1 10 사료첨가용유산균생균제와생명공학기술을이용한균주개발 최윤재, 김은배 서울시관악구관악로 599 서울대학교농업생명과학대학 식품 동물생명공학부동물세포공학연구실, 요약 : 유산균은인간을포함한동물의건강을증진시키는생균제로알려져왔고, 최근에는축산에서도항생제를대체

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1 1 10 사료첨가용유산균생균제와생명공학기술을이용한균주개발 최윤재, 김은배 서울시관악구관악로 599 서울대학교농업생명과학대학 식품 동물생명공학부동물세포공학연구실, 요약 : 유산균은인간을포함한동물의건강을증진시키는생균제로알려져왔고, 최근에는축산에서도항생제를대체할소재로주목받고있다. 유산균에의한건강증진효과는유산및박테리오신과같은항균물질의생산, 병원균의소장상피세포부착억제, 동물의면역시스템조절, 소화효소분비등과같은작용기작이복합적으로작용하여나타나는것으로알려져있다. 국내외축산분야에서도유산균생균제를활용하여항생제대체효과를검정하는연구가많이수행되고있다. 많은연구에서유산균생균제급여가증체와설사발생률저하에긍정적인효과를보였지만, 유산균의종류및동물실험방법등에따라효과가다른것으로보고되었다. 또한최근에는생명공학기술을활용하여유산균의생균제적특성을증진시키는연구가많이수행되고있다. 이렇게개량된유산균을축산에도입할경우생산성및편의성등을높일수있을것으로기대하고있다. 향후, 축산에서는유산균생균제의활용도가높아질것이며이를대비하기위해과학적이고체계적인연구가뒷받침되어야할것이다. 서론 1950 년대이후부터축산분야에서는가축의성장촉진및질병예방목적으로항생제를사료에첨가하여사용하여왔다. 이후항생제의긍정적인효과이면에는여러가지부정적인결과들이보고되었는데, 항생제내성균주의우점, 항생제다제내성균의출현, 신규항생제의지속적인도입, 축산물에항생제잔류, 환경에항생제방출, 인간치료용항생제에대한내성병원균출현등의문제점들이제기되고있다. 이에전세계적으로항생제를사료첨가제로사용하지말자는여론이형성되어 ( 표 1), 유럽의경우 2006 년부터사료첨가용항생제의사용을전면금지하였고 (Nousiainen et al., 2004), 우리나라의경우에도단계적으로항생제사용이금지되어 2012 년에는사료첨가용항생제의사용이전면금지될예정이다 (Kim et al., 2009). 항생제사용이단계적으로금지되고있는상황에서현재다양한종류의항생제대체제들이관심을받고있는데 (Kim et al., 2005), 국내에서도면역조절제 (Hong et al., 2001; Hong et al., 2003; Cho et al., 2008), 효소제 (Kim et al., 2007a), 광물질제제 (Han and Shin 2009), 허브또는식물추출물 (Ko et al., 2007; Lee and Paik 2007), 유기산 (Kim et al., 2009), 그리고유산균생균제 (Kim et al., 2008a; Han and Shin 2009; Jang et al., 2009) 등에대한연구가활발하다. 이들중, 유산균은역사적으로인간에게유익한균으로알려져왔고, 장수에도움이되었으며 (Oh 2008), 면역증진 (Herich and Levkut 2002), 암예방 (Kim et al., 2007b) 등건강증진효과가있는것으로알려져있다. 또한과거많은연구들을통해서사료첨가제로유산균을급여하였을때, 가축의성장및설사예방효과가보고되었다. 이로인해유산균이최근항생제대체제로서관심을받고있는상황이다. 본고에서는, 유산균의어떠한특성이인간과가축에게이로운효과를주는지, 실제로축산분야에서사료첨가제로유산균을사용하였을경우어떠한효과를낼수있는지에대하여설명할것이다. 또한유산균의능력을더욱증진시키기위한생명공학기술을소개하면서향후연구방향에대한전망을제시해보고자한다

2 표 1. 사료첨가용항생제규제에관한역사 연도 규제주체내용 1986 스웨덴성장촉진용항생제 (AGP; Antimicrobial Growth Promotors) 의사용금지 1996 영국 동물사료에인체용항생제의사용금지 1997 EU Avoparcin의사용금지 WHO 항생제내성균문제로식용동물에대한항생제사용억제지시 1998 덴마크 Virginiamycin 등양돈사료내 AGP의사용금지 1999 EU Virginiamycin, Bacitracin, Spiramycin, Tylosin, Olaquindox, Carbadox 사용금지 2000 WHO 인체용항생제를동물용으로사용하지않도록권고 2004 Codex 항생물질, 의약물질, 성장촉진제등성장촉진을위한물질은동물사료로이 용될수없다고규정 대한민국항생제사용종류를 53종에서 25종으로감축 2006 EU 성장 촉진용 Flavophospholipol, Salinomycin sodium, Avilamycin, Monensin sodium의사용금지 ( 수의사처방없이사용전면금지 ) 2009 대한민국항생제 25종중에서 7종사용금지조치, 유기 무항생제축산직불제도입 2012 대한민국항생제사료혼합전면금지 유산균과유산균생균제 유산균 (Lactic acid bacteria, LAB) 이란탄수화물을발효하여최종산물로서유산 (lactic acid) 을생산할수있는박테리아를의미한다. 대부분의유산균은그람양성이고, 포자형성능력이없으며, 구형 (cocci) 또는막대형 (rod) 의모습을보인다 (Axelsson 2004). 주로많이이용되는유산균에는 Bifidobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus 등이있다. 생균제 (Probiotics) 의개념은 1965 년에정의된이래로그개념이계속발전해왔다 (Fioramonti et al., 2003). 