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유리 추
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1 동의생리병리학회지제 22 권 1 호 Korean J. Oriental Physiology & Pathology 22(1): , 2008 손윤희 1 ㆍ서재범ㆍ남경수 동국대학교의과대학약리학교실, 1 : 동국대학교난치병한양방치료연구센터 Effect of Prunella vulgaris L. on Chemopreventive Enzymes of Colorectal Cancer Yun Hee Shon 1, Jae Beom Seo, Kyung Soo Nam Department of Pharmacology, College of Medicine, Dongguk University, 1 : Intractable Disease Research Center, Dongguk University Water extract from Prunella vulgaris L. (PVW) was tested for colon cancer chemopreventive activity by measuring the activities of cytochrome P450 1A1, phase Ⅱ detoxification enzyme [quinone reductase (QR) and glutathione S-transferase (GST)] and ornithine decarboxylase (ODC) and glutathione (GSH) levels in cultured human colorectal adenocarcinoma HT-29 cells. PVW significantly inhibited 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)-induced cytochrome P450 1A1 activity at 10 and 50 μg / ml. PVW induced QR activity in a dose-dependent manner over a concentration range of 1~50 μg / ml. GST activity was also induced with the treatment of PVW in HT-29 cells. In addition GSH levels were increased with PVW. PVW inhibited ODC activity, a key enzyme of polyamine biosynthesis, which is enhanced in tumor promotion. These results suggest that Prunella vulgaris L. has colon cancer chemopreventive activity by inhibiting cytochrome P450 1A1 and ODC activities and by increasing phase Ⅱ enzyme activity and GSH levels. Key words : Prunella vulgaris L., cytochrome P450 1A1, quinone reductase, glutathione S-transferase, glutathione, ornithine decarboxylase 서론 암예방 (cancer chemoprevention) 은기존의항암제를이용한암세포의치료라는개념과는다른것으로, 암을연구하는데있어가장유망한영역의하나이다. 암발생은정상세포가외부의발암물질원에의해다단계로진행되며크게개시 (initiation), 촉진 (promotion), 그리고진행 (progression) 의세과정으로진행된다. 이러한다단계과정으로일어나는암발생과정 (carcinogenesis) 은여러가지천연물또는화학적화합물에의해억제되거나지연될수있다. 특히직장암은산업화된현대에서발병률과사망률이높은질병중의하나이며 1), 직장암발생은환경적요인의영향을많이받으므로암예방제재가직장암발생에미치는영향을살펴보는것은매우중요하다. 외부의발암물질은 phase Ⅰ 효소인 cytochrome P 450 효소에의해대사되어활성화된발암물질 (ultimate carcinogens) 로 교신저자 : 남경수, 경북경주시석장동 707, 동국대학교의과대학약리학교실 namks@dongguk.ac.kr, Tel : 접수 : 2007/09/19 채택 : 2007/11/26 바뀌어전자친화적물질 (electrophilic product), epoxides 또는매우독성이강한물질이된다 2). 따라서 cytochrome P450 효소의활성을억제시킬수있다면암예방의효과가있다. Quinone reductase (QR) 이나 glutathione S-transferase (GST) 와같은 phase Ⅱ 효소의유도는화학적인스트레스와암발생과정중의개시 (initiation) 단계에서돌연변이물질, 발암물질로부터세포를보호하는주요대사이다 3). 