특허청구의범위 청구항 1 서열목록제 2 서열의아미노산서열로이루어진 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질. 청구항 2 상기제 1 항의 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을코딩하는핵산분자. 청구항 3 제 2 항에있어서, 상기핵산분자

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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 9/02 ( ) C12N 15/53 ( ) C12P 7/22 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2011 년 03 월 08 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 14 항 2011 년 03 월 08 일 (54) 발명의명칭신규한트랜스 - 아네솔산화효소 (57) 요약 (11) 공개번호 (43) 공개일자 2012년09월18일 (71) 출원인 광주과학기술원 광주광역시북구첨단과기로 123 ( 오룡동 ) (72) 발명자 허호길 광주광역시북구첨단과기로 123, 환경공학부 ( 오룡동, 광주과학기술원 ) 한동페이 광주광역시북구첨단과기로 123, 환경공학과 ( 오룡동, 광주과학기술원 ) 류지영 광주광역시북구첨단과기로 123, 환경공학과 ( 오룡동, 광주과학기술원 ) (74) 대리인 양부현 본발명에서트랜스-아네솔의산화적분해를촉진하는트랜스-아네솔유전자를최초로기술하였다. TAO는또한특정 1-프로페닐화합물에서알데하이드화합물을형성시킬수있다. TAO는신규의산화효소이며, 기질에대한입체선호적인산소공격을보여주었다. 또한, TAO는 NAD(P)H 의존산화효소이다. 트랜스-아네솔에대한전체반응의경로는도 6에서제시하였다. 기질범위가확장된 TAO의능력을고려하면, TAO는바닐린과같은방향족화합물을합성하는데매우유용할것이다. 대표도 - 도6-1 -

2 특허청구의범위 청구항 1 서열목록제 2 서열의아미노산서열로이루어진 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질. 청구항 2 상기제 1 항의 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을코딩하는핵산분자. 청구항 3 제 2 항에있어서, 상기핵산분자의염기서열은서열목록제 1 서열의뉴클레오타이드서열로이루어진것을특 징으로하는핵산분자. 청구항 4 상기제 2 항또는제 3 항의 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을코딩하는핵산분자를포함하는 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질발현용벡터. 청구항 5 상기제 4 항의벡터를포함하는형질전환체. 청구항 6 제 1 항에있어서, 상기 TAO 단백질은페닐프로파노이드화합물 (phenyl propanoid compounds) 의산화반응을 촉매 (catalyzing) 하는것을특징으로하는단백질. 청구항 7 다음의단계를포함하는벤즈알데하이드유도체의제조방법 : (a) 상기제 1 항의 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을준비하는단계 ; (b) 상기 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을하기화학식 1 또는 2의화합물과접촉시키는단계 ; 및 (c) 하기화학식 3 또는 4의벤즈알데하이드유도체를수득하는단계 ; 화학식 1-2 -

3 화학식 2 화학식 3 화학식 4 상기화학식 1 및 3 에서, R 1, R 2 및 R 3 은서로독립적으로수소, 하이드록실기및메톡시기이고, 상기화학식 2 및 4 에서, R 4 는 C 1 -C 2 알킬렌이고, R 5 는수소, 하이드록실기및메톡시기이다. 청구항 8 제 7 항에있어서, 상기화학식 1 또는 3 에서 R 2 는메톡시기인것을특징으로하는방법. 청구항 9 제 7 항에있어서, 상기화학식 2 또는 4 에서 R 4 는메틸렌기, R 5 는수소인것을특징으로하는방법. 청구항 10 제 7 항에있어서, 상기단계 (c) 는 NADH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Hydrogen), NADPH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Hydrogen), Mg(Ⅱ) 및타이론 (Tiron) 으로구성된군으로부터선택되는보조인자 (cofactor) 의존재하에서실시하는것을특징으로하는방법. 청구항

4 제 7 항에있어서, 상기 TAO 단백질은정제된단백질인것을특징으로하는방법. 청구항 12 제 7 항에있어서, 상기 TAO 단백질은감마프로테오박테리아 (Gamma-proteobacteria) 내에포함된것을특징으로 하는방법. 청구항 13 제 12 항에있어서, 상기감마프로테오박테리아 (Gamma-proteobacteria) 는슈도모나스 (Pseudomonas) 또는대장 균 (E. coli) 인것을특징으로하는방법. 청구항 14 제 13 항에있어서, 상기슈도모나스 (Pseudomonas) 는슈도모나스퓨티다 (Pseudomonas putida) 인것을특징으로 하는방법. 명세서 [0001] 기술분야 감마프로테오박테리아에서대사물질의변환반응에관여하는유전자에대한발명이다. [0002] [0003] [0004] 배경기술페닐프로파노이드계물질및미생물에의해변형된대사중간체는전통적으로향신료및향수산업에서아로마화학물질의화학합성에서출발재료로서이용되어왔다. 여러미생물에서프로페닐벤젠에서방향족알데하이드로변형시킬수있는능력을가지고있음이보고되었다 (3, 6, 7, 11, 14). 이러한신규의분리된박테리아는향료를생산하는데환경친화적인대체적대상임을보여주었다. 프로페닐벤젠이방향족알데하이드로생전환 (biotransformation) 되는것은프로페닐가지가알데하이드로산화되는것과관련된다. 어떤효소들은아이소유진올에서바닐린으로의전환에관여하고있음이알려졌다 (8,9). 트랜스-아네솔 ( 파라-메톡시프로페닐벤젠 ) 은예컨대, 스타아니스, 아니스열매기름및스위트펜넬과같이정유 (essential oils) 의주요구성요소의풍부한페닐프로파노이드화합물이다 (11). 이는베이킹, 사탕, 아이스크림, 껌및알콜음료에서향신물질로널리사용되었다 (5). 트랜스-아네솔은 1-프로페닐벤젠의한종류로서, 아이소유진올과동일하게 1-프로페닐기를가지구조로서포함한다. 따라서, 트랜스-아네솔생전환메커니즘에대한본연구가아이소유진올에서바닐린으로의전환을이해하는데기여를할것이다. 트랜스-아네솔을유일한탄소공급원으로사용할수있는오직두가지박테리아균주인, Arthrobacter sp.ta13 및 Pseudomonas 균주 JYR-1을분리하였다 (7, 10). 트랜스-아네솔-유도 TA13은파라-아니스알코올, 파라-아니스알데하이드, 파라-아니스산, 파라-하이드록시벤조산및프로토카테큐산을유일한탄소공급원으로사용하여성장할수있었다. 게다가, 균주 TA13의돌연변이체는많은양의세가지대사중간체인트랜스-아네솔다이올, 파라-아니스산및 4,6-다이카복시산염-2-피론을축적하였다. 4개의돌연변이체는파라- 아니스알콜및파라-아니스알데하이드를거의축적하지않았다. 따라서균주 TA13은에폭사이드및다이올을경유하여트랜스-아네솔에서아니스알콜로그후에아니스알데하이드로변형시키거나또는다이올에서아니스알데하이드로직접변환시킬것으로가정하였다. JYR-1 균주의신- 및안티-아네솔-2,3-에폭사이드인두개의입체이성질체에폭사이드는, 트랜스-아네솔의생전환이일어나는과정동안대사중간체로서확인되었다 (7). 파라-아니스산및파라-하이드록시벤조산도또한 JYR-1 균주의세포배양에서관찰되었다 (7). 두개의트랜스-아네솔분해균주는트랜스-아네솔뿐아니라트랜스-아네솔과구조적으로유사한방향족화합물로도변환된다. 균주 TA13은에스트라골 (estragole) 을이용할수있으나, 유진올, 아이소유진올, 사프롤또는아이소사프롤을유일한탄소공급원으로이용할수없다 (10). 그러나아이소유진올, 유진올, 아이소사프롤및사프 - 4 -

