakii Isolation Agar CM1134B Cronobacter sakazakii: 청록색집락 Cronobacter sakazakii Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI) Agar CM1122B Cronobacter(Enterobacter) sakazakii: 청록색집락 Listeria spp. Brilliance TM Listeria Agar CM1080B (+SR0227E +SR0228E) PO5165A* Listeria monocytogenes: 불투명한환을가진하늘색집락 Listeria innocua: 환없는하늘색집락 Listeria spp. Chromogenic Listeria Agar (ISO) CM1084B (+SR0226E +SR0244E) Listeria monocytogenes: 불투명한환을가진하늘색집락 Listeria innocua: 환없는하늘색집락 ThermoFisher Scientific Microbiology Division 89

90 Oxoid Chromogenic Media - Brilliance TM 적합미생물 Oxoid Product Name Product Code 성상설명성상이미지 Salmonella spp. Brilliance TM Salmonella Agar CM1092B (+SR0194E) PO5098A* Salmonella : 보라색집락 Salmonella spp. OSCM, Salmonella chromogenic agar base CM1007B (+SR0194E) Salmonella spp. 에따라, 심홍색, 심홍색 / 청색, 청색 Coagulasepositive Staphylococci Brilliance TM Staph 24 Agar PO1186A* Coagulase positive Staphylococci: 청색집락 Group B Streptococci Brilliance TM GBS Agar PO5320A* S. agalactiae: 분홍색 Candida spp. Brilliance TM Candida Agar CM1002B (+SR0231E) PO5170A* 균주에따라서, 검청색, 녹색, 불규칙적분홍빛갈색, 베이지, 노란색, 갈색 ESBLs ( 항생제내 Brilliance TM ESBL 성대장균 / 대장균 Agar 군 ) PO5302A* K. pneumoniae SHV-18: 녹색 E. coli TEM-3: 청색 MRSA ( 항생제내성황색포도상구균 ) Brilliance TM MRSA 2 Agar PO1210A* S. aureus : 청색 B. licheniformis : 분홍색 VRE ( 항생제내성장구균 ) Brilliance TM VRE Agar PO1175A* E. faecalis(vre) 균주에따라, 밝은청색, 인디고 / 퍼플색 CRE ( 카바페넴계 Brilliance TM CRE 내성균 ) Agar PO1226A* K. pneumoniae NDM-1 : 청색 E. coli CRE : 창백한분홍색 A. baumannnii : 크림색 UTI 원인균들 UTI 원인균들 Brilliance TM UTI Agar Brilliance TM UTI Clarity Agar * 는조제된배지 (prepared media) CM0949B PO5120A* CM1106B PO5159A* Enterococci : 청색 E. coli : 분홍색 Proteus, Morganella, Providencia: 갈색 Pseudomonas : 형광갈색또는녹색 Staphylococcus : 흰색 enterococci : 청색 / 청록색 E. coli : 분홍색 coliform: 검청 / 분홍색 Proteus, Providencia: 갈색환 ( 주 ) 메스디아 전화 팩스 일반 info@mesdia.com 기술지원 techsupport@mesdia.com