최근에는동물의건강과복지에유용한효과가있는미생물균체또는미생물구성물질로서생균제를정의하고있다 (Marteau et al., 2002). 이러한관점에서, 유산균생균제는동물의건강및복지증진을위해사용되는유산균또는그구성성분으로구성된미생물제제라고정의할수있겠다. 유산균에의한유산 (lactic acid) 생산 유산균은이름에서도알수있듯이, 유산이 라는유기산 (organic acid) 을생산할수있다 ( 그림 1). 유기산은일반적으로이유자돈의위내 ph 를낮춰주고, 장내미생물의균총에변화를주며, 영양소이용률과소장의형태에영향을주는것으로알려져있다 (Kim et al., 2005). 이유자돈의경우위내 ph 가높아단백질및곡류사료에대한소화에어려움을겪고있어, 양돈분야에서는유기산을이용하여이유자돈의위내 ph 를낮추는연구를수행해왔으며농가현장에서도적용되고있다. 이렇게사용되는유기산에는 lactic acid 와 citric acid 등이포함되는데, 이들을적절히공급한다면위내 ph 저하뿐아니라사료에대한기호성또한높일수있다. 유산균이장내에도입되면유산균주변의 ph 를낮추어유해균에대한 antagonism 을발휘하여유해균의성장을억제할수있어설사예방및치료효과를기대할수있다 (Nousiainen et al., 2004). 유산균에의한박테리오신 (bacteriocins) 생산 유산균은박테리오신이라는항균물질을생산할수있다 ( 그림 1). 박테리오신이란박테리아가생산하는 peptide 계열의항균물질이다 (Cotter et al., 2005) 년유산균유래의

3 그림 1. 유산균에의한병원균억제효과. 유산균에의한병원균억제기작은대부분 in vitro 에서검증되었으며, 병원균억제효과가 in vivo 에서관찰되기는하지만정확히어떤기작에의해그러한효과가나타나는지는좀더구체적인연구가필요하다. 박테리오신이발견된이래로 1953 년영국에서 Lactococcus lactis 유래의 nisin 이최초로시장에선보였고그이후로 1969 년 FAO 와 WHO 에서, 1983 년 EU 에서, 1988 년 US FDA 에서 nisin 의산업적사용이승인되었다. 유산균에의해생산되는박테리오신은다양한 target 균주에대하여효과를보이지만, 일반적으로낮은 GC content 의그람양성균주에효과를보인다. 그람음성균주에대한효과도보여지긴하지만보통은 outer membrane 이손상된경우에효과가있는것으로알려져있다. 박테리오신에대한기존의분류방식이최근에수정되어 3 가지종류로구분되고있다 (Cotter et al., 2005). Class I 박테리오신은흔히 lanthionine-containing bacteriocins (lantibiotics) 로불리는데, 이들은 posttranslational modification(ptm) 과정을통해변형된아미노산을포함하는저분자 peptides (19-38 amino acids) 로알려져있다. 첫번째작용방식으로, amphiphilic cationic lantibiotics 는 membrane 에 pore 를형성하여 membrane potential 을붕괴시켜세포내부로부터대사물질을배출시킴으로써대상세포를파괴한다. 두번째작용방식은대상세포의효소들을억제하여세포를파괴한다. Nisin 과같은박테리오신은위의 2 가지기능을모두가진것으로알려져있다. Class II 박테리오신은흔히 non-lanthionine-containing bacteriocins 로불리는데, 10kDa 미만의작은 peptides 로구성된다. 열에안정적이지만 lantibiotics 와는다르게 PTM 을거치지않는다. 이들박테리오신은 membrane 의투과성 (permeabilization) 을증진시킴으로써대상세포로부터다양한분자들을배출시킴으로써세포를파괴한다. Class III 박테리오신은흔히 bacteriolysins 로불리는데, 이들은분자량이크고열에민감한항균단백질이다. 다양한 domain 이존재하는데, 이들은 translocation, receptor binding, lethal activity 등에관여한다. 현재까지 4 가지의유산균유래의 class III 박테리오신의특성이규명되었다

4 박테리오신이장내에서유해균을억제한다면유해균에의해나타나는설사증세를예방하거나치료할수있다. 하지만박테리오신에의한유해균억제효과를 in vivo 에서직접적으로증명하기란쉬운일이아니다. 최근 Lactobacillus salivarius UCC118 의 Abp118 박테리오신이 Listeria monocytogenes 를 in vivo 에서직접적으로억제할수있다는연구결과가발표되었다 (Corr et al., 2007). Abp118 은 class II 에속하는박테리오신으로서, 기존에 L. monocytogenes 에대한 in vitro 항균활성이보고되어있었다. Abp118 은 L. salivarius 의 abpt 유전자에의해 encoding 된 transporter 에의해분비가조절되는데, 이유전자를 inactivation 시켜 Abp118 를분비하지못하는균주를만들수있다. WT 과 mutant 균주를쥐에게먹이고 L. monocytogenes 를 challenge 하였을때, WT 을먹인쥐에서는 liver 에서 control 에비해 L. monocytogenes 수가 20% 로감소되었지만, Abp118 을생산하지못하는 mutant 균주를먹인쥐에서는 control 과비슷한수의 L. monocytogenes 가검출되었다. 