5 롤이있는글루코스에서자란균주 TA13은각기질을각기바닐린 (vanillin) 및바닐린산 (vanillic acid), 바닐린산및페룰산 (ferulic acid), 피페로닐산 (piperonylic acid) 및하이드록시차비콜 (hydroxychavicol) 로변환시켰다 (10). 사프롤 (safrole) 을제외한각화합물의대사산물은균주 TA13가프로페닐벤젠화합물의사슬의산화반응을시작할수있음을가리켰다 (10). 방향족고리 3번탄소에붙어있는메톡시기를제거하기위한디메틸라아제없이는아마벤젠고리의분해및방향족화합물의이용에방해될것이다 (10). 반면에, 균주 JYR-1은카페인산 (caffeic acid), 파라-쿠마르산 (p-coumaric acid) 뿐아니라, 유일한탄소공급원으로서벤젠고리의 3번탄소에연결된메톡시기를지니고있는아이소유진올및페룰산도사용할수있었다. 그러나균주 JYR-1은트랜스-아네솔에서자라는휴지세포 (resting cell) 에의해서는유진올을분해할수없었다. 이러한결과들은두박테리아균주사이에기질범위가다소차이가있음을시사한다. [0005] 본명세서전체에걸쳐다수의논문및특허문헌이참조되고그인용이표시되어있다. 인용된논문및특허문헌의개시내용은그전체로서본명세서에참조로삽입되어본발명이속하는기술분야의수준및본발명의내용이보다명확하게설명된다. 발명의내용 [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] [0011] [0012] 해결하려는과제다양한방향족화합물을대사하는박테리아의능력을고려하면, 트랜스-아네솔-분해유전자는아직발표되지않은신규한유전자일것이다. 본발명자들의이전연구에서트랜스-아네솔을유일한탄소공급원으로사용하고 100 mm까지높은농도의트랜스-아네솔조건에서성장할수있는균주 JYR-1를조사하였다 (7). 이번연구에서본발명자들은우선트랜스-아네솔의대사에관여하는유전자들을제시하고, 이들유전자들을균주 JYR-1의약 12-kb 구역에클러스터링하였다. 트랜스-아네솔산화효소 (trans-anethole Oxidase, TAO) 는 E.Coli에서트랜스-아네솔의대사과정의첫단계를시작하는과정에서이종적으로발현된다. TAO는트랜스-아네솔뿐아니라다른여러페닐프로파노이드화합물을기질로받아들일수있었다. 추론되는 TAO의아미노산서열은 TAO가지금까지보고된추정되는보존부위가아닌새로운산화효소로밝혀졌다. 따라서, 본발명의목적은 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을제공하는데있다. 본발명의다른목적은 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을코딩하는핵산분자를제공하는데있다. 본발명의또다른목적은 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을코딩하는핵산분자를포함하는 TAO(transanethole oxidase) 단백질발현용벡터를제공하는데있다. 본발명의다른목적은 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질발현용벡터를포함하는형질전환체를제공하는데있다. 본발명의또다른목적은 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을기질과접촉시켜벤즈알데하이드유도체의제조방법을제공하는데있다. [0013] 본발명의다른목적및이점은하기의발명의상세한설명, 청구범위및도면에의해보다명확하게된다. [0014] 과제의해결수단 본발명의일양태에따르면, 본발명은서열목록제 2 서열의아미노산서열로이루어진 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을제공한다. [0015] 트랜스 - 아네솔 ( 파라 - 메톡시프로페닐벤젠 ) 의 IUPAC 명은트랜스 -1 메톡시 -4-( 프로프 -1- 에닐 ) 벤젠 [trans-1- methoxy-4-(prop-1-enyl)benzene] 이다. 이는방향성이며, 불포화에터의구조이다. 화학적으로는물보다 - 5 -

6 에탄올에더잘녹으며, 스타아니스, 아니스열매기름및스위트펜넬과같이정유 (essential oils) 의주요구성요소로사용되고산업적으로는베이킹, 사탕, 아이스크림, 껌및알콜음료에서향신물질로널리사용된다. 트랜스-아네솔은 1-프로페닐벤젠의한종류로서, 프로페닐기의이중결합을중심으로양쪽의치환기가트랜스위치하고있는구조를가지고있다. 아네솔은시스, 트랜스이성질체의구조가모두존재하지만, 산업계에서보다널리이용되는구조는트랜스구조의아네솔이다. 아이소유진올과동일하게 1-프로페닐기를가지구조로서포함한다. [0016] [0017] [0018] [0019] 트랜스-아네솔은예컨대아네솔디싸이온 (anethole dithione, ADT), 아네솔트리싸이온 (nethole trithione, ATT) 과같은의약성분으로이용된다. 본명세서에서용어 TAO(trans-anethole oxidase, 트랜스-아네솔산화효소 ) 단백질 는트랜스-아네솔및그유도체의산화반응에관여하는옥시게나아제효소를의미한다. 한편, 본발명의 TAO 단백질은트랜스-아네솔의다양한유도체의산화반응을유도하여프로페닐기를알데하이드로산화시키도록유도할수있다. 바람직하게는본발명의 TAO 단백질은트랜스-아네솔, 아이소유진올, O-메틸아이소유진올, 아이소사프롤을산화하도록유도하여벤즈알데하이드유도체로생전환하는것을촉매한다. 본발명의바람직한구현예에따르면, 상기 TAO 단백질은미생물로부터유래된것이다. 보다바람직하게는상기 TAO 단백질은감마프로테오박테리아강 (gammaproteobacteria Class) 슈도모나달리스목 (Pseudomonadales Order) 슈도모나다지에과 (Pseudomonadaceae Family) 슈도모나스속 (Pseudomonas Genus) 미생물로부터유래된것이며, 가장바람직하게는감마프로테오박테리아강 (gammaproteobacteria Class) 슈도모나달리스목 (Pseudomonadales Order) 슈도모나다지에과 (Pseudomonadaceae Family) 슈도모나스속 (Pseudomonas Genus) 슈도모나스퓨티다종 (P. putida Species) JYR-1종에서유래된것이다. [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] 본발명의다른양태에따르면, 본발명은 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을코딩하는핵산분자를제공하는데있다. 본명세서에서용어 핵산분자 는 DNA(gDNA 및 cdna) 그리고 RNA 분자를포괄적으로포함하는의미를갖으며, 핵산분자에서기본구성단위인뉴클레오타이드는자연의뉴클레오타이드뿐만아니라, 당또는염기부위가변형된유사체 (analogue) 도포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90: (1990)). 본발명의 TAO 단백질의기본적인특성및활성을갖도록하는변이를갖는다면, 본발명의 TAO는첨부한서열목록에기재된아미노산서열또는뉴클레오타이드서열에한정되지않는다는것은당업자에게명확하다. 뉴클레오타이드에서의변이는단백질에서변화를가져오지않는것도있다. 이러한핵산은기능적으로균등한코돈또는동일한아미노산을코딩하는코돈 ( 예를들어, 코돈의축퇴성에의해, 아르기닌또는세린에대한코돈은여섯개이다 ), 또는생물학적으로균등한아미노산을코딩하는코돈을포함하는핵산분자를포함한다. 또한, 뉴클레오타이드에서의변이가 TAO 자체에변화를가져올수도있다. TAO의아미노산에변화를가져오는변이인경우에도본발명의 TAO와거의동일한활성을나타내는것이얻어질수있다. 본발명의 TAO 범위에포함될수있는생물학적기능균등물은본발명의 TAO와균등한생물학적활성을발휘하는아미노산서열의변이에한정될것이라는것은당업자에게명확하다. 이러한아미노산변이는아미노산곁사슬치환체의상대적유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기등에기초하여이루어진다. 아미노산곁사슬치환체의크기, 모양및종류에대한분석에의하여, 아르기닌, 라이신과히스티딘은모두양전하를띤잔기이고 ; 알라닌, 글라이신과세린은유사한크기를갖으며 ; 페닐알라닌, 트립토판과타이로신은유사한모양을갖는다는것을알수있다. 따라서, 이러한고려사항에기초하여, 아르기닌, 라이신과히스티딘 ; 알라닌, 글라이신과세린 ; 그리고페닐알라닌, 트립토판과타이로신은생물학적으로기능균등물이라할수있다. 변이를도입하는데있어서, 아미노산의소수성인덱스 (hydropathic idex) 가고려될수있다. 각각의아미노산은소수성과전하에따라소수성인덱스가부여되어있다 : 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인 / 시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메 - 6 -

7 이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및아르기닌 (- 4.5). [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] 단백질의상호적인생물학적기능 (interactive biological function) 을부여하는데있어서소수성아미노산인덱스는매우중요하다. 유사한소수성인덱스를가지는아미노산으로치환하여야유사한생물학적활성을보유할수있다는것은공지된사실이다. 소수성인덱스를참조하여변이를도입시키는경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다바람직하게는 ± 1 이내, 보다더바람직하게는 ± 0.5 이내의소수성인덱스차이를나타내는아미노산사이에치환을한다. 한편, 유사한친수성값 (hydrophilicity value) 을가지는아미노산사이의치환이균등한생물학적활성을갖는단백질을초래한다는것도잘알려져있다. 미국특허제4,554,101호에개시된바와같이, 다음의친수성값이각각의아미노산잔기에부여되어있다 : 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트 (+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 친수성값을참조하여변이를도입시키는경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다바람직하게는 ± 1 이내, 보다더바람직하게는 ± 0.5 이내의친수성값차이를나타내는아미노산사이에치환을한다. 분자의활성을전체적으로변경시키지않는단백질에서의아미노산교환은당해분야에공지되어있다 (H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장통상적으로일어나는교환은아미노산잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의교환이다. 상술한생물학적균등활성을갖는변이를고려한다면, 본발명의 TAO 단백질또는핵산분자는서열목록에기재된서열과실질적인동일성 (substantial identity) 을나타내는서열도포함하는것으로해석된다. 상기의실질적인동일성은, 상기한본발명의서열과임의의다른서열을최대한대응되도록얼라인하고, 당업계에서통상적으로이용되는알고리즘을이용하여얼라인된서열을분석한경우에, 최소 40% 의상동성, 보다바람직하게는최소 50% 의상동성, 가장바람직하게는최소 60% 의상동성을나타내는서열을의미한다. 서열비교를위한얼라인먼트방법은당업계에공지되어있다. 얼라인먼트에대한다양한방법및알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: (1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: (1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994) 에개시되어있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990)) 은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서접근가능하며, 인터넷상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와같은서열분석프로그램과연동되어이용할수있다. BLSAT는 에서접속가능하다. 이프로그램을이용한서열상동성비교방법은 [0033] [0034] [0035] 본발명의또다른양태에따르면, 본발명은 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을코딩하는핵산분자를포함하는 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질발현용벡터를제공하는데있다. 본명세서에서사용되는용어, " 벡터 (vector)" 는외부의유전물질을다른세포로옮기는데사용되는전달수단인 DNA 분자이다. 대표적으로플라스미드벡터, 박테리오파아지벡터, 코스미드벡터, 인공염색체를이용한벡터 ( 예컨대, YAC, BAC) 등이존재한다. 벡터를이용하여원하는유전물질을대량발현하는데있으므로벡터로서의기능을하기위해필요한공통요소가존재하는데, 복제원점 (Replication Origin), 여러제한효소자리 (Multicloning site), 선택표지 (selective marker) 가반드시존재하여야한다. 벡터그자체는 DNA 염기서열로이식할유전자 (transgene) 과벡터백본 (backbone) 을포함한다. 본발명의벡터는전형적으로클로닝을위한벡터또는발현을위한벡터로서구축될수있다. 또한, 본발명의벡터는원핵세포또는진핵세포를숙주로하여구축될수있다. 본발명의핵산분자가원핵세포유래이고, 배양의편의성등을고려하여, 원핵세포를숙주로하는것이바람직하다. 본발명의벡터는전형적으로클로닝을위한벡터또는발현을위한벡터로서구축될수있다

