(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2014-0015139 (43) 공개일자 2014년02월06일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C07K 16/28 (2006.01) C07K 16/22 (2006.01) C12N 15/13 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) (21) 출원번호 10-2012-7012401 (22) 출원일자 ( 국제 ) 2010 년 10 월 15 일 심사청구일자 없음 (85) 번역문제출일자 2012 년 05 월 14 일 (86) 국제출원번호 PCT/US2010/052843 (87) 국제공개번호 WO 2011/047262 국제공개일자 (30) 우선권주장 2011 년 04 월 21 일 61/251,804 2009 년 10 월 15 일미국 (US) 전체청구항수 : 총 76 항 (54) 발명의명칭이원가변도메인면역글로불린및이의용도 (57) 요약 (71) 출원인 애브비인코포레이티드 미국일리노이주 60064 놀스시카고놀스워키건로드 1 (72) 발명자 가유르타리크 미국매사추세츠주 01746 홀리스톤워싱턴스트리트 1014 카마쓰라제쉬브이. 미국매사추세츠주 01545 슈루즈버리레드랜드스트리트 27 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 본발명은가공된다가및다특이적결합단백질, 이의제조방법, 및특히질환의예방, 진단및 / 또는치료에사용하기위한이의용도에관한것이다. 대표도 - 도 1 장훈 - 1 -
(72) 발명자 류쥔졘 미국매사추세츠주 01545 슈루즈버리크림슨드라이브 14 오노르마리페. 미국매사추세츠주 02482 웰즐리유니트 34 오크스트리트 11-2 -
특허청구의범위청구항 1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 중쇄가변도메인이고 ; VD2는제2 중쇄가변도메인이고 ; C는중쇄불변도메인이고 ; X1은링커이고단, 이것은 CH1이아니고 ; X2는 Fc 영역이고 ; n은 0 또는 1이다 ] 를포함하는폴리펩타이드쇄를포함하는결합단백질로서, 상기결합단백질이 NGF와 PGE2; NGF와 TNF-α; NGF와 IL-1β; 및 NGF와 IL-6R로이루어진그룹으로부터선택되는항원쌍과결합할수있는, 결합단백질. 청구항 2 제1항에있어서, VD1 및 VD2가서열번호 28, 30, 32, 및 34로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는, 결합단백질. 청구항 3 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 경쇄가변도메인이고 ; VD2는제2 경쇄가변도메인이고 ; C는경쇄불변도메인이고 ; X1은링커이고단, 이것은 CH1이아니고 ; X2는 Fc 영역을포함하지않고 ; n은 0 또는 1이다 ] 를포함하는폴리펩타이드쇄를포함하는결합단백질로서, 상기결합단백질이 NGF와 PGE2; NGF와 TNF-α; NGF와 IL-1β; 및 NGF와 IL-6R로이루어진그룹으로부터선택되는항원쌍과결합할수있는, 결합단백질. 청구항 4 제3항에있어서, 상기 VD1 및 VD2 경쇄가변도메인이서열번호 29, 31, 33, 및 35로이루어진그룹으로부터선택된아미노산서열을포함하는, 결합단백질. 청구항 5 제1항또는제3항에있어서, n이 0인결합단백질. 청구항 6 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 중쇄가변도메인이고 ; VD2는제2 중쇄가변도메인이고 ; C는중쇄불변도메인이고 ; - 3 -
X1은링커이고, 단이것은 CH1이아니고 ; X2는 Fc 영역이다 ] 를포함하는제1 폴리펩타이드쇄및제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 경쇄가변도메인이고 ; VD2는제2 경쇄가변도메인이고 ; C는경쇄불변도메인이고 ; X1은링커이고, 단, 이것은 CH1이아니고 ; X2는 Fc 영역을포함하지않고 ; n은 0 또는 1이다 ] 를포함하는제2 폴리펩타이드쇄를포함하는결합단백질로서, 상기결합단백질이 NGF와 PGE2; NGF와 TNF-α; NGF와 IL-1β; 및 NGF와 IL-6R로이루어진그룹으로부터선택된항원쌍과결합할수있는, 결합단백질. 청구항 7 제6항에있어서, 상기 VD1 및 VD2 중쇄가변도메인이서열번호 28, 30, 32, 및 34로이루어진그룹으로부터선택된아미노산서열을포함하고, 상기 VD1 및 VD2 경쇄가변도메인이서열번호 29, 31, 33, 및 35로이루어진그룹으로부터선택된아미노산서열을포함하는, 결합단백질. 청구항 8 제1항, 제3항및제6항중어느한항에있어서, X1 또는 X2가서열번호 1 내지 26으로이루어진그룹으로부터선택된아미노산서열인, 결합단백질. 청구항 9 제6항에있어서, 상기결합단백질이 2개의제1 폴리펩타이드쇄및 2개의제2 폴리펩타이드쇄를포함하는, 결합단백질. 청구항 10 제1항, 제3항및제6항중어느한항에있어서, 상기 Fc 영역이본래의서열 Fc 영역및변이서열 Fc 영역으로이루어진그룹으로부터선택된, 결합단백질. 청구항 11 제10항에있어서, 상기 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 및 IgD 기원의 Fc 영역으로이루어진그룹으로부터선택된, 결합단백질. 청구항 12 제1항, 제3항및제6항중어느한항에있어서, 상기제1 폴리펩타이드쇄의 VD1 및상기제2 폴리펩타이드쇄의 VD1이각각동일한제1 및제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득되는, 결합단백질. 청구항 13 제1항, 제3항및제6항중어느한항에있어서, 상기제1 폴리펩타이드쇄의 VD1 및상기제2 폴리펩타이드쇄의 VD1이각각상이한제1 및제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득되는, 결합단백질. 청구항 14 제1항, 제3항및제6항중어느한항에있어서, 상기제1 폴리펩타이드쇄의 VD2 및상기제2 폴리펩타이드쇄의 VD2가각각동일한제1 및제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득되는, 결합단백질. - 4 -
청구항 15 제1항, 제3항및제6항중어느한항에있어서, 상기제1 폴리펩타이드쇄의 VD2 및상기제2 폴리펩타이드쇄의 VD2가각각상이한제1 및제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득되는, 결합단백질. 청구항 16 제13항내지제15항중어느한항에있어서, 상기제1 및제2 모항체가상기항원상의상이한에피토프에결합하는, 결합단백질. 청구항 17 제13항내지제15항중어느한항에있어서, 상기제1 모항체또는이의항원결합부가, 상기제2 모항체또는이의항원결합부가상기제2 항원에결합하는효능과상이한효능으로상기제1 항원에결합하는, 결합단백질. 청구항 18 제13항내지제15항중어느한항에있어서, 상기제1 모항체또는이의항원결합부가, 상기제2 모항체또는이의항원결합부가상기제2 항원에결합하는친화성과상이한친화성으로상기제1 항원에결합하는, 결합단백질. 청구항 19 제13항내지제15항중어느한항에있어서, 상기제1 모항체또는이의항원결합부및상기제2 모항체또는이의항원결합부가사람항체, CDR 접목항체및사람화된항체로이루어진그룹으로부터선택되는, 결합단백질. 청구항 20 제13항내지제15항중어느한항에있어서, 상기제1 모항체또는이의항원결합부및상기제2 모항체또는이의항원결합부가 Fab 단편 ; a F(ab') 2 단편 ; 힌지영역에서디설파이드브릿지에의해연결된 2개의 Fab 단편을포함하는 2가단편 ; VH 및 CH1 도메인으로이루어진 Fd 단편 ; 단일암 (arm) 의항체의 VL 및 VH 도메인으로이루어진 Fv 단편 ; dab 단편 ; 분리된상보성결정영역 (CDR); 단일쇄항체 ; 및이중항체 (diabody) 로이루어진그룹으로부터선택되는, 결합단백질. 청구항 21 제1항, 제3항및제6항중어느한항에있어서, 상기결합단백질이, 상기제1 모항체또는이의항원결합부, 또는상기제2 모항체또는이의항원결합부에의해나타나는하나이상의목적하는성질을나타내는, 결합단백질. 청구항 22 제22항에있어서, 상기목적하는성질이하나이상의항체파라미터로부터선택되는, 결합단백질. 청구항 23 제21항에있어서, 상기항체파라미터가항원특이성, 항원에대한친화성, 효능, 생물학적기능, 에피토프인지, 안정성, 용해도, 생산효율, 면역원성, 약리역학, 생체이용률, 조직교차반응성, 및유사항원결합으로이루어진그룹으로부터선택되는, 결합단백질. 청구항 24 2개의폴리펩타이드쇄가 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 중쇄가변도메인이고 ; VD2는제2 중쇄가변도메인이고 ; - 5 -
C는중쇄불변도메인이고 ; X1은링커이고, 단이것은 CH1이아니고 ; X2는 Fc 영역이다 ] 를포함하고 ; 2개의폴리펩타이드쇄가 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 경쇄가변도메인이고 ; VD2는제2 경쇄가변도메인이고 ; C는경쇄불변도메인이고 ; X1은링커이고, 단, 이것은 CH1이아니고 ; X2는 Fc 영역을포함하지않고 ; n은 0 또는 1이다 ] 를포함하는 4개의폴리펩타이드쇄를포함하는, 2개의항원과결합할수있는결합단백질로서, 상기 VD1 및 VD2 중쇄가변도메인이서열번호 28, 30, 32, 및 34로이루어진그룹으로부터선택된아미노산서열을포함하고, 상기 VD1 및 VD2 경쇄가변도메인이서열번호 29, 31, 33, 및 35로이루어진그룹으로부터선택되는아미노산서열을포함하는, 결합단백질. 청구항 25 2개의폴리펩타이드쇄가 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 중쇄가변도메인이고 ; VD2는제2 중쇄가변도메인이고 ; C는중쇄불변도메인이고 ; X1은링커이고, 단이것은 CH1이아니고 ; X2는 Fc 영역이고 ; n은 0 또는 1이다 ] 를포함하고 ; 2개의폴리펩타이드쇄가 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 경쇄가변도메인이고 ; VD2는제2 경쇄가변도메인이고 ; C는경쇄불변도메인이고 ; X1은링커이고, 단, 이것은 CH1이아니고 ; X2는 Fc 영역을포함하지않고 ; n은 0 또는 1이다 ] 를포함하는 4개의폴리펩타이드쇄를포함하는, 2개의항원과결합할수있는결합단백질로서, 상기 DVD-Ig가 NGF와 PGE2; NGF와 TNF-α; NGF와 IL-1β; 및 NGF와 IL-6R로이루어진그룹으로부터선택된하나이상의항원과결합하는, 결합단백질. 청구항 26 제1항, 제3항, 제6항, 제24항및제25항중어느한항에있어서, 상기하나이상의표적에대해표면플라스몬공명에의해측정시적어도약 10 2 M -1 s -1 ; 적어도약 10 3 M -1 s -1 ; 적어도약 10 4 M -1 s -1 ; 적어도약 10 5 M -1 s -1 ; 및적어도약 10 6 M -1 s -1 로이루어진그룹으로부터선택되는결합속도상수 (Kon) 를갖는, 결합단백질. - 6 -
청구항 27 제1항, 제3항, 제6항, 제24항및제25항중어느한항에있어서, 상기하나이상의표적에대해표면플라스몬공명에의해측정시최대약 10-3 s -1 ; 최대약 10-4 s -1 ; 최대약 10-5 s -1 ; 및최대약 10-6 s -1 로이루어진그룹으로부터선택되는해리속도상수 (Koff) 를갖는, 결합단백질. 청구항 28 제 1 항, 제 3 항, 제 6 항, 제 24 항및제 25 항중어느한항에있어서, 상기하나이상의표적에대해최대약 10-7 M; 최대약 10-8 M; 최대약 10-9 M; 최대약 10-10 M; 최대약 10-11 M; 최대약 10-12 M; 및최대 10-13 M 로이루어진그룹 으로부터선택되는해리상수 (K D ) 를갖는, 결합단백질. 청구항 29 면역부착분자, 이미지화제, 치료제및세포독성제로이루어진그룹으로부터선택된제제를추가로포함하는, 제1항, 제3항, 제6항, 제24항및제25항중어느한항에따른결합단백질을포함하는, 결합단백질접합체. 청구항 30 제29항에있어서, 상기제제가방사선표지, 효소, 형광표지, 발광표지, 생물발광표지, 자기표지및비오틴으로이루어진그룹으로부터선택된이미지화제인결합단백질접합체. 청구항 31 제30항에있어서, 상기이미지화제가 3 H, 14 C, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I, 177 Lu, 166 Ho, 및 153 Sm으로이루어진그룹으로부터선택된방사선표지인결합단백질접합체. 청구항 32 제30항에있어서, 상기제제가항-대사물, 알킬화제, 항생제, 성장인자, 사이토킨, 항-혈관형성제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소및아폽토시스제제로이루어진그룹으로부터선택된치료제또는세포독성제인결합단백질접합체. 청구항 33 제1항, 제3항, 제6항, 제24항및제25항중어느한항에있어서, 결정화된결합단백질인결합단백질. 청구항 34 제33항에있어서, 상기결정이담체부재약제학적제어방출결정인결합단백질. 청구항 35 제33항에있어서, 상기결합단백질의가용성대응물보다큰생체내반감기를갖는, 결합단백질. 청구항 36 제33항에있어서, 생물학적활성을보유하는, 결합단백질. 청구항 37 제1항, 제3항, 제6항, 제24항및제25항중어느한항에따른결합단백질아미노산서열을암호화하는분리된핵산. 청구항 38 제37항에따른분리된핵산을포함하는벡터. 청구항 39-7 -
제38항에있어서, pcdna, ptt, ptt3, pefbos, pbv, pjv, pcdna3.1 TOPO, pef6 TOPO, 및 pbj로이루어진그룹으로부터선택되는벡터. 청구항 40 제38항에따른벡터를포함하는숙주세포. 청구항 41 제40항에있어서, 원핵세포인숙주세포. 청구항 42 제41항에있어서, 이. 콜라이 (E. Coli) 인숙주세포. 청구항 43 제40항에있어서, 진핵세포인숙주세포. 청구항 44 제43항에있어서, 상기진핵세포가원생동물세포, 동물세포, 식물세포및진균류세포로이루어진그룹으로부터선택되는, 숙주세포. 청구항 45 제43항에있어서, 상기진핵세포가포유동물세포, 조류세포및곤충세포로이루어진그룹으로부터선택되는동물세포인숙주세포. 청구항 46 제45항에있어서, CHO 세포인숙주세포. 청구항 47 제45항에있어서, COS인숙주세포. 청구항 48 제43항에있어서, 효모세포인숙주세포. 청구항 49 제48항에있어서, 상기효모세포가사카로마이세스세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 인숙주세포. 청구항 50 제45항에있어서, 곤충 Sf9 세포인숙주세포. 청구항 51 결합단백질을제조하기에충분한조건하에서배양배지에서제40항내지제50항중어느한항에따른숙주세포를배양함을포함하는, 결합단백질을제조하는방법. 청구항 52 제51항에있어서, 제조된결합단백질의 50% 내지 75% 가이원특이적 4가결합단백질인방법. 청구항 53 제51항에있어서, 제조된결합단백질의 75% 내지 90% 가이원특이적 4가결합단백질인방법. 청구항 54-8 -
제51항에있어서, 제조된결합단백질의 90% 내지 95% 가이원특이적 4가결합단백질인방법. 청구항 55 제51항의방법에따라제조된단백질. 청구항 56 제1항내지제36항및제55항중어느한항의결합단백질및약제학적으로허용되는담체를포함하는약제학적조성물. 청구항 57 제56항에있어서, 하나이상의추가치료제를추가로포함하는약제학적조성물. 청구항 58 제57항에있어서, 상기추가치료제가치료제, 이미지화제, 세포독성제, 혈관형성억제제 ; 키나제억제제 ; 공동자극분자차단제 ; 부착분자차단제 ; 항-사이토킨항체또는이의기능성단편 ; 메토트렉세이트 ; 사이클로스포린 ; 라파마이신 ; FK506; 검출가능한표지또는리포터 ; TNF 길항제 ; 항류마티스제 ; 근육이완제, 진통제, 비-스테로이드소염약물 (NSAID), 진정제, 마취제, 진정제 (sedative), 국부마취제, 신경근차단제, 항미생물제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화성스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장호르몬, 호르몬대체약물, 방사선약제, 항우울제, 항정신제, 자극제, 천식약제, 베타효능제, 흡입스테로이드, 에피네프린또는유사체, 사이토킨및사이토킨길항제로이루어진그룹으로부터선택되는약제학적조성물. 청구항 59 제1항내지제36항및제55항중어느한항의결합단백질을피험체에게투여하여치료가달성되는, 피험체의질환또는장애를치료하기위한방법. 청구항 60 제59항에있어서, 상기장애가류마티스성관절염, 골관절염, 연소성만성관절염, 패혈성관절염, 라임관절염, 건선관절염, 반응성관절염, 척추관절증, 전신홍반성낭창, 크론질환, 대장염, 장염증질환, 인슐린의존성진성당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성질환, 건선, 피부경화증, 이식편대숙주질환, 기관이식거부, 기관이식과관련된급성또는만성면역질환, 유육종증, 동맥경화증, 파종성혈관내응고, 가와사키병, 그레이브병, 신증후군, 만성피로증후군, 베게너육아종증, 헤노흐-쇼엔라인자반증, 신장의현미경적혈관염, 만성활성간염, 포도막염, 패혈성쇼크, 독소쇼크증후군, 패혈증증후군, 악액질, 감염성질환, 기생충질환, 후천성면역결핍증후군, 급성횡단성척수염, 헌팅톤무도병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 원발성담즙성간경변, 용혈성빈혈, 악성종양, 심부전증, 심근경색, 애디슨병, 산발성질환, 다분비선제I형결핍증및다분비선제II형결핍증, 슈미트증후군, 성인성 ( 급성 ) 호흡곤란증후군, 탈모증, 원형탈모증, 혈청반응음성관절증, 관절증, 라이터병, 건선성관절증, 궤양성대장염성관절증, 장병증성관절병증, 클라미디아증, 예르시니아및살모넬라관련관절증, 척추관절증, 죽종질환 / 동맥경화증, 아토피성알레르기, 자가면역수포성질환, 심상성천포창, 낙엽성천포창, 유천포창, 선상 IgA 질환, 자가면역용혈성빈혈, 크움즈양성용혈성빈혈, 후천성악성빈혈, 연소성악성빈혈, 근통성뇌염 / 로얄프리 (Royal Free) 질환, 만성점막피부칸디다증, 거세포동맥염, 원발성경화성간염, 잠복성자가면역간염, 후천성면역결핍질환증후군, 후천성면역결핍관련질환, B형간염, C형간염, 공통가변성면역결핍증 ( 공통가변성감마글로불린저혈증 ), 확장형심근증, 여성불임증, 난소부전증, 조숙난소부전, 섬유성폐질환, 잠복성섬유조직폐포염, 후-염증성간질성폐질환, 간질성폐렴, 결합조직질환관련간질성폐질환, 조합성결합조직질환관련폐질환, 전신성경화증관련간질성폐질환, 류마티스성관절염관련간질성폐질환, 전신홍반성낭창관련폐질환, 피부근염 / 다발성근염관련폐질환, 쇼그렌질환관련폐질환, 강직성척추염관련폐질환, 혈관염범발성폐질환, 혈철증관련폐질환, 약물-유도된간질성폐질환, 섬유증, 방사선섬유증, 폐색성세기관지염, 만성호산구성폐렴, 림프구성침윤성폐질환, 감염후간질성폐질환, 통풍성관절염, 자가면역간염, 1형자가면역간염 ( 전형적자가면역또는루포이드간염 ), 2형자가면역간염 ( 항-LKM 항체간염 ), 자가면역매개된저혈당증, 흑색극세포증에따른 B형인슐린저항성, 부갑상선기능저하증, 기관이식과관련된급성면역질환, 기관이식과관련된만성 - 9 -