특히 QR은 quinone을환원시켜무독하게만들고, 발암물질에의해일어나는돌연변이와종양화효과를막아주는역할을한다. Glutathione (GSH) 는발암과정중개시단계에서 GSH의전자친화적인성질로인해외부물질이 DNA와결합하여암을유발하는것을막아준다. 또한촉진단계에서는산화적유리라디칼 (oxidative free radical) 의공격을제한함으로서발암과정을저해할수있다 4). Polyamine (putrescine, spermidine과 spermine) 은종양형성시비정상적으로생합성되며발암과정에밀접한관계가있다. Polyamine 생합성과정에서중요한효소는 putrescine의생성에관여하는 ornithine decarboxylase (ODC) 이며정상세포와종양세포의증식에필수적이다. 또한 ODC의유도는암촉진단계

2 (promotion) 에도중요한기능을담당하고있어생쥐의여러조직을이용한암촉진실험에서 ODC활성유도와발암물질의암촉진능력간의밀접한관계가보고되었다 5). 특히 ODC 활성유도가직장암발생과정에서도관찰되어졌다 6). 꿀풀하고초 ( 夏枯草 ) 는꿀풀과 ( 脣形科, Labiatae) 에속한다년생草本인꿀풀 (Prunellae Herba Vulgaris) 의지상부全草를일컫는다 7). 임상적으로는고한 ( 苦寒 ) 한성미로간화 ( 肝火 ) 를청설 ( 淸泄 ) 하여소종지통 ( 消腫止痛 ) 하고간화 ( 肝火 ) 가청설 ( 淸泄 ) 하게되면혈 ( 血 ) 이위쪽에공급되므로양간명목 ( 養肝明目 ) 의효과를겸하게된다고한다 8). 하고초의주성분은 triterpenoid, saponin, ursolic acid, rutin, hyperoxide, tannin, caffeic acid, alkaloid, vitamin B1, vitamin C, vitamin K, 칼륨염등이며, 그약리작용을살펴보면칼륨염, triterpenoid, ursolic acid 등은이뇨작용, tannin은수렴작용, alkaloid는진해지혈작용을한다고알려져있다 9). 본연구에서는꿀풀하고초물추출물이사람직장암세포 (HT-29) 에서의 phase I 효소인 cytochrome P450 1A1 효소활성과 phase II 효소인 QR과 GST 활성, GSH 함량및 ODC 활성에미치는영향을측정하여꿀풀하고초의직장암예방효능을살펴보고자한다. 재료및방법 1. 재료 1) 시약 RPMI 1640 medium, antibiotics, flavin adenine dinucleotide (FAD), 3-4,5- dimethylthiazol-2-yl-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT), β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (β-nadp), glucose-6-phosphate, glucose-6-phosphate dehydrogenase, menadione, sodium dodecyl sulfate, dicuomarol, crystal violet, NADP+, chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB), glutathione reductase, 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA), Na-EDTA, tert-butylhydroquinone(tbhq), ellagic acid, resveratrol, difluoromethylornithine(dfmo), 5, 5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB), Tris-HCl, bicinchoninic acid protein kit는 Sigma사 (St. Louis, MO, USA) 에서구입하였고, fetal bovine serum (FBS) 은웰진사 (Daegu, Korea) 제품을사용하였다. 기타세포배양용시약및추 출용유기용매는특급시약을사용하였다. 2) 꿀풀하고초물추출액의제조 꿀풀하고초는동국대학교부속한방병원에서구입하였고, 꿀 풀하고초의 voucher specimen(no. 00P-29) 은동국대학교난치병 한양방치료연구소에보관되어있다. 꿀풀하고초의물추출물은 생약 60 g을분쇄하여 3차증류수 400 ml 가한뒤 rotary evaporator (BUCHI RE121, Switzerland) 에서 3시간전탕하여추 출하고여과한후 4, 3,000 rpm에서 10분간원심분리하여얻은 상층액 200 ml을감압농축하여 ph 7.4로적정하였다. 그리고저 온에서 24시간방치하여 membrane filter (0.22 μm, Whatman. Germany) 로여과하고, 여과된열수추출액을 freezer dryer를이용하여완전건조시킨후건조중량 (4.58 g) 을측정하였다. 