8 [0036] 예를들어, 본발명의벡터가발현벡터이고, 원핵세포를숙주로하는경우에는, 전사를진행시킬수있는강 λ λ 력한프로모터 ( 예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacuv5 프로모터, lpp 프로모터, p L 프로모터, pr 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, reca 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터및 T7 프로모터등 ), 해독의개시를위한라이보좀결합자리및전사 / 해독종결서열을포함하는것이일반적이다. 숙주세포로서 E. coli 가이용되는경우, E. coli 트립토판생합성경로의프로모터및오퍼레이터부위 (Yanofsky, C., J. λ Bacteriol., 158: (1984)) 그리고파아지 λ의좌향프로모터 (p L 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14: (1980)) 가조절부위로서이용될수있다. [0037] [0038] [0039] 한편, 본발명에이용될수있는벡터는당업계에서종종사용되는플라스미드 ( 예 : pta163, psc101, ColE1, pbr322, puc8/9, phc79, puc19, pet, pegfp, pcr 등 ), 파지 ( 예 : λgt4λb, λ-charon, λδz1 및 M13 등 ) 또는바이러스 ( 예 : SV40 등 ) 를조작하여제작될수있다. 한편, 본발명의벡터가발현벡터이고, 진핵세포를숙주로하는경우에는, 포유동물세포의지놈으로부터유래된프로모터 ( 예 : 메탈로티오닌프로모터 ) 또는포유동물바이러스로부터유래된프로모터 ( 예 : 아데노바이러스후기프로모터, 백시니아바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스프로모터및 HSV의 tk 프로모터 ) 가이용될수있으며, 전사종결서열로서폴리아데닐화서열을일반적으로갖는다. 한편, 본발명의벡터는선택표지로서, 당업계에서통상적으로이용되는항생제내성유전자를포함하며, 예를들어암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신및테트라사이클린에대한내성유전자가있다. [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] 본발명의또다른양태에따르면, 본발명은상술한본발명의벡터에의해형질전환된형질전환세포를제공한다. 명세서에서사용되는용어, " 형질전환 " 은외부로부터주어진유전물질에의하여생물의유전적인성질이변하는것을말한다. 형질전환은폐렴쌍구균, 대장균등의박테리아에서주로일어나지만, 최근에는많은실험들을통해식물이나동물등에새로운유전자를이식하는방식도가능해지고있다. 본발명의벡터를안정되면서연속적으로클로닝및발현시킬수있는숙주세포는당업계에공지되어어떠한숙주세포도이용할수있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스서브틸리스, 바실러스츄린겐시스와같은바실러스속균주, 그리고살모넬라티피무리움, 세라티아마르세슨스및다양한슈도모나스종과같은장내균과균주등이있다. 또한, 본발명의벡터를진핵세포에형질전환시키는경우에는숙주세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포및사람세포 ( 예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 ) 등이이용될수있다. 본발명의벡터를숙주세포내로운반하는방법은, 숙주세포가원핵세포인경우, CaCl 2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: (1973)), 하나한방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: (1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: (1983)) 및전기천공방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16: (1988)) 등에의해실시될수있다. 또한, 숙주세포가진핵세포인경우에는, 미세주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: (1985)), 및유전자밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: (1990)) 등에의해벡터를숙주세포내로주입할수있다. [0045] [0046] 본발명의다른양태에따르면, 본발명은다음의단계를포함하는벤즈알데하이드유도체의제조방법을제공 한다 : (a) TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을준비하는단계 ; - 8 -

9 [0047] [0048] [0049] (b) 상기 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을하기화학식 1 또는 2 의화합물과접촉시키는단계 ; 및 (c) 하기화학식 3 또는 4 의벤즈알데하이드유도체를수득하는단계 ; 화학식 1 [0050] [0051] 화학식 2 [0052] [0053] 화학식 3 [0054] [0055] 화학식 4 [0056] [0057] [0058] [0059] 상기화학식 1 및 3 에서, R 1, R 2 및 R 3 은서로독립적으로수소, 하이드록실기및메톡시기이고, 상기화학식 2 및 4 에서, R 4 는 C 1 -C 2 알킬렌이고, R 5 는수소, 하이드록실기및메톡시기이다. 본발명의바람직한구현예에따르면, 상기화학식 1 또는 3 에서 R 1, R 2 및 R 3 은하이드록실기및메톡시기이고, 화학식 2 또는 4 에서 R 4 는메틸렌기, R 5 는하이드록실기, 수소인것을포함하며, 가장바람직하게는상기화학식 1 또는 3 에서 R 2 는메톡시기인것을특징으로하며, 화학식 2 또는 4 에서 R 4 는메틸렌기, R 5 는수소인것을포함 한다. [0060] 본발명의바람직한구현예에따르면, 상기단계 (c) 는 NADH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Hydrogen), NADPH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Hydrogen), Mg(Ⅱ) 및타이론 (Tiron) 으로구성된군으로 부터선택되는보조인자 (cofactor) 의존재하에서실시하는것을특징으로하는방법을제공한다

10 [0061] [0062] 명세서에서사용되는용어, NADH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Hydrogen) 은여러보조인자 (cofactor) 중에하나로서, 효소의비단백질구성요소로효소활성을증대시키는데필요하다. 살아있는세포에서발견되고, 아데닌염기와니코티나마이드의두종류의염기로구성된디뉴클레오타이드는인산기로연결되어있다. 대사과정에서 NADH는산화환원반응 (redox reaction) 에관여하여, 전자를운반하는 운반체의역할을한다. NAD + 는산화제로한분자에서전자를받아들이면서 NADH의환원형의구조로변환되어다른분자를환원시키는환원제의역할을담당한다. 또한전사후변형 (posttranslational modifications) 과정에서 NADH는효소에결합한기질 (substrate) 을떼어내거나, 반대로효소에기질을결합시킬수있어의약개발에서 NAD + 대사과정이관여되는효소를타킷으로하는연구가진행중이다. [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] 명세서에서사용되는용어, NADPH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Hydrogen) 은 NADH의리보오스고리의 2번탄소에인산기가부착된구조를가진여러보조인자 (cofactor) 중에하나로서, 효소의비단백질구성요소로효소활성을증대시키는데필요하다. 동화작용 (anabolism), 지질및핵산합성에관여하여다른분자를환원시키는환원제의역할을담당한다. 명세서에서사용되는용어, Tiron 은 IUPAC 명이 sodium 4,5-dihydroxybenzene-1,3-disulfonate이며우라늄, 철 (Ⅲ) 과같은독성이높은금속과결합하여세포독성을감소시키는킬레이터로작용한다. 본발명에서 Tiron은 Fe(Ⅲ) 을포획하는킬레이터로이용되어금속의 cofactor로서의역할이적절하게작용하는지확인하는데이용된다. 본발명의바람직한구현예에따르면, 상기 TAO 단백질은정제된단백질인것에서벤즈알데하이드유도체의제조방법을제공한다. 본발명의바람직한구현예에따르면, 상기 TAO 단백질은감마프로테오박테리아 (gammaproteobacteria) 내에서벤즈알데하이드유도체의제조방법을제공한다. 명세서에서사용되는용어, 감마프로테오박테리아 (gammaproteobacteria) 는프로테오박테리아계 (proteobacteria Phylum) 중의주요한강 (Class) 의하나로 16S rrna의서열의차이로알파프로테오박테리아 (alphaproteobacteria), 베타프로테오박테리아 (betaproteobacteria), 감마프로테오박테리아 (gammaproteobacteria), 델타프로테오박테리아 (deltaproteobacteria), 입실론프로테오박테리아 (Elsilonproteobacteria), 제타프로테오박테리아 (Zetaproteobacteria) 로구분된다. 모든감마프로테오박테리아는그람음성균으로, 외막은주로지질다당류 (lipopolysaccharides) 로구성되며, 플라겔라 (flagella) 또는글라이딩 (gliding) 을이용하여운동성을가진다. 대사작용은주로혐기성 (anaerobic), 화학적독립영양 (chemoautotrophs) 및종속영양성에의한방식으로영양공급을받는다. 감마프로테오박테리아종류는 Achromatiaceae, Aeromonadaceae, Alteromonadaceae, Azotobacteraceae, Beggiatoaceae, Branhamaceae, Chromatiaceae, Ectothiorhodospiraceae, Enterobacteriaceae(Escherichia coli), Erwinia, Halomonadaceae, Legionellaceae, Leucotrichaceae, Lysobacteraceae, Methylococcaceae, Moraxellaceae, Nevskiaceae, Oleiphilaceae, Pasteurellaceae, Phlomobacter, Pseudomonadaceae, Succinivibrionaceae, Thiocapsaceae, Vibrionaceae, Xanthomonadaceae 등으로분류할수있다. 보다바람직하게는, Escherichia 및 Pseudomonadaceae 이며가장바람직하게는 E.coli BL21(DE3) 및 Pseudomonas putida이다. E.coli BL21(DE3) 는 lac 프로모터에 T7 중합효소를인코딩하는시퀀스를가지고있어, IPTG 등을이용하여 lac 프로모터를유도하면 T7 중합효소가만들어지고 pet 또는 prset 등과같은발현벡터의재조합된단백질유전자를발현시키는데주로이용되는시스템중에하나이다. 독성이존재하는경우적은양으로도대장균이잘자라지못하도록할수있기때문에이를조절하는시스템이필요하며 lac 프로모터와 T7 프로모터의조합을통해유도가안된상태에서외래단백질의발현을효과적으로억제하는데박테리오파지람다의 DE3 라이소젠을발현시킨다. Pseudomonas putida는막대구조의그람음성균이며, 16S rrna 분석을통한분류학적기준으로 P. putida종에속한다. P. putida의용도는생물적환경정화 (bioremediation) 또는기름을생분해하는미생물의이용되어스타이렌을생분해될수있는 PHA로변환시킨다. P. putida는인간에게병원을일으키는것으로알려진 P. aeruginosa와달리안전한박테리아균주이다