면역질환, 골관절증, 원발성경화성담관염, 1형건선, 2형건선, 특발성백혈구감소증, 자가면역호중구감소증, 신장질환 NOS, 사구체신염, 신장의현미경적혈관염, 라임병, 원판양홍반성낭창, 남성불임증특발증또는 NOS, 정자자가면역, 다발성경화증 ( 모든아형 ), 교감성안염, 결합조직질환에속발성인폐고혈압증, 구드패스튜어증후군, 결절성다발성동맥염의폐징후, 급성류마티스성열, 류마티스성척추염, 스틸씨병, 전신성경화증, 쇼그렌증후군, 다카야스병 / 동맥염, 자가면역혈소판감소증, 특발성혈소판감소증, 자가면역갑상선질환, 갑상선기능항진증, 갑상선종증자가면역갑상선기능저하증 ( 하시모토병 ), 위축성자가면역갑상선기능저하증, 원발성점액수종, 수정체성혈관염, 원발성혈관염, 백반증급성간질환, 만성간질환, 알콜성경변, 알콜유도간손상, 콜레오사타티스 (choleosatatis), 특이체질성간질환, 약물유도간염, 비알콜성지방간염, 알레르기및천식, B 그룹스트렙토코씨 (streptococci) (GBS) 감염, 정신장애 ( 예를들어, 우울증및정신분열증 ), Th2 형및 Th1 형매개질환, 급성및만성통증 ( 상이한형태의통증 ), 및폐암, 유방암, 위암, 방광암, 결장암, 췌장암, 난소암, 전립선암및직장암과같은암종및조혈악성종양 ( 백혈병및림프종 ), A베타지방단백질혈증, 말초청색증, 급성및만성기생충성또는감염성과정, 급성백혈병, 급성림프성모구성백혈병 (ALL), 급성골수백혈병 (AML), 급성또는만성세균감염, 급성췌장염, 급성신부전증, 선암종, 공기이소성심방박동, AIDS 치매합병증, 알콜유도간염, 알레르기성결막염, 알레르기성접촉피부염, 알레르기성비염, 동종이식거부, 알파-1-안티트립신결핍, 근위축성측삭경화증, 빈혈, 앙기나협심증, 전각세포퇴화, 항 cd3 치료, 항인지질증후군, 항-수용체과민성반응, 대동맥및말초결찰증, 대동맥해부, 동맥고혈압, 동맥경화증, 동정맥누공, 운동실조증, 심방세동 ( 지연또는발작성 ), 심방조동, 동정맥막힘, B 세포림프종, 골이식거부, 골수이식 (BMT) 거부, 좌각차단, 버키트림프종, 화상, 심장성부정맥, 심장성기절증후군, 심장종양, 심근증, 심폐우회염증반응, 연골이식거부, 소뇌피질퇴화, 소뇌장애, 혼란또는다초점심방빈맥, 화학치료관련장애, 만성골수성백혈병 (CML), 만성알콜증, 만성염증병리, 만성림프성백혈병 (CLL), 만성폐쇄폐질환 (COPD), 만성살리실레이트중독, 결장직장암종, 울혈성심부전, 결막염, 접촉성피부염, 폐심장, 관상동맥질환, 크루츠펠트-자콥 (Creutzfeldt-Jakob) 질환, 배양음성패혈증, 낭섬유증, 사이토킨치료관련장애, 권투선수치매 (Dementia pugilistica), 탈수초성질환, 댕기출혈열, 피부염, 피부학적증상, 당뇨병, 진성당뇨병, 당뇨병성동맥경화질환 (diabetic ateriosclerotic disease), 광범위루이체질환, 확장성울혈성심근증, 기저핵장애, 중년다운증후군, CNS 도파민수용체차단약물에의해유도된약물유도운동장애, 약물과민증, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비질환, 후두개염, 엡스타인-바르바이러스감염, 피부홍통증, 추체외로및소뇌장애, 가족성적혈구잠식성림프조직구증, 태아흉선이식거부, 프리드리히운동실조증, 기능성말초동맥장애, 진균류패혈증, 가스괴저, 위궤양, 사구체신염, 임의의기관또는조직이식거부, 그람음성패혈증, 그람양성패혈증, 세포내기관으로인한육아종, 모발세포백혈병, 할러포르덴-스파츠질환 (Hallervorden-Spatz disease), 하시모토갑상선염, 고초열, 심장이식거부, 혈색소증, 혈액투석, 용혈성요독증후군 / 혈전성혈소판감소성자반증, 출혈, 간염 (A), 히스다발부정맥, HIV 감염 /HIV 신경병증, 호지킨질환, 과운동성장애, 과민성반응, 과민성폐렴, 고혈압, 운동부족장애, 시상하부-뇌하수체-부신피질계평가, 특발성애디슨질환, 특발성폐섬유증, 항체매개세포독성, 무력증, 유아척추근육위축증, 대동맥염증, 인플루엔자 A, 이온화방사선노출, 홍채섬모체염 / 자궁염 / 광학적신경근염, 허혈관류손상, 허혈뇌졸중, 연소성류마티스관절염, 연소성척추근육위축증, 카포시육종, 신장이식거부, 레지오넬라, 리슈마니아증, 나병, 피질척수계병변, 지방부종, 간이식거부, 림프피부종, 말라리아, 악성림프종, 악성조직구증, 악성흑색종, 뇌막염, 수막염균혈증, 대사 / 특발성, 편두통, 미토콘드리아다중시스템장애, 복합연결조직질환, 모노클로날감마글로불린혈증, 다발성골수종, 다발성시스템퇴화 ( 만셀데제린-토마스쉬-드라거및마차도-조셉 ), 중증근무력증, 세포내마이코박테리움감염증, 마이코박테리움결핵, 골수이형성증후군, 심근경색, 심근허혈장애, 비인두암종, 신생아만성폐질환, 신염, 신증, 신경퇴행성질환, 신경성 I 근육위축증, 호중구감소성발열, 비-호지킨림프종, 복부대동맥및이의지류폐색, 폐색성동맥질환, okt3 치료, 고환염 / 부고환염, 고환염 / 절관절제술반전과정, 기비대, 골다공증, 췌장이식거부, 췌장암종, 부수종양성증후군 / 악성고칼슘혈증, 부갑상선이식거부, 골반염증질환, 다년성비염, 심막질환, 말초동맥경화질환, 말초혈관장애, 복막염, 악성빈혈, 폐포자충폐렴, 폐렴, POEMS 증후군 ( 다발신경병증, 장기비대, 내분비질환, 모노클로날감마글로불린혈증, 및피부변화증후군 ), 관류후증후군, 펌프후증후군, MI 후심장절개증후군, 자간전증, 전진적상핵마비, 원발성폐고혈압, 방사선치료, 레이노드현상및질환, 레이노드질환, 레프섬질환, 일반협소 QRS 심근증, 신혈관성고혈압, 재관류손상, 제한성심근병증, 육종, 피부경화증, 노인무도병, 루이체형노인성치매, 혈청음성관절병증, 쇼크, 겸상적혈구빈혈증, 피부동종이식거부, 피부변화증후군, 소장이식거부, 고형종양, 특이적부정맥, 척수운동실조, 척수소뇌퇴화, 스트렙토코커스근염, 소뇌구조적병변, 아급성경화성범뇌염, 실신, 심혈관계매독, 전신아나팔락시스, 전신염증반응증후군, 전신개시연소성류마티스관절염, T-세포또는 FAB ALL, 말초혈관확장증, 폐색성혈전혈관염, 혈소판감소증, 독성, 이식, 외상 / 출혈, III형 - 10 -
과민성반응, IV형과민성, 불안정앙기나, 요독증, 요로패혈증, 두드러기, 승모판심장질환, 하지정맥, 혈관염, 정맥동질환, 정맥종혈전증, 심실세동, 바이러스및진균류감염, 바이탈뇌염 / 무균성수막염, 바이탈-연관적혈구식작용증후군, 웨른니케-코르사코프증후군, 윌슨질환, 임의의기관또는조직의이종이식거부, 급성관상증후군, 급성특발성다발신경근염, 급성염증신경근병증, 급성허혈, 성인스틸스질환, 원형탈모증, 아나필락시스증 (anaphylaxis), 항-인지질항체증후군, 재생불량성빈혈, 동맥경화증, 아토피성습진, 아토피성피부염, 자가면역피부염, 스트렙토코커스감염과관련된자가면역장애, 자가면역장병증, 자가면역난청, 자가면역림프구증식성증후군 (ALPS), 자가면역심근염, 자가면역미성숙난소부전증, 안건염, 기관지확장증, 수포성유천포창, 심혈관질환, 악성항인지질증후군, 셀리악질환 (celiac disease), 경추척추증, 만성허혈, 반흔성유천포창, 다발성경화에대한위험을갖는임상적으로분리된증후군 (cis), 결막염, 유년기개시정신성장애, 만성폐쇄성폐질환 (COPD), 누낭염, 피부근염, 당뇨망막증, 진성당뇨병, 요추간반탈출증, 추간판내장증, 약물유도면역용혈성빈혈, 심내막염, 자궁내막증, 내안구염, 겉공막염, 다형홍반, 중증다형홍반, 임신성유천포창, 길레인바레증후군 (Guillain-Barre syndrome) (GBS), 건초열, 휴즈증후군 (Hughes syndrome), 특발성파킨슨질환, 특발성간질폐렴, IgE-매개알레르기, 면역용혈성빈혈, 봉입체근염, 감염성안구염증질환, 염증수초탈락질환, 염증심장질환, 염증신장질환, IPF/UIP, 홍채염, 각막염, 건성각결막염, 쿠스마울질환또는쿠스마울-마이어질환, 란드리마비, 랑게르한스세포조직구증, 열성홍반 (livedo reticularis), 황반변성, 미시적혈관염, 경직성척추염, 운동뉴런장애, 점막유천포창, 다발성기관부전증, 중증근무력증, 골수이형성증, 심근염, 신경근장애, 신경병증, 비-A 비-B 간염, 시신경염, 골용해, 난소암, 소수관절 JRA, 말초동맥폐색성질환 (PAOD), 말초혈관질환 (PVD), 말초동맥질환 (PAD), 정맥염, 결절성다발동맥염 ( 또는결절성동맥주위염 ), 다발연골염, 측두동맥염, 회색질척수염, 다발성관절 JRA, 다발성내분비결핍증후군, 다발성근염, 류마티스성다발성근육통 (PMR), 펌프후증후군, 1차파킨슨병, 전립선및직장암및조혈악성 ( 백혈병및림프종 ), 전립선염, 순수적혈구저형성증, 1차부신부전증, 재발성시속신경근염, 협착증, 류마티스심장질환, 사포 ( 활막염, 여드름, 농포증, 및골염 ), 피부경화증, 2차아밀로이드증, 폐쇼크, 상공막염, 좌골신경통, 2차부신부전증, 실리콘관련연결조직질환, 스네돈-윌킨슨 (sneddon-wilkinson) 피부증, 강직성척추염, 스티븐-존슨증후군 (SJS), 전신염증반응증후군, 일시적동맥염, 톡소플라스믹망막증, 독성표피괴사, 횡단척수염, TRAPS ( 종양괴사인자수용체, 1형알레르기반응, II형당뇨병, 두드러기, 통상의간질폐렴 (UIP), 혈관염, 춘계각결막염, 바이러스망막염, 보그트-고야나기-하라다 (Vogt-Koyanagi-Harada) 증후군 (VKH 증후군 ), 습윤황반퇴화, 상처치료, 관절병증과관련된여시니아및살모넬라증을포함하는그룹으로부터선택되는방법. 청구항 61 제60항에있어서, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 기관지내, 복강내, 캅셀내, 연골내, 강내, 세포내, 소뇌내, 소뇌심실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척추내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 일시주사 (bolus), 질내, 직장, 협측, 설하, 비내및경피투여로부터선택되는하나이상의방식으로피검체에투여되는방법. 청구항 62 a) 제1 항원과결합할수있는제1 모항체또는이의항원결합부를수득하는단계 ; b) 제2 항원과결합할수있는제2 모항체또는이의항원결합부를수득하는단계 ; c) VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은상기제1 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제1 중쇄가변도메인이고, VD2는상기제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제2 중쇄가변도메인이고, C는중쇄불변도메인이고, X1은링커이고, 단, 이것은 CH1이아니고, X2는 Fc 영역이고 n은 0 또는 1이다 ] 를포함하는제1 및제3 폴리펩타이드쇄를작제하는단계 ; d) VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, - 11 -
VD1은상기제1 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제1 경쇄가변도메인이고, VD2는상기제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제2 경쇄가변도메인이고, C는경쇄불변도메인이고, X1은링커이고, 단, 이것은 CH1이아니고, X2는 Fc 영역을포함하지않고, n은 0 또는 1이다 ] 를포함하는제2 및제4 폴리펩타이드쇄를작제하는단계 ; 및 e) 상기제1 및상기제2 항원과결합할수있는이원가변도메인면역글로불린이생성되도록상기제1, 제2, 제3 및제4 폴리펩타이드쇄를발현시키는단계를포함하는, 2개의항원과결합할수있는이원가변도메인면역글로불린을제조하는방법으로서, 상기결합단백질은 NGF와 PGE2; NGF와 TNF-α; NGF와 IL-1β; 및 NGF와 IL-6R로이루어진그룹으로부터선택된항원쌍과결합할수있는, 이원가변도메인면역글로불린을제조하는방법. 청구항 63 제62항에있어서, 상기 VD1 및 VD2 중쇄가변도메인이서열번호 28, 30, 32, 및 34로이루어진그룹으로부터선택된아미노산서열을포함하고, 상기 VD1 및 VD2 경쇄가변도메인이서열번호 29, 31, 33, 및 35로이루어진그룹으로부터선택된아미노산서열을포함하는방법. 청구항 64 제62항에있어서, 상기제1 모항체또는이의항원결합부및상기제2 모항체또는이의항원결합부가사람항체, CDR 접목항체및사람화된항체로이루어진그룹으로부터선택되는방법. 청구항 65 제62항에있어서, 상기제1 모항체또는이의항원결합부및상기제2 모항체또는이의항원결합부가 Fab 단편 ; a F(ab') 2 단편 ; 힌지영역에서디설파이드브릿지에의해연결된 2개의 Fab 단편을포함하는 2가단편 ; VH 및 CH1 도메인으로이루어진 Fd 단편 ; 단일암 (arm) 의항체의 VL 및 VH 도메인으로이루어진 Fv 단편 ; dab 단편 ; 분리된상보성결정영역 (CDR); 단일쇄항체 ; 및이중항체로이루어진그룹으로부터선택되는방법. 청구항 66 제62항에있어서, 상기제1 모항체또는이의항원결합부가이원가변도메인면역글로불린에의해나타나는하나이상의목적하는성질을갖는방법. 청구항 67 제62항에있어서, 상기제2 모항체또는이의항원결합부가이원가변도메인면역글로불린에의해나타나는하나이상의목적하는성질을갖는방법. 청구항 68 제62항에있어서, 상기 Fc 영역이본래의서열 Fc 영역및변이서열 Fc 영역으로이루어진그룹으로부터선택되는방법. 청구항 69 제62항에있어서, 상기 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 및 IgD 기원의 Fc 영역으로이루어진그룹으로부터선택되는방법. 청구항 70 제66항에있어서, 상기목적하는성질이하나이상의항체파라미터로부터선택되는방법. - 12 -
청구항 71 제67항에있어서, 상기목적하는성질이하나이상의항체파라미터로부터선택되는방법. 청구항 72 제70항에있어서, 상기항체파라미터가항원특이성, 항원에대한친화성, 효능, 생물학적기능, 에피토프인지, 안정성, 용해도, 생산효율, 면역원성, 약리역학, 생체이용률, 조직교차반응성, 및유사항원결합으로이루어진그룹으로부터선택되는방법. 청구항 73 제71항에있어서, 상기항체파라미터가항원특이성, 항원에대한친화성, 효능, 생물학적기능, 에피토프인지, 안정성, 용해도, 생산효율, 면역원성, 약리역학, 생체이용률, 조직교차반응성, 및유사항원결합으로이루어진그룹으로부터선택되는방법. 청구항 74 제62항에있어서, 상기제1 모항체또는이의항원결합부가, 상기제2 모항체또는이의항원결합부가상기제2 항원에결합하는친화성과상이한친화성으로상기제1 항원에결합하는방법. 청구항 75 제62항에있어서, 상기제1 모항체또는이의항원결합부가, 상기제2 모항체또는이의항원결합부가상기제2 항원에결합하는효능과상이한효능으로상기제1 항원에결합하는방법. 청구항 76 a) 제1 항원과결합할수있고이원가변도메인면역글로불린에의해나타나는하나이상의목적하는성질을갖는제1 모항체또는이의항원결합부를수득하는단계 ; b) 제2 항원과결합할수있고이원가변도메인면역글로불린에의해나타나는하나이상의목적하는성질을갖는제2 모항체또는이의항원결합부를수득하는단계 ; c) VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은상기제1 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제1 중쇄가변도메인이고, VD2는상기제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제2 중쇄가변도메인이고, C는중쇄불변도메인이고, X1은링커이고, 단, 이것은 CH1이아니고, X2는 Fc 영역이고, n은 0 또는 1이다 ] 를포함하는제1 및제3 폴리펩타이드쇄를작제하는단계 ; d) VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은상기제1 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제1 경쇄가변도메인이고, VD2는상기제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제2 경쇄가변도메인이고, C는경쇄불변도메인이고, X1은링커이고, 단, 이것은 CH1이아니고, X2는 Fc 영역을포함하지않고, n은 0 또는 1이다 ] 를포함하는제2 및제4 폴리펩타이드쇄를작제하는단계 ; 및 e) 목적하는성질을갖는, 상기제1 및상기제2 항원과결합할수있는이원가변도메인면역글로불린이생성되도록, 상기제1, 제2, 제3 및제4 폴리펩타이드쇄를발현시키는단계 - 13 -
