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1 1) 대한한방부인과학회지 THE JOURNAL OF ORIENTAL OBSTETRICS & GYNECOLOGY VOL.22 NO.1 : (2009) 柴胡疎肝散加減方이멜라닌생성및유전자발현에미치는영향 대전대학교한의과대학부인과교실 김주영, 임현정, 신선미, 유동열 ABSTRACT The Effect of Sihosogansangagambang (SS) on Melanin Synthesis and gene expression in B16F10 Mouse Melanoma Cell Ju-Young Kim, Hyun-Jung Lim, Sun-Mi Shin, Dong-Youl Yoo Dept. of Oriental Medicine Graduate School, Daejeon University Purpose: This study was performed to determine the inhibitory effect of Sihosogansangagambang (SS) on synthesis in B16F10 melanoma cells (B16F10). Methods: The inhibitory effects of Sihosogansangagambang on synthesis were used by in vitro assay. To elucidate inhibitory effects of SS on synthesis, we determined the release in B16F10. And to investigate the mechanism of inhibitory effect of SS, we assessed the gene expression of tyrosinase, TRP-1, TRP-2 and ERK-1 in B16F10. Results: 1. SS decreased the release of in B16F10 melanoma cells. 2. SS inhibited mushroom tyrosinase activity in vitro. 3. SS decreased the expression of tyrosinase, TRP-2 in B16F10 melanoma cells, but did not decreased the expression of TRP-1 in B16F10 melanoma cells. 4. SS decreased the expression of ERK-1 in B16F10 melanoma cells. Conclusion: From these results, it may be suggested that SS is possesed of the antimelanogenetic effects. Key Words: Sihosogansangagambang (SS), synthesis, antimelanogenetic effect, tyrosinase, TRP, ERK 교신저자( 유동열) : 대전광역시서구둔산동 1136번지대전대학교둔산한방병원 전화 : 이메일 : dlwndlf@hanmail.net 95

2 柴胡疎肝散加減方이멜라닌생성및유전자발현에미치는영향 Ⅰ. 서 론 최근대기오염으로인한오존층파괴 와이에따른자외선노출이증가되면 서, 자외선으로인한피부노화와피부색 의변화가심해지고있다. 또한미용적 인이유로피부착색에대한관심이높아 지고있어, 이에보다안정적이고효과 적인피부색소질환의치료를위하여미 백소재를발견하고자하는연구가활발 히진행되고있다 1-3). 피부중표피에서의색소침착을유발 하는질환은멜라닌 () 분비가 증가하여발생하는주근깨, 기미, 밀크커 피색반점등이있으며, 활성화된멜라 닌세포의수가증가하여발생하는단순 흑자, 일광흑자등이있다 4). 최근미백효과에대한연구는피부미 백효과와항산화작용및피부노화방지 를포함하는포괄적인개념으로진행되 고있는데, 특히 tyrosinase의활성을억 제하여멜라닌의초기생성을감소시키 는기전이주로연구되고있다 4-6). 한의학에서색소침착증은 黃帝內經 素門 < 至眞要大論 > 7) 에 면진 ( 面塵 ) 이 라하여처음언급된이래, 諸病源候 論 < 面皯黑䵳候 > 8) 에서그병리기전과 형태에대하여구체적으로언급하였고, 이후제가들에의해형태와색조에따라 간증 ( 䵟䵳 ), 간점 ( 䵟點 ), 면흑 ( 面黑 ), 면간증 ( 面䵟䵳 ), 작란 ( 雀卵 ), 반간증 ( 斑䵟䵳 ), 염자 ( 黶子 ), 작반 ( 雀斑 ), 여 흑반 ( 黧黑斑 ), 간암 ( 䵟黯 ), 여흑간증 ( 黧黑䵟䵳 ), 흑반 ( 黑斑 ) 등으로다양하 게표현되어있다 9). 한약을이용한미백관련연구로는赤 何首烏 10), 車前子 11), 黃柏 12), 加味大黃膏 13) 및逍遙散加減化裁 14) 등이멜라닌생 성억제효과가있다고보고되었다. 柴胡 疎肝散에관한연구로, 정 15) 은스트레스 에대한예방효과가있다고하였으며, 박 16) 은肝氣鬱結로나타난氣鬱脇痛을 호전시킨다고보고하였다. 柴胡疎肝散加減方은 中醫婦科臨床精 華 에수록된처방으로柴胡疎肝散 17) 에 서陳皮, 枳殼을去하고當歸, 鬱金, 黃 芩, 丹蔘, 鷄血藤, 枳實炒를加하여肝鬱 氣滯로인해顔面에氣血의濡養이이루 어지지못하여발생하는 하는데에활용되고있다 18). 본연구에서는 효능이있는 疏肝解鬱, 黃褐斑을치료 活血消斑 의 柴胡疎肝散加減方의미백효과 를확인하고자, B16F10 mouse melanoma cell 을이용하여柴胡疎肝散加減方이 유리에미치는영향을측정하였 고 in vitro에서 mushroom tyrosinase 활 성에미치는영향을측정하였으며, 그 작용기전을밝히기위하여 B16F10 melanoma cell에서 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, ERK-1 등의유전자발현에대 하여연구한결과유의한성적을얻었기 에보고하는바이다. Ⅱ. 1. 재 1) 실 료 세포주 험 본실험에사용한 melanocyte는서울 대학교한국세포주은행에서분양한 B16F10 mouse melanoma cell 을사용하 였다. 2) 약 물 실험에사용한시호소간산가감방 ( 이 하 SS 라칭함.) 의구성약물은대전대학 96