11 [0073] [0074] [0075] [0076] 발명의효과본발명의특징및이점을요약하면다음과같다 : (a) 본발명은신규서열의 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질서열을제공한다. (b) 본발명의 TAO 단백질은대사과정에서중요한중간체로전환되도록페닐프로파노이드화합물 (phenyl propanoid compounds) 의산화반응을촉매 (catalyzing) 하는것을특징으로하는단백질을제공한다. (c) 본발명의 TAO 단백질에의해대사과정에서중요한중간체로전환되도록페닐프로파노이드화합물 (phenyl propanoid compounds) 의산화반응에의한벤즈알데하이드유도체의제조방법을제공한다. [0077] 도면의간단한설명도 1은슈도모나스퓨티다 JYR-1의 20-kb 구역의유전자배열로. 14개중 5개의 ORF가트랜스-아네솔에서프로토카테큐산으로의대사과정에관여하는것으로예상되고, 관여되는유전자는각각파라-아니스산탈메틸화효소, 환원효소 (ania), 파라-아니스산탈메틸화효소 (anib), 트랜스-아네솔산화효소 (tao), 파라-아니스알데하이드탈수소화효소 (adh) 및파라-하이드록시벤조산염수산화효소 (pbh) 이고 tao 유전자에표기된세개의화살표는 Tn5가삽입부위임을보여주는그림이다. 도 2는 E. coli BL21(DE3)(pET-TAO) 에서트랜스-아네솔로부터형성되는대사물질의 HPLC 용출프로파일로패널 (A) 는 E. coli BL21(DE3)(pET-TAO) 와트랜스-아네솔이반응후 40분후측정한용출프로파일이고, 패널 (B) 는 6시간후측정한용출프로파일이며, 패널 (C) 는 E. coli BL21(DE3)(pET21-a) 와트랜스-아네솔의반응시측정값이고, 패널 (D) 는비교화합물인트랜스-아네솔및파라-아니스알데하이드와의반응으로측정된데이터를보여주는그림이다. 도 3은 E. coli에서발현된 TAO의휴지세포에의한트랜스-아네솔의생전환운동론으로, E. coli BL21(DE3)(pET-TAO)( 솔리드심볼 ) 의휴지세포와열로살균처리한 E. coli( 오픈심볼 ) 를트랜스-아네솔과함께 360분간배양하였다. 트랜스-아네솔및파라-아니스알데하이드은각각사각형과삼각형으로나타내었다. 도 4는 E. coli에서발현된에의한트랜스-아네솔에서파라-아니스알데하이드로의전환에대한액체크로마토그래피질량분석으로, 패널 (A) 는 16 O 2, H 2 O 16 에서배양한결과의그래프이고, 패널 (B) 는 18 O 2, H 2 O 16 에서배양한결과의그래프이고, 패널 (C) 는 16 O 2, H 2 O 18 에서배양한결과의그래프, 패널 (D) 는비교화합물파라-아니스알데하이드가존재할때의질량분석수치를나타낸그림이다. 도 5는 TAO에의해촉매되는트랜스-아네솔의산화적분해의제안된메커니즘으로패널 (A) 는 16 O 2, H 2 O 16 에서, 패널 (B) 는 18 O 2, H 2 O 16 에서, 패널 (C) 는 16 O 2, H 2 O 18 에서배양할때의방사성동위원소 ( 18 O) 로표지된산소가삽입된위치를보여주는그림이다. 도 6은균주 JYR-1에의한트랜스-아네솔의제안된대사경로이며, 반응경로에관여할것으로예상되는유전자들을진한이탤릭체로기술하였고, 이들이탤릭체로표기된유전자는트랜스-아네솔산화효소 (tao), 파라-아니스알데하이드탈수소화효소 (adh), 파라-아니스산탈메틸화효소 (aniab) 및파라-하이드록시벤조산염수산화효소 (pbh) 를보여주는그림이다. [0078] 발명을실시하기위한구체적인내용이하, 실시예를통하여본발명을더욱상세히설명하고자한다. 이들실시예는오로지본발명을보다구체적으로설명하기위한것으로, 본발명의요지에따라본발명의범위가이들실시예에의해제한되지않는다는것은당업계에서통상의지식을가진자에있어서자명할것이다. [0079] 실시예

12 [0080] [0081] [0082] [0083] 실험재료및실험방법플라스미드, 박테리아균주및성장환경본발명에서이용되는모든플라스미드와박테리아균주는표 1에나열하였다. Pseudomonas putida JYR-1는 25 에서 10 mm의트랜스-아네솔이함유된 TSB(tryptic soy broth) 배지또는 MSB(Stanier s minimal salt broth) 배지 (12) 에접종하여강한진탕 (200 rpm) 조건으로배양시켰다. 균주 Escherichia coli는 37 에서 LB 배지에접종하여일반적인조건에서배양시켰다. 필요한때에, 50 /ml의앰피실린 (Amp), 50 /ml의카나마이신 (Kan) 및 12.5 /ml의클로로암페니콜을 E.Coli 선별에사용하였다. [0084] [0085] [0086] 화학물질트랜스-아네솔, 파라-아니스알데하이드, 아이소유진올, 유진올, 프로페닐구아에솔, O-메틸아이소유진올, 아이소사프롤, 신남산, 페룰산및 4-쿠마르산은 Sigma-Aldrich(Milwaukee, WI) 에서구입하였다. 유기용매 (LPLC 등급 ) 은 Fisher Scientific(Fair Lawn, NJ) 에서구입하였다. [0087] [0088] [0089] 유전자라이브러리컨스트럭션및스크리닝 Pseudomonas putida JYR-1의 genomic DNA은제조사의지침에따라 Qiagen DNA 완충용액세트및 Genomic-tip 100/G(Qiagen, Valencia, CA) 을이용하여추출하였다. 대략 40-kb의 genomic DNA 절편을만들었고 fosmid 라이브러리는제조사의지침에따라 EpiFOSTM Fosmid Library Production Kit(Epicentre Biotechnologies, Madison, WI) 를이용하여제작하였다. 600개의클로로암페니콜저항성클론을선별하였다. 클론 10개를 20 ml의 LB 배지및 500 트랜스-아네솔이포함된위액용기 (serum bottle) 안으로접종하였다. 세포들을 30 에서밤새도록 200 rpm에서진탕배양하였다. LB 배지에서트랜스-아네솔및그의대사산물을추출하기위해동일부피의에틸에세테이트를용기에첨가하였으며, 10분동안 120 rpm에서수직진탕하였다. 추출물 (4 ml) 을 Speed vaccum (Vision Scientific Co. 수원, 대한민국 ) 에서건조시키고, 0.5 ml의메탄올에용해시키고아래에기술한고성능액체크로마토그래피 (high performance liquid chromatography, HPLC) 로분석하였다. [0090] pta163 의 Tn5 돌연변이유발및돌연변이체의스크리닝 [0091] 트랜스 - 아네솔을대사할수있는클론하나를클론 TA163 으로지정하였다. pta163 클론으로부터 pta163 의플라 스미드 DNA를제작하여제조사의지시에따라EZ-Tn5 TM <KAN-2> Insertion Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) 의트랜스포손과함께반응시켰다. pta163이삽입된 Tn5는 E. coli TransdorMax EC100 (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI) 에전기천공방식에의해형질전환되었다. 클론이삽입된트랜스포손을 Kan(50 μg/ml) 및 Chl(12.5 μg/ml) 이포함된 LB 아가플레이트에서선별하였다. [0092] [0093] 트랜스-아네솔의분해를못하는돌연변이체를스크리닝하기위해, 각돌연변이체를항생제가포함된 LB 미디어에접종시켜밤새도록배양하였고, 휴지세포를 10분동안 10,000g에서원심분리하여분리하고 20 mm의인산완충용액 (ph 7.0) 에두번세척하였다. 2 mm 트랜스-아네솔과함께현탁세포를 25 에서 200 rpm에서진탕배양하였다. 에틸아세테이트를반응혼합물에첨가하였고, Speed vacuum로건조시켰다. 나머지를메탄올에용해시키고 HPLC를이용하여분석하였다. Tn5 트랜스포손삽입자리를확인하기위해, 트랜스-아네솔로변형시키는능력을잃어버린클론 pta163-1c, pta163-3a 및 pta163-7c를 Ez-Tn5 <KAN-2> 트랜스포손-특이적프라이머 ( 유발인자키트에서 KAN-2 FP-1 정방향프라이머및 KAN-2 RP-1 역방향프라이머 Tn5 돌연변이유발인자를받음 ) 를이용하여시퀀싱하였다. 트랜스포손은 ORF 10의 119번째, 438번째, 682번째염기에삽입되었는데, Tn5 트랜스포손은트랜스-아네솔의첫단계에관여하는것을시사한다