를포함하는, 목적하는성질을갖는, 2개의항원에결합할수있는이원가변도메인면역글로불린을제조하는방법으로서, 상기결합단백질은 NGF와 PGE2; NGF와 TNF-α; NGF와 IL-1β; 및 NGF와 IL-6R로이루어진그룹으로부터선택된항원쌍과결합할수있는, 이원가변도메인면역글로불린을제조하는방법. 명세서 [0001] [0002] [0003] [0004] 기술분야관련출원의상호참조본출원은 2009년 10월 15일자로출원된미국임시특허출원제61/251,804호에대한우선권을주장하고, 이는임의의목적으로그전체가본원에참조로서명확하게인용된다. 기술분야본발명은다가및다특이적결합단백질, 이의제조방법및특히, 급성및만성염증질환, 암및기타질환의예방및 / 또는치료에있어서의이의용도에관한것이다. [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] 배경기술 2개이상의항원에결합할수있는다특이적항체와같이가공된단백질은당업계에공지되어있다. 당해다특이적결합단백질은세포융합, 화학적접합또는재조합 DNA 기술을사용하여제조될수있다. 이특이적항체는이특이적항체의목적하는특이성을갖는쥐모노클로날항체 (mab) 를발현하는 2개의상이한하이브리도마세포주의체세포융합을기초로하는쿼드로마 (quadroma) 기술 ( 문헌참조 : Milstein, C. and A.C. Cuello (1983) Nature 305(5934): p. 537-40) 을사용하여제조되었다. 수득한하이브리드-하이브리도마 ( 또는쿼드로마 ) 세포주내에서 2개의상이한면역글로불린 (Ig) 중쇄및경쇄의무작위쌍형성때문에, 10개이하의상이한 Ig 종이제조되고이중에하나만이기능성이특이적항체이다. 잘못된쌍을형성한부산물의존재및상당히감소된생산수율은정교한정제과정이요구됨을의미한다. 이특이적항체는 2개의상이한 mab의화학적접합에의해제조될수있다 ( 문헌참조 : Staerz, U.D., et al. (1985) Nature 314(6012): 628-31). 당해방법은균질의제제를생성시키지못한다. 다른방법은 2개의상이한 mab 또는보다소형의항체단편의화학적접합을사용하였다 ( 문헌참조 : Brennan, M., et al.(1985) Science 229(4708): 81-3). 이특이적항체를생성하기위해사용되는또다른방법은이종이기능성가교링커를사용하여 2개의모항체를커플링시키는것이지만수득한이특이적항체는가교링커와모항체의반응이부위특이적이지않기때문에분자적으로상당히이종성이다. 이특이적항체의보다균질의제제를수득하기위해, 2개의상이한 Fab 단편은부위특이적방식으로이들의힌지시스테인잔기에서화학적으로가교결합되었다 ( 문헌참조 : Glennie, M.J., et al.(1987) J. Immunol. 139(7): 2367-75). 그러나, 이러한방법으로는완전한 IgG 분자가아닌 Fab'2 단편이수득된다. 광범위한기타재조합이특이적항체포맷이최근에개발되었다 ( 문헌참조 : Kriangkum, J., et al.(2001) Biomol Eng, 2001. 18(2): 31-40). 이들중에서, 탠덤 (tandem) 단일쇄 Fv 분자및이중항체 (diabody) 및이의다양한유도체가가장광범위하게사용된다. 통상적으로, 이들분자의작제는상이한항원을인지하는 2개의단일쇄 Fv(scFv) 단편으로부터시작된다 ( 문헌참조 : Economides, A.N., et al.(2003) Nat. Med. 9(1): 47-52). 탠덤 scfv 분자 (tafv) 는추가의펩타이드링커를사용하여단순히 2개의 scfv 분자를연결하는곧은포맷을나타낸다. 탠덤 scfv 분자에존재하는 2개의 scfv 단편은분리된폴딩실체를형성한다. 다양한링커를사용하여 2개의 scfv 단편을연결시킬수있고링커의길이는 63개이하의잔기이다 ( 문헌참조 : Nakanishi, K., et al. (2001) Ann. Rev. Immunol. 19: 423-74). 모 scfv 단편은보통세균에서가용성형태로발현될수있지만탠덤 scfv 분자는흔히세균에서불용성응집체를형성하는것으로관찰된다. 따라서, 재폴딩프로토콜또는포유동물발현시스템의사용이가용성탠덤 scfv 분자를제조하는데적용된다. 최근연구에서, CD28 및흑색종관련프로테오글리캔에대해지시된탠덤 scfv의유전자전이래빗및소에의한생체내발현이보고되었다 ( 문헌참조 : Gracie, J.A., et al.(1999) J. Clin. Invest. 104(10): 1393-401). 당해작제에서, 2개의 scfv 분자는 CH1 링커에의해연결되고이특이적항체의혈청농도는 100mg/L 이하인것으로밝혀졌다. 도메인정렬 - 14 -
의변이및다양한길이또는유연성을갖는중간링커의사용을포함하는다양한전략을사용하여세균에서가용성으로발현시킬수있었다. 현재몇몇연구가세균에서, 매우짧은 Ala3 링커또는긴글라이신 / 세린풍부링커를사용한가용성탠덤 scfv 분자의발현을보고하였다 ( 문헌참조 : Leung, B.P., et al. (2000) J. Immunol. 164(12): 6495-502; Ito, A., et al. (2003) J. Immunol. 170(9): 4802-9; Karni, A., et al. (2002) J. Neuroimmunol. 125(1-2): 134-40). 최근연구에서, 길이가 3개또는 6개잔기인무작위중간링커를포함하는탠덤 scfv 레퍼토리의파아지디스플레이를사용하여세균에서가용성및활성형태로생성되는분자를집적시켰다. 당해방법으로 6개의아미노산잔기링커를갖는탠덤 scfv 분자를분리하였다 ( 문헌참조 : Arndt, M. and J. Krauss (2003) Methods Mol. Biol. 207: 305-21). 당해링커서열이탠덤 scfv 분자의가용성발현을위한일반적인해결책이되는지는불명확하다. 하지만, 당해연구는지시된돌연변이유발과병용하여탠덤 scfv 분자의파아지디스플레이가세균에서활성형태로발현될수있는분자를집적시키기위한강력한도구임을입증하였다. [0010] [0011] [0012] 이특이적이중항체 (Db) 는발현을위해이중항체포맷을사용한다. 이중항체는 VH 및 VL 도메인을연결하는링커의길이를약 5개의잔기로감소시킴에의해 scfv 단편들로부터제조된다 ( 문헌참조 : Peipp, M. and T. Valerius (2002) Biochem. Soc. Trans. 2002. 30(4): 507-11). 당해링커크기의감소는 VH와 VL 도메인의교차쌍형성에의한 2개의폴리펩타이드쇄의이량체화를촉진시킨다. 이특이적이중항체는동일세포내에서 VHA-VLB 및 VHB-VLA의구조 (VH-VL 배열 ), 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA의구조 (VL-VH 배열 ) 중어느하나를갖는 2개의폴리펩타이드쇄를발현시킴에의해제조된다. 다수의광범위한상이한이특이적이중항체가과거에제조되었었고이들대부분은세균에서가용성형태로발현될수있다. 그러나, 최근비교연구는가변성도메인의배향이활성결합부위의발현및형성에영향을줄수있음을입증한다 ( 문헌참조 : Mack, M. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 92(15): 7021-5). 하지만, 세균에서가용성발현은탠덤 scfv 분자에비해중요한잇점을나타낸다. 그러나, 2개의상이한폴리펩타이드쇄는단일세포내에서발현되기때문에, 불활성동종이량체가활성이종이량체와함께생성될수있다. 이로써, 이특이적이중항체의균질의제제를수득하기위해서는추가의정제단계의수행이필요하다. 이특이적이중항체를생성시키는한가지방법은크놉-인투-홀 (knob-into-hole) 이중항체를생성시키는것이다 ( 문헌참조 : Holliger, P., T. Prospero, and G. Winter(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 90(14): 6444-8.18). 이것은 HER2 및 CD3에대해지시된이특이적이중항체에대해입증되었다. Val37을 Phe로대체하고 Leu45를 Trp로대체함에의해대형크놉이 VH 도메인에도입되었고항-HER2 또는항-CD3 가변도메인에서, Phe98을 Met로돌연변이시키고 Tyr87을 Ala로돌연변이시킴에의해상보적인홀을 VL 도메인에생성시켰다. 당해방법을사용함에의해이특이적이중항체의생산은모이중항체에의한 72% 에서크놉인투홀이중항체에의해 90% 이상으로증가될수있었다. 중요하게도, 생산수율은이들돌연변이결과로서단지약간감소하였다. 그러나, 몇몇분석된작제물에대해서항원결합활성의감소가관찰되었다. 따라서, 이것은당해방법이결합활성이변형되지않은이종이량체성분자를생산하는돌연변이를동정하기위해다양한작제물의분석을필요로함을시사한다. 또한, 당해방법은생체내안정성이불량하고약리역학이바람직하지못한불변영역에서의면역글로불린서열을돌연변이로변형시킴에따라서면역원성을증가시킬수있는비고유및비천연형태의항체서열을제조할필요가있다. 단일쇄이중항체 (scdb) 는이특이적이중항체형분자 (diabody-like molecule) 의형성을개선시키기위한또다른전략을제공한다 ( 문헌참조 : Holliger, P. and G. Winter(1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4): 128-30; Wu, A.M., et al.(1996) Immunotechnology 2(1): 21-36). 이특이적단일쇄이중항체는길이가약 15개아미노산잔기인추가의중간링커를사용하여 2개의이중항체형성폴리펩타이드를연결시킴에의해제조된다. 결론적으로, 단량체단일쇄이중항체에상응하는분자량 (50-60 kda) 을갖는모든분자는이특이적이다. 몇몇연구는이특이적단일쇄이중항체가세균에서가용성및활성형태로발현되고다수의정제된분자가단량체로서존재함을입증하였다 ( 문헌참조 : Holliger, P. and G. Winter(1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4): 128-30; Wu, A.M., et al.(1996) Immunotechnology. 2(1): 21-36; Pluckthun, A. and P. Pack(1997) Immunotechnology. 3(2): 83-105; Ridgway, J.B., et al.(1996) Protein Engin. 9(7): 617-21). 따라서, 단일쇄이중항체는탠덤 scfv의잇점 ( 모든단량체는이특이적이다 ) 과이중항체의잇점 ( 세균에서가용성발현 ) 을갖는다. 보다최근에, 이중항체는 Fc로융합되어이중-이중항체로호칭되는보다 Ig와유사한분자를제조하였다 ( 문헌참조 : Lu, D., et al.(2004) J Biol Chem 279(4): 2856-65). 또한, IgG의중쇄에서 2개의 Fab 반복체를포함하고 4개의항원분자와결합할수있는다가의항체작제물이보고되었다 ( 문헌참조 : WO 0177342A1, and Miller, K., et al. (2003) J. Immunol. 170(9): 4854-61). - 15 -
[0013] 당업계에서는 2 개이상의항원과결합할수있는개선된다가결합단백질이요구된다. 미국특허원제 11/507,050 호는고친화성으로 2 개이상의항원에결합할수있는신규계열의결합단백질을제공하고이는이 원가변도메인면역글로불린 (DVD-Ig TM ) 으로호칭된다. 본발명은 2 개이상의항원에결합할수있는추가의신 규결합단백질을제공한다. [0014] [0015] 발명의내용본발명은 2개이상의항원에결합할수있는다가결합단백질에관한것이다. 본발명은고친화성으로 2개이상의항원과결합할수있는신규계열의결합단백질을제공한다. 하나의양태에서, 본발명은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 가변도메인이고, VD2는제2 가변도메인이고, C는불변도메인이고, X1은아미노산또는폴리펩타이드이고, X2는 Fc 영역이고, n은 0 또는 1이다 ] 을포함하는폴리펩타이드쇄를포함하는결합단백질을제공한다. 하나의양태에서, 결합단백질의 VD1 및 VD2는중쇄가변도메인이다. 또다른양태에서, 중쇄가변도메인은쥐중쇄가변도메인, 사람중쇄가변도메인, CDR 접목중쇄가변도메인및사람화된중쇄가변도메인으로이루어진그룹으로부터선택된다. 또다른양태에서, VD1 및 VD2는동일한항원과결합할수있다. 또다른양태에서, VD1 및 VD2는상이한항원과결합할수있다. 또다른양태에서, C는중쇄불변도메인이다. 예를들어, X1은링커이고, 단 X1은 CH1이아니다. 예를들어, X1은 AKTTPKLEEGEFSEAR( 서열번호 1); AKTTPKLEEGEFSEARV( 서열번호 2); AKTTPKLGG( 서열번호 3); SAKTTPKLGG( 서열번호 4); SAKTTP( 서열번호 5); RADAAP ( 서열번호 6); RADAAPTVS ( 서열번호 7); RADAAAAGGPGS ( 서열번호 8); RADAAAA(G 4 S) 4 ( 서열번호 9), SAKTTPKLEEGEFSEARV ( 서열번호 10); ADAAP ( 서열번호 11); ADAAPTVSIFPP ( 서열번호 12); TVAAP ( 서열번호 13); TVAAPSVFIFPP ( 서열번호 14); QPKAAP ( 서열번호 15); QPKAAPSVTLFPP ( 서열번호 16); AKTTPP ( 서열번호 17); AKTTPPSVTPLAP ( 서열번호 18); AKTTAP ( 서열번호 19); AKTTAPSVYPLAP ( 서열번호 20); ASTKGP ( 서열번호 21); ASTKGPSVFPLAP ( 서열번호 22), GGGGSGGGGSGGGGS ( 서열번호 23); GENKVEYAPALMALS ( 서열번호 24); GPAKELTPLKEAKVS ( 서열번호 25); 및 GHEAAAVMQVQYPAS ( 서열번호 26) 으로이루어진그룹으로부터선택되는링커이다. 하나의양태에서, X2는 Fc 영역이다. 또다른양태에서, X2는변이 Fc 영역이다. [0016] [0017] 하나의양태에서, 상기된결합단백질은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 중쇄가변도메인이고, VD2 는제2 중쇄가변도메인이고, C는중쇄불변도메인이고, X1은링커이고, 단이것은 CH1이아니고, X2는 Fc 영역이다 ] 를포함하는폴리펩타이드쇄를포함한다. 하나의양태에서, 결합단백질의 VD1 및 VD2는경쇄가변도메인이다. 하나의양태에서, 경쇄가변도메인은쥐경쇄가변도메인, 사람경쇄가변도메인, CDR 접목경쇄가변도메인및사람화된경쇄가변도메인으로이루어진그룹으로부터선택된다. 하나의양태에서, VD1 및 VD2는동일한항원에결합할수있다. 또다른양태에서, VD1 및 VD2는상이한항원과결합할수있다. 하나의양태에서, C는경쇄불변도메인이다. 또다른양태에서, X1은링커이고, 단 X1은 CL1이아니다. 하나의양태에서, X1은 AKTTPKLEEGEFSEAR( 서열번호 1); AKTTPKLEEGEFSEARV( 서열번호 2); AKTTPKLGG( 서열번호 3); SAKTTPKLGG( 서열번호 4); SAKTTP( 서열번호 5); RADAAP ( 서열번호 6); RADAAPTVS ( 서열번호 7); RADAAAAGGPGS ( 서열번호 8); RADAAAA(G 4 S) 4 ( 서열번호 9), SAKTTPKLEEGEFSEARV ( 서열번호 10); ADAAP ( 서열번호 11); ADAAPTVSIFPP ( 서열번호 12); TVAAP ( 서열번호 13); TVAAPSVFIFPP ( 서열번호 14); QPKAAP ( 서열번호 15); QPKAAPSVTLFPP ( 서열번호 16); AKTTPP ( 서열번호 17); AKTTPPSVTPLAP ( 서열번호 18); AKTTAP ( 서열번호 19); AKTTAPSVYPLAP ( 서열번호 20); ASTKGP ( 서열번호 21); ASTKGPSVFPLAP ( 서열번호 22), GGGGSGGGGSGGGGS ( 서열번호 23); GENKVEYAPALMALS ( 서열번호 24); GPAKELTPLKEAKVS ( 서열번호 25); 및 GHEAAAVMQVQYPAS ( 서열번호 26) 으로이루어진그룹으로부터선택되는링커이다. 하나의양태에서, 결합단백질은 X2를포함하지않는다. [0018] [0019] 하나의양태에서, 가변중쇄및가변경쇄는둘다동일한링커를포함한다. 또다른양태에서, 가변중쇄및가변경쇄는상이한링커를포함한다. 또다른양태에서, 가변중쇄및가변경쇄둘다는짧은 ( 약 6개아미노산 ) 링커를포함한다. 또다른양태에서, 가변중쇄및가변경쇄는긴 (6개초과의아미노산 ) 링커를포함하다. 또다른양태에서, 가변중쇄는짧은링커를포함하고, 가변경쇄는긴링커를포함한다. 또다른양태에서, 가변중쇄는긴링커를포함하고, 가변경쇄는짧은링커를포함한다. 하나의양태에서, 상기된결합단백질은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 경쇄가변도메인이고, VD2 는제2 경쇄가변도메인이고, C는경쇄불변도메인이고, X1은링커이고, 단, 이것은 CH1이아니고, X2는 Fc - 16 -