3 The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.22 No.1 February 2009 교부속한방병원에서구입한것을정선 하여사용하였다. 1첩의내용과분량은 다음과같다 (Table 1). Table 1. Prescription of Sihosogansangagambang (SS) Herb Weight Scientific name name (g) 白芍藥 Paeoniae Radix Alba 8 丹 蔘 Salviae miltiorrhizae Radix 8 鷄血藤 Spatholobi Caulis 8 柴 胡 Bupleuri Radix 4 當 歸 Angelicae gigantis Radix 4 香附子 Cyperi Rhizoma 4 鬱 金 Cucumae Radix 4 黃 芩 Scutellariae Radix 4 枳 實 Aurantii immaturus Fructus 3 川 芎 Cnidii Rhizoma 3 甘 草 Glycyrrhizae Radix 3 TOTAL 53 3) (1) 시약및기기 시 약 본실험에사용된시약중 Hank's balanced salt solution, dimethyl sulfoxide (DMSO), α-msh, Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), NaOH, mushroom tyrosinase, tyrosinase, L-tyrosine, phenol, isoamyl alcohol, isopropyl alcohol, ethanol, DTT, diethyl pyrocarbonate (DEPC), magnesium chloride (MgCl 2) 는 Sigma (USA) 제품을, normal saline 은중외제약제품을, TRIzol, superscript II RT는 Invitrogen (USA) 제품을, fetal bovine serum (FBS), penicillin -streptomycin, Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), trypsin-edta 는 Gibco/BRL (USA) 제품을, RNase는 Pharmingen (USA) 제품을, TRP-1, TRP-2 등 ELISA kit는 R&D system (USA) 제품을, oligo dt, datp, dgtp, dttp, Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV-RT) 는 Promega (USA) 제품을, deoxyribonucleotide triphosphate (dntp), Taq polymerase 는 Biotools (Spain) 제품을, DNA marker 는 Bioneer (USA) 제품을, DNA ligase 는 BMS (USA) 제품을, cyanine3-dctp, cyanine5-dctp는 Amersham (USA) 제 품을, PCR purification kit는 Nucleogen (USA) 제품을사용하였으며, 기타시약 은특급시약을사용하였다. (2) 기 기 본실험에사용된기기는 centrifuge (Hanil unicon 54R, Korea), rotary vaccum evaporator (Büchi 461, Switzerland), deep freezer (Sanyo, Japan), freeze dryer (Eyela, Japan), roller mixer (Gowon scientific technology, Korea), 96 well plate, 24 well plate, 6 well plate (Seolin, Korea), CO 2 hematocytometer incubator (Sanyo, Japan), (Fuchs-Rosenthal, Germany), clean bench (Sejong, Korea), autoclave (Sanyo, Japan), micro-pipet (Gilson, France), water bath (Vision scientific, Korea), vortex mixer (Vision scientific, Korea), MALDI-TOF (Shimadzu, Japan), thermocycler system (MWG Biotech., Germany), ice-maker (Vision scientific, Korea), cornical tube (Falcon, USA), homogenizer (OMNI, USA), UV illuminator (VL TFX-20M, USA), liquid handler (Packard, USA), PCR apparatus (Biometra T1, USA), image analyser (VL, USA), electrophoresis 97