따라서이러한 L. monocytogenes 감소의결과는정확히 Abp118 이라는박테리오신의직접적인효과라할수있다. 그동안유산균유래박테리오신이병원균억제효과가있다는 in vitro 결과는있었지만, 이와같이직접적인병원균억제효과를 in vivo 연구를통해증명한사례는매우드물다. 최근돼지에서도 L. salivarius 에대한연구가소개되었는데, 항균물질을생산하는 L. salivarius 는다른종류의 lactobacilli 와함께돼지에게급여했을때, 회장전체 lactobacilli 중가장많은비율을차지하고있었다 (Walsh et al., 2008). 이는 L. salivarius 의항균활성이다른 lactobacilli 에대한경쟁적우월로작용한결과로해석할수있다. 이러한결과를토대로유산균생균제를개발함에있어서그조합이얼마나중요한지를알수있다. 유산균박테리오신은식품보존제로서도활용이가능한데, 유산균이안전한미생물로인식이되고있으므로유산균에서생산된박테리오신또한안전하게사용할수있다는데에그 이유가있다. 실제로 nisin 은식품에사용이가능한보존제이며 (Cleveland et al., 2001), 이러한박테리오신을사료에첨가한다면사료보존제로서도활용이가능할것으로생각된다. 유산균의장부착능력 장내병원균은장상피세포 (IEC, intestinal epithelial cells) 표면을덮고있는 mucus layer 를통과하여 IEC 에도달하거나 IEC 를통과하여동물에설사와같은병리증세를야기할수있다. 유산균을이용하면이러한피해를줄일수있다 ( 그림 1). 유산균은장상피세포에부착할수있는능력이있어장에서일시적으로 colony 를형성할수있다. 병원균은장상피세포의부착수용체 (adhesion receptors) 에부착이가능한데, 유산균이이수용체를미리점유하고있게되면, 병원균의장체류시간이줄어병원균의증식을억제할수있다 (Nousiainen et al., 2004). 예를들어, 유산균의장부착능력으로인하여 E. coli O157:H7 과같은병원균이장상피세포에부착하는것을억제할수있다 (Sherman et al., 2005; Kim et al., 2008b). 장상피세포상층의점액질 mucus layer 에는항균성효소인 lysozyme, immunoglobulin, mucin 등이포함되어있다. 이러한 mucus layer 에유산균이부착할수있는데, hypothetical mucus-binding protein 들이관여한다는사실과이러한유산균의부착으로인하여 mucin 의분비량도증가한다는사실이실험적으로증명되었다 (Jonsson et al., 2001; Mack et al., 2003). 이후에수많은연구들을통해 Mub, Msa, LspA, MapA 등의 mucusbinding protein 들이밝혀졌다 (Vélez et al., 2007). 이외에도유산균은 extracellular matrix(ecm) 에부착할수있는데, 이는 ECMbinding protein 들을통해가능하며대부분의 ECM-binding protein 들은 S-layer protein 계열로알려져있다. 이들은 ECM 뿐만아니라상피세포층에도부착할수있는것으로알려져있다 (Sánchez et al., 2008). 유산균의부착에는앞서언급한단백질들뿐아니라, 지질계

5 열의 lipoteichoic acids(lta) 와당류계열의 exopolysaccharides(eps) 와같은비단백질성물질들또한관여한다 (Sánchez et al., 2008). 이상에서설명한유산균의장내부착기능은병원균에대한경쟁적인배제 (competitive exclusion) 에있어서매우중요한역할을하고있으며, 이러한배제에대해서는특히동물실험에대한구체적인연구가필요한상황이다. 유산균의면역조절능력 장에는 intra-epithelial lymphocytes(iel), M-cells, dendritic cells(dc) 등수많은면역세포들이존재하고, lymphatic follicles 와 Peyer s patches 를포함하는전문화된면역조직인 gut-associated lymphoid tissue(galt) 가존재하여경구를통해장으로유입되는미생물에효과적으로대응할수있다 (Macpherson and Harris 2004). 유산균은이러한동물의장내면역시스템을자극하여 ( 그림 1), 동물의건강에이로운효과를낼수있는것으로알려져있다 (Herich and Levkut 2002). 유산균에의한비특이적면역반응으로는복강과폐에존재하는 macrophages 와 leukocytes 의활성증진, 면역세포의 lysozomal enzymes 생산증가, phagocytic cells 의 nitrogen radicals 생산증가, monocyte-macrophage 의 phogocytosis 활성증진등이보고되었다. 유산균은특이적면역반응또한유도할수있었다. 예를들어, 발효유를먹인쥐에게 Shigella sonnei 를 challenge 하였을때 control 에비해생존율증가, liver 와 spleen 에서의 S. sonnei 생균수감소및 anti- Shigella 항체증가를관찰하였다 (Macías et al., 1992). 또한 L. casei 섭취한쥐에서 Salmonella typhimurium 를 challenge 하였을때 control 에비해 S. typhimurium 특이적인 IgA 분비량의증가로 S. typhimurium 감염이억제되었다 (Alvarez et al., 1998). 유산균이이러한면역증진효과를보이는기전에는무엇보다세포구성물질이중요한역할을담당한다. 