그리고실험조건에사용되는배지및증류수에희석시켜실험에사용하였다. 2. 방법 1) 세포배양사람직장암 HT-29 세포 (KCLB 30038) 를 10% FBS가포함된 RPMI 1640을배양액으로하여 CO 2 배양기 (5% CO 2, 37 ) 에서배양하였다. 세포는액체질소의기체상태 (-150 ) 에보존해두었다가같은 passage 번호를가진세포를녹여서실험에사용하였다. 2) 마이크로좀의분리 Sprague-Dawley계웅성흰쥐의간으로부터마이크로좀의분리는 Pohl과 Fouts 10) 의방법을참고하여실시하였다. 관류법을통하여 DMBA를처리하고 24시간뒤 5% KCl 완충용액으로간을 perfusion 시킨후적출하였다. 적출된간은 5% KCl 완충용액을첨가하여조직균질기에서마쇄하고 7,000 g에서 10 분간원심분리한후, 상층액을다시 77,000 g에서 60분간원심분리하였다. 형성된침전물은 0.05 M Tris-HCl buffer (ph 7.5) 에재현탁하여 microsome 분획으로실험에사용하였다. Microsomal protein 농도결정은 bicinchoninic acid protein kit로실시하였다. 3) Cytochrome P450 1A1의활성저해측정 Cytochrome P450 1A1는 ethoxyresorufin-o-deethylase (EROD) 활성으로측정하였다 11). 즉, microsomal protein (2 mg / ml ) 200 μl에 640 μl의 0.05 M Tris-HCl buffer (ph 7.5), 100 μl의 BSA (10 mg / ml ), 20 μl의 0.25 M MgCl 2, 40 μl의 cofactor solution, 2.5 unit의 glucose-6-phosphate dehydrogenase, 10 μl의 substrate (1 mg of ethoxyresorufin in 10 ml of methanol), 10 μl의하고초물추출액을농도별로첨가하였다. 모든시약들을잘섞은후, 37 에서 4분간반응시키고, 2 ml의 methanol로반응을종결시켰다. 2,000 g에서 20분동안원심분리하여상층액을취하고, 형광분광광도계 (SHIMADZU RF-5000, Kyoto, Japan) 로측정 (550 nm excitation, 585 nm emission) 하였다. 4) Quinone reductase (QR) 활성측정 HT-29 세포의 QR 활성은 Prochaska와 Santamaria의방법 12) 으로측정하였다. QR specific activity 계산은분당환원된 MTT 의흡광도와 crystal violet의흡광도에의해산출하였고, QR의활성유도는대조군의활성과시료에의한활성의비로계산하였다. 5) 세포내 glutathione S-transferase (GST) 활성측정 HT-29 세포의 GST 활성측정은윤 13) 등의방법으로실시하여 3분간흡광도의증가를 380 nm에서측정하였다. GST 활성은 slop/min/ mg protein으로계산하여시료를처리하지않은대조군의 GST 활성에대한시료를처리한 GST 활성의비로나타내었으며, 세포내총단백질은 bicinchoninic acid protein kit를사용하여그양을산출하였다. 6) 세포내 glutathione (GSH) 함량측정

3 손윤희ㆍ남경수 HT-29 세포내의총 GSH 함량은윤 13) 등의방법으로측정하였다. GSH 함량은 GSH 표준곡선으로계산하였고, nmol/ mg protein으로표시하였으며, GSH 함량의비는대조군에의한 GSH 양과시료에의해생성된 GSH 양의비율로측정하였다. 세포내총단백질은 bicinchoninic acid protein kit를사용하여그양을산출하였다. 7) Ornithine decarboxylase (ODC) assay 직장암세포 HT-29를 24-well tissue culture plate에 well 당 cells/ ml세포를접종시키고, 18시간후에 TPA와시료또는양성대조군인 0.01 mm difluoromethylornithine (DFMO) 을처리하여 6시간동안배양하여세척한후용해시키고 cell extract의 ODC 활성은 L-[1-14 C]ornithine에서 [ 14 C]CO 2 방출에의하여측정하였다 5). ODC 활성억제는 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) 만처리한조절군에대한각시료들의저해도정도를 percentage로나타내었다. 8) 통계학적처리 실험결과는평균 ± 표준편차 (standard deviation, SD) 로나타내었으며, 실험에대한유의성검정을위해 student's t-test를수행하여결과치는 p 값이 0.05 미만을통계학적으로의미있는것으로간주하였다. 