91 Pre-Weigh TM Dehydrated Culture Media 배지조제의능률을올리세요 미리정량된분말배지로업무흐름을간략화하세요. 더큰시험용액부피의필요와빠른결과를얻기원하는요구로실험결과의손실없이효율을최대화하기위한해결책이요구되었습니다. 오늘 찢어서기울이면 (Rip & Tip) 되는편리한 Thermo Scientific Pre-Weigh Dehydrated Culture Media (DCM) 로업무흐름을간략화하세요. 비용을줄이면서생산성을최대화하는데도움을주는 1 리터및 8 리터제품이있습니다. 효율다양한 Pre-Weigh DCM을선택하여수작업시간을줄이고생산성을최대화하면서정확도를올리세요. 편리책꽂이모양의박스포장으로제공되며쉽게개봉하고 찢어서기울이는 형태로사용하여업무흐름을단순화할수있습니다. 순응성능의신뢰가유지됩니다. 편리하고검증된포장형태로표준 DCM과같은고품질의배지가제공됩니다. 유연 1리터및 8리터파우치를조합하여필요한배지용량을맞출수있습니다. 잠재적효율을얻게됩니다 표준 DCM 과 Pre-Weigh DCM 을사용한배지조제의비교 * 예 A: 매일 45리터를조제할때, 주당 134분의시간절약연간 14.5일에해당 ** 예 B: 매일 15리터를조제할때, 주당 45분의시간절약연간 5일에해당 ** * 실험실조건하에서내부시험자료에기반함. ** 연간 52 주, 주당 5 일, 1 일 8 시간실험실운영으로계산됨. * MYP Agar Base 제품은 Polymyxin B( 제품번호 : SR0099E) 와 Egg Yolk Emulsion ( 제품번호 : SR0047E) 이필요합니다. ThermoFisher Scientific Microbiology Division 91

92 COMPLETE SOLUTIONS. COMPLETE CONFIDENCE. Find the solutions you need for each step of your microbiological food safety testing workflow. MEDIA PREPARATION & SAMPLE ENRICHMENT Prepared Media Available as prepared bottles, tubes & bags in volumes to suit your workflow Dehydrated Culture Media Available in a choice of pack sizes to suit your needs Maximize efficiency & reduce your QC burden with a choice of dehydrated or ready-to-use media & automated enrichment solutions. Dry-Bags Enrichment Media Reduce time & labor when preparing media in-house Media Dispensing & Sample Blending Fast, accurate dispensing of media with Diluflux Automated Gravimetric Dilutor Powerful, reliable blending of samples with Homogenizer Laboratory Blender SAMPLE PREPARATION & DETECTION Analyze even the most challenging samples with proven solutions fit for any & all food testing workflow preferences. For Reliable, Cost-effective Pathogen & Routine Organism Testing Use: Culture Media Quality assured, FDA & ISO compliant in dehydrated or prepared formats CAN BE USED WITH Dynabeads & BeadRetriever System Best suited for testing beef & other products for E.coli O157:H7 & other STEC OR WITH Pathatrix Auto System Best for testing challenging samples with low positivity rates For Rapid, Quantifiable Pathogen Testing Of Complex Matrices Use: MicroSEQ Pathogen Detection System Batch process up to 96 samples WITH PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Ideal for <50 samples per day OR WITH PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit & MagMAX Express-96 Processor Maximize throughput, ideal for >50 samples per day OR WITH Pathatrix Auto System Reduce false positives & indeterminate results when testing challenging samples with low positivity rates For Quick, Simple Pathogen Testing Use: SureTect Real-Time System Small footprint, low noise instrument with simple, rapid direct lysis sample preparation process. Fit for continuous processing of samples. TaqMan custom assays, CeeramTools virus kits, Imegen meat speciation & GMO tests can be run on the same open platform, Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR instrument CONFIRMATION & IDENTIFICATION Differentiate and confirm micro-organisms with a range of products using biochemical, immunological or molecular characteristics. Biochemical Identification A range of options including O.B.I.S. Identification System, RapID Systems & MicroBact range or individual biochemical reagents Immunological Identification Latex tests and agglutinating sera for clearing or confirming presumptive positives with identification possible to genus, species or serotype level Molecular Identification TaqMan and RapidFinder Real-Time PCR assays for identification beyond genus and species level, e.g. specific Salmonella serovars and STEC O-groups Quality Control Organisms For ensuring consistency in media preparation & in test performance 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are property of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries, unless otherwise specified. Taqman is a registered 서울특별시 trademark of Roche 강서구 Molecular 양천로 Systems Inc., used under permission and license. 비즈메트로 A-1101 Contact Information: Tel Fax microbiology@thermofisher.com info@mesdia.com USA LT2200A International +44 (0) ThermoFisher Scientific Microbiology Division microbiology@thermofisher.com