유산균의세포벽구성물질중하나인 LTA 를동물의면역세포가 toll-like receptor(tlr) 를통해인지하면면역세포가자극되어다양한 cytokine 들의분비가조절된다 (Sashihara et al., 2006). Cytokine 들은항체생산능력과세포성면역을조절할수있는물질로서동물의면역을총괄하는물질들이다. 하지만면역이라는생리적반응이크다고해서무조건동물의건강에좋은효과를주는것만은아니다. 과도한면역은몸의균형을깨고 allergy 와만성대장질환을유발할수도있다. Allergy 와만성대장질환도유산균에의해면역을조절함으로써예방과치료가가능하다. Lactobacillus reuteri 를천식모델의쥐에경구로주입한이후 allergen challenge 를하였을때, L. salivarius 를주입한처리구와는다르게 eosinophil 이 airway lumen 과 parenchyma 로유입되는것을줄일수있었고 TNF, MCP-1, IL-5, IL-13 과같은염증관련 cytokine 들의수치를낮출수있었다 (Forsythe et al., 2007). 결과적으로, L. reuteri 를이용하여알레르기나천식과같은과도한면역반응을개선할수있었다. 유산균의세포벽성분에는 teichoic acid 라는지질계열의물질이있는데, 이는면역세포의 TLR 에의해인지가된다. Lactobacillus plantarum 의 teichoic acid 가면역세포의 TLR2 에의해인지되어 TNF-α 와같은 proinflammatory cytokine 들의분비를유도할수있다. 그런데 L. plantarum 의 dlt 유전자를 inactivation 시키면 teichoic acid 에 modification 을가하여 D-alanine 의수식비율을줄일수가있어 cytokine 들의분비를조절하여결국쥐의장내의염증을줄여만성대장질환을개선할수있었다 (Grangette et al., 2005). 이와같이, 유산균은동물의면역세포를자극하여면역시스템을조절할수있으며이러한특성을활용하면축산분야에서경제동물의면역능력을증진시킬수있을것으로판단된다. 경제동물에서의면역증진효과는앞으로도많은연구가필요한상황이다. 동물의대사작용에대한유산균의효과 유산균의섭취는동물의체내대사작용에

6 도영향을미치게된다 (Nousiainen et al., 2004). Cholesterol 함량이높은사료를급여한돼지에게 Lactobacillus acidophilus 를먹이면혈중 cholesterol 증가를억제할수있다. 이는유산균에의해 bile salt 가 deconjugation 되어 bile salt 배출을촉진하기때문으로여겨진다 (Tanaka et al., 1999; Nousiainen et al., 2004). 장내에서는 E. coli 와같은미생물에의하여발암성의질소화합물을발생시키게되는데, 유산균은이러한유해질소화합물의발생을줄일수있다. 예를들어, L. acidophilus 를급여한돼지의장내에서 amine 의생산량이줄었다는보고가있다 (Nousiainen et al., 2004). 유산균은또한경제동물의소화를돕는분해효소를분비하는데, 특히송아지와자돈에서중요한역할을한다. Amylolytic 또는 glucanolytic activity 를지닌유산균이보고되어있다 (Champ et al., 1983; Jonsson and Hemmingsson 1991). 예를들어, 보리와귀리에있는 β-d-glucan 은돼지나가금자체의효소로는분해가되지않아, glucanolytic activity 를지닌유산균의활용이의의를지닌다. 또한대다수의유산균이 β-galactosidase activity 를보이고있어 lactose 소화를개선할수있다 (Garvie et al., 1984). 유산균생균제에의한증체효과 유산균을경제동물의사료첨가제로이용하여항생제를대체하기위한연구는 70 년대후반부터현재에이르기까지오랜기간수행되어져왔다 (Nousiainen et al., 2004). 이러한연구들은실험동물의상태, 사육환경, 유산균의 species 나 strain 종류, 급여시유산균의성상, 급여된유산균의균수등의조건이다양하여결과또한다양하게나타났다. 실험방법과결과의다양성에도불구하고, 유산균의첨가는대체로경제동물의성장및건강에이로운결과를보이는것으로정리할수있다. 유산균이돼지의생산성에미치는효과 여러종류의경제동물중에서특히유산균 생균제연구가가장활발한분야는역시돼지이다 년부터 2001 년사이에학술지에발표된자돈에대한유산균생균제급여실험 39 건을정리한자료에따르면 (Nousiainen et al., 2004), 유산균생균제처리구가 control group 에비해증체율이높은실험이 27 건이었으며이중에서통계적유의성이있는결과는 9 건이었다. 증체율감소한실험은 11 건이었으며통계적유의성이있는실험은 3 건이었다. 대체로자돈에있어서유산균생균제의급여는증체에도움이되지만사료효율 (Gain/Feed) 은낮아질수있었으며, 특히발효유의형태로급여한경우사료효율이낮아지는결과를보였다. 자돈뿐만아니라, 성장이끝난성돈의경우유산균의급여로인하여약간의증체가관찰되었으나, 그효과는자돈에대한효과보다는크지않았다. 이와같은생균제의효과는항생제처리와비교하여설명하는것이중요하다 일령자돈에서유산균과항생제의효과를비교한연구자료에따르면 (Chang et al., 2001), L. reuteri 처리구가무처리구나항생제 (1.1% tiamuline 과 13.2% oxytetracycline) 처리구에비하여분중 lactobacilli 수가증가하였고 (P<0.01), 사료효율 (Feed/Gain) 이개선되는 (P<0.01) 결과를보였으며, 무처리구에비해분중 enterobacteria 수의감소를보였다. 