4 柴胡疎肝散加減方이멜라닌생성및유전자발현에미치는영향 (BMS, USA), ELISA reader (BMS, USA), quantitative real time PCR apparatus (ABI Prism 7000, USA), Gel-Pro analyzer 3.1 (Media Cybernetics, USA) 등을사용하였다. 2. 방 1) 법 시료추출및분획조제 시호소간산가감방 3첩분량을증류수 1,500 ml에넣고열탕추출기에서 100 로 여 3 시간동안가열추출한다음, 여과하 rotary vacuum evaporator로감압농 축하고, freeze dryer로동결건조하여분 말 13.4 g ( 수득율 8.4%) 을얻었으며, 검 액은실험에필요한농도로생리식염수 에용해시켜사용하였다. 후 2) 검액조제 실험용검액은추출물을 PBS에녹인 membrane filter (0.22 μm) 로여과하 여멸균하고사용시까지냉장보관하였 다. 배양된세포에사용하기직전에실 험농도에맞도록 다음사용하였다. 3) 세포배양 DMEM 배지로조정한 세포배양에사용된배지는 10% FBS 와 penicillin, streptomycin이포함된 DMEM 배지를사용하였으며 1일 1회 배지를교환하였다. FBS는잔존하는보 체성분을불활성화시키기위해실온에서 녹인후 heat inactivation (56 water bath에서 30 분간가열) 하여사용하였으 며, 배지는 0.2 μm membrane filter로여 과후사용하였다. B16F10 mouse melanoma cell에각조건별로 96 well plate에는 well 당 100 μl, 24 well plate에는 well 당 500 μl로 medium 을넣어주었다. 세 포를회수할때는 trypsin-edta 1 ml을 가하여 37 에서 1분간반응시킴으로써 부착된세포를분리하고배지 고원심분리 4 ml을넣 (1,000 rpm, 3 분) 를하여세 척한후실험에사용하거나필요시액체 질소에서냉동보관하였다. 세포는 37, 5% CO 2 를사용한 CO 2 배양기에서배양 하였다. 4) B16F10 Melanoma Ccell (Melanocyte) Proliferation 측정 세포를 cells/ ml의농도로 6 well plate에넣고 6시간배양하여 plate에부 착시킨다음, 분획하여조제한검액을 농도별로첨가하여 1, 2, 3일간배양하였 다. 배양완료후 0.05% trypsin-edta를 처리하여세포를분리한다음, PBS로 희석하여 계측하였다. hematocytometer로세포수를 5) B16F10 Melanocyte의 Melanin 유 리량측정 Melanin 유리량측정은 Hosoi 등의방 법 19) 을사용하였다. Melanin 생성세포 로는마우스에서얻은흑색종의일종인 B16F10 melanoma cell 을이용하였다. 배 양된 B16F10 melanoma cell ( 정상군) 에 α-msh ( α-melanocyte stimulating hormon e, 10 μm) 를처리한다음 ( 대조군), 다시 300, 150, 75, 37 μg/ ml농도의 SS를가하 여 3 일간배양한후 ( 실험군), 세포배양 액에유출되는 의량을측정하였 는데, 약 24시간후부터세포내 의생성을현미경으로관찰할수있었 다. 세포배양액은 10% DMSO가함유 된 1 N NaOH 300 μl에넣고 80 에서 1시간동안처리하여 을용해시 켰다. 405 nm에서흡광도 (optical density) 를측정하였으며, 정량은합성 멜라닌 (Sigma Co., USA) 을대조군으로 98

5 The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.22 No.1 February 2009 사용하여작성된표준곡선에서구하였 다. 6) Mushroom Tyrosinase 활성에미치 는영향측정 Tyrosinase 활성에미치는영향은 Mason and Peterson 등의방법 20) 을사 용하였다. 즉, 0.1M phosphate buffer (ph 6.8) 150 μl, 3 mm L-tyrosine 수용 액 20 μl, 검액 20 μl을차례대로가한 다음, 2,500 U/ ml mushroom tyrosinase 10 μl를가하였다. 반응은 37 에서 30분 간 incubation 시켰으며매 10분간격으 로 405 nm 에서흡광도를측정하였다. Tyrosinase 로구하였다. 활성은아래에표시한식으 Tyrosinase 활성도 (%) = (B-B')/(A-A') x 100 A: 대조군반응액의흡광도 A': 대조군의 tyrosinase 대신 buffer 가 한반응액의흡광도 B: 검액이첨가된반응액의흡광도 B': B 반응액중 tyrosinase 대신 buffer 가한반응액의흡광도 7) 유전자발현에대한영향 (1) 총 RNA 분리 배양하고있는 B16F10 세포에 TRIzol reagent를처리하여총 1 ml RNA를 분리하였다. 분리한 RNA에 100 μl phenol 과 100 μl chloroform/ isoamyl alcohol (24:1) 을넣고잘섞은후원심분리하 는과정을 2번반복함으로써상층액을 분리하였다. 