영역을포함하지않는다 ] 을포함하는폴리펩타이드쇄를포함한다. [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] 또다른양태에서, 본발명은 2개의폴리펩타이드쇄를포함하는결합단백질을제공하고, 이때, 제1 폴리펩타이드쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 중쇄가변도메인이고, VD2는제2 중쇄가변도메인이고, C는중쇄불변도메인이고, X1은링커이고, 단, 이것은 CH1이아니고, X2는 Fc 영역이다 ] 를포함하고 ; 제2 폴리펩타이드쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 경쇄가변도메인이고, VD2는제2 경쇄가변도메인이고, C는경쇄불변도메인이고, X1은링커이고, 단이것은 CH1이아니고, X2는 Fc 영역을포함하지않는다 ] 를포함한다. 특히바람직하게, 이원가변도메인 (DVD) 결합단백질은 4개의폴리펩타이드쇄를포함하고, 이때, 제1의 2개의폴리펩타이드쇄는각각 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 중쇄가변도메인이고, VD2는제2 중쇄가변도메인이고, C는중쇄불변도메인이고, X1은링커이고, 단, 이것은 CH1이아니고, X2는 Fc 영역이다 ] 을포함하고 ; 제2의 2개의폴리펩타이드쇄는각각 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 경쇄가변도메인이고, VD2는제2 경쇄가변도메인이고, C는경쇄불변도메인이고, X1은링커이고, 단, 이것은 CH1이아니고, X2는 Fc 영역을포함하지않는다 ] 를포함한다. 당해이원가변도메인 (DVD) 단백질은 4개의항원결합부위를갖는다. 또다른양태에서, 상기된결합단백질은하나이상의표적과결합할수있다. 하나의양태에서, 당해표적은사이토킨, 세포표면단백질, 효소및수용체로이루어진그룹으로부터선택된다. 또다른양태에서, 결합단백질은하나이상의표적의생물학적기능을조절할수있다. 또다른양태에서, 결합단백질은하나이상의표적을중화시킬수있다. 본발명의결합단백질은림포킨, 모노킨및폴리펩타이드호르몬, 수용체또는종양마커로이루어진그룹으로부터선택되는사이토킨과결합할수있다. 예를들어, 본발명의 DVD-Ig는하기한것중 2개이상과결합할수있다 : 종양괴사인자알파 (TNF α), 인터류킨 1β(IL-1β), 신경성장인자 (NGF), IL-6 수용체 (IL-6), 및프로스타글란딘 E2(PGE2)( 또한표 2 참조 ). 특정양태에서, 결합단백질은 NGF 와 PGE2; NGF와 TNF-α; 및 NGF와 IL-1β로이루어진그룹으로부터선택된표적쌍과결합할수있다 ( 실시예 2.1 내지 2.12 참조 ). 하나의양태에서, NGF( 서열번호 1) 및 IL-6R에결합할수있는결합단백질은서열번호 44와서열번호 46으로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 중쇄아미노산서열 ; 및서열번호 45와서열번호 47로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 하나의양태에서, NGF( 서열번호 1) 및 IL-6R에결합할수있는결합단백질은서열번호 44의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 45의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 다른양태에서, NGF( 서열번호 1) 및 IL-6R에결합할수있는결합단백질은서열번호 46의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 47의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 하나의양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 PGE2에결합할수있는결합단백질은서열번호 48와서열번호 50으로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 중쇄아미노산서열 ; 및서열번호 49와서열번호 51로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 하나의양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 PGE2에결합할수있는결합단백질은서열번호 48의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 49의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 다른양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 PGE2에결합할수있는결합단백질은서열번호 50의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 51의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 제 2 양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 PGE2에결합할수있는결합단백질은서열번호 52와서열번호 54로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 중쇄아미노산서열 ; 및서열번호 53과서열번호 55로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 하나의양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 PGE2에결합할수있는결합단백질은서열번호 52의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 53의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 다른양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 PGE2에결합할수있는결합단백질은서열번호 54의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 55의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 제 3 양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 PGE2에결합할수있는결합단백질은서열번호 56과서열번호 58로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 중쇄아미노산서열 ; 및서열번호 57과서열번호 59로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 하나의양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 PGE2에결합할수있는결합단백질은서열번호 56의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 57의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 다른양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 PGE2에결합할수있는결합단백질은서열번호 58의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 59의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 제 4 양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 PGE2에결합할수있는결합단백질은서열번호 60과서열번호 62로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 중쇄아미노산서열 ; 및서열번호 61과서열번호 63으로이루어진그룹으로부터선 - 17 -
택된 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 하나의양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 PGE2에결합할수있는결합단백질은서열번호 60의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 61의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 다른양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 PGE2에결합할수있는결합단백질은서열번호 62의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 63의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] 하나의양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 TNF-α에결합할수있는결합단백질은서열번호 64와서열번호 66으로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 중쇄아미노산서열 ; 및서열번호 65와서열번호 67로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 하나의양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 TNF-α에결합할수있는결합단백질은서열번호 64의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 65의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 다른양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 PGE2에결합할수있는결합단백질은서열번호 66의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 67의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 제 2 양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 TNF-α에결합할수있는결합단백질은서열번호 68과서열번호 70으로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 중쇄아미노산서열 ; 및서열번호 69와서열번호 71로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 하나의양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 TNF-α에결합할수있는결합단백질은서열번호 68의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 69의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 다른양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 PGE2에결합할수있는결합단백질은서열번호 70의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 71의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 제 3 양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 TNF-α에결합할수있는결합단백질은서열번호 72와서열번호 74로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 중쇄아미노산서열 ; 및서열번호 73과서열번호 75로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 하나의양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 TNF-α에결합할수있는결합단백질은서열번호 72의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 73의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 다른양태에서, NGF( 서열번호 2) 및 PGE2에결합할수있는결합단백질은서열번호 74의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 75의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 제 4 양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 TNF-α에결합할수있는결합단백질은서열번호 76과서열번호 78로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 77과서열번호 79로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 하나의양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 TNF-α에결합할수있는결합단백질은서열번호 76의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 77의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 또다른양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 TNF-α에결합할수있는결합단백질은역배향을갖고서열번호 78의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 79의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 하나의양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 IL1-β에결합할수있는결합단백질은서열번호 80과서열번호 82로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 81과서열번호 83으로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 하나의양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 IL1-β에결합할수있는결합단백질은서열번호 80의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 81의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 또다른양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 IL1-β에결합할수있는결합단백질은역배향을갖고서열번호 82의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 83의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 제 2 양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 IL1-β에결합할수있는결합단백질은서열번호 84와서열번호 86으로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 85와서열번호 87로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 하나의양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 IL1-β에결합할수있는결합단백질은서열번호 84의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 85의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 또다른양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 IL1-β에결합할수있는결합단백질은역배향을갖고서열번호 86의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 87의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 제 3 양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 IL1-β에결합할수있는결합단백질은서열번호 88과서열번호 90으로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 89와서열번호 91로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 하나의양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 IL1-β에결합할수있는결합단백질은서열번호 88의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 89의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 또다른양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 IL1-β에결합할수있는결합단백질은역배향을갖고서열번호 90의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 91의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 제 4 양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 IL1-β에결합할수있는결합단백질은서열번호 92와서열번호 94로이루 - 18 -