본연구에서는유산균을하루에 2ⅹ10 6 또는 2ⅹ10 8 CFU 두가지수준으로급여하였는데 2ⅹ10 6 에서 2ⅹ10 8 과비슷한결과를보였다. 즉, 유산균의첨가가자돈에서항생제처리보다우수한효과를보였으며, 급여한생균수는일정량이상이되었을때더좋은효과를보이지는않았다. 이와는다른결과를보인연구결과도있다. 이유자돈을대상으로항생제 (avilamycin, 0.12%) 와생균제 (L. casei 또는 L. cripticus, 0.2%) 의효과를직접적으로비교한연구결과가국내에서발표되었다 (Jang et al., 2009). 5 주동안실시된동물실험에서, 항생제처리구에서일당증체량 (ADG, P<0.01) 과사료효율 (Gain/Feed, P<0.05) 이다른그룹 ( 무처리구또는유산균처리구 ) 에비해높게나타났고, 유산균처리구는항생제나생균제를처리하지않은무처리구에

7 비해서는일당증체량과사료효율이개선되는양상을보였다. 이러한결과는생균수, 균주의종류, 급여시기, 급여기간등이대상동물에적절하지않았기에발생한결과일것으로판단되므로, 이에대한구체적인연구가필요하다고하겠다. 유산균이송아지의생산성에미치는효과 복잡한미생물생태계를구성하고있는반추위를통해영양소를이용하는소의경우, 유산균생균제급여를통한소의생산성향상효과를평가하기에어려움이있어서많은연구가수행되지는않았다. 하지만송아지의경우아직반추위가발달되지않은상태이고소화기계통이단위동물과비슷한상황이므로유산균의효과를평가하는방식이단위동물과비슷하여많은연구가이루어지고있다 년부터 2001 년까지학술지에발표된송아지에대한유산균생균제급여실험 36 건을정리한자료에따르면 (Nousiainen et al., 2004), 25 건의실험에서 control group 에비해증체율이증가하였고이중에서통계적유의성이있는결과는 6 건이었다. 반면에증체율이감소한결과는 5 건이지만통계적유의성은없었다. 따라서돼지에서와마찬가지로송아지에서도유산균생균제의급여에따른증체율은대체로증가하였다고볼수있다. 556 두의 10 일령의송아지들을이용하여유산균의효과를분석한최근의연구사례를소개하자면 (Timmerman et al., 2005), 본연구에서는송아지들을 D+1 일부터 D+7/D+10 일까지항생제처리를하면서동시에 D+1 일부터 2 주일또는 8 주간유산균을급여또는비급여하였다. 실험개시 8 주가지난후유산균을섭취한송아지의일당증체량 (ADG) 은 626 g/d 로유산균비급여군의 610 g/d 에비하여유의적으로증가하였다. 또한사료효율 (Feed/Gain) 은유산균처리구가 1.52 로비처리구의 1.63 에비해통계적으로유의성있게개선되었다. 송아지사망률또한유산균처리구에서더낮은결과를보였다 (1.93% 대 0.52%). 이실험에서는인간유래의유산균 6 종의 mixture 인 MSPB 와송아 지유래의유산균 6 종의 mixture 인 CSPB 를이용하였는데, 설사를보인송아지의수와송아지당설사횟수를비교해보면 MSPB 는유산균비처리구와비슷한정도를보였지만, 송아지유래의 CSPB 는비처리구에비해절반이하로설사발생이줄었다. 이러한경향은분중 coliform 박테리아의수에서도나타나는데 CSPB 의경우비처리구및 MSPB 에비해이들박테리아의수가 90% 이상줄었다. 아마도설사빈도의감소는이러한 coliform 박테리아수감소와관련이있을것이며, 설사빈도감소는증체, 사료효율, 사망률의개선으로이어졌을것으로여겨진다. 이연구에서특히주목할점은유산균의유래가중요하였다는점이다. 인간유래의기존의상업제품보다는송아지에서직접분류한유산균이좀더송아지에게긍정적인효과를보였다는점이다. 유산균이닭 ( 육계 ) 의생산성에미치는효과 닭 ( 육계 ) 에대한연구도많이수행되었고, 이에대하여정리된자료에따르면 (Ahmad 2006), 육계에서증체및사료효율에대한증진되는결과와효과가없는결과가모두보고되었다. 이에대한몇가지사례를살펴보면아래와같다. 그리스에서보고된연구결과를보면 Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Pediococcus 가포함된생균제를 1 일령육계병아리에 6 주간사료에첨가하여급여한결과항생제처리구와무처리구의중간정도되는증체율과사료효율을보였다 (Mountzouris et al., 2007). 오스트리아에서보고된연구결과에서는 Lactobacillus 유산균처리구가비처리구와비교하여증체량, 일당증체량, 사료효율, 십이지장과회장에서의융모길이등의수치가통계적으로비슷하여차이를내지못했다 (Awad et al., 2009). 반면에최근국내에서육계에대한유산균의장내체류시간, 적정급여량, 적정급여주기에대한연구결과를보고하였다 (Kim et al., 2008a). L. reuteri 를사료와혼합하여 1.0ⅹ 10 4 CFU/g 수준으로 5 주령육계 (100 수 ) 에급