0.5 ml isopropyl alcohol을 이용하여 RNA를침전시킨후 70% ethanol 로세척하고자연건조시켰다. RNAase free water에서 RNA를녹인후 RNase-free DNase를첨가하고 -70 에 서저장보관하였다. (2) cdna 제조 대조군및시험군에서각각분리한 total RNA 액 2 μl (2 μg RNA 함유) 에 oligo dt 2 μl (10 pm) 을넣은후조심 스럽게혼합한다음, 90 o C에서 5분간 incubation 하였다. primer가 annealing 하 도록 4 o C 로유지하며 10 RT buffer 2 μl, 0.1M DTT 2 μl, 10mM dntp nucleotide mix 1ul, reverse transcriptase 1 μl를가 하고여기에 H 2 O 10 μl을첨가하여 20 μl로한다음, 아주조심스럽게손으로 tipping 혼합하였다. 이후, 42 o C에서 90분 간 incubation 한다음, 얼음에방치하였 다. 그리고다시 H 2 O 100 μl을첨가하여 -20 o C 에보관하였다. 각의시약은 Amersham Bioscience (USA) 에서구입하였다. (3) Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Oligo dt μl, reaction buffer (50 mm tris-hcl, 75 mm KCl, 3 mm MgCl 2, 10 mm DTT, ph 8.3), 1 mm dntp과 한 200 unit M-MLV-RT를분리 RNA에처리하여역전사를수행함으 로써 cdna 를합성하였다. PCR은 total volume 15 μl에 10배의 PCR buffer, 0.2 mm dntps, 2 pmole의 sense 및 antisense primer를넣은혼합액에 cdna와 1.25 unit의 Taq polymerase을넣어 PCR을 시행하였다. Tyrosinase의 sense primer 는 GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT 이었으며, antisense primer는 TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC 을 사용하였다. TRP-1의 sense primer는 GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC, antisense primer 는 AAG ACG CTG CAC TGC TGG TCT 을사용하였으며, TRP-2 의 sense primer 는 GGC CAG CTT 99

6 柴胡疎肝散加減方이멜라닌생성및유전자발현에미치는영향 TCA GGC AGA GGT, antisense primer 는 CGG TTG TGA CCA ATG GGT GCC 이었다. ERK-1의 sense primer는 ATC AGA TCC TGA GAG GGC TA, antisense primer 는 CAG AGC TTT GGA GTC AGC AT 를사용하였다. Control로는 GAPDH를사용하였으며 sense primer는 CAGC CTC GTC CCG TAG ACA AA 이었으며, antisense primer 는 CAC GAC ATA CTC AGC ACC GGC 이었다. PCR 조건은 94 4 분, 30 cycles 의 (94 30 초, 초, 초), 분이었다. 증폭된 PCR 산물 을 2% agarose gel 에전기영동하였다. 전 기영동결과나온 band를 density 분석 프로그램인 Gel-Pro analyzer 3.1을이용 하여용량을산출하였다. (4) Real time RT-PCR 우선시험관에정량한 RNA 5 μg, random hexamer (50 pmol/3 μl ), 10 mm dntp 1 μl를넣고 DEPC 처리된 증류수를가하여 10 μl의 RNA/primer mixture 를만들었다. 실험용 sample을 65 에서 5분간 incubation 시킨후 1분 이상얼음에방치하였다. Reaction mixture 으로 10배의 RT buffer 2 μl, 25mM MgCl 2 4 μl, 0.1 M DTT 2 μl, RNAase 1 μl을섞어준비하였다. Tyrosinase의 sense primer는 GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT 이었으며, antisense primer 는 TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC 을사용하였다. TRP-1 의 sense primer는 GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC, antisense primer 는 AAG ACG CTG CAC TGC TGG TCT 사용하였으며, TRP-2 의 을 sense primer는 GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT, antisense primer 는 CGG TTG TGA CCA ATG GGT GCC 이었다. ERK-1 의 sense primer는 ATC AGA TCC TGA GAG GGC TA, antisense primer 는 CAG AGC TTT GGA GTC AGC AT 를사용하였다. Control로는 GAPDH를사용하였으며 sense primer는 CAGC CTC GTC CCG TAG ACA AA 이었으며, antisense primer 는 CAC GAC ATA CTC AGC ACC GGC 이었다. Reaction mixture를 에가하여섞고실온에 superscript II RT 1 μl RNA/primer mixture 2 분간방치한후, (50 units) 를가 하고 25 o C에 10분간 incubation 시켰다. 