어진그룹으로부터선택된 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 93과서열번호 95로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 하나의양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 IL1-β에결합할수있는결합단백질은서열번호 92의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 93의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 또다른양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 IL1-β에결합할수있는결합단백질은역배향을갖고서열번호 94의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 95의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] 하나의양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 IL-6R에결합할수있는결합단백질은서열번호 96과서열번호 98로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 97과서열번호 99로이루어진그룹으로부터선택된 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 하나의양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 IL-6R에결합할수있는결합단백질은서열번호 96의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 97의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 또다른양태에서, NGF( 서열번호 2) 와 IL-6R에결합할수있는결합단백질은역배향을갖고서열번호 98의 DVD 중쇄아미노산서열및서열번호 99의 DVD 경쇄아미노산서열을포함한다. 또다른양태에서, 본발명은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제1 중쇄가변도메인이고, VD2는제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제2 중쇄가변도메인이고, C는중쇄불변도메인이고, (X1)n은링커이고, 단, 이것이 CH1이아닌경우당해 (X1)n은존재하거나부재이고 ; (X2)n은 Fc 영역이고이때당해 (X2)n은존재하거나부재이다 ] 를포함하는폴리펩타이드쇄를포함하는결합단백질을제공한다. 하나의양태에서, Fc 영역은결합단백질로부터부재이다. 또다른양태에서, 본발명은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제1 경쇄가변도메인이고, VD2는제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제2 경쇄가변도메인이고, C는경쇄불변도메인이고, (X1)n은링커이고, 단, 이것이 CH1이아닌경우당해 (X1)n은존재하거나부재이고 ; (X2)n은 Fc 영역을포함하지않고이때당해 (X2)n은존재하거나부재이다 ] 를포함하는폴리펩타이드쇄를포함하는결합단백질을제공한다. 하나의양태에서, (X2)n은결합단백질로부터부재이다. 또다른양태에서, 본발명의결합단백질은제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제1 중쇄가변도메인이고, VD2는제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제2 중쇄가변도메인이고, C는중쇄불변도메인이고, (X1)n은링커이고, 단, 이것이 CH1이아닌경우당해 (X1)n은존재하거나부재이고 ; (X2)n은 Fc 영역이고이때당해 (X2)n은존재하거나부재이다 ] 를포함하는제1 폴리펩타이드쇄, 및제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제1 경쇄가변도메인이고, VD2는제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제2 경쇄가변도메인이고, C는경쇄불변도메인이고, (X1)n은링커이고, 단, 이것이 CH1이아닌경우당해 (X1)n은존재하거나부재이고 ; (X2)n은 Fc 영역을포함하지않고이때당해 (X2)n은존재하거나부재이다 ] 를포함하는제2 폴리펩타이드쇄를포함한다. 또다른양태에서, 당해결합단백질은 2개의제1 폴리펩타이드쇄및 2개의제2 폴리펩타이드를쇄를포함한다. 또다른양태에서, (X2)n은제2 폴리펩타이드로부터부재이다. 또다른양태에서, 제1 폴리펩타이드에존재하는경우 Fc 영역은고유서열 Fc 영역및변이서열 Fc 영역으로이루어진그룹으로부터선택된다. 또다른양태에서, Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 및 IgD 기원의 Fc 영역으로부터이루어진그룹으로부터선택된다. 또다른양태에서, 본발명의결합단백질은, 제1 및제3 폴리펩타이드쇄가 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제1 중쇄가변도메인이고, VD2는제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제2 중쇄가변도메인이고, C는중쇄불변도메인이고, (X1)n은링커이고, 단, 이것이 CH1이아닌경우당해 (X1)n은존재하거나부재이고 ; (X2)n은 Fc 영역이고이때당해 (X2)n은존재하거나부재이다 ] 를포함하고, 제2 및제4 폴리펩타이드쇄가 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제1 경쇄가변도메인이고, VD2는제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제2 경쇄가변도메인이고, C는경쇄불변도메인이고, (X1)n은링커이고, 단, 이것이 CH1이아닌경우당해 (X1)n은존재하거나부재이고 ; (X2)n은 Fc 영역을포함하지않고이때당해 (X2)n은존재하거나부재이다 ] 를포함하는 4개의폴리펩타이드쇄를포함하는 2개의항원과결합할수있는 DVD-Ig이다. 본발명은모항체를미리선별함에의해 DVD-Ig 결합단백질을제조하는방법을제공한다. 하나의양태에서, 2 개의항원과결합할수있는이원가변도메인면역글로불린을제조하는방법은 a) 제1 항원과결합할수있는제1 모항체또는이의항원결합부를수득하는단계 ; b) 제2 항원과결합할수있는제2 모항체또는이의항원결합부를수득하는단계 ; c) VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제1 중쇄가변도메인이고, VD2는제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제2 중쇄가변 - 19 -
도메인이고, C는중쇄불변도메인이고, (X1)n은링커이고, 단, 이것이 CH1이아닌경우당해 (X1)n은존재하거나부재이고 ; (X2)n은 Fc 영역이고이때당해 (X2)n은존재하거나부재이다 ] 를포함하는제1 및제3 폴리펩타이드쇄를작제하는단계 ; d) VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제1 경쇄가변도메인이고, VD2는제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제2 경쇄가변도메인이고, C는경쇄불변도메인이고, (X1)n은링커이고, 단, 이것이 CH1이아닌경우당해 (X1)n은존재하거나부재이고 ; (X2)n은 Fc 영역을포함하지않고이때당해 (X2)n은존재하거나부재이다 ] 를포함하는제2 및제4 폴리펩타이드쇄를작제하는단계 ; 및 e) 상기제1 및제2 항원과결합할수있는이원가변도메인면역글로불린이생성되도록제1, 제2, 제3 및제4 폴리펩타이드쇄를발현시키는단계를포함한다. [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] 또다른양태에서, 본발명은목적하는성질을갖는 2개의항원에결합할수있는이원가변도메인면역글로불린을제조하는방법을제공하고, 당해방법은 a) 제1 항원과결합할수있고이원가변도메인면역글로불린에의해나타나는하나이상의목적하는성질을갖는제1 모항체또는이의항원결합부를수득하는단계 ; b) 제2 항원과결합할수있고이원가변도메인면역글로불린에의해나타나는하나이상의목적하는성질을갖는제2 모항체또는이의항원결합부를수득하는단계 ; c) VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제1 중쇄가변도메인이고, VD2는제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제2 중쇄가변도메인이고, C는중쇄불변도메인이고, (X1)n은링커이고, 단, 이것이 CH1이아닌경우당해 (X1)n은존재하거나부재이고 ; (X2)n은 Fc 영역이고이때당해 (X2)n은존재하거나부재이다 ] 를포함하는제 1 및제3 폴리펩타이드쇄를작제하는단계 ; d) VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제1 경쇄가변도메인이고, VD2는제2 모항체또는이의항원결합부로부터수득된제2 경쇄가변도메인이고, C는경쇄불변도메인이고, (X1)n은링커이고, 단, 이것이 CH1이아닌경우당해 (X1)n은존재하거나부재이고 ; (X2)n은 Fc 영역을포함하지않고이때당해 (X2)n은존재하거나부재이다 ] 를포함하는제2 및제4 폴리펩타이드쇄를작제하는단계 ; 및 e) 상기제1 및제2 항원과결합할수있는이원가변도메인면역글로불린이생성되도록제1, 제2, 제3 및제4 폴리펩타이드쇄를발현시키는단계를포함한다. 하나의양태에서, 본원에기재된제1 및제2 폴리펩타이드쇄의 VD1은동일한모항체또는이의항원결합부로부터수득된다. 또다른양태에서, 본원에기재된제1 및제2 폴리펩타이드쇄의 VD1은상이한모항체또는이의항원결합부로부터수득된다. 또다른양태에서, 본원에기재된제1 및제2 폴리펩타이드쇄의 VD2는동일한모항체또는이의항원결합부로부터수득된다. 또다른양태에서, 본원에기재된제1 및제2 폴리펩타이드쇄의 VD2는상이한모항체또는이의항원결합부로부터수득된다. 하나의양태에서제1 모항체또는이의항원결합부및제2 모항체또는이의항원결합부는동일한항체이다. 또다른양태에서, 제1 모항체또는이의항원결합부및제2 모항체또는이의항원결합부는상이한항체이다. 하나의양태에서제1 모항체또는이의항원결합부는제1 항원과결합하고제2 모항체또는이의항원결합부는제2 항원과결합한다. 특정양태에서, 제1 및제2 항원은동일한항원이다. 또다른양태에서, 모항체는동일한항원상에상이한에피토프와결합한다. 또다른양태에서제1 및제2 항원은상이한항원이다. 또다른양태에서, 제1 모항체또는이의항원결합부는제2 모항체또는이의항원결합부가제2 항원과결합하는효능과는상이한효능으로제1 항원과결합한다. 또다른양태에서, 제1 모항체또는이의항원결합부는제2 모항체또는이의항원결합부가제2 항원과결합하는친화성과상이한치환성으로제1 항원과결합한다. 또다른양태에서, 제1 모항체또는이의항원결합부및제2 모항체또는이의항원결합부는사람항체, CDR 접목항체및사람화된항체로이루어진그룹으로부터선택된다. 하나의양태에서, 항원결합부는 Fab 단편, F(ab') 2 단편, 힌지영역에서디설파이드브릿지에의해연결된 2개의 Fab 단편을포함하는 2가단편 ; VH 및 CH1 도메인으로이루어진 Fd 단편 ; 항체의단일암의 VL 및 VH 도메인으로이루어진 Fv 단편, dab 단편, 분 리된상보성결정영역 (CDR), 단일쇄항체및이중항체로이루어진그룹으로부터선택된다. [0046] 또다른양태에서, 본발명의결합단백질은제1 모항체또는이의항원결합부또는제2 모항체또는이의항원결합부에의해나타나는하나이상의목적하는성질을갖는다. 또한, 제1 모항체또는이의항원결합부및제2 모항체또는이의항원결합부는이원가변도메인면역글로불린에의해나타나는하나이상의목적하는성질을갖는다. 하나의양태에서, 당해목적하는성질은하나이상의항체파라미터로부터선택된다. 또다른양태에서, 당해항체파라미터는항원특이성, 항원에대한친화성, 효능, 생물학적기능, 에피토프인지, 안정성, 용해도, 생산효율, 면역원성, 약동력, 생체이용률, 조직교차반응성및동족항원결합으로이루어진그룹으로부터선택된다. 하나의양태에서, 결합단백질은다가이다. 또다른양태에서, 결합단백질은다특이적 - 20 -
이다. 본원에기재된다가및다특이적결합단백질은특히치료학적관점에서바람직할수있는성질을갖는다. 예를들어, 다가및다특이적결합단백질은 (1) 항체가결합하는항원을발현하는세포에의해 2가항체보다신속하게내재화 ( 및 / 또는동화 ) 될수있고 ; (2) 효능제항체일수있고 / 있거나 (3) 다가항체가결합할수있는항원을발현하는세포의세포사및 / 또는아폽토시스를유발할수있다. 다가및 / 또는다특이적결합단백질의하나이상의항원결합특이성을제공하는 " 모항체 " 는항체가결합하는항원을발현하는세포에의해내재화 ( 및 / 또는동화 ) 되는것일수있고 / 있거나효능제, 세포사유도및 / 또는아폽토시스유도항체일수있고본원에기재된바와같은다가및 / 또는다특이적결합단백질은이들성질중하나이상이개선됨을나타낼수있다. 더욱이, 모항체는이들성질중임의의하나이상이결여될수있지만본원에기재된바와같은다가결합단백질로서작제되는경우이들성질들이부여될수있다. [0047] 또다른양태에서, 본발명의결합단백질은표면플라스몬공명에의해측정된바와같이하나이상의표적에 대해약 10 2 M -1 s -1 이상 ; 약 10 3 M -1 s -1 이상 ; 약 10 4 M -1 s -1 이상 ; 약 10 5 M -1 s -1 이상및약 10 6 M -1 s -1 이상으로이루어진그룹으로부터선택되는결합율상수 (Kon) 를갖는다. 하나의양태에서, 본발명의결합단백질은표면플라스몬공명에의해측정된바와같이하나이상의표적에대해 10 2 M -1 s -1 내지 10 3 M -1 s -1 ; 10 3 M -1 s -1 내지 10 4 M -1 s -1 ; 10 4 M -1 s -1 내지 10 5 M -1 s -1 또는 10 5 M -1 s -1 내지 10 6 M -1 s -1 의결합율상수 (Kon) 을갖는다. [0048] 또다른양태에서, 결합단백질은표면플라스몬공명에의해측정된바와같이하나이상의표적에대해약 10-3 -1 s -4-1 이하 ; 약 10 s -5-1 이하 ; 약 10 s -6-1 이하및약 10 s 이하로이루어진그룹으로부터선택되는해리율상수 (Koff) 를갖는다. 하나의양태에서, 본발명의결합단백질은표면플라스몬공명에의해측정된바와같이하 나이상의표적에대해 10-3 s -1 내지 10-4 s -1 ; 10-4 s -1 내지 10-5 s -1 또는 10-5 s -1 내지 10-6 s -1 의해리율상수 (Koff) 를 갖는다. [0049] 또다른양태에서, 결합단백질은하나이상의표적에대해약 10-7 M 이하 ; 약 10-8 M 이하 ; 약 10-9 M 이하 ; 약 10-10 M 이하 ; 약 10-11 M 이하 ; 약 10-12 M 이하및 10-13 M 이하로이루어진그룹으로부터선택되는해리상수 (K D ) 를갖는다. 하나의양태에서, 본발명의결합단백질은이의표적에대해 10-7 M 내지 10-8 M; 10-8 M 내지 10-9 M; 10-9 M 내지 10-10 M; 10-10 내지 10-11 M; 10-11 M 내지 10-12 M 또는 10-12 내지 M 10-13 M의해리상수 (K D ) 를갖는다. [0050] 또다른양태에서, 상기된결합단백질은면역부착분자, 이미지화제제, 치료제및세포독성제제로이루어진 그룹으로부터선택되는제제를포함하는접합체이다. 하나의양태에서, 이미지화제제는방사선표지, 효소, 형 광표지, 발광표지, 생물발광표지, 자기표지및비오틴으로이루어진그룹으로부터선택된다. 또다른양 태에서, 이미지화제제는 3 H, 14 C, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I, 177 Lu, 166 Ho, 및 153 Sm으로이루어진그룹으로부터선택되는방사선표지이다. 또다른양태에서, 치료제또는세포독성제제는항대사물, 알킬화제, 항생제, 성장인자, 사이토킨, 항-혈관형성제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소및아폽토시스유발제제로이루어진그룹으로부터선택된다. [0051] [0052] [0053] [0054] 또다른양태에서, 상기된결합단백질은결정화된결합단백질이고결정으로서존재한다. 하나의양태에서, 결정은담체부재의제어방출약제학적결정이다. 또다른양태에서, 결정화된결합단백질은당해결합단백질의가용성대응물보다생체내에서보다큰반감기를갖는다. 또다른양태에서, 결정화된결합단백질은생물학적활성을보유한다. 또다른양태에서, 상기된결합단백질은당화된다. 예를들어, 당화는사람당화패턴이다. 본발명의한측면은상기된결합단백질중임의의하나를암호화하는분리된핵산에관한것이다. 추가의양태는상기된분리된핵산을포함하는벡터를제공하고이때, 벡터는 pcdna; ptt (Durocher et al., Nucleic Acids Research 2002, Vol 30, No.2); ptt3 ( 추가의다중클로닝부위를갖는 ptt); pefbos (Mizushima, S. and Nagata, S., (1990) Nucleic acids Research Vol 18, No. 17); pbv; pjv; pcdna3.1 TOPO, pef6topo 및 pbj으로이루어진그룹으로부터선택된다. 하나의양태에서, 벡터는미국특허출원 61/021,282에기재된벡터이다. 또다른측면에서, 숙주세포는상기된벡터로형질전환된다. 하나의양태에서, 숙주세포는원핵세포이다. - 21 -