8 여하였을때, 회장점막및장내용물에서총유산균중급여된유산균의비율은 D+1 일에약 27% 에서 D+7 일에약 5% 미만으로감소되었다. 이유산균을음수에첨가하여 1 일령의병아리에 5 주간공급하였을때, 비처리구에비하여비록사료효율의개선은없었으나 5.0ⅹ10 3 CFU/ml 수준으로유산균을공급한처리구에서 5 주간의증체량이유의적으로증가하였다 (P<0.05). 이보다적거나많이공급한경우비처리구와의유의적차이는보이지않았다. 여기서결정된급여량으로 1 일또는 2 일간격으로급여하는것이비처리구나 3 일또는 5 일간격처리구에비하여 5 주간의증체량이증가하였다. 비록항생제처리구와의비교는없었지만, 이결과에서유산균급여가육계병아리에게긍정적인효과를보인다는사실이확인되었고, 이러한연구전략을통해유산균의급여량과적정급여시기등을결정할수있었다. 경제동물에서의유산균의이용및연구 이상에서정리한바와같이, 유산균기반의생균제를경제동물에급여할경우균주의종류와특성, 급여방법 ( 시기, 기간, 양, 성상 ) 등이달라서로비교하기어려운상황이지만대체로유산균이경제동물의생산성증진에효과가있는것으로판단할수있다. 이러한긍정적인효과는앞서설명한유산균의다양한건강증진특성 ( 유산, 박테리오신, 장부착, 면역활성, 대사작용등 ) 에의해나타나는복합적인효과라고볼수있다. 향후연구에서는항생제처리구가포함된 placebo-controlled doubleblind test 를통해유산균의효과를편견없이비교하는것이중요하며, 효과검정이후에는급여방법에대한구체적인연구를통해농가에구체적인지침과함께유산균생균제를보급하는것이중요하다. 생명공학기술을활용한유산균생균제의기능개선 앞서설명한바와같이, 유산균생균제는다양한기작에의해경제동물의생산성을증진 시킬수있었는데, 최근에는생명공학기술을이용하여좀더우수한특성을지닌균주를개발하여이를축산에응용하고자하는관심이높아지고있다. 유산균의내산성증진 생균제로사용되는유산균이산업적인효과를발휘하기위해서는위장의낮은 ph 를지나안전하게소장과대장으로이동해야한다. 유산균의내산성은균의 species 와 strain 에따라다르지만, 대체로 1~10% 정도이다. 위장의낮은 ph 조건에서더잘견디기위해서는유산균의내산성을증진시키는일이무엇보다도중요하다. 무작위돌연변이를유도하여내산성이높은균을반복적으로선발하던고전적인방식을벗어나, 최근에는유전체전체를재조합 (genome shuffling) 하여 ( 그림 2) 내산성이증진된균주를육종할수있는기술이소개되었다 (Patnaik et al., 2002). 고전적인방식의경우, 수년간에걸쳐내산성을서서히증진시켜야했지만, genome shuffling 기술은단시간에내산성을증진시킬수있는기술이므로산업현장에신속히대응할수있다. 이러한 genome shuffling 기술은유산균의다른특성을증진시키는데에도적용이가능할것으로판단된다 (Gong et al., 2009). 유산균에서소화효소의생산분비 유산균이비록동물의소화에도움을주는다양한효소를분비한다고는하나, 그러한효소의종류가상당히제한적으로존재한다. 유산균은영양소가풍부한우유속에서서식했던미생물이기때문에, 진화를거치는동안상당히많은종류의소화효소유전자들이유전체로부터제거되었다 (Pfeiler and Klaenhammer 2007). 이러한이유로, 동물산업에서중요한효소를유산균에서발현시켜이용하고자하는연구들이수행되었다. Alfalfa 를이용한 silage 제조시수용성탄수화물의양이적어 L. plantarum 에의한발효가제한을받는다. Alfalfa 는 starch 가풍부하여

9 그림 2. 유전체재조합 (Genome shuffling). 유전체재조합기술을이용하여다양한종류의 genotype 을구성하면개량형질이개선된균주를확보할수있다. 이후개량형질에맞는선발방법에따라개선된균주를선발하여활용이가능하다. L. plantarum 이 amylase 를발현분비한다면 lactic acid 를생산하는데충분한탄수화물을확보할수있다. 이러한취지로 L. plantarum 에서외래 amylase 를발현시킨연구가소개된바있다 (Fitzsimons et al., 1994). 보리 (barley), 소맥 (wheat), 호밀 (rye), 귀리 (oats) 등의곡류는단위동물의사료원료로사용이되지만, 이들은비전분질의다당류 (NSP) 인 β-glucan 과 arabinoxylans 등으로구성이되어있어단위동물의소화장관에서점도를높여다른영양소의소화를방해하는항영양인자로작용한다. 이러한문제를해결하기위해 β- glucanase 나 xylanase 를사료에첨가하여점도를낮추고 NSP 의항영양효과를감소시켜단위동물의성장증진을도모할수있다. 이와같은효소의첨가는생산비를증가시키므로, 유 산균에서이들효소를발현및분비시킨다면유산균과분해효소의두가지장점을동시에활용하는것이가능하다. 실제로이러한난분해성탄수화물을분해할수있는외래효소유전자를 L. reuteri 에도입하여분해효소들의활성을확인한연구가보고된바있다 (Liu et al., 2005). Phytate 는식물의조직에서인을저장하기위한구조체이다. 비반추가축은 phytate 를분해할수있는효소가없어이를인의공급원으로사용할수없다. 또한 phytate 는일부광물질의흡수를방해하고단백질과의결합으로단백질이용성을방해하며, 배출시에는환경에인을축적시키는환경오염원으로인식되고있다. 이러한문제를해결하기위해 phytate 를분해할수있는 phytase 를사료첨가제로사용하

10 고있는데, 이는양돈농가의생산비증가를가져온다. 유산균에서 phytase 효소를발현및분비시킨다면유산균과 phytase 의이점을동시에활용할수있다. 이러한취지에서 phytase 를발현하는 Lactobacillus 들을개발한연구가보고된바있다 (Kang 2003). 유산균을이용한경구백신의개발 최근 10 여년동안유산균을활용한경구백신개발에대한연구가활발하게진행되어왔다. 유산균은병원성적고면역활성능력이우수하며, 동시에외래유전자의도입및발현이수월하기때문에이러한연구들이많이관심을받아왔다. 주로 L. plantarum 과 L. lactis 중심으로연구가되었는데, 이는이들균주에서안정적인발현시스템이존재하고이들균주에대한안전성이확인되었기때문으로생각된다. 병원성박테리아나바이러스유래의유전자를유산균에서발현시킨후, 실험동물에게경구로급여하면병원균특이적인항체가분 (feces) 과혈청 (serum) 에서검출이된다. 이러한방식으로개발된백신을유산균경구백신이라고한다. 