다시 42 o C에서 50분간 incubation 시킨 다음, 70 o C에서 15분간가열하여 inactivate 시키고얼음물에서식혔다. RNase 1 μl 를가하고다시 37 o C에서 20분간 incubation 시킨다음, 사용시까지 -20 o C에보관하 였다. 각각의 optical tube에 2배의 SYBR green Mix 12.5 μl, cdna 0.2 μl, 5 pmol/ μl primer pair mix 1 μl, 11.3 μl H 2 O를넣 고, 50 o C 2분 1 cycle, 95 o C 10분 1 cycle, (95 o C 15 초, 60 o C 30 초, 72 o C 30 초) 40 cycles, 72 o C 10 분 1 cycle 로증폭시켰다. PCR을마친후 tube 를꺼낸다음, 반응 액 5 μl를사용하여 3% agarose gel에서 PCR specificity 를측정했다. SDS 7,000 software를사용하여 real time PCR 과를분석하였다. 3. 통계학적분석 결 각결과에대한유의성검증은 Student's t-test 를이용하였다. p<0.05 인경우유 의성이있다고판정하였다. Ⅲ. 실험결과 100

7 The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.22 No.1 February B16F10 Melanocyte의 Melanin 리에미치는영향 유 B16F10 melanoma cell은 α-msh (10 μm) 를처리한경우세포배양액에유출 되는 의량이유의성있게증가 하였다. 그러나 SS는 300, 150 μg/ ml의 농도에서증가한 의량을대조군 에비해각각 21%, 14% 억제하였다 (Fig. 1). Melanin Contents(O.D. 405nm) ## * 서대조군에비해유의성있게억제하였 다 (Fig. 3). Mushroom Tyrosinase Activity (%) C S S30 0 S S150 SS75 SS37 Fig. 2. Effects of SS on mushroom tyrosinase activity in vitro. C(Control): Vehicle SS300: 300 μg/ ml of SS SS150: 150 μg/ ml of SS SS75: 75 μg/ ml of SS SS37: 37 μg/ ml of SS : p<0.01 vs C 0.1 N C SS300 SS150 SS75 SS37 Fig. 1. Effects of SS on the release of from B16F10 melanoma cells. N(Normal): Vehicle C(Control): α-msh (10 μm) SS300: α-msh (10 μm) μg/ ml of SS SS150: α-msh (10 μm) μg/ ml of SS SS75: α-msh (10 μm) + 75 μg/ ml of SS SS37: α-msh (10 μm) + 37 μg/ ml of SS ##: p<0.01 vs N : p<0.01 vs C, *: p<0.05 vs C 2. Mushroom Tyrosinase 는영향 활성에미치 SS는 300, 150 μg/ ml농도에서 tyrosinas e 활성을대조군에비해각각 30%, 14% 억제하였다 (Fig. 2). 3. Tyrosinase 발현에미치는영향 Tyrosinase는 α-msh (10 μm) 처리 시발현이정상군에비해유의성있게 (p<0.01) 증가하였으며, SS는증가한유 전자발현을 200 μg/ ml, 100 μg/ ml의농 도 (p<0.01) 와 25 μg/ ml농도 (p<0.05) 에 Relative mrna of Tyrosinase ## N C S S 200 S S 100 S S 50 S S 25 Fig. 3. Effects of SS on the expression of tyrosinase in B16F10 melanoma cells. N(Normal): Vehicle C(Control): α-msh (10 μm) SS200: α-msh (10 μm) μg/ ml of SS SS100: α-msh (10 μm) μg/ ml of SS SS50: α-msh (10 μm) + 50 μg/ ml of SS SS25: α-msh (10 μm) + 25 μg/ ml of SS ##: p<0.01 vs N : p<0.01 vs C, *: p<0.05 vs C 4. TRP-1 발현에미치는영향 TRP-1은 α-msh (10 μm) 처리시발 현이정상군에비해유의성있게 (p<0.01) 증가하였으며, SS는 200, 100, 50, 25 μg/ ml 의농도에서증가한유전자발현을대조 * 101