또다른양태에서, 숙주세포는이. 콜라이 (E. coli) 이다. 관련양태에서, 숙주세포는진핵세포이다. 또다른양태에서, 진핵세포는원생생물세포, 동물세포, 식물세포및진균류세포로이루어진그룹으로부터선택된다. 또다른양태에서, 숙주세포는 CHO, COS, NS0, SP2, PER.C6을포함하지만이에제한되지않는포유동물세포 ; 또는사카로마이세스세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 와같은진균류세포또는 Sf9와같은곤충세포이다. [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] 하나의양태에서, 예를들어, 상이한특이성을갖는 2개이상의 DVD-Ig는단일재조합숙주세포에서제조된다. 예를들어, 항체혼합물의발현은 Oligoclonics, (Merus B.V., The Netherlands)( 미국특허제7,262,028호 ; 제7,429,486호 ) 라고불린다. 본발명의또다른측면은상기된숙주세포중임의의하나를결합단백질을생산하기에충분한조건하에배양배지에서배양함을포함하는, 상기된결합단백질을제조하는방법을제공한다. 하나의양태에서, 당해방법에의해제조되는결합단백질중 50% 내지 75% 는이원특이적 4가결합단백질이다. 특정양태에서, 당해방법에의해제조되는결합단백질중 75% 내지 90% 는이원특이적 4가결합단백질이다. 특정양태에서, 제조되는결합단백질중 90% 내지 95% 는이원특이적 4가결합단백질이다. 하나의양태는결합단백질방출용조성물을제공하고이때당해조성물은상기된바와같은결정화된결합단백질및성분및하나이상의중합담체를포함하는제형을포함한다. 예를들어, 중합담체는폴리 ( 아크릴산 ), 폴리 ( 시아노아크릴레이트 ), 폴리 ( 아미노산 ), 폴리 ( 무수물 ), 폴리 ( 데프시펩타이드 ), 폴리 ( 에스테르 ), 폴리 ( 락트산 ), 폴리 ( 락틱-코-글리콜산 ) 또는 PLGA, 폴리 (b-하이드록시부티레이트), 폴리 ( 카프롤락톤 ), 폴리 ( 디옥사논 ); 폴리 ( 에틸렌글리콜 ), 폴리 ( 하이드록시프로필 ) 메타크릴아미드, 폴리 [( 오르가노 ) 포스파젠 ], 폴리 ( 오르토에스테르 ), 폴리 ( 비닐알콜 ), 폴리 ( 비닐피롤리돈 ), 말레산무수물-알킬비닐에테르공중합체, 플루론산폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스및셀룰로스유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 하이알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리캔, 황화폴리에아카라이드, 이의블렌드및공중합체로이루어진하나이상의그룹으로부터선택된중합체이다. 예를들어, 당해성분은알부민, 슈크로스, 트레할로스, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌글리콜및폴리에틸렌글리콜로이루어진그룹으로부터선택된다. 또다른양태는상기된유효량의조성물을포유동물에게투여함을포함하는, 포유동물을치료하는방법을제공한다. 본발명은또한상기된바와같은결합단백질및약제학적으로허용되는담체를포함하는약제학적조성물을제공한다. 추가의양태에서, 약제학적조성물은장애를치료하기위한하나이상의추가의치료제를포함한다. 예를들어, 추가의제제는치료제, 이미지화제, 세포독성제제, 혈관형성억제제 ( 항-VEGF 항체또는 VEGF-트랩을포함하지만이에제한되지않음 ); 키나제억제제 (KDR 및 TIE-2 억제제를포함하지만이에제한되지않음 ); 공동자극분자차단제 ( 항-B7.1, 항-B7.2, CTLA4-Ig, 항-CD20을포함하지만이에제한되지않음 ); 부착분자차단제 ( 항-LFA-1 항체, 항-E/L 셀렉틴항체, 소분자억제제를포함하지만이에제한되지않음 ); 항-사이토킨항체또는이의기능성단편 ( 항-IL-18, 항-TNF, 항-IL-6/ 사이토킨수용체항체를포함하지만이에제한되지않음 ); 메토트렉세이트 ; 사이클로스포린 ; 라파마이신 ; FK506; 검출가능한표지또는리포터 ; TNF 길항제 ; 항류마티스제 ; 근육이완제, 마약류비스테로이드소염약물 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소마취제, 신경근차단제, 항미생물성제제, 건선치료제, 코르티코스테로이드, 동화작용스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장호르몬, 호르몬대체약물, 방사선약제, 항우울증제, 항정신병제, 자극제, 천식약물, 베타효능제, 흡입스테로이드, 에피네프린또는유사체, 사이토킨및사이토킨길항제로이루어진그룹으로부터선택된다. 또다른측면에서, 본발명은상기된결합단백질을사람피검체에투여하여사람피검체내표적또는표적들의활성이억제되어치료가달성됨을포함하는, 상기된결합단백질이결합할수있는표적또는표적들이해로운장애를앓는사람피검체를치료하는방법을제공한다. 예를들어, 장애는관절염, 골관절염, 연소성만성관절염, 패혈성관절염, 라임관절염, 건선관절염, 반응성관절염, 척추관절증, 전신홍반성낭창, 크론질환, 대장염, 장염증질환, 인슐린의존성진성당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성질환, 건선, 피부경화증, 이식편대숙주질환, 기관이식거부, 기관이식과관련된급성또는만성면역질환, 유육종증, 동맥경화증, 파종성혈관내응고, 가와사키병, 그레이브병, 신증후군, 만성피로증후군, 베게너육아종증, 헤노흐-쇼엔라인자반증, 신장의현미경적혈관염, 만성활성간염, 포도막염, 패혈성쇼크, 독소쇼크증후군, 패혈증증후군, 악액질, 감염성질환, 기생충질환, 후천성면역결핍증후군, 급성횡단성척수염, 헌팅톤무도병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 원발성담즙성간경변, 용혈성빈혈, 악성종양, 심부전증, 심근경색, 애디슨병, 산발성질환, 다분비선제I형결핍증및다분비선제II형결핍증, 슈미트증후군, 성인성 ( 급성 ) 호흡곤란증후군, 탈 - 22 -
모증, 원형탈모증, 혈청반응음성관절증, 관절증, 라이터병, 건선성관절증, 궤양성대장염성관절증, 클라미디아증, 예르시니아및살모넬라관련관절증, 척추관절증, 죽종질환 / 동맥경화증, 아토피성알레르기, 자가면역수포성질환, 심상성천포창, 낙엽성천포창, 유천포창, 선상 IgA 질환, 자가면역용혈성빈혈, 크움즈양성용혈성빈혈, 후천성악성빈혈, 연소성악성빈혈, 근통성뇌염 / 로얄프리 (Royal Free) 질환, 만성점막피부칸디다증, 거세포동맥염, 원발성경화성간염, 잠복성자가면역간염, 후천성면역결핍질환증후군, 후천성면역결핍관련질환, B형간염, C형간염, 공통가변성면역결핍증 ( 공통가변성감마글로불린저혈증 ), 확장형심근증, 여성불임증, 난소부전증, 조죽난소부전, 섬유성폐질환, 잠복성섬유조직폐포염, 후-염증성간질성폐질환, 간질성폐렴, 결합조직질환관련간질성폐질환, 조합성결합조직질환관련폐질환, 전신성경화증관련간질성폐질환, 류마티스성관절염관련간질성폐질환, 전신홍반성낭창관련폐질환, 피부근염 / 다발성근염관련폐질환, 쇼그렌질환관련폐질환, 강직성척추염관련폐질환, 혈관염범발성폐질환, 혈철증관련폐질환, 약물-유도된간질성폐질환, 섬유증, 방사선섬유증, 폐색성세기관지염, 만성호산구성폐렴, 림프구성침윤성폐질환, 감염후간질성폐질환, 통풍성관절염, 자가면역간염, 1형자가면역간염 ( 전형적자가면역또는루포이드간염 ), 2형자가면역간염 ( 항-LKM 항체간염 ), 자가면역매개된저혈당증, 흑색극세포증에따른 B형인슐린저항성, 부갑상선기능저하증, 기관이식과관련된급성면역질환, 기관이식과관련된만성면역질환, 골관절증, 원발성경화성담관염, 1형건선, 2형건선, 특발성백혈구감소증, 자가면역호중구감소증, 신장질환 NOS, 사구체신염, 신장의현미경적혈관염, 라임병, 원판양홍반성낭창, 남성불임증특발증또는 NOS, 정자자가면역, 다발성경화증 ( 모든아형 ), 교감성안염, 결합조직질환에속발성인폐고혈압증, 구드패스튜어증후군, 결절성다발성동맥염의폐징후, 급성류마티스성열, 류마티스성척추염, 스틸씨병, 전신성경화증, 쇼그렌증후군, 다카야스병 / 동맥염, 자가면역혈소판감소증, 특발성혈소판감소증, 자가면역갑상선질환, 갑상선기능항진증, 갑상선종증자가면역갑상선기능저하증 ( 하시모토병 ), 위축성자가면역갑상선기능저하증, 원발성점액수종, 수정체성포도막염, 원발성혈관염, 백반증급성간질환, 만성간질환, 알콜성경변, 알콜유도간손상, 콜레오사타티스 (choleosatatis), 특이체질성간질환, 약물유도간염, 비알콜성지방간염, 알레르기및천식, B 그룹스트렙토코씨 (streptococci) (GBS) 감염, 정신장애 ( 예를들어, 우울증및정신분열증 ), Th2 형및 Th1 형매개질환, 급성및만성통증 ( 상이한형태의통증 ), 및폐암, 유방암, 위암, 방광암, 결장암, 췌장암, 난소암, 전립선암및직장암과같은암종및조혈악성종양 ( 백혈병및림프종 ), A베타지방단백질혈증, 말초청색증, 급성및만성기생충성또는감염성과정, 급성백혈병, 급성림프성모구성백혈병 (ALL), 급성골수백혈병 (AML), 급성또는만성세균감염, 급성췌장염, 급성신부전증, 선암종, 공기이소성심방박동, AIDS 치매합병증, 알콜유도간염, 알레르기성결막염, 알레르기성접촉피부염, 알레르기성비염, 동종이식거부, 알파-1-안티트립신결핍, 근위축성측삭경화증, 빈혈, 앙기나협심증, 전각세포퇴화, 항 cd3 치료, 항인지질증후군, 항-수용체과민성반응, 대동맥및말초결찰증, 대동맥해부, 동맥고혈압, 동맥경화증, 동정맥누공, 운동실조증, 심방세동 ( 지연또는발작성 ), 심방조동, 동정맥막힘, B 세포림프종, 골이식거부, 골수이식 (BMT) 거부, 좌각차단, 버키트림프종, 화상, 심장성부정맥, 심장성기절증후군, 심장종양, 심근증, 심폐우회염증반응, 연골이식거부, 소뇌피질퇴화, 소뇌장애, 혼란또는다초점심방빈맥, 화학치료관련장애, 만성골수성백혈병 (CML), 만성알콜증, 만성염증병리, 만성림프성백혈병 (CLL), 만성폐쇄폐질환 (COPD), 만성살리실레이트중독, 결장직장암종, 울혈성심부전, 결막염, 접촉성피부염, 폐심장, 관상동맥질환, 크루츠펠트-자콥 (Creutzfeldt-Jakob) 질환, 배양음성패혈증, 낭섬유증, 사이토킨치료관련장애, 권투선수치매 (Dementia pugilistica), 탈수초성질환, 댕기출혈열, 피부염, 피부학적증상, 당뇨병, 진성당뇨병, 당뇨병성동맥경화질환 (diabetic ateriosclerotic disease), 광범위루이체질환, 확장성울혈성심근증, 기저핵장애, 중년다운증후군, CNS 도파민수용체차단약물에의해유도된약물유도운동장애, 약물과민증, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비질환, 후두개염, 엡스타인-바르바이러스감염, 피부홍통증, 추체외로및소뇌장애, 가족성적혈구잠식성림프조직구증, 태아흉선이식거부, 프리드리히운동실조증, 기능성말초동맥장애, 진균류패혈증, 가스괴저, 위궤양, 사구체신염, 임의의기관또는조직이식거부, 그람음성패혈증, 그람양성패혈증, 세포내기관으로인한육아종, 모발세포백혈병, 할로포르덴-스파츠질환 (Hallervorden-Spatz disease), 하시모토갑상선염, 고초열, 심장이식거부, 혈색소증, 혈액투석, 용혈성요독증후군 / 혈전성혈소판감소성자반증, 출혈, 간염 (A), 히스다발부정맥, HIV 감염 /HIV 신경병증, 호지킨질환, 과운동성장애, 과민성반응, 과민성폐렴, 고혈압, 운동부족장애, 시상하부-뇌하수체-부신피질계평가, 특발성애디슨질환, 특발성폐섬유증, 항체매개세포독성, 무력증, 유아척추근육위축증, 대동맥염증, 인플루엔자 A, 이온화방사선노출, 홍채섬모체염 / 자궁염 / 광학적신경근염, 허혈관류손상, 허혈뇌졸중, 연소성류마티스관절염, 연소성척추근육위축증, 카포시육종, 신장이식거부, 레지오넬라, 리슈마니아증, 나병, 피질척수계병변, 지방부종, 간이식거부, 림프피부종, 말라리아, 악성림프종, 악성조직구증, 악성흑색종, 뇌막염, 수막염균혈증, 대사 / 특발성, 편두통, 미토콘드리아다중시스템장애, 복합연결조직질환, 모 - 23 -
노클로날감마글로불린혈증, 다발성골수종, 다발성시스템퇴화 ( 만셀데제린-토마스쉬-드라거및마차도-조셉 ), 중증근무력증, 세포내마이코박테리움감염증, 마이코박테리움결핵, 골수이형성증후군, 심근경색, 심근허혈장애, 비인두암종, 신생아만성폐질환, 신염, 신증, 신경퇴행성질환, 신경성 I 근육위축증, 호중구감소성발열, 비-호지킨림프종, 복부대동맥및이의지류폐색, 폐색성동맥질환, okt3 치료, 고환염 / 부고환염, 고환염 / 절관절제술반전과정, 기비대, 골다공증, 췌장이식거부, 췌장암종, 부수종양성증후군 / 악성고칼슘혈증, 부갑상선이식거부, 골반염증질환, 다년성비염, 심막질환, 말초동맥경화질환, 말초혈관장애, 복막염, 악성빈혈, 폐포자충폐렴, 폐렴, POEMS 증후군 ( 다발신경병증, 장기비대, 내분비질환, 모노클로날감마글로불린혈증, 및피부변화증후군 ), 관류후증후군, 펌프후증후군, MI 후심장절개증후군, 자간전증, 전진적상핵마비, 원발성폐고혈압, 방사선치료, 레이노드현상및질환, 레이노드질환, 레프섬질환, 일반협소 QRS 심근증, 신혈관성고혈압, 재관류손상, 제한성심근병증, 육종, 피부경화증, 노인무도병, 루이체형노인성치매, 혈청음성관절병증, 쇼크, 겸상적혈구빈혈증, 피부동종이식거부, 피부변화증후군, 소장이식거부, 고형종양, 특이적부정맥, 척수운동실조, 척수소뇌퇴화, 스트렙토코커스근염, 소뇌구조적병변, 아급성경화성범뇌염, 실신, 심혈관계매독, 전신아나팔락시스, 전신염증반응증후군, 전신개시연소성류마티스관절염, T-세포또는 FAB ALL, 말초혈관확장증, 폐색성혈전혈관염, 혈소판감소증, 독성, 이식, 외상 / 출혈, III형과민성반응, IV형과민성, 불안정앙기나, 요독증, 요로패혈증, 두드러기, 승모판심장질환, 하지정맥, 혈관염, 정맥동질환, 정맥종혈전증, 심실세동, 바이러스및진균류감염, 바이탈뇌염 / 무균성수막염, 바이탈-연관적혈구식작용증후군, 웨른니케-코르사코프증후군, 윌슨질환, 임의의기관또는조직의이종이식거부를포함하는그룹으로부터선택된다. [0060] [0061] 하나의양태에서, 본발명의조성물및방법으로치료되거나진단되는질환은원발성및전이성암을포함하지만이에제한되지않고당해암은유방암, 결장암, 직장암, 폐암, 구인두암, 두경부암, 식도암, 위암, 췌장암, 간암, 방광암및담관암, 소장암, 뇨관암 ( 신장암, 방광암및요상피암을포함 ), 여성생식관암 ( 경부암, 자궁암및난소암, 및융모막상피종및생식융모상피성질환 ), 남성생식관암 ( 전립선암, 저정낭암, 고환암및생식세포종양을포함 ), 내분비선암 ( 갑상선암, 부신암및뇌하수체암을포함 ), 및피부암, 및혈관종, 흑색종, 육종 ( 골기원암및연조직기원의암및카포시육종을포함 ), 뇌암, 신경암, 안구암, 및수막암 ( 성상세포종, 신경아교종, 아교모세포종, 망막아세포종, 신경종, 신경아세포종, 양성종양, 및수막종을포함 ), 조혈악성종양으로유래되는고형종양, 예를들어, 백혈병및림프종 ( 호지킨및비호지킨림프종둘다 ) 를포함한다. 본발명의 DVD-Ig는또한하기의질환중하나이상을치료할수있다 : 급성관상증후군, 급성특발성다발신경근염, 급성염증탈수초성다발성신경염, 급성허혈, 성인스틸스질환, 원형탈모증, 아나필락시스증 (anaphylaxis), 항-인지질항체증후군, 재생불량성빈혈, 동맥경화증, 아토피성습진, 아토피성피부염, 자가면역피부염, 스트렙토코커스감염과관련된자가면역장애, 자가면역장질환, 자가면역난청, 자가면역림프구증식성증후군 (ALPS), 자가면역심근염, 자가면역혈소판감소증 (AITP), 자가면역조기폐경, 안건염, 기관지확장증, 수포성유천포창, 심혈관질환, 악성항인지질증후군, 셀리악질환 (celiac disease), 경추척추증, 만성허혈, 반흔성유천포창, 다발성경화에대한위험을갖는임상적으로분리된증후군 (CIS), 결막염, 유년기개시정신성장애, 만성폐쇄성폐질환 (COPD), 누낭염, 피부근염, 당뇨망막증, 진성당뇨병, 요추간반탈출증, 추간판내장증, 약물유도면역용혈성빈혈, 심내막염, 자궁내막증, 내안구염, 겉공막염, 다형홍반, 중증다형홍반, 임신성유천포창, 길레인바레증후군 (Guillain-Barre syndrome) (GBS), 건초열, 휴즈증후군 (Hughes syndrome), 특발성파킨슨질환, 특발성간질폐렴, IgE 매개알레르기, 면역용혈성빈혈, 봉입체근염, 감염성안구염증질환, 염증탈수초질환, 염증심장질환, 염증신장질환, IPF/UIP, 홍채염, 각막염, 건성각결막염, 쿠스마울질환또는쿠스마울-마이어질환, 란드리마비, 랑게르한스세포조직구증, 열성홍반 (livedo reticularis), 황반변성, 미시적혈관염, 경직성척추염, 운동뉴런장애, 점막유천포창, 다발성기관부전증, 중증근무력증, 골수이형성증후군, 심근염, 신경근장애, 신경병증, 비-A 비-B 간염, 시신경염, 골용해, 난소암, 소수관절 JRA, 말초동맥폐색성질환 (PAOD), 말초혈관질환 (PVD), 말초동맥질환 (PAD), 정맥염, 결절성다발동맥염 ( 또는결절성동맥주위염 ), 다발연골염, 측두동맥염, 회색질척수염, 다발성관절 JRA, 다발성내분비결핍증후군, 다발성근염, 류마티스성다발성근육통 (PMR), 펌프후증후군, 1차파킨슨병, 전립선및직장암및조혈악성 ( 백혈병및림프종 ), 전립선염, 순수적혈구저형성증, 1차부신부전증, 재발성시속신경근염, 협착증, 류마티스심장질환, 사포 ( 활막염, 여드름, 농포증, 및골염 ), 피부경화증, 2차아밀로이드증, 폐쇼크, 상공막염, 좌골신경통, 2차부신부전증, 실리콘관련연결조직질환, 스네돈-윌킨슨 (sneddonwilkinson) 피부증, 강직성척추염, 스티븐-존슨증후군 (SJS), 전신염증반응증후군, 일시적동맥염, 톡소플라스믹망막증, 독성표피괴사, 횡단척수염, TRAPS ( 종양괴사인자수용체, 1형알레르기반응, II형당뇨병, 두드러기, 통상의간질폐렴 (UIP), 혈관염, 춘계각결막염, 바이러스망막염, 보그트-고야나기-하라다증후군 - 24 -
(VKH 증후군 ), 습윤황반퇴화, 상처치료, 여시니아및살모넬라관련관절증. [0062] [0063] [0064] [0065] 하나의양태에서, 본발명의항체또는이의항원결합부는, 단독으로사용되는경우또는방사선치료및 / 또는기타화학치료제와병용하여사용되는경우, 암을치료하거나본원에기재된종양기원의전이의예방에사용된다. 또다른측면에서, 본발명은상기된결합단백질중임의의하나를상기논의된바와같은제2 제제의투여전후또는동시에투여하는단계를포함하는, 장애를앓는환자를치료하는방법을제공한다. 특정양태에서, 제 2 제제는부데노사이드, 상피성장인자, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 설파살라진, 아미노살리실레이트, 6-머캅토퓨린, 아자티오프린, 메트로니다졸, 리폭시게나제억제제, 메살라민, 올살라진, 발살라지드, 항산화제, 트롬복산억제제, IL-1 수용체길항제, 항-IL-1β mab, 항-IL-6 또는 IL-6 수용체, 성장인자, 엘라스타제억제제, 피리디닐-이미다졸화합물, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13 IL-15, IL-16, IL-18, IL-23, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF의항체또는효능제, CD2, CD3, CD4, CD8, CD-19, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 또는이의리간드의항체, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 프레드니솔론, 포스포디에스테라제억제제, 아데노신효능제, 항혈전제, 보체억제제, 아드레날린제제, IRAK, NIK, IKK, p38, MAP 키나제억제제, IL-1β전환효소억제제, TNFα전환효소억제제, T-세포시그날전달억제제, 메탈로프로테이나제억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신전환효소억제제, 가용성사이토킨수용체, 가용성 p55 TNF 수용체, 가용성 p75 TNF 수용체, sil-1ri, sil-1rii, sil-6r, 소염사이토킨, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ로이루어진그룹으로부터선택된다. 특정양태에서, 상기된약제학적조성물은비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 기관지내, 복강내, 캅셀내, 연골내, 강내, 세포내, 소뇌내, 소뇌심실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척추내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 일시주사, 질내, 직장, 협측, 설하, 비내및경피투여로부터선택되는하나이상의방식으로피검체에게투여된다. 본발명의한측면은본발명의하나이상의결합단백질에대한하나이상의항-이디오타입항체를제공한다. 항-이디오타입항체는중쇄또는경쇄또는이의리간드결합부의하나이상의상보성결정영역 (CDR), 중쇄또는경쇄가변영역, 중쇄또는경쇄불변영역, 골격영역또는본발명의결합단백질에도입될수있는이의일부에제한되지않지만이와같은하나이상의면역글로불린분자부분을포함하는분자를함유하는임의의단백질또는펩타이드를포함한다. [0066] 도면의간단한설명 도 1a 는이원가변도메인 (DVD)-Ig 작제물을도시하고 2 개의모항체기원의 DVD-Ig 의제조전략을보여준다. 도 1b 는작제물 DVD1-Ig, DVD2-Ig, 및하이브리도마클론 2D13.E3 ( 항 -IL-1α) 및 13F5.G5 ( 항 -IL-1β) 기원의 2 개의키메라단일특이적항체를도시한다. [0067] [0068] [0069] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명은 2개이상의항원과결합할수있는다가및 / 또는다특이적결합단백질에관한것이다. 특히, 본발명은 DVD-Ig를제조하기위한핵산, 재조합발현벡터및숙주세포뿐만아니라이원가변도메인면역글로불린 (DVD-Ig) 에관한것이다. 시험관내또는생체내에서특이적항원을검출하기위한본발명의 DVD-Ig를사용하는방법이또한본발명에포함된다. 본명세서에서다른표시가없는한, 본발명과관련하여사용된과학및기술적용어들은당업자가통상적으로알고있는의미를갖는다. 그러나용어의의미및범위는임의의잠재적인모호성의경우, 임의의사전적또는외적인정의에대해사전에제공된정의로서명백해야만한다. 또한, 정황상다른필요가없는한, 용어의단수적표현은복수도포함하며, 복수적표현은단수도포함하는것이다. 본명세서에서, " 또는 " 는다른표시가없는한 " 및 / 또는 " 을의미한다. 또한, " 포함하는 " 및이러한유형어, 예컨대 " 포함한다 " 및 " 포함한 " 의용어의사용은제한적의미가아니다. 또한, " 원소 " 또는 " 성분 " 등의용어도다른구체적표현이없는한, 1 유니트를포함하는원소및성분은물론하나이상의서브유니트를포함하는원소및성분들도포함한다. 일반적으로, 본명세서에기술된세포및조직배양, 분자생물학, 면역학, 미생물학, 유전학및단백질과핵산 - 25 -