유산균에서발현된항원단백질로는박테리아유래의 Brucella abortus 의 L7/L12 (Pontes et al., 2003), Clostridium tetani 의 TTFC (Robinson et al., 1997; Grangette et al., 2004) 등과바이러스유래의 HPV type16 의 E7 (Poo et al., 2006), Bovine rotavirus 의 NSP4 (Enouf et al., 2001) 등이보고되었다 ( 표 2). 부루셀라는 Brucella abortus 에의해발병이되는질병으로소에서발병했을때유산이나불임의증상을야기할수있고, Clostridium tetani 는파상풍의원인균으로서 TTFC 단백질에의한예방접종이가능하다. 이와같은박테리아유래의항원을유산균에서발현시켜동물에급여하면해당병원성박테리아에대한면역을확보할수있다. HPV type16 은자궁경부암의원인바이러스중하나이고, rotavirus 는소장상피세포에감염하여유아와어린이에게심각한설사증세유발하는원인바이러스이다. 이들바이러스유래의항원을유산균에서발현시켜동물에급여하면자궁경부암및설사증세를예방할수있다. 물론경제동물에서암에대한걱정은하지않겠지만, 바이러스유래의항원을유산균에발현하여면역을유도할수있다는점을응용한다면항바이러스특성을지닌기능성유산균을개발할수있을것이다. 유산균에서면역조절제의발현 유산균에서는다양한종류의 cytokine 들을발현및분비시킬수있다. 현재까지 IL-2, IL- 6, IL-10, IL-12 등의 cytokine 들이유산균에서발현및분비되어쥐에서효능평가가이루어졌다. IL-2 와 IL-6 의경우 IgA 와 IgG 의생산을증진시키는능력이있어서백신접종시에면역효과를증대시킬수있는 cytokine 들이다. 실제로 IL-2 또는 IL-6 와항원단백질인 TTFC 를유산균에서 co-expression 시킨후쥐에게경비투여한결과 serum 중의 anti- TTFC IgG 의함량이 TTFC 만발현시킨유산균을처리한 group 보다유의적으로증가하였다 (Steidler et al., 1998). IL-10 은 inflammatory bowel disease(ibd) 라는대장염에치료효과가있는것으로알려져있는데, 이는 IBD 의경우장에서의비정상적인 T-cell 반응이그원인 표 2. 유산균을이용한경구백신개발사례 Types Origins Antigens Diseases References Bacteria Brucella abortus L7/L12 소의불임및유산 (Pontes et al., 2003) Clostridium tetani TTFC 인간의파상풍 (Robinson et al., 1997; Grangette et al., 2004) Virus HPV type16 E7 인간의자궁경부암 (Poo et al., 2006) Bovine rotavirus NSP4 유아와어린이의설사 (Enouf et al., 2001)

11 그림 3. 유전자변형유산균의생물학적방제 (biological containment). thya 유전자가제거되고인간의 IL-10 이발현되는유전자변형유산균은 thymidine 이결핍된환경으로배출된이후, 성장이억제되어사멸된다. 중하나인데 IL-10 과같은 cytokine 에의해비정상적인 T-cell 반응을억제하여대장염을완화할수있다. IL-10 을발현및분비할수있는유산균이개발되어쥐에게경구로급여하였을때대장염의증상이 50% 정도감소되었다 (Steidler et al., 2000). IL-12 는 DNA 백신과함께투여할경우 adjuvant 로서의효과를보이며, 몇몇 bacteria, virus 등의감염에세포성면역을유도할수있어면역적으로중요한 cytokine 으로알려져있다. IL-12 을발현및분비하는유산균을쥐의 splenocytes 에처리하였을때, INF-γ 의분비를유도하였으며, 외래항원과함께쥐의 splenocytes 를자극할경우항원특이적으로 Th1 cytokine 들 (IL-2 와 INFγ) 의생산을증진시켰다 (Bermudez-Humaran et al., 2003). 이상의예와같이유산균에서 cytokine 을발현시키면 cytokine 고유의기능을발휘할수있을뿐만아니라, 이들유산균의급여만으로도동물에서 cytokine 의이용이가능하다. 하지만이러한 cytokine 들은면역을조절하는기능이있어적절한유산균급여량을정하는연구가필요하다. 유전자변형유산균의환경친화적이용방안 앞서언급한바와같이, 유산균에서외래유전자를발현시키거나특정유전자를제거함으로써신규한유용균주를개발할수있다 (Wells and Mercenier 2008). 외래유전자를유산균에서발현시키기위해서는 gene cloning 과정과외래 DNA를유산균 host에도입하는과정을겪게되는데, 이때 DNA가유산균에제대로도입되었는지확인하기위한선발목적의보조유전자가사용되는데그것이바로항생제저항성유전자이다. 항생제저항성유전자가포함된유산균을산업적으로사용하게되면동물로부터배출되어환경에널리퍼져병원성미생물이항생제내성을획득할수도있다. 외래유전자를발현시키기위해사용하는 DNA 운반체로는일반적으로 plasmid를사용하게되는데이때불필요하게많은 DNA가유산균에도입될수있다. 이는잠재적으로타미생물에전이되어항생제저항성유전자등의확산을매개할수도있다. 이외에도유산균에서발현시키고자하는외래유전자그자체가문제가되는경우도있다. 유산균은우유나분과같은서식지를가지고있지만, 만약새로운유전자를받아들임으로써다른환경에있는영양소를이용할수있게된다면유산균고유의서식지가바뀌게되어생태계가교란될수있다. 이와같이유전자변형유산균 (GM-LAB) 이환경에미칠잠재적인문제점을고려하면, GM- LAB의산업화를위해서는이들을환경친화적으로개발하는것이무척중요하다. 예를들어, thya - hil-10 + GM-LAB과같은균주는환경친화성과 GMO 개발이라는두가지이슈를동시에구현할수있었다 (Steidler et al., 2003). 이균주는 thya 유전자를제거하고그곳에 human IL-10 유전자를도입하였다. 즉, 이균주는 thya를제거함으로써 thymidine이첨가된