8 柴胡疎肝散加減方이멜라닌생성및유전자발현에미치는영향 군에비해억제하는경향은보였으나유 의성이없었다 (Fig. 4). 2 2 Relative mrna of TRP-2 1 ## Relative mrna of TRP ## N C SS200 SS100 SS50 SS25 Fig. 4. Effects of SS on the expression of TRP-1 in B16F10 melanoma cells. N(Normal): Vehicle C(Control): α-msh (10 μm) SS200: α-msh (10 μm) μg/ ml of SS SS100: α-msh (10 μm) μg/ ml of SS SS50: α-msh (10 μm) + 50 μg/ ml of SS SS25: α-msh (10 μm) + 25 μg/ ml of SS ##: p<0.01 vs N 0 N C SS200 SS100 SS50 SS25 Fig. 5. Effects of SS on the expression of TRP-2 in B16F10 melanoma cells. N(Normal): Vehicle C(Control): α-msh (10 μm) SS200: α-msh (10 μm) μg/ ml of SS SS100: α-msh (10 μm) μg/ ml of SS SS50: α-msh (10 μm) + 50 μg/ ml of SS SS25: α-msh (10 μm) + 25 μg/ ml of SS ##: p<0.01 vs N : p<0.01 vs C 5. TRP-2 발현에미치는영향 TRP-2는 α-msh (10 μm) 처리시발 현이정상군에비해유의성있게 (p<0.01) 증가하였으며, SS는 200, 100, 50 μg/ ml 농도에서증가한유전자발현을대조군 에비해유의성있게 (p<0.01) 억제하였 다 (Fig. 5). 6. ERK-1 발현에미치는영향 ERK-1은 α-msh (10 μm) 처리시발 현이정상군에비해유의성있게 (p<0.01) 감소하였으며, SS는감소한유전자발현 을 200, 100, 25 μg/ ml농도 (p<0.01) 와 50 μg/ ml농도 (p<0.05) 에서대조군에 비해유의성있게증가시켰다 (Fig. 6). Relative mrna of ERK * * ## * * N C S S S S S S 5 0 S S 2 5 Fig. 6. Effects of SS on the expression of ERK-1 in B16F10 melanoma cells. N(Normal): Vehicle C(Control): α-msh (10 μm) SS200: α-msh (10 μm) μg/ ml of SS SS100: α-msh (10 μm) μg/ ml of SS SS50: α-msh (10 μm) + 50 μg/ ml of SS SS25: α-msh (10 μm) + 25 μg/ ml of SS ##: p<0.01 vs N : p<0.01 vs C, *: p<0.05 vs C Ⅳ. 고 찰 최근에는대기오염으로인한오존층의 파괴와이에따른자외선의유해성에대 한관심이증가하면서, 이로인한피부 * * * * * 102

9 The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.22 No.1 February 2009 노화에따른피부색의변화, 침착이심 해지고있으며, 또한미용적인이유에서 피부착색에대한관심이높아지고있다 1-3). 피부는표피층, 진피층, 피하지방층의 3 개층으로구성되어있으며, 체온조절 과외부로부터내부장기를보호하는등 생명유지를위한주요기능과, 부수적으 로피부호흡, 특정물질에대한선택적 흡수, 피부색형성등의기능이있다 4,21-24). 피부색은 3가지의요인에의하여 결정되는데, 피부속에들어있는카로틴 과진피에있는혈관에서스며나온혈액 색깔및멜라닌이중요한요인이된다 25). 피부의멜라닌세포는자외선에노출 되면색소침착을일으키는데, 표피에서 의색소침착을유발하는질환은주근깨, 기미, 밀크커피색반점, 단순흑자, 일광 흑자등이있다. 주근깨는주로일광노 출부위의피부에생기는황갈색의작은 색소반을말하며, 기미는다양한크기의 갈색색소반이태양광선의노출부위특 히얼굴에발생하는질환으로서경구피 임약등에의해악화되는것으로알려져 있으며, 밀크커피색반점은직경이 2-20 mm 에이르는경계가분명하고균일한 밀크커피색의색소반을말한다. 단순흑 자는경계가명확하고갈색이나검은색 을띠는 2-3 mm의둥근반점으로서한 개또는몇개가체점막의어느곳에서 도생길수있으며, 일광흑자는햇볕의 노출부위특히얼굴과손등에불규칙한 모양과균일한검은색을보이는색소반 이산재하여발생한다 4). 멜라닌색소의주요기능은피부에서 발생하는 active oxygen이나 free radical 을제거하고, 자외선을흡수또는분산 시켜체내에자외선이들어가지못하도 록피부를보호하는역할을하는데 4-6), 궁극적으로색소침착을유발하게된다. UV 포로부터 과함께 등의외부스트레스는피부각질세 α-msh 와같은 growth hormone TGF- β, PGE₂등을분비하는 데, 이러한 cytokine류는 melanocyte에 존재하는수용체에결합하여세포기능을 활성화시킨다 26). 활성화된 melanocyte 는 인 melanosome 에서페놀류의고분자물질 을합성하는데, 이러한 은외부스트레스로부터피부를방어하 는기전의일환으로작용하게된다 27). Keratinocyte ( 각질형성세포 ) 에의해분비 된 α-msh 에의해자극을받은 melanocyte 로부터생성된 은 dendrite 등을 통하여다시 keratinocyte등에전해져서 스트레스에의한세포상해를억제하는 작용을나타내게한다 28). 한의학에서색소침착증은 黃帝內經 素門 < 至眞要大論 > 7) 에 면진 ( 面塵 ) 이 라하여처음언급된이래, 諸病源候 論 < 面皯黑䵳候 > 8) 에서그병리기전과 형태에대하여구체적으로언급하였고, 이후제가들에의해형태와색조에따라 간증 ( 䵟䵳 ), 간점 ( 䵟點 ), 면흑 ( 面黑 ), 면간증 ( 面䵟䵳 ), 작란 ( 雀卵 ), 반간증 ( 斑䵟䵳 ), 염자 ( 黶子 ), 작반( 雀斑 ), 여 흑반 ( 黧黑斑 ), 간암 ( 䵟黯 ), 여흑간증 ( 黧黑䵟䵳 ), 흑반 ( 黑斑 ) 등으로다양하 게표현되어있다 9). 한의학적병인으로 첫째 陽明之氣不足을들었고 7), 둘째風 邪와痰飮으로氣血이不和됨을원인으 로보았으며 8), 셋째思慮過多로인하여 脾胃를 傷하여발생한다고하였고 29) 넷 째는腎水不足으로인한虛火의발생을, 103