화학및하이브리드화등과관련하여사용된용어들은당업계에공지되어있고공통적으로사용되는것이다. 본발명의방법및기술은당업계에공지되어있고, 다른표시가없는한본명세서전체에서인용되고논의된각종일반서적및구체적인문헌들에기술된바와같은통상의방법에따라일반적으로수행된다. 효소반응및정제기술은당업계에서공통적으로수행되거나본명세서에기술된바와같이제조자의지침에따라수행한다. 본명세서에기술된분석화학, 합성유기화학및의학및약제화학과관련하여사용된용어및그실험절차및기술은당업계에공지되어일반적으로사용되는것이다. 화학합성, 화학분석, 약제, 제형, 전달및환자치료에대해서도표준기술을사용한다. [0070] [0071] [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] 본발명을더용이하게이해할수있도록이하에사용된용어들의정의를정리했다. 본명세서에사용된 " 폴리펩타이드 " 란용어는아미노산의임의의중합체쇄을의미한다. " 펩타이드 " 및 " 단백질 " 이란용어는폴리펩타이드란용어와혼용할수있는것으로서, 이역시아미노산의중합체쇄을의미한다. " 폴리펩타이드 " 란용어는천연또는합성단백질, 단백질단편및단백질서열의폴리펩타이드유사체를포함한다. 폴리펩타이드는단량체또는중합체일수있다. 본원의 " 폴리펩타이드 " 의사용은본문에서달리언급되지않는경우폴리펩타이드및이의단편및변이체 ( 변이체의단편을포함하여 ) 를포괄하는것으로의도된다. 항원성폴리펩타이드에대해, 폴리펩타이드의단편은임의로폴리펩타이드의하나이상의연속또는비선형에피토프를함유한다. 하나이상의에피토프단편의정확한경계는당업계의통상의기술을사용하여확인될수있다. 당해단편은약 5개이상의연속아미노산, 예를들어, 약 10개이상의연속아미노산, 약 15개이상의연속아미노산또는약 20개이상의연속아미노산을포함한다. 폴리펩타이드의변이체는본원에기재된바와같다. " 분리된단백질 " 또는 " 분리된폴리펩타이드 " 란용어는그기원이나파생급원에따라서자연상태일때동반되던자연관련성분과관련되어있지않은단백질또는폴리펩타이드이다. 즉, 동일한종유래의다른단백질이실질적으로없고 ; 다른종유래의세포에의해서발현되거나 ; 자연에서발생되지않는것이다. 즉, 자연적으로생성하는세포와다른세포시스템에서합성되거나화학적으로합성된폴리펩타이드는이의자연관련성분에서 " 분리된 " 것이다. 또한, 단백질은당업계에공지된단백질정제기술을사용하여분리를통해자연관련성분으로부터실질적으로유리될수도있다. 본명세서에사용된 " 회수하는 " 이란용어는당업계에공지된단백질정제기술등을사용하여분리에의해자연관련성분이실질적으로제거된폴리펩타이드와같은화학종을제공하는과정을의미한다. 본원에사용된바와같은 " 생물학적활성 " 은항원의모든고유생물학적성질을언급한다 ( 생체내에서발견되는바와같이천연에존재하든또는재조합수단에의해제공되거나가능한경우이든지간에상관없이 ). 생물학적성질은수용체로의결합 ; 세포증식의유도, 세포성장의억제, 기타사이토킨의유도, 아폽토시스의유도및효소활성을포함하지만이에제한되지않는다. 항체, 단백질또는펩타이드의제2 화학종과의상호작용과관련하여본명세서에사용된 " 특이적결합 " 또는 " 특이적으로결합하는 " 이란용어는그상호작용이화학종상의특정구조 ( 예컨대, 항원결정인자또는에피토프 ) 의존재에따라이루어진다는것을의미한다. 예컨대, 항체는일반적으로단백질보다는특정단백질구조를인식하여여기에결합한다. 항체가에피토프 "A" 에특이적이라면, 표지된 "A" 와항체를포함하는반응에서에피토프 A( 또는유리된미표지 A) 를포함하는분자의존재는항체에결합된표지된 A의양을감소시킬것이다. 본명세서에사용된 " 항체 " 란용어는 4개의폴리펩타이드쇄, 즉 2개의중쇄 (H) 와 2개의경쇄 (L) 로구성된임의의면역글로불린 (Ig) 분자또는이러한 Ig 분자의필수적인에피토프결합특징을갖는임의의기능성단편, 돌연변이체, 변형체또는유도체를의미한다. 이러한돌연변이체, 변형체또는유도체항체형은당업계에공지되어있다. 이의구체예에대해서는이하에논의되나, 이에국한되지는않는다. 완전한항체에서, 각중쇄는중쇄가변영역 ( 본명세서에서약어로 HCVR 또는 VH로표시됨 ) 과중쇄불변영역으로구성된다. 중쇄불변영역은 3개의도메인, CH1, CH2 및 CH3으로구성된다. 각경쇄는경쇄가변영역 ( 본명세서에서약어로 LCVR 또는 VL로표시됨 ) 과경쇄불변영역으로구성된다. 경쇄불변영역은 1개도메인, CL로구성된다. VH 및 VL 영역은다시상보성결정영역 (CDR) 이라불리는초가변성영역들로나뉠수있고, 여기에는골격영역 (FR) 이라는더보존적인영역들이산재되어있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로구성되며, 이들은아미노말단에서카복시말단으로다음과같은순서에따라배열된다 : FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 면역글로불린분자는임의의유형 ( 예를들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 ( 예를들어, IgG 1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는서브클래스일수있다. - 26 -
[0078] [0079] 용어 "Fc 영역 " 은온전한항체의파파인분해에의해생성될수있는면역글로불린중쇄의 C-말단영역을정의하는데사용된다. Fc 영역은고유서열 Fc 영역또는변이 Fc 영역일수있다. 면역글로불린의 Fc 영역은일반적으로 2개의불변도메인, CH2 도메인및 CH3 도메인을포함하고임의로 CH4 도메인을포함한다. 항체이펙터기능을변경시키기위한 Fc부내의아미노산잔기의치환은당업계에공지되어있다 (Winter et al., 미국특허 5,648,260; 5,624,821). 항체의 Fc 부는여러중요한이펙터기능, 예컨대사이토킨유도, ADCC, 식세포작용, 보체의존적세포독성 (CDC) 및항체와항원-항체복합체의반감기 / 제거율등을매개한다. 몇몇경우에는이러한이펙터가능이치료항체에바람직하지만, 어떤다른경우에는치료목적에따라서불필요하거나심지어유해할수도있다. 특정사람 IgG 아이소타입, 구체적으로 IgG1 및 IgG3은각각 FcγR 및보체 C1q에대한결합을통해 ADCC 및 CDC를매개한다. 신생 Fc 수용체 (FcRn) 는항체의혈행반감기를결정하는중요한성분이다. 또다른양태에서는, 항체의불변영역, 예컨대항체의 Fc 영역에존재하는적어도하나의아미노산잔기가치환되어이펙터기능이변경된항체가제공된다. 면역글로불린의 2개의동일한중쇄의이량체화는 CH3 도메인의이량체화에의해매개되고힌지영역내에서디설파이드결합에의해안정화된다 ( 문헌참조 : Huber et al. Nature; 264: 415-20; Thies et al 1999 J Mol Biol; 293: 67-79.). 중쇄-중쇄디설파이드결합을방지하기위한힌지영역내시스테인잔기의돌연변이는 CH3 도메인의이량체화를불안정화시킬것이다. CH3 이량체화에관여하는잔기들은동정되었다 ( 문헌참조 : Dall'Acqua 1998 Biochemistry 37: 9266-73.). 따라서, 1가의반쪽 Ig를생성시킬수있다. 흥미롭게도, 이들 1가의반쪽 Ig 분자는 IgG 및 IgA 서브클래스둘다에대해천연에서발견되었다 ( 문헌참조 : Seligman 1978 Ann Immunol 129: 855-70.;Biewenga et al 1983 Clin Exp Immunol 51: 395-400). FcRn: Ig Fc 영역의화학양론은 2:1인것으로측정되었고 ( 문헌참조 : West et al. 2000 Biochemistry 39: 9698-708), 반쪽 Fc는 FcRn 결합을매개하기에충분하다 ( 문헌참조 : Kim et al 1994 Eur J Immunol; 24: 542-548.). CH3 이량체화에중요한잔기가 CH3 베타쉬트구조의내부접지면상에존재하는반면에, FcRn 결합에관여하는영역이 CH2-CH3 도메인의외부접지면상에존재하기때문에, CH3 도메인의이량체화를붕괴시키기위한돌연변이는 FcRn 결합에대해큰역효과를나타내지않을수있다. 그러나, 반쪽 Ig 분자는통상의항체크기보다작기때문에조직침투에있어서특정잇점을가질수있다. 하나의양태에서, 하나이상의아미노산잔기는본발명의결합단백질의불변영역, 예를들어, Fc 영역에서치환되어중쇄의이량체화가붕괴되어반쪽 DVD Ig 분자가생성된다. IgG의항-염증활성은 IgG Fc 단편의 N-연결된글리칸의시알화에의존한다. 항 -염증활성에대한정확한글리칸요건을결정하여적당한 IgG1 Fc 단편을생성할수있어효능이크게개선된완전한재조합시알화된 IgG1 Fc를제조할수있다 ( 문헌참조 : Anthony, R.M., et al. (2008) Science 320:373-376). 본명세서에사용된항체의 " 항원결합부 "( 또는간단히 " 항체부 ") 란용어는항원에대한특이적결합능을갖는하나이상의항체단편을의미한다. 항체의항원결합기능은완전한항체의단편에의해수행될수있는것으로밝혀져있다. 이러한항체양태들은또한이특이적, 이중특이또는다중특이형일수있으며, 즉 2개이상의다른항원에특이적으로결합할수있다. 항체의 " 항원결합부 " 라는용어에포함되는결합단편의예에는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로이루어진일가단편인 Fab 단편 ; (ii) 2개의 Fab 단편이힌지영역에서디설파이드브릿지에의해결합되어있는이가단편 ; (iii) VH 및 CH1 도메인으로이루어진 Fd 단편 ; (iv) 항체한쪽아암의 VL 및 VH 도메인으로이루어진 Fv 단편 ; (v) 하나의가변도메인을포함하는 dab 단편 (Ward et al.,(1989) Nature 341: 544-546; Winter et al., 본원에참조로서인용된 PCT 공보 WO90/05144A1); 및 (vi) 분리된상보성결정영역 (CDR) 을포함한다. 또한, Fv 단편의두도메인, VL 및 VH는다른유전자에의해암호화되지만, VL 및 VH 영역이쌍을이루어일가분자 ( 일본쇄 Fv(scFv) 로알려진것 ; 예컨대 Bird et al.(1998) Science 242: 423-426; 및 Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883) 를형성하고있는단일단백질쇄로서제조될수있게하는합성링커를이용하여 VL 및 VH 영역은재조합법으로결합될수있다. 이러한단일쇄항체는항체의 " 항원결합부 " 라는용어에도포함되는것으로도간주된다. 단일쇄항체의다른형태, 예컨대이중항체 (diabody) 도포함된다. 이중항체는일본쇄폴리펩타이드에서 VH 및 VL 도메인이발현되지만, 동일쇄상의두도메인사이에쌍형성을허용하기에는너무짧은링커를사용하여상기도메인들이다른쇄의상보성도메인과쌍을이루어 2개의항원결합부위를생성하는 2가의이특이적항체이다 ( 예컨대, Holliger, P., et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J., et al.(1994) Structure 2: 1121-1123). 이러한항체결합부는당업계에공지되어있다 ( 문헌참조 : Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)). 추가로, 단일쇄항체는또한상보적경쇄폴리펩타이드와함께한쌍의항원결합영역을형성하는한쌍의탠덤 Fv 절편 (VH-CH1-VH-CH1) 을포함하는 " 선형항체 " 를포함한다 ( 문헌참조 : Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995); 및미국특허제 5,641,870호 ). - 27 -
[0080] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] 용어 " 다가결합단백질 " 은본원명세서전반에걸쳐 2개이상의항원결합부위를포함하는결합단백질을지칭하는데사용된다. 하나의양태에서, 다가결합단백질은바람직하게 3개이상의항원결합부위를갖도록가공되고일반적으로천연항체가아니다. 용어 " 다특이적결합단백질 " 은 2개이상의관련또는비관련표적에결합할수있는결합단백질을언급한다. 본발명의이원가변도메인 (DVD) 결합단백질은 2개이상의항원결합부위를포함하고 4가또는다가의결합단백질이다. DVD는즉, 하나의항원에결합할수있는 1특이적이거나 2개이상의항원에결합할수있는다특이적일수있다. 2개의중쇄 DVD 폴리펩타이드및 2개의경쇄 DVD 폴리펩타이드를포함하는 DVD 결합단백질은 DVD Ig로언급된다. DVD Ig의각반쪽은하나의중쇄 DVD 폴리펩타이드및하나의경쇄 DVD 폴리펩타이드및 2개의항원결합부위를포함한다. 각각의결합부위는항원결합부위당항원결합에관여하는총 6개의 CDR을갖는중쇄가변도메인및경쇄가변도메인을포함한다. 본원에사용된바와같은용어 " 이특이적항체 " 는쿼드로마기술 ( 문헌참조 : Milstein, C. and A.C. Cuello, Nature, 1983. 305(5934): p. 537-40), 2개의상이한모노클로날항체의화학적접합 ( 문헌참조 : Staerz, U.D., et al., Nature, 1985. 314(6012): p. 628-31), 또는 Fc 영역에돌연변이를도입하는크놉인투홀또는유사한방법 ( 문헌참조 : Holliger, P., T. Prospero, and G. Winter, Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(14): p. 6444-8.18) 에의해, 다중의상이한면역글로빈종 ( 이중에하나만이작용성이특이적항체이다 ) 을생성시킴으로써제조되는완전한길이의항체를언급한다. 분자기능에의해, 이특이적항체는이의 2개의결합암 ( 한쌍의 HC/LC) 중하나상의하나의항원 ( 또는에피토프 ) 에결합하고이의 2번째암 ( 다른쌍의 HC/LC) 상의다른항원 ( 또는에피토프 ) 에결합한다. 당해정의에따라, 이특이적항체는 2개의구분된항원결합암 (2개특이성및 CDR 서열로 ) 을갖고이것이결합하는각각의항원에대해 1가이다. 본원에사용된바와같은용어 " 이원-특이적항체 " 는이의결합암 ( 한쌍의 HC/LC) 의각각에서 2개의상이한항원 ( 또는에피토프 ) 와결합할수있는완전한길이의항체를언급한다 ( 문헌참조 : PCT 공보 WO 02/02773). 따라서, 이원-특이적결합단백질은동일한특이성및동일한 CDR 서열을갖는 2개의동일한항원결합암을갖고이것이결합하는각각의항원에대해 2가이다. 결합단백질의 " 작용성항원결합부위 " 는표적항원에결합할수있는부위이다. 항원결합부위의항원결합친화성은근본적으로항원결합부위가유래된모항체만큼강하지않지만항원에결합하는능력은항원에결합하는항체를평가하기위해공지된다수의방법중임의의하나를사용하여측정가능해야만한다. 더욱이, 본원에서다가의항체의항원결합부위의항원결합친화성은정량적으로동일할필요는없다. 용어 " 사이토킨 " 은세포간매개체로서다른세포집단에작용하는하나의세포집단에의해방출되는단백질에대한일반적용어이다. 당해사이토킨의예는림포킨, 모노킨및통상적인폴리펩타이드호르몬이다. 사이토킨중에는사람성장호르몬, N-메티오닐사람성장호르몬및소성장호르몬과같은성장호르몬 ; 부갑상선호르몬 ; 티록신 ; 인슐린 ; 프로인슐린 ; 렐락신 ; 프로렐락신 ; 난포자극호르몬 (FSH), 갑상선자극호르몬 (TSH) 및황체호르몬 (LH) 와같은당단백질호르몬 ; 간성장인자 ; 섬유아세포성장인자 ; 프롤락틴 ; 태반락토겐 ; 종양괴사인자-알파및 - 베타뮬러리안억제물질 ; 마우스생식선자극호르몬관련펩타이드 ; 인히빈 ; 액티빈 ; 혈관내피성장인자 ; 인테그린 ; 트롬보포이에틴 (TPO); NGF-알파와같은신경성장인자 ; 혈소판성장인자 ; TGF- 알파및 TGF-베타와같은형질전환성장인자 (TGF); 인슐린형성장인자-1 및 -11; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성인자 ; 인터페론-알파, -베타및 -감마콜로니자극인자 (CSF)( 예를들어, 대식세포-CSF(M-CSF)) 와같은인터페론 ; 과립구대식세포-CSF(GM-CSF); 및과립구-CSF(G-CSF); IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23과같은인터류킨 (IL); TNF- 알파또는 TNF-베타와같은종양괴사인자 ; 및 LIF 및키트리간드 (KL) 을포함하는기타폴리펩타이드인자가포함된다. 본원에사용된바와같이, 용어사이토킨은천연공급원또는재조합세포배양물및천연서열사이토킨의생물학적활성등가물기원의단백질을포함한다. 용어 " 링커 " 는펩타이드결합에의해연결된 2개이상의아미노산잔기를포함하는폴리펩타이드를지칭하는데사용되고하나이상의항원결합부를연결하는데사용된다. 당해링커폴리펩타이드는문헌 ( 참조 : Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123) 에널리공지되어있다. 예시적인링커는 AKTTPKLEEGEFSEAR ( 서열번호 1); AKTTPKLEEGEFSEARV ( 서열번호 2); AKTTPKLGG ( 서열번호 3); SAKTTPKLGG ( 서열번호 4); SAKTTP ( 서열번호 5); RADAAP ( 서열번호 6); RADAAPTVS ( 서열번호 7); RADAAAAGGPGS ( 서열번호 8); RADAAAA(G 4 S) 4 ( 서열번호 9), SAKTTPKLEEGEFSEARV ( 서열 번호 10); ADAAP ( 서열번호 11); ADAAPTVSIFPP ( 서열번호 12); TVAAP ( 서열번호 13); TVAAPSVFIFPP ( 서열번호 14); QPKAAP ( 서열번호 15); QPKAAPSVTLFPP ( 서열번호 16); AKTTPP ( 서열번호 17); AKTTPPSVTPLAP ( 서열번호 - 28 -