13 [0094] [0095] [0096] ORF 10, 트랜스-아네솔산화효소 (TAO) 의서브클로닝 ORF 10을클로닝하기위해, NdeI 인식부위 (5'- GGGAATTCCATATGGAGGACATCATGCAAGGC -3') 에붙어있는정방향프라이머를이용하여 BamHI 인식부위 (5'-CGCGGATCCTCAGTTAGTCCTCAAGTCGGAATT-3') 에붙어있는역방향프라이머PCR을진행하였다. pg-tao을얻고 E. coli DH5α에형질전환하기위하여 pgem-teasy vector(promega, Madison, WI) 에 PCT 생성물을클로닝하였다. pg-tao은제한효소 NdeI 및 BamHI을이용하여절단하고이후 tac 프로모터에의해조절되는pET21-a vector(novagen, Madison, WI) 에결합하였다. 플라스미드 pet-tao를 E. coli BL21(DE3)(Novagen, Madison, WI) 내부에형질전환시켰다. 대조실험으로, 카나마이신저항유전자, puc4k 벡터에서클로닝된 KanR2 절편을 pet-tao 벡터로옮기고 tao 유전자의 PstI 부위에삽입하였다. 카나마이신내성유전자를갖는 tao 유전자블로킹 pet-taob 벡터를 E. coli BL21(DE3) 에형질전환하였다. [0097] [0098] [0099] 트랜스-아네솔생전환의속도론. E. coli BL21(DE3)(pET-TAO) 를 LB 배지에서 37 에서밤새도록진탕 (200 rpm) 배양하였다. 세포 (1% (v/v)) 를새로운 LB 미디어로옮기고 37 에서 2시간반동안배양시키고, 20 에서 30분동안추가적인진탕 (150 rpm) 배양시켰다. IPTG가최종농도가 1 mm이되도록첨가하였고, TAO의발현을 12시간동안유도하였다. 세포를 10,000g로 10분동안원심분리하여분리하였고, MSB(Steiner's basal medium) 배지에현탁하였다. 세포를 10,000 x g, 4 에서 10분동안원심분리하여수집하고 MSB(Steiner's basal medium) 에현탁하였다. 두번반복후, 최종적으로세포를 MSB 배지에재현탁하였고, 흡광도는 600 nm에서 2까지조정하였다. 에너지원으로서 0.5 mm 글루코스를추가한휴지기현탁액에 5 mm의트랜스-아네솔 ( 메탄올에서만든모액 (stock solution) 100 mm로부터 ) 과반응시켰다. 25 에서 4시간동안진탕하여반응시켰고, 세배의에틸아세테이트로반응용액을추출하였다. 에틸아세테이트추출물은 Speed Vacuum으로증발시키고, 남은것을적정량의메탄올에용해시켜폴리비닐리딘플루오라이드 (PVDF) 로채워진주사기필터에여과시켰다. 남은트랜스-아네솔의양및 TAO에의해형성된파라-아니스알데하이드양은 HPLC를통해측정하였다. TAO의기질스펙트럼을조사하기위해, 트랜스-아네솔과유사한화합물을 100 mm의농도로메탄올에서만들고, 이를최종농도 1 mm에 0.5 mm 글루코스가들어있는세포현탁액에첨가하였다. 상기조건하에서 4시간동안반응한후에화합물을상기기술한방법으로추출하여 HPLC로분석하였다. 각대사산물은, 비교화합물을이용하여 UV 스펙트럼및 LC-MS의비교로동정하였다. [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] 세포추출물및효소어세이 E. coli BL21(DE3)(pET-TAO) 를배양하여상기기술한바와같이 tao 유전자를유도하였다. 세포를분리하여 20 mm Tris 완충용액 (ph 8.0) 으로두번세척하였고실험에사용하기전에 -70 에보관하였다. 세포펠렛 ( 습량 10 g) 을 10% 글리세롤 (TG 완충용액 ) 이함유된 20 mm의 Tris(pH 8.0) 20 ml에재현탁시켰고, 70% 진폭으로울트라소니케이터 (Cole-Parmer, Chicago, IL, USA) 를 20분동안 (3.0 S on 및 9.0 S off) 세포를파쇄하고, 30분간 4 18,000 g에서두차례의원심분리를통해추출물을얻었다. 세포추출물을 5배의 TG 완충용액으로묽히고 Amicon YM-10 멤브레인 (Millpore, Bedford, MA) 을통과시키는초미세여과방식을이용하여농축시켰으며이후 4 에서한차례반복시행하였다. 30 에서 1 mg의단백질이들어있는 20 mm Tris-Cl(pH 8.0) 및메탄올에용해된 1 mm의트랜스-아네솔을총부피 1 ml로하여 TAO 어세이를수행하였다. 한외여과된세포추출물을반응용액에첨가하여 30 에서 5분동안사전배양하였고 1분간배양하였다. 트랜스-아네솔을첨가하여반응을개시시켰고 30 에서 10분동안수행하였고, 1 ml의메탄올을첨가하여정지시켰다. 효소용액을 4 에서 13,000g로 20분간원심분리하여, 생성된파라-아니스알데하이드의양을측정하기위해상층액을 HPLC로분석하였다. [0105] [0106] 분석방법 광다이오드어레이검출기 (Varian, Walnut Creek, CA) 가장착된 Varian ProStar HPLC 및역상 C18 컬럼 ( 입자