12 특수한배양환경에서만증식이되고 thymidine 과같은첨가물이존재하지않는환경에서는성장억제및세포자살이유도되었다 ( 그림 3). 또한이균주에는항생제저항성유전자나부수적인 plasmid 가잔류하지않아서환경친화성을증진시켰다. 이러한새로운연구흐름은 GM-LAB 에대한관심을증진시켰고산업화에대한기대에부응할수있는길을열어주었다. 결론 현재우리는축산분야에서항생제를대체할대안을찾아야하는당면과제를안고있다. 다양한대체제들이현재활발하게연구되고있으며, 그중에서특히유산균이많은관심을받고있다. 유산균은다양한기전으로동물의건강을유지시켜주고질병을예방하게해준다. 하지만이러한특성은균주마다다르고대상동물마다그효과도다양하다. 따라서유산균을축산에서제대로활용하기위해서는유산균의기능성검정, 기능성을높일수있는배양 / 보존방법의개발, 유산균의급여방법 ( 시기, 기간, 양, 성상 ) 등에대한연구가이루어져야할것이다. 생명공학기술을활용하여유용한신규균주를개발하는것과이를환경친화적으로사용하는것또한우리가개척해야할분야이다. 유산균이비록전통적으로인간이많이접해왔고병원성이적다고는하지만, 유산균의안전성문제를외면해서는안된다. WHO/FAO 에서는전문가회의를거쳐안전상의이유로일부유산균의사용을금지하였으므로 (Ji 2005), 축산과인류복지를위해안전성확보를가장기본적인명제로남겨두어야할것이다. 참고문헌 Ahmad, I. (2006) Effect of probiotics on broilers performance. Int J Poult Sci 5, Alvarez, S., Gobbato, N., Bru, E., Holgado, A.P.D.R. and Perdigón, G. (1998) Specific immunity induction at the mucosal level by viable Lactobacillus casei: a perspective for oral vaccine development. Food Agric Immunol 10, Awad, W. A., Ghareeb, K., Abdel-Raheem, S. and Bohm, J. (2009) Effects of dietary inclusion of probiotic and synbiotic on growth performance, organ weights, and intestinal histomorphology of broiler chickens. Poult Sci 88, Axelsson, L. (2004) Lactic acid bacteria: Classification and Physiology. In Lactic acid bacteria. pp Bermudez-Humaran, L. G., Langella, P., Cortes-Perez, N. G., Gruss, A., Tamez- Guerra, R. S., Oliveira, S. C., Cardenas, O. S.-., Montes de Oca-Luna, R. and Le Loir, Y. (2003) Intranasal immunization with recombinant Lactococcus lactis secreting murine interleukin-12 enhances antigenspecific Th1 cytokine production. Infect Immun 71, Champ, M., Szylit, O., Raibaud, P. and Aïut- Abdelkader, N. (1983) Amylase production by three Lactobacillus strains isolated from chicken crop. J Appl Microbiol 55, Chang, Y.-H., Kim, J.-K., Kim, H.-J., Kim, W.-Y., Kim, Y.-B. and Park, Y.-H. (2001) Selection of a potential probiotic Lactobacillus strain and subsequent in vivo studies. Antonie Van Leeuwenhoek 80, Cho, B. I., You, S. J., Kim, E. J., Ahn, B. K., Paik, H. D., Yun, C. W., Chang, H. I., Kim, S. W. and Kang, C. W. (2008) Effects of the combination feeding of β-glucan and multi-species probiotics on growth performance and microflora in broiler chickens. Korean J Anim Sci Technol 50, Cleveland, J., Montville, T. J., Nes, I. F. and Chikindas, M. L. (2001) Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food

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