10 柴胡疎肝散加減方이멜라닌생성및유전자발현에미치는영향 30), 다섯째는熱을주된원인으로파악 하였다 31). 최근미백효과에대한연구는피부미 백효과와항산화작용및피부노화방지 를포함하는포괄적인개념으로진행되 고있는데, 자외선차단소재연구, 멜라 닌세포에멜라닌() 의합성을명 령하는신호전달물질인 cytokine의작용 을조절하는연구, 유전자발현억제, tyrosinase 작용억제, 활성산소제거소재, 색소환원, 각질층제거촉진소재연구등 다양하게진행되고있다. 이중에서도 tyrosinase 의활성을억제하여멜라닌의 초기생성을감소시키는기전이주로많 이연구되고있다 4-6). 또한피부미백제로는 Kojic acid, arbutin, ascorbic acid, hydroquinone 등 이많이사용되고있는데, 이들제품의 안정성 에 32,33), (stability) 에문제가있기때문 화학적인물질이아닌천연물에 서부작용을줄이면서안전성있는물질 을찾는연구를수행하고있으며이로 인해초점이한방으로돌려지고있는실 정이다 34). 한약재를이용한미백관련연구로는 赤何首烏 9), 車前子 11), 黃柏 12), 五味子 35), 白彊蠶 36), 補骨脂 37), 側柏葉 38), 川芎 39), 白朮 40), 細辛 41), 枳實 42), 桂皮 43) 등의추 출액들이멜라닌생성억제효과가있다 고보고하였으며, 미백연구로 한약복합제제에대한 麻黃및摩風膏 44), 瀉白散 45), 加減西施玉容散 46), 加味歸脾湯 47), 加味大 黃膏 13) 및逍遙散加減化裁 14) 등에대한 연구가이루어졌다. 柴胡疎肝散은 疏肝 行氣 活血 止 痛의효능이있어肝經受邪로인한左脇 痛을치료할목적으로창방되었다 17,48). 張 49) 은柴胡疎肝散원방에서靑皮를陳 皮醋炒로, 枳殼을枳殼醋炒로변화시켰 는데, 근대의의서들에서는張의處方을 주로인용하여사용하고있다 50,51). 柴胡疎肝散加減方은 中醫婦科臨床精 華 에수록된처방으로 柴胡疎肝散에서 陳皮, 枳殼을去하고當歸, 鬱金, 黃芩, 丹蔘, 鷄血藤, 枳實炒를加하여肝鬱氣滯 로인해顔面에氣血의濡養이이루어지 지못하여발생하는 데에활용되고있다 18). 黃褐斑을치료하는 柴胡疎肝散加減方의구성약물의 性味 와效能을살펴보면, 柴胡는性味가苦 凉하고疏肝解鬱 升擧陽氣하며, 當歸 는性味가溫甘辛하고補血和血 調經止 痛의效能이있으며, 香附子는性味가 辛微苦甘平하고理氣解鬱 調經止痛하며, 鬱金은性味가凉辛苦하고行氣化痰 淸 心解鬱하며, 黃芩은性味가寒苦하고瀉 實火 除退熱하며, 白芍藥은性味가苦 酸凉하고養血斂陰 平抑肝陽의效能이 있으며, 丹蔘은性味가微寒苦하고活血 去痰 凉血消癰의效能이있으며, 鷄血 藤은性味가溫苦微甘하고活血補血 舒 筋活絡하며, 枳實은性味가微寒苦辛酸 하고破氣散結 瀉痰消積의效能이있으 며, 川芎은性味가辛溫하고活血行氣 祛風止痛의效能이있으며, 甘草는性味 가甘平하고補裨益氣 調和諸藥의효능 이있다 52). 이상으로보아시호소간산가 감방은 氣滯로인한 로사료된다. 疏肝解鬱, 活血消斑하므로, 肝鬱 黃褐斑에효과가있을것으 본연구에서는시호소간산가감방 (SS) 의미백효과를확인하고자, mouse melanoma cell인 B16F10을이용하여 SS가 유리와 tyrosinase의활성에미치는영향 104

11 The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.22 No.1 February 2009 을측정하였으며, 그작용기전을밝히 기위하여 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, ERK-1 향을평가하였다. Melanin 등의유전자발현에미치는영 은외부스트레스로부터피부 를방어하는기전의일환으로 melanocyte 에서합성된다 53). 그러나피부미백에부 정적영향을주기때문에 합성 을차단하기위한다양한시도가있었 다. 본연구에서는시호소간산가감방추 출물을이용하여 억제를시도하 였다. Melanin 생성세포로는마우스에서 얻은흑색종의일종인 B16F10 melanoma cell 을이용하였다. α-msh는 UV와같은 외부스트레스를받으면피부각질세포 로부터유리되며 melanocyte 에존재하는수 용체에결합하여기능을나타내는 growth hormone 의일종이다. B16F10 melanoma cell은 α-msh (10 μm) 를처리한경우세포배양액에유출 되는 의량이유의하게증가하였 다. 그러나 SS는 300, 150 μg/ ml의농도 에서 해각각 의량을처리대조군에비 Melanin 재하는 21%, 14% 감소시켰다(Fig. 1). 합성은 melanosome 내에존 tyrosinase 의작용을통해이루어진 다. 