14 크기 : 5 μm, 4.6 mm 25 cm, Milford, MA) 이용하여분석용 HPLC를수행하였다. 0.1% 폼산및물이함유된아세토나이트릴로구성된이동상을다음과같이계획하였다 : 시작시 10% 아세토나이트릴, 10분에 60% 아세토나이트릴, 20분에 90% 아세토나이트릴, 30분에 90% 아세토나이트릴. 10 μl을주입하는데유속은 1 ml/min이었고, UV 검출은 270 nm에서검출하였다. [0107] [0108] LC/MS를 Alliance 2695 LC system(waters Corporation, Milford, MA) 을 positive 모드의전자분사이온화 (electrospray ionization, ESI+) 하는 Quattro LC 트리플사중극자이중질량분석기 (Waters, Milford, MA) 와결합하여측정하였다. LC 분석을위해, SunFire C18 컬럼 (3.5 m, 2.1 x 150 mm, Waters) 를이용하였고, 이동상, 용출단계및검출은상기기술한분석용 HPLC과동일하였다 ; 유속은 0.2 ml/min이었다. MS 분석을위해, 공급원온도, 용매제거온도및캐필러리전압은각각 150, 350 및 3.2 kv로유지하였다. con 전압은 20 V였다. con 가스및용매제거가스는각각 30 l/hr 및 500 l/hr인초순수질소세트였다. 단백질농도는 Bio-Rad protein assay(bio-rad, Richmond, CA) 와함께브래포드어세이방법을이용하여측정하였으며, 소혈청알부민을표준으로삼았다. [0109] 18 O2 및 H 2 O 18 배양 [0110] 18 O2 배양을두주사기가연결된닫힌시스템에서수행하였다. 시스템을닫기전에질소가스로반응완충용 액에서공기를모두제거하였다. 한주사기를이용하여, 총부피의 50% 의질소가스를추출하였고, 다른주사 기로추출한부피에해당하는 18 O 2 가스를주입하였다. 마지막으로, 대략 1:1 로 N 2 : 18 O 2 비율을인위적인공기 조성을포함하는시스템을구성하였다. 휴지세포및 1 mm 트랜스 - 아네솔이포함된 50% 의 H 2 O 18 로만들어진 0.5 ml 의 MSB 완충용액에서 H 2 O 18 배양실험을수행하였다. 반응, 추출및분석은상기기술한동일한방법으 로수행하였다. [0111] [0112] 뉴클레오타이드서열접근번호 본발명에서기술된 DNA 서열및그의연역단백질서열은접근번호아래 GenBank 데이터베이스에기탁하였다. [0113] [0114] [0115] [0116] 실험결과및토의사항트랜스-아네솔생전환유전자의클로닝트랜스-아네솔생전환기능을하는유전자를알아보기위해, 포스미드 (fosmid) 지노믹라이브러리를스크리닝하였다. 35 kb의 P. putida JYR-1 크로모좀 DNA를운반하는양성포스미드클론 pta163을 600개의콜로니에서선별하였다. E. coli(pta163) 에서트랜스-아네솔을파라-아니스산으로전환하는능력이존재함을발견하였다. pta163 클론의삽입된 DNA를시퀀싱하였고각각, 3.1 kb, 2.0 kb, 20.4 kb, 8.6 kb의뉴클레오타이드를가지는콘티그 0, 1, 2, 3의 4개의콘티그 (contig) 로조립하였다. 이중에서, 콘티그 2는 14개의추정의전사해독틀 (ORFs) 를포함하였다 ( 도 1). 이 14개 ORF의추정되는아미노산서열을 NCBI 단백질데이터베이스에블라스트하였다. table s2에서블라스트결과를보여준다. 서열정보에근거하여, 가능한 ORF의추정되는아미노산서열을 NCBI 단백질 BLAST에서비교해보았다. 콘티그 1에서주석이달린 ORF는 table s2에나열되어있다. 추정되는 ORF 중에서 ORF 7, 8, 11 및 13은트랜스- 아네솔의대사진행과정과관련이있을것으로기대하였다. ORF 7 및 8의추정되는아미노산서열은각각, P. putida W619의페레독신 (62%) 및바닐산염모노산소첨가효소 (75%) 의서열과매우높은상동성을가졌다. 바닐산및파라-아니스산은벤젠고리의 3번및 4번에연결된메톡시기위치를제외하고유사한구조를지닌다. ORF7 및 8은아마파라-아니스산의탈메틸화에관여할것으로보여, 이에파라-아니스산의탈메틸화효소를인코딩하는 ania(orf 7) 및 anib(orf 8) 로명명하였다. ORF11 및 13의추정되는아미노산서열은각각, 파라- 하이드록시벤즈알데하이드탈수소효소및파라-하이드록시벤조에이트수산화효소와 65% 및 74% 의상동성을보였다. 파라-하이드록시벤즈알데하이드및파라-아니스알데하이드사이의구조적인유사성을고려하면, ORF 11 은파라-아니스알데하이드의탈수소화반응에관여할것으로기대하였으며, ORF 13은파라-하이드록시벤조산의

15 수산화를가능케할것으로보았다. 이에본발명자들은 ORF 11 및 13을파라-아니스알데하이드탈수소화효소 (p-anisaldehyde dehydrogenase, adh) 및파라-하이드록시벤조산염수산화효소 (p-hydroxy benzoate hydroxylase, pbh) 로명명하였다. 트랜스-아네솔에서프로토카테큐산으로의대사과정중에형성되었던다른산물들은아세트알데하이드및포름알데하이드이다 ( 도 6). ORF 4 및 ORF 12의추정되는아미노산서열은글루타티온-비의존포름알데하이드탈수소효소및알데하이드탈수소효소와 98% 및 91% 로매우높은상동성을보였다. 포름알데하이드는포름알데하이드탈수소화효소에의해포름산으로산화된다 (13). 포름산에서이산화탄소로의추가적산화는 4개의유전자로구성된포름산염탈수소효소에의해촉매화된다 (2). 게다가 ORF 1 의추정되는아미노산서열과 P. putida F1의포름산염탈수소화효소알파소유닛사이에 97% 의아미노산서열의상동성이관찰되었다. [0117] [0118] Tn5 돌연변이유발및핵심유전자동정트랜스-아네솔으로변환하는효소를인코딩하는구역을알아보기위해 pta163의랜덤 Tn5 돌연변이체를준비하였다. 트랜스-아네솔로변환하는능력을확인하기위해 96개저항콜로니를시험하였다. 변환능력을상실하는콜로니의삽입부위를양방향시퀀싱으로확인하였다. 도 1은 pta163의콘티그 2에서 ORF 10에위치한세돌연변이체는트랜스-아네솔생전환활성을억제하는결과를낳았다. 이에, ORF 10 구역을가리키는결과는트랜스-아네솔전환경로에관여하는핵심유전자라는것을시사한다 (7). 본발명자들은 1,047 bp의시퀀스를 tao 유전자라명명하였다. [0119] [0120] tao 유전자의시퀀스비교추정되는트랜스-아네솔산화효소 (tao에의해인코딩되는 ) 아미노산서열은어떠한보존부위를포함하고있지않이므로이는새로운효소이다. Genebank 데이터베이스로단백질블라스트분석결과관련성없는단백질과함께, 34% 의상동상을보였다. 정렬된결과및 12개의많은단백질계통수를각각표 4에나타내었다. [0121] [0122] E. coli에서트랜스-아네솔산화효소의발현 ORF 10의기능을파악하기위해, 개시코돈에서정지코돈에이르는 ORF 10을발현벡터 pet-21a(+) 에삽입하여클로닝하였고, 그결과플라스미드 pet-tao 는 tac 프로모토에의해조절되었다. 1 mm의 IPTG에의해유도된 BL21(DE3)(pET-TAO) 의휴지세포는약 6시간동안트랜스-아네솔을파라-아니스알데하이드로완전히변환시킬수있었고 ( 도 2), 따라서 ORF 10을 tao 유전자라명명할수있었다. Simoni 등논문 (11) 에서균주 TA13을분해하는트랜스-아네솔은트랜스-아네솔에서아니스알데하이드로의변환이트랜스-아네솔에폭사이드및다이올을경유하며, 두개이상의효소가이반응에관여될것으로가정하였다. 그러나오직하나의단일유전자만이트랜스-아네솔의산화적분해에관여한다. 아이소유진올모노산소첨가효소 (Iem) 를인코딩하는단일유전자에의해아이오유진올에서바닐린으로의유사분해반응이진행된다 (4). 비록 TAO 및 Iem이 1-프로페닐기의이중결합을산화적분해반응이일어난결과형성되는알데하이드와같이거의유사한효소적반응을보이지만, TAO와 Iem 사이에는단지 11.5% 의아미노산상동성을갖는다. 이러한결과는두단백질사이에는아무런구조적관련성이없음을시사한다. 따라서, 구조분석은새로운산화효소인 TAO의메커니즘을이해하는데도움을줄것이다. [0123] [0124] 대사산물의동정 pet-tao을포함하는 E. coli BL21(DE3) 에의한대사산물은 HPLC 크로마토그램의정체시간, UV-가시광선스펙트로스코프 ( 데이타는없음 ) 및 LC-MS에의해확인된분자량을대응되는비교화합물과비교하여확인하였다. 반응시간 1 시간시추출된샘플에서 HPLC 용출프로파일에서두개의피크가관찰되었다. 피크 Ⅰ및 Ⅱ는각각 14.5분및 20.1분에서비교화합물인대사물질과기질로알려진파라-아니스알데하이드및트랜스-아네솔에서나타나는피크와동일한피크의정체시간을보여주었다 ( 도 2B). 반응시간 4시간시샘플에서추출된 HPLC 용출프로파일은한개의피크가나타났다. 피크 Ⅰ에서는 14.5분의정체시간에서나타났고, 파라-아니스알데하이드가대사물질인것으로확인되었다 ( 도 2C). 양성모드에서 ( 도 3) 의전자스프레이이온화질량스펙트럼은 137(M+H) 및 108(M-29+H) 의수치가나타나 136의분자질량인것과일치하였다. 감소된질량은파라-아니