결 과 1. Cytochrome P450 1A1의활성에미치는영향 Cytochrome P450 1A1 효소활성억제효과는암예방효과를의미하므로꿀풀하고초물추출물이 DMBA에의해유도된 cytochrome P450 1A1 효소활성억제율을측정한결과, 1, 5, 10 및 50 μg / ml에서각각 7.4%, 11.8%, 16.4% 와 20.9% 의저해율이나타났으므로 (Fig. 1), 꿀풀하고초물추출물이 cytochrome P450 1A1 활성을저해시키는데효과가있음을알수있었다. % of Inhibition RV Concentration (μg/ml) Fig. 1. Effect of water extract from Prunella vulgaris L. on DMBA-induced cytochrome P450 1A1 activity. RV, 0.05 nmole resveratrol. Experimental details are described in Material and Methods. Values represent mean±sd (n=3). The value of each group statistically significant as compared with control ( p<0.05, p<0.01). 2. Quinone reductase (QR) 활성에미치는영향 꿀풀하고초물추출물에의한 QR 활성유도효과를 HT-29 세포에서살펴본결과, 꿀풀하고초물추출물 1, 5, 10 과 50 μg / ml의각농도에서 8, 2, 6 및 0배의유도율을각각나타 내었다 (Fig. 2). 한편, 양성대조군으로사용한 50 μm tbhq에서 1배의활성유도율을나타내었으며, 꿀풀하고초물추출물 50 μg / ml (p<0.05) 농도에서통계적으로유의성있는활성유도율이관찰됨으로꿀풀하고초는 quinone에의한세포내독성및세포내 DNA 손상을제거할것으로추측된다. QR activity (treated/control) tbhq Fig. 2. Induction of quinone reductase (QR) activity in HT-29 cells by water extract from Prunella vulgaris L. tbhq, 50 μm tert-butylhydroquinone. Indicated values represent mean±sd (n=3). Values statistically significant compared with the control are marked as asterisks ( p<0.05). 3. Glutathione S-transferase (GST) 활성에미치는영향 꿀풀하고초물추출물에의한 GST 활성을관찰한결과, 50 μg / ml의농도에서대조군에비해 3배의유의성있는 (p<0.05) 활성유도율을보였고, 실험에사용된그밖의농도에서는뚜렷한유도효과를관찰할수없었다 (Fig. 3). GST activity (treated/control EA Fig. 3. Induction of glutathione S-transferase (GST) activity in HT-29 cells by water extract from Prunella vulgaris L. EA, 50 μm ellagic acid. Indicated values represent mean±sd (n=3). The value of each group statistically significant as compared with control ( p<0.05, p<0.01). 4. Glutathione (GSH) 생성에미치는영향 꿀풀하고초물추출물에의한 GSH 생성을살펴본결과, 10 μg / ml에서 5배 (p<0.05), 50 μg / ml농도를처리한세포에서 GSH 함량 0배 (p<0.01) 의유의성있는증가를나타내었다 (Fig. 4). 5. Ornithine decarboxylase (ODC) 활성에미치는영향 HT-29 세포현탁액에서꿀풀하고초물추출물이 TPA에의해서유도된 ODC 활성에미치는영향을살펴본결과, 꿀풀하고초물추출물농도 10 과 50 μg / ml (p<0.05) 에서 13.6 및 19.1% 의 ODC활성억제효과가나타났다 (Fig. 5)