이 tyrosinase 는 L-tyrosine 을산화시켜 L-DOPA 를만드는 tyrosine hydroxylase 로 작용하며, DOPA 를산화시켜 DOPAquinone 을만드는 DOPA oxidase로작용하여 을합성하는중요한효소로알려 져있다. 그러므로 생성을억제 하는피부미백제개발에는 tyrosinase의 활성을억제하는것이필수적이다. 따라 서 SS가 합성을억제하는것을확 인하고, tyrosinase 활성에미치는영향을 평가하기위하여 mushroom 의 tyrosinase 활성에미치는영향을측정하였다. Mushroom tyrosinase의저해제는 tyrosinase 활성부 위구리이온의상태변화에관여함으로써 tyrosinase 의산화, 환원과정을조절할 수있기때문에, 버섯 tyrosinase를이용 한시험관내 tyrosinase 활성억제실험은 피부미백제의개발에있어서유용한일 차평가법으로인정되고있다 54). 실험결과 SS는 300, 150 μg/ ml농도에서 tyrosinase 활성을대조군에비해각각 30%, 14% 억제하였다 (Fig. 2). 면 Melanocyte 내유전자발현이증가하 합성이증가하게된다 55-57). 따라서 tyrosinase 발현을억제하면 합성을억제할수있다. 본연구 에서는 SS가 생성에관여하는 유전자들에미치는영향을평가하는일 환으로 을 tyrosinase의발현에미치는영향 RT-PCR 및 real time PCR system 을이용하여평가하였다. 실험결과 tyrosinase는 α-msh (10 μm) 처리시 발현이정상군에비해증가하였으며, SS 는증가한유전자발현을 200, 100, 25 μg/ ml의농도에서대조군에비해유의성 있게억제하였다 (Fig. 3). TRP-1은 tyrosinase related protein으 로알려져있는단백질로서 TRP-2에의 해생성된 DHICA (5,6-dihydroxy indole -2-carboxylic acid) 를 oxidation 시켜 IQCA (indole-2-carboxylic acid) 를생성 하는데, IQCA는흑갈색을나타낸다 따라서 TRP-1 58,59). 발현을억제하면미백효 과를기대할수있다. 실험결과 TRP-1 은 α-msh (10 μm) 처리시발현이정 상군에비해증가하였으며, SS는 200, 100, 50, 25 μg/ ml의농도에서증가한유 전자발현을대조군에비해억제하였으 105

12 柴胡疎肝散加減方이멜라닌생성및유전자발현에미치는영향 나유의성이없었다 (Fig. 4). TRP-2는 DOPAchrome tautomerase 로알려져있는효소로서 DOPAchrome 을이용하여 DHICA (5,6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid) 를생성한다. DHICA는 TRP-1에의해산화되어 IQCA (indole-2-carboxylic acid) 를생성하는데, IQCA 는흑갈색을나타낸다 TRP-2 58,59). 따라서, 발현을억제하면미백효과를기 대할수있다. 실험결과 TRP-2는 α -MSH (10 μm) 처리시발현이정상군 에비해유의성있게증가하였으며, SS 는 200, 100, 50 μg/ ml 농도에서증가한 유전자발현을대조군에비해유의성있 게억제하였다 (Fig. 5). ERK는 extracellular regulated kinase 로알려져있는세포내신호전달단백질 로유전자발현을조절하는인자로알려 져있으며, ERK의발현이억제되면 색소생성이증가하는것으로 알려져있다 56). 따라서 ERK-1의발현이 증가하면색소생성이억제될수있다. 실험결과 ERK-1은 α-msh (10 μm) 처리시발현이정상군에비해감소하였 으며, SS는 200, 100, 50, 25 μg/ ml농도 에서감소한유전자발현을대조군에비 해유의성있게증가시켰다 (Fig. 6). 이상의결과시호소간산가감방 (SS) 는 생성에관여하는 tyrosinase, TRP-2 발현을억제하고, 신호전달단백 질로유전자조절인자들인 ERK-1의발 현을증가시켜, melanocyte의 생성을억제하는것으로판단된다. Ⅴ. 결 론 柴胡疎肝散加減方 (SS) 의추출물을 이용하여 유리에미치는영향을 측정하였다. 또한, 생성과관련 되는 tyrosinase의활성과유전자발현에 대한연구를통하여아래와같은결과를 얻었다. 1. SS는 B16F10 melanoma cell의 유리를유의성있게억제하였다. 2. SS는 tyrosinase 의활성을유의성있 게억제하였다. 3. SS는 B16F10 melanoma cell에서 tyrosinase 및 TRP-2의유전자발현 을유의성있게억제하였으나, TRP-1 의발현에는유의성이없었다. 4. SS는 B16F10 melanoma cell에서 ERK-1 의발현을유의성있게증가 시켰다. 이상의결과, 시호소간산가감방추출 물은 melanocyte에서 생성을억 제함으로써미백효과를나타낸다고생각 된다. 따라서향후시호소간산가감방에 대한연구가한방부인과영역에서黃褐 斑 다. 치료를위한토대가되기를기대한 참고문헌 1. 하병조. 화장품학. 서울: 壽文社 ; Maeda K, Fukuda M. In vitro effectiveness of several whitening cosmetic components in human melanocytes. J. Soc Cosmet Chem. 1991;42: Mishima Y, Kondoh H, Hatae S. Overview for development of future 106

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