16 스알데하이드의토막내기에의해형성된알데하이드기이다. [0125] [0126] 트랜스-아네솔생전환의반응속도론트랜스-아네솔의생전환반응속도는 HPLC에의해탐색하였고트랜스-아네솔및파라-아니스알데하이드의표준곡선과비교하여측정하였다. 도 5에서보듯이, 2.5 mm의초기농도를갖는트랜스-아네솔은반응이후그농도가급격히낮아지고 4시간만에전부파라-아니스알데하이드로전환되었다. 그러나, 열처리하여죽인 pet- TAO을포함하는 E. coli BL2(DE3) 은 12시간배양후에중요한생전환을보이지않았다. [0127] [0128] 파라 - 아니스알데하이드에대한방사성동위원소 ( 18 O) 표지 TAO 에의한트랜스 - 아네솔의산화성분해가일어나는동안파라 - 아니스알데하이드안으로들어가는산소원자의 근원을확인하기위해, 18 O 로표지된 O 2 및 H 2 O 로 E. coli BL21(DE3)(pET-TAO) 의휴지세포에의해생성된파라 - 아니스알데하이드의증가질량을 LC/MS 를이용하여측정하였다. m/z 가 139 인파라 - 아니스알데하이드의증가된 질량피크는오직 H 2 O 18 에서배양된세포안에서만관찰되었다 ( 도 3). 본발명자들은 TAO에의해파라-아니스알데하이드내부로삽입된 18 O로표지된산소의산소삽입메커니즘을제안해보았으며, 오직 H 2 O 18 에서만증가된질량이관찰된것은도 4의경로 C를통해설명할수있었다. shimon 논문에서 Arthrobacter sp. TA13에의해트랜스-아네솔트랜스-아네솔에폭사이드및다이올을경유하여파라-아니스알데하이드로의분해를가정하였다 (7). Ryu 논문에서는 P. putida JYR-1에의해진행하는트랜스-아네솔대사과정초기단계에서두개의트랜스-아네솔이성질체를확인하였다. 그들의제안된경로는아이소유진올에서바닐린으로의경로와유사하다. 그러나 TAO에의한산소원자의삽입패턴은 IE27(15, 16) 및 P. nitroreducens Jin1. 의아이소유진올모노산소첨가효소에의해산소분자및물분자가바닐린내부로들어가는패턴과매우다르다. Marasco 논문 (4) 에서는박테리아의카로티노이드산소첨가효소에의해레스베라트롤모노산소첨가효소메커니즘결과효소를 18 O 2 로배양시단일동위원소 18 O로표지된분해생성물이생성될수있음을보여주었다. 이러한결과들로보아 TAO는산소에의한공격시입체선호자리를가지고모노산소첨가효소반응을경유하는트랜스-아네솔의촉진시킬것으로본다. [0129] [0130] [0131] TAO 단백질에의한식물에서유래된페닐프로페노이드생전환 E. coli BL21(DE3)(pET-TAO) 의휴지세포를 1 mm의페닐프로파노이드화합물에배양시켰을때트랜스-아네솔과구조적인유사성을가진다. 표 2에서보듯이, TAO가기질로서 95.8%, 48% 및 99.9% 의전환수율로아이소유진올, O-메틸아이소유진올및아이소사프롤을받아들인결과각각알데하이드화합물인바닐린, 베라트라알데하이드및피페로날로전환되었다. 그러나유진올, 프로페닐구아에솔, 신남산, 페룰산및 4-쿠마르산은 TAO에의해이용되지않았다. 테스트된화합적구조를고려하면, TAO는 21-프로페닐기가아닌 1-프로페닐기를필요로하였으며, 벤젠고리의 4번위치에메톡시기 (-OCH 3 ) 및하이드록시기 (-OH) 가 3번위치에수소원자 (-H), 메톡시기 (-OCH 3 ) 및하이드록시 기 (-OH) 가연결된구조를선호하는경향이있었다. TAO는또한아이소사프롤처럼 3,4-메틸렌다이옥시를받아들었다. 그러나, 3번및 4번위치에다이옥시기의존재시 TAO의활성능력이감소하였다. 흥미롭게도, 프로페닐구에솔의에톡시 (-OCH 2 CH 3 ) 기는 1-프로페닐기가같이존재함에도불구하고 TAO 활성을강하게억제하는듯보였다. [0132] [0133] TAO 활성시금속및보조인자의효과 TAO 활성에서보조인자의효과를관찰하기위해, 본발명자들은 E. coli BL21 (DE3)(pET-TAO) 의한외여과된세포추출물을준비하였고, 무기보조인자및유기보조인자의존재시분석을수행하였다. NADH 및 NADPH의첨가시 TAO 활성은 4.3배까지증가하였고 ( 표 3), 이는 TAO가 NAD(P)H 의존산화효소일것을시사한다. Mg(Ⅱ)

17 의첨가시어떠한 TAO 활성억제도보이지않았다. 그러나 Fe(Ⅱ), Fe(Ⅲ), Mn(Ⅱ), Ni(Ⅱ), Cu(Ⅱ), 및 Zn(Ⅱ) 등의무기보조인자를첨가한경우에 TAO 활성은각각상대적으로 89.5%, 75,7%, 68.6%, 28.3%, 7.7%, 및 12.4% 정도로억제되었다 ( 표 3). [0134] [0135] 본발명자들은또한 Fe 2+ 및 Fe 3+ 이온특이적킬레이터인 1, 10-페난트롤린및타이론 (Tiron) 에서오직 1, 10-페난트롤린에서만약한억제를보여주었다. 이러한결과는 TAO는어떠한금속보조인자도필요로하지않음을보여주었다. TAO에서어떠한추정되는보존부위가없기에, 본발명자들은 NAD(P)H과 TAO 사이의관계를명확히할수없었다. 따라서모티프에결합하는 NAD(P)H를확인하기위한 TAO에대한추가적인구조적연구및 TAO의효소적메커니즘의이해가필요하다. 요컨대, 본발명에서트랜스-아네솔의산화적분해를촉진하는트랜스-아네솔유전자를최초로기술하였다. TAO는또한특정 2-프로페닐화합물에서알데하이드화합물을형성시킬수있다. TAO는신규의산화효소이며, 기질에대한입체선호적인산소공격을보여주었다. 또한, TAO는 NAD(P)H 의존산화효소이다. 트랜스-아네솔에대한전체반응의경로는도 6에서제시하였다. 기질범위가확장된 TAO의능력을고려하면, TAO는바닐린과같은방향족화합물을합성하는데매우유용할것이다. [0136] 균주또는플라스미드 설명 공급원 균주 Pseudomonas putida JYR-1 트랜스-아네솔전환균주 (7) Escherichia coli EPI100 포스미드라이브러리에대한숙주균주 Epicentre Escherichia coli EC100 트랜스포존 Tn5 삽입에대한숙주균주 Epicentre Escherichia coli DH5α 클로닝벡터에대한숙주균주 (1) Escherichia coli BL21(DE3) 발현벡터에대한숙주균주 Novagen 플라스미드 pepifos-5 표 1 Cm r ; 지노믹라이브러리컨스트럭트를위한 7.5-kb 포스미드벡터 Epicentre pgem-teasy Ap r ; TA 클로닝벡터 Promega pet21-a Ap r ; 발현벡터 Novagen pta163 Cm r ; JYR-1의 tao유전자를포함하는 41-kb pepi Fos-5 본발명 r r pta163-1c, pta163-3a, pta163-7c Cm Km ; pta163의 tao 유전자내부에트랜스포손본발명 Tn5 삽입 pg-tao Ap r ; pgem- tao 유전자를포함하는 T 이지클로닝본발명 벡터 pet-tao Ap r ; pet21-tao 유전자를포함하는발현벡터 본발명 [0137] 상기표 1 은본발명에서사용된박테리아균주및플라스미드이다. [0138] 기질 전환율 (%) 대사물질 화합물명 구조 천연화합물여부 화합물명 구조 트랜스-아네솔 Yes 파라-아니스알데하이드 아이소유진올 Yes 바닐린 표 2 유진올 Yes N/D N/D

18 프로페닐구아에솔 O- 메틸아이소유진올 아이소사프롤 No N/D N/D Yes 베라트라알데하 이드 Yes 피페로날 신남산 Yes N/D N/D 페룰산 Yes N/D N/D 4- 쿠마르산 Yes N/D N/D [0139] 상기표 2 는 tao 유전자로검사한여러기질을나타내었다. 표 3 [0140] 보조인자 (1 mm) 상대적활성도 (%) No cofactor 100 ± 0.9 NADH ± 4.4 NADPH ± 2.0 Fe(Ⅱ) ⅡⅢ 89.5 ± 2.8 Fe(Ⅲ) 75.7 ± 3.8 NADH + Fe(Ⅱ) ± 17.8 NADH + Fe(Ⅲ) ± 3.1 Mg(Ⅱ) ± 0.8 Mn(Ⅱ) 68.6 ± 4.8 Ni(Ⅱ) 28.3 ± 0.2 Cu(Ⅱ) 7.7 ± 0.6 Zn(Ⅱ) 12.4 ± 0.3 1,10-Phenanthroline 76.6 ± 0.3 Tiron ±1.1 [0141] 상기표 3 은 E. Coli 에서발현되는 TAO 에서추출한한외세포추출물에의한트랜스 - 아네솔에서파라 - 아니스알 데하이드로의전환시보조인자의영향에대한활성도수치이다. [0142] ORF 유전 자명 위치 유전자크기 아미노산 표 4 가장유사한단백질 ( 트랜스 - 아네솔대사에대한추정적기능 ) 아미노산유사 (%) 유사단백질의접근번호 크기 (aa) 시작 정지 (bp) ORF 포메이트탈수소화, 알파소유닛 97 YP_ ORF 몰리브돕테린산화환원효소 Fe 4 S 4 98 YP_ 부위 76 ORF MarR 군전사조절인자 70 YP_ ORF 포름알데하이드탈수소화효소 98 YP_ 글루타티온-독립 ORF MFS_1 주요활성인자초과 73 YP_