4 GSH levels (treated/control tbhq Fig. 4. Increase of glutathione (GSH) levels in HT-29 cells by water extract from Prunella vulgaris L. tbhq, 50 μm tert-butylhydroquinone. Indicated values represent mean±sd (n=3). Values statistically significant compared with the control are marked as asterisks ( p<0.05, p<0.01, p<0.005). % of Inhibition DFMO Concentration (μg/ml) Fig. 5. Effect of water extract from Prunella vulgaris L. on TPA-induced ornithine decarboxylase (ODC) activity in human colorectal adenocarcinoma HT-29 cells. DFMO, 0.01 mm difluoromethylornithine. Indicated values represent mean±sd (n=3). Values statistically significant compared with the control are marked as asterisks ( p<0.05, p<0.01). 고 찰 Phase Ⅰ 효소인 cytochrome P450 효소유도는발암물질을활성화된발암물질 (ultimate carcinogens) 로바꾸기때문에암유발위험인자이다. 따라서 cytochrome P450 효소의활성을억제시킬수있다면암예방의효과가있을것이므로꿀풀하고초물추출물을이용하여 DMBA에의해유도된 cytochrome P450 1A1 효소의억제율을측정한결과, 효소의활성을저해함을관찰할수있었다. Cytochrome P450 1A1 활성을억제시키는물질로 vitamin A, phosphorothioate oligonucleotide 등의물질도알려져있다 14,15). QR은 quinone과 quinoneimines를환원시켜세포독성 (cytotoxicity) 으로부터세포를보호하며, 돌연변이유발및발암물질에의한종양효과로부터보호작용을한다. GST는외부이물질의대사과정중생성된친전자성대사산물을 GSH와결합하여용해되기쉬운수용성물질로만들어배설시키는효소로서, 세포질내에다량으로존재하며여러종류의 isozyme이밝혀져있다 16). 또한, 이효소는생체내의 GSH를기질로이용하여발암의직접적인원인이되는활성중간대사산물을제거함은물론항산화활성의역할도한다. 따라서, 암예방물질을검색하는데있어 서 GST는 phase Ⅱ enzyme 중의하나로서개시 (initiation) 단계의 biomarker로이용되고있다. 직장암세포주 HT-29에서의증가한 phase II 생체해독효소의활성증가는직장에서의직장암발생관련발암물질의활성을억제하여, 결과적으로직장암발생을억제할수있는것으로보고되었다 17). 그러므로꿀풀하고초물추출물은 phase II 생체해독효소의활성증가작용에의하여직장암발생의개시단계를저해할수있을것으로보인다. 환원형 glutathione (GSH) 또한암예방물질의스크린에사용된다. GSH는반응성이있는대사중간물로부터세포를보호한다. 발암과정의개시단계에서는 GSH의전자친화적인성질로인해외부물질이 DNA와결합하여암을유발하는것을막아준다. 진행 촉진의단계에서는 oxidative free radical의공격을제한함으로서발암과정을저해할수있다. 또한 GSH는외부의독성물질이세포내침입했을때직접반응하거나 GST에의해독성물질과결합하여무독하게하는기능을가지고있다. 본실험에서 GSH의생성이꿀풀하고초물추출물의농도에의존적으로증가하는경향을보였다. ODC는 polyamine 대사물생성에관여하는효소로서 polyamine은정상세포와종양세포의증식에필수적인성분이다. 또한 ODC 유도는암화과정의촉진에중요한기능을담당하고있어동물조직에서도암촉진물질들이 ODC 활성을유도하는것으로보고되었다 5). 특히직장암세포의성장과종양촉진자에대한직장암세포의생물학적반응에 polyamine과 ODC 활성이매우중요한요소임이증명되었다 18). 그러므로 ODC 활성저해제로작용하여 polyamine 함량을변화시킬수있는물질은직장암치료에사용할수있을것이다. 꿀풀하고초물추출물의 ODC 활성억제결과에의하면꿀풀하고초가직장암발생과정의촉진억제에의한암예방효과가있을것으로보인다. 결론 꿀풀하고초로물추출물을조제하여흰쥐의간마이크로좀 (microsome) 분획에서 cytochrome P450 1A1 활성, 사람직장암세포인 HT-29세포에서 QR과 GST의활성및 GSH의생성유도율을측정한결과, 꿀풀하고초물추출물은농도의존적으로 cytochrome P450 1A1 활성을저해하였다. 그리고 phase II 생체해독효소인 QR과 GST의활성및 GSH의생성을증가시켰으므로직장암발생 (carcinogenesis) 의개시 (initiation) 단계를저해할수있을것으로보인다. 또한직장암발생과정의촉진단계에관여하는 ODC 활성도저해하였으므로꿀풀하고초물추출물은직장암발생의개시단계와촉진단계에저해효과가있다. 그러므로꿀풀하고초는직장암발생에관련된더많은연구를통하여직장암예방제재로서개발가능성이있는것으로판단된다. 참고문헌 1. Parkin, D.M., Pisani, P., Ferlay, J. Estimates of the worldwide incidence of eighteen major cancers in Int

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