19 ORF 외막포린 68 YP_ ORF 7 ania 페레독신 ( 파라-아니스산탈메틸화효소, 환원효소 ) 62 YP_ ORF 8 anib 바릴산염모노산소첨가효소 ( 파라-아니스산탈메틸화효소 ) 75 YP_ ORF 추정적외막단백질 W 49 YP_ ORF 10 tao 가정적단백질 ( 트랜스-아네솔산화효소 ) 32 XP_ ORF 11 adh 파라-하이드록시벤즈알데하이드 65 AAA75634 탈수소화효소 ( 파라-아니스알데하이드탈수소화효소 ) ORF 알데하이드탈수소화효소 91 YP_ ( 아세트알데하이드탈수소화효소 ) ORF 13 pbh 파라-하이드록시벤조산염하이드 74 AAG17455 록시화효소 ORF 일부 일부 아데닌특이적 DNA 메틸전달효소 60 YP_ [0143] 상기표 4 는트랜스 - 아네솔의대사과정에관여하는콘티그 2 에서발견되는 14 개의 ORF 의아미노산서열의상동 성분석자료이다. [0144] [0145] [0146] [0147] [0148] [0149] [0150] [0151] [0152] [0153] 참고문헌 (1) Boyer, H. W., and D. Roulland-Dussoix A complementation analysis of the restriction and modification of DNA in Escherichia coli. J Mol Biol 41: (2) Ferry, J. G Formate dehydrogenase. FEMS Microbiol Rev 7: (3) Hua, D., C. Ma, S. Lin, L. Song, Z. Deng, Z. Maomy, Z. Zhang, B. Yu, and P. Xu Biotransformation of isoeugenol to vanillin by a newly isolated Bacillus pumilus strain: identification of major metabolites. J Bacteriol 130: (4) Marasco, E. K., and C. Schmidt-Dannert Identification of bacterial carotenoid cleavage dioxygenase homologues that cleave the interphenyl alpha,beta double bond of stilbene derivatives via a monooxygenase reaction. Chembiochem 9: (5) Newberne, P., R. L. Smith, J. Doull, J. I. Goodman, I. C. Munro, P. S. Portoghese, B. M. Wagner, C. S. Weil, L. A. Woods, T. B. Adams, C. D. Lucas, and R. A. Ford The FEMA GRAS assessment of trans-anethole used as a flavouring substance. Flavour and Extract Manufacturer's Association. Food Chem Toxicol 37: (6) Overhage, J., A. U. Kresse, H. Priefert, H. Sommer, G. Krammer, J. Rabenhorst, and A. Steinbuchel Molecular characterization of the genes pcag and pcah, encoding protocatechuate 3,4-dioxygenase, which are essential for vanillin catabolism in Pseudomonas sp. strain HR199. Appl Environ Microbiol 65: (7) Ryu, J., J. Seo, Y. Lee, Y. Lim, J. H. Ahn, and H. G. Hur Identification of syn- and antianethole-2,3-epoxides in the metabolism of trans-anethole by the newly isolated bacterium Pseudomonas putida JYR-1. J Agric Food Chem 53: (8) Ryu, J. Y., J. Seo, T. Unno, J. H. Ahn, T. Yan, M. J. Sadowsky, and H. G. Hur Isoeugenol monooxygenase and its putative regulatory gene are located in the eugenol metabolic gene cluster in Pseudomonas nitroreducens Jin1. Archives of Microbiology 192: (9) Seshadri, R., A. S. Lamm, A. Khare, and J. P. N. Rosazza Oxidation of isoeugenol by

20 Nocardia iowensis. Enzyme and Microbial Technology 43: [0154] [0155] [0156] [0157] [0158] [0159] [0160] (10) Shimoni, E., T. Baasov, U. Ravid, and Y. Shoham Biotransformations of propenylbenzenes by an Arthrobacter sp. and its t-anethole blocked mutants. J Biotechnol 105: (11) Shimoni, E., T. Baasov, U. Ravid, and Y. Shoham The trans-anethole degradation pathway in an Arthrobacter sp. J Biol Chem 277: (12) Stanier, R. Y., N. J. Palleroni, and M. Doudoroff The aerobic pseudomonads: a taxonomic study. J Gen Microbiol 43: (13) Tanaka, N., Y. Kusakabe, K. Ito, T. Yoshimoto, and K. T. Nakamura Crystal structure of formaldehyde dehydrogenase from Pseudomonas putida: the structural origin of the tightly bound cofactor in nicotinoprotein dehydrogenases. J Mol Biol 324: (14) Unno, T., S. J. Kim, R. A. Kanaly, J. H. Ahn, S. I. Kang, and H. G. Hur Metabolic characterization of newly isolated Pseudomonas nitroreducens Jin1 growing on eugenol and isoeugenol. J Agric Food Chem 55: (15) Yamada, M., Y. Okada, T. Yoshida, and T. Nagasawa Purification, characterization and gene cloning of isoeugenol-degrading enzyme from Pseudomonas putida IE27. Arch Microbiol 187: (16) Zhang, Y., P. Xu, S. Han, H. Yan, and C. Ma Metabolism of isoeugenol via isoeugenol-diol by a newly isolated strain of Bacillus subtilis HS8. Appl Microbiol Biotechnol 73: 도면 도면 1 도면

21 도면 3 도면

22 도면 5 도면 6 서열목록 <110> Gwangju Institute of Science and Technology <120> Novel Trans-Anethole Oxidase

23 <130> PN <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1044 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 1 atggaggaca tcatgcaagg caccaacgca gcggttagcg acaaccgcgg atacaaatgg 60 atagccaggg aaatagagcg gctggaccct gaaaaggact ttgccgaaat ctggcggctg 120 tccacaacgt actatgtgaa cgactttgtg atgaacctgg tttacacgct gggcatccct 180 gcttttaccc aaccgccggc gggcagcgtc gtgatgggag taacgacaga aaaagccatc 240 aaaaaaccgc agaagcgtac cgacgacacc ttgcagcatt tttggacctg gttcgaatac 300 gggccggatg atccgaggat gcaagcttca ttggcgcatg tgaatcgcgg gcatgcagca 360 cttgccaagc gttcccctgg tacattcccg gctcgcgatg tgatctatac cacagcctgg 420 atcggggcca acctgcaccg cttgcgcctg agcgtcggtc ttccgggttt taccaaaaat 480 cagcaaatcg cttcgcagcg ctactgggcc gctatctgcc ggcaattctg gagtgaagac 540 ggtttagtca ctgagtatcc ggaaagcttc gaggccatgc tgcagtacat cgaggattac 600 gaagcccagc catgggaaca ggttgaatcc gggcgagtgc tgaccgaggc catcatcaag 660 caattcgtgg atgcctactt cccaggccca ttagggtgga ttggccgtca actctatctc 720 tcgttccagc ttcccaccat caacggcttg atgcagtccg ggaaacctaa cccgatcatg 780 aagtgggtga tgcgaaaggg cctgtggttc ggcttaacgc ttcaggagcg tgtcttcccc 840 gacccgaaat tatcaactcc agaaaaggcg cgcaggaaac cggtacgccc aggccaacac 900 attgatccgc ctacagccga ggtgaaatgt cctttccctg gagcgactag ccaaccctcc 960 ataccgtccg ccgattcatc tggttgccct ttccacgctg gcaaagcgaa cggggaagcc 1020 aacaattccg acttgaggac taac 1044 <210> 2 <211> 348 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 2 Met Glu Asp Ile Met Gln Gly Thr Asn Ala Ala Val Ser Asp Asn Arg

24 Gly Tyr Lys Trp Ile Ala Arg Glu Ile Glu Arg Leu Asp Pro Glu Lys Asp Phe Ala Glu Ile Trp Arg Leu Ser Thr Thr Tyr Tyr Val Asn Asp Phe Val Met Asn Leu Val Tyr Thr Leu Gly Ile Pro Ala Phe Thr Gln Pro Pro Ala Gly Ser Val Val Met Gly Val Thr Thr Glu Lys Ala Ile Lys Lys Pro Gln Lys Arg Thr Asp Asp Thr Leu Gln His Phe Trp Thr Trp Phe Glu Tyr Gly Pro Asp Asp Pro Arg Met Gln Ala Ser Leu Ala His Val Asn Arg Gly His Ala Ala Leu Ala Lys Arg Ser Pro Gly Thr Phe Pro Ala Arg Asp Val Ile Tyr Thr Thr Ala Trp Ile Gly Ala Asn Leu His Arg Leu Arg Leu Ser Val Gly Leu Pro Gly Phe Thr Lys Asn Gln Gln Ile Ala Ser Gln Arg Tyr Trp Ala Ala Ile Cys Arg Gln Phe Trp Ser Glu Asp Gly Leu Val Thr Glu Tyr Pro Glu Ser Phe Glu Ala Met Leu Gln Tyr Ile Glu Asp Tyr Glu Ala Gln Pro Trp Glu Gln Val Glu Ser Gly Arg Val Leu Thr Glu Ala Ile Ile Lys Gln Phe Val Asp Ala Tyr Phe Pro Gly Pro Leu Gly Trp Ile Gly Arg Gln Leu Tyr Leu Ser Phe Gln Leu Pro Thr Ile Asn Gly Leu Met Gln Ser Gly Lys Pro Asn Pro Ile Met Lys Trp Val Met Arg Lys Gly Leu Trp Phe Gly Leu

25 Thr Leu Gln Glu Arg Val Phe Pro Asp Pro Lys Leu Ser Thr Pro Glu Lys Ala Arg Arg Lys Pro Val Arg Pro Gly Gln His Ile Asp Pro Pro Thr Ala Glu Val Lys Cys Pro Phe Pro Gly Ala Thr Ser Gln Pro Ser Ile Pro Ser Ala Asp Ser Ser Gly Cys Pro Phe His Ala Gly Lys Ala Asn Gly Glu Ala Asn Asn Ser Asp Leu Arg Thr Asn