18); AKTTAP ( 서열번호 19); AKTTAPSVYPLAP ( 서열번호 20); ASTKGP ( 서열번호 21); ASTKGPSVFPLAP ( 서열번호 22), GGGGSGGGGSGGGGS ( 서열번호 23); GENKVEYAPALMALS ( 서열번호 24); GPAKELTPLKEAKVS ( 서열번호 25); 및 GHEAAAVMQVQYPAS ( 서열번호 26) 를포함하지만이에제한되지않는다. [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] " 면역글로불린불변도메인 " 은중쇄또는경쇄불변도메인을언급한다. 사람 IgG 중쇄및경쇄불변도메인아미노산서열은당업계에공지되어있다. 본원에사용된바와같은용어 " 모노클로날항체 " 또는 "mab" 는실질적으로균질의항체집단으로부터수득된항체를언급하고, 즉, 개개의항체를포함하는집단은최소량으로존재할수있는가능한천연돌연변이를제외하고는동일하다. 모노클로날항체는고도로특이적이고단일항원에대해지시된것이다. 추가로, 전형적으로상이한결정인자 ( 에피토프들 ) 에대해지시된상이한항체들을포함하는항체집단과는반대로, 각각의모노클로날항체는항원상의단일결정인자에대해지시된다. 수식어 " 모노클로날 " 은임의의특정방법에의해항체생성을요구하는것으로해석되지말아야한다. 본원에사용된바와같은용어 " 사람항체 " 는사람배선면역글로불린서열로부터유래하는가변및불변영역을포함하는것으로의도된다. 본발명의사람항체는예를들어, CDR 및특히 CDR3에서사람배선면역글로불린서열에의해암호화되지않은아미노산잔기 ( 예를들어, 시험관내무작위또는부위특이적돌연변이유발에의해또는생체내체세포돌연변이에의해도입된돌연변이 ) 를포함할수있다. 그러나, 본원에사용된바와같은용어 " 사람항체 " 는마우스와같은또다른포유동물종의배선으로부터유래하는 CDR 서열이사람골격서열상으로접목된항체를포함하는것으로의도되지않는다. 본원에사용된바와같은용어 " 재조합사람항체 " 는재조합수단에의해생성되거나, 발현되거나, 제작되거나분리된모든사람항체, 예를들어, 숙주세포내로형질감염된재조합발현벡터를사용하여발현된항체 ( 하기섹션 II C에서추가로기재됨 ), 재조합, 조합된사람항체라이브러리로부터유래된항체 (Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., and Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J.V., and Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., and Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378 ), 사람면역글로불린유전자로유전자전이된동물 ( 예를들어, 마우스 ) 로부터분리된항체 (Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., and Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al (2000) Immunology Today 21:364-370) 또는사람면역글로불린유전자서열을기타 DNA 서열로스플라이싱함을포함하는임의의기타수단에의해생성되거나발현되거나제작되거나분리된항체를포함하는것으로의도된다. 당해재조합사람항체는사람배선면역글로불린서열로부터유래된가변및불변영역을갖는다. 그러나특정양태에서, 당해재조합사람항체는시험관내돌연변이유발 ( 또는사람 Ig 서열로유전자전이된동물이사용되는경우, 생체내체세포돌연변이유발 ) 에적용되고따라서재조합항체의 VH 및 VL 영역의아미노산서열은사람배선 VH 및 VL 서열로부터유래하고이와관련된것이지만생체내사람항체배선레퍼토리내에천연적으로존재하지않을수있는서열이다. " 친화성성숙된 " 항체는하나이상의 CDR에서하나이상이변형되어당해변형된것을갖지않는모항체에비해항원에대한항체의친화성이개선된것이다. 바람직한친화성성숙된항체는표적항원에대해나노몰또는심지어피코몰친화성을갖는다. 친화성성숙된항체는당업계에공지된과정에의해생성된다. 문헌 [ 참조 :Marks et al. BidlTechnology 10:779-783 (1992)] 은 VH 및 VL 도메인셔플링에의한친화성성숙화를기재하고있다. CDR 및 / 또는골격잔기의무작위돌연변이유발은문헌 [ 참조 :Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. BioL 226:889-896 (1992)] 에기재되어있고활성향상아미노산잔기를이용한선택적돌연변이유발위치, 접촉또는과돌연변이위치에서의선택적돌연변이는미국특허 US 6914128B1에기재되어있다. " 키메라항체 " 란용어는한종유래의중쇄및경쇄가변영역서열과다른종유래의불변영역서열을포함하는항체, 예컨대쥐의중쇄및경쇄가변영역이사람불변영역에결합된항체를의미한다. "CDR 접목항체 " 란용어는한종에서유래되는중쇄및경쇄가변영역서열을포함하지만, VH 및 / 또는 VL의하나이상의 CDR 영역의서열들이다른종의 CDR 서열로교체된항체를의미하는것으로서, 예컨대쥐의 CDR의하나이상 ( 예컨대, CDR3) 이사람 CDR 서열로교체된쥐의중쇄및경쇄가변영역을보유한항체가있다. " 사람화된항체 " 란용어는사람을제외한종 ( 예컨대, 마우스 ) 유래의중쇄및경쇄가변영역서열을포함하지만 VH 및 / 또는 VL 서열의적어도일부가더 " 사람다운 ", 즉사람배선가변서열과더유사한서열로변경된항 - 29 -
체를의미한다. 사람화된항체의일형태는비사람 CDR 서열이대응하는사람 CDR 서열을대신하기위하여사람 VH 및 VL 서열로도입된 CDR 접목항체이다. 또한 " 사람화된항체 " 는목적하는항원과면역특이적으로결합하고실질적으로사람항체의아미노산서열을갖는골격 (FR) 영역및실질적으로비-사람항체의아미노산서열을갖는상보성결정영역 (CDR) 을포함하는항체또는변이유도체, 유사체또는이의단편이다. CDR과관련하여본원에사용된바와같은용어 " 실질적으로 " 는비-사람항체 CDR과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상또는 99% 이상동일한아미노산서열을갖는 CDR을언급한다. 사람화된항체는실질적으로하나이상및전형적으로 2개의가변도메인 (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv) 를포함하고여기서, CDR 영역모두또는실질적으로모두는비-사람면역글로불린 ( 즉, 공여자항체 ) 의 CDR에상응하고골격영역의모두또는실질적으로모두는사람면역글로불린컨센서스서열의 CDR이다. 하나의양태에서, 사람화된항체는또한사람면역글로불린의전형적인영역인면역글로불린불변영역 (Fc) 의하나이상의부분을포함한다. 몇몇양태에서, 사람화된항체는적어도중쇄의가변도메인뿐만아니라경쇄둘다를함유한다. 당해항체는또한중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 CH4 영역을포함할수있다. 몇몇양태에서, 사람화된항체는사람화된경쇄만을함유한다. 몇몇양태에서, 사람화된항체는사람화된중쇄만을함유한다. 특정양태에서, 사람화된항체는경쇄및 / 또는사람화된중쇄의사람화된가변도메인만을함유한다. [0094] [0095] [0096] [0097] 용어 " 캐뱃번호 ", " 캐뱃정의 " 및 " 캐뱃표지 " 는상호교환적으로본원에서사용된다. 이러한용어는당해분야에서인지되며항체또는이의항원결합부의중쇄및경쇄가변영역에서다른아미노산잔기보다더가변적인 ( 즉, 초가변성 ) 아미노산잔기의번호를매기는시스템을의미한다 [Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-391 and, kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]. 중쇄가변영역에있어서, 초가변영역은 CDR1에있어서아미노산 31 내지 35 부위, CDR2에있어서아미노산 50 내지 65 부위, 및 CDR3에있어서아미노산 95 내지 102 부위의범위이다. 경쇄가변영역에있어서, 초가변영역은 CDR1에있어서아미노산 24 내지 34 부위, CDR2에있어서아미노산 50 내지 56 부위, 및 CDR3에있어서아미노산 89 내지 97 부위의범위이다. 본원에사용된바와같은용어 "CDR" 은항체가변서열내상보성결정영역을언급한다. 중쇄및경쇄각각의가변영역에는 3개의 CDR이있고가변영역각각에대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서명명된다. 본원에사용된바와같은용어 "CDR 세트 " 는항원에결합할수있는단일가변영역내존재하는 3개의 CDR 그룹을언급한다. 이들 CDR의정확한경계선은상이한시스템에따라상이하게정의되었다. 문헌 [Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991))] 에기재된시스템은항체의임의의가변영역에적용될수있는명확한잔기번호매김시스템을제공할뿐만아니라 3개의 CDR을한정하는정확한잔기경계선을제공한다. 이들 CDR은캐뱃 CDR로서언급될수있다. 문헌 [Chothia and coworkers (Chothia &Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) and Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989))] 에서는, 아미노산서열수준에서다양성이크다할지라도캐뱃 CDR내에특정아부위는거의동일한펩타이드골격형태를취하고있음을밝혔다. 이들아부위는 L1, L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3으로서명명되었고여기서, "L" 및 "H" 는각각경쇄및중쇄영역을지칭한다. 이들영역은초티아 CDR로서언급될수있고이는캐뱃 CDR과중복되는경계선을갖는다. 캐뱃 CDR과중복하는 CDR을한정하는또다른경계선은문헌 [Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) and MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)] 에기재되어있다. 또다른 CDR 경계선한정은상기시스템중하나를엄격하게따르지는않지만, 특정잔기또는잔기그룹또는심지어전체 CDR이항원결합에영향주지않는다는예측또는실험적발견의측면에서이들이단축되거나연장될수있다하더라도캐뱃 CDR과중복된다. 본원에사용된방법은당해시스템중어느하나에따라정의된 CDR을사용할수있지만바람직한양태는캐뱃또는초티아한정된 CDR을사용하는것이다. 본원에사용된바와같은용어 " 골격 " 또는 " 골격서열 " 은 CDR을제외한가변영역의나머지서열을언급한다. CDR 서열의정확한정의는상이한시스템에의해결정될수있기때문에, 골격서열의의미는이에따라상이하게해석된다. 6개의 CDR ( 경쇄의 CDR-L1, -L2, 및 -L3 및중쇄의 CDR-H1, -H2, 및 -H3) 은또한경쇄또는중쇄상의골격영역을각쇄상에 4개의서브-영역 (FR1, FR2, FR3 및 FR4) 으로나누고여기서, CDR1은 FR1과 FR2 사이에위치되고, CDR2는 FR2와 FR3 사이에위치되고 CDR3은 FR3과 FR4 사이에위치된다. FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서특정서브-영역으로특정화하는것없이다르게언급된골격영역은단일의천연면역글로불린쇄의가변영역내에조합 FR을나타낸다. 본원에사용된바와같은 FR은 4개의서브-영역중하나를나타내고 FR들은골격영역을구성하는 4개의서브-영역중 2개이상을나타낸다. 본원에사용된바와같은, " 배선항체유전자 " 또는 " 유전자단편 " 은특정면역글로불린의발현을위해유전학 - 30 -
적재배열및돌연변이를유발하는성숙과정을거치지않는비-림프성세포에의해암호화된면역글로불린서열을언급한다 [Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)]. 본발명의다양한양태에의해제공되는잇점중하나는배선항체유전자가성숙항체유전자보다종에서개체에특징적인필수아미노산서열을보존할가능성이높음에따라당해종에서치료학적으로사용되는경우외래공급원으로서인지될가능성이낮다는사실에기인한다. [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] 본원에사용된바와같은용어 " 중화 " 는결합단백질이사이토킨에특이적으로결합하는경우사이토킨의생물학적활성을중화시킴을언급한다. 하나의양태에서, 중화결합단백질은사이토킨에결합하여약 20% 이상, 40% 이상, 60% 이상, 80% 이상또는 85% 이상으로사이토킨의생물학적활성을감소시킨다. 용어 " 활성 " 은 2개이상의항원에대한 DVD-Ig의결합특이성 / 친화성과같은활성을포함한다. " 에피토프 " 란용어는면역글로불린또는 T-세포수용체에특이적결합이가능한임의의폴리펩타이드결정인자를포함한다. 특정양태에서, 에피토프결정인자에는아미노산, 당측쇄, 포스포릴또는설포닐과같은분자의화학적활성표면기가포함되고, 특정양태에서는특이적인입체구조특징, 및 / 또는특이적하전특징을갖는것일수있다. 에피토프는항체에의해결합되는항원의일영역이다. 특정양태에서, 항체는단백질및 / 또는거대분자의배합혼합물에서자신의표적항원을우선적으로인식할때항원에특이적으로결합한다고한다. 항체가교차경쟁 ( 하나가다른하나의결합또는조절효과를방해한다 ) 하는경우항체는 " 동일한에피토프에결합한다 " 라고일컫는다. 추가로에피토프의구조적인정의 ( 중첩, 유사, 동일 ) 는유용하지만기능적정의는흔히이들이구조적 ( 결합 ) 및기능적 ( 조절, 경쟁 ) 파라미터를포괄하기때문에보다관련된다. 본명세서에사용된 " 표면플라스몬공명 " 이란용어는예를들어, BIAcore 시스템 (BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ) 등을이용하여바이오센서매트릭스내의단백질농도의변경을검출하여생체특이적상호작용을실시간분석할수있는광학현상을의미한다. 이에대한상세한설명은문헌 [Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B., et al.(1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; 및 Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277] 에기술되어있다. 본명세서에사용된 "K on " 이란용어는당업계에공지된바와같이항체 / 항원복합체를형성하기위한항원에대 한결합단백질 ( 예를들어, 항체 ) 의결합을나타내는온레이트상수 (on rate constant) 를의미하는것으로간주한다. "K on " 은또한본원에서상호교환적으로사용되는바와같이용어 " 결합율상수 " 또는 "ka" 로공지되어있다. 표적항원에대한항체의결합율또는항체와항원간의복합체형성율을지적하는당해값은하기의식으로나타낸다 : [0103] [0104] 항체 ("Ab") + 항원 ("Ag") Ab-Ag. 본원에사용된바와같은용어 "K off " 는당업계에공지되어있는바와같이, 예를들어, 항체 / 항원복합체로부터 결합단백질 ( 예를들어, 항체 ) 의해리에대한오프레이트상수또는 " 해리율상수 " 를의미하는것으로간주한 다. 당해값은하기의식에나타낸바와같이시간경과에따라 Ab-Ag 복합체가유리된항체및항원으로분리 되거나표적항원으로부터의항체의해리율을지적한다 : [0105] [0106] Ab + Ag Ab-Ag. 본원에사용된용어 "K D " 는 " 평형해리상수 " 를언급하고평형에서의적정측정또는해리율상수 (Koff) 를결합 율상수 (Kon) 으로나누어수득된값을언급하는것으로간주한다. 결합율상수, 해리율상수및평형해리율상수는항원에대한항체의결합친화성을나타내는데사용된다. 결합율및해리율상수를결정하기위한방법은당업계에널리공지되어있다. 형광계기술의사용은평형상태에서생리학적완충액중의샘플을조사하기위해높은민감성및능력을제공한다. 다른실험방법및장비, 예를들어, BIAcore ( 생분자상호작용분석 ) 분석을사용할수있다 (( 예를들어, 제조원 (BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden) 으로부터구입가능한장비 ). 추가로, KinExA ( 동력한배척분석 ) 분석 ( 제조원 : Sapidyne Instruments (Boise, Idaho)) 을또한사용할수있다. [0107] " 표지 " 및 " 검출가능한표지 " 는특이적결합파트너, 예를들어, 항체또는분석물에부착된잔기를이미하고 예를들어, 당해잔기는항체및분석물과같은특이적결합쌍의구성원간의반응을겸출가능하게하고당해 표지된특이적결합파트너, 예를들어, 항체또는분석물은 " 검출가능하게표지된 " 것으로서언급된다. 따라서, - 31 -
본원에사용된바와같은당해용어 " 표지된결합단백질 " 은결합단백질의동정을위해제공된표지가혼입된단백질을언급한다. 하나의양태에서, 당해표지는가시적또는장치적수단, 예를들어, 방사선표지된아미노산및마크된아비딘 ( 예를들어, 광학적또는비색측정방법에의해검출될수있는형광마커또는효소적활성을함유하는스트렙타비딘 ) 에의해검출될수있는비오티닐잔기의폴리펩타이드로의부착에의해검출가능한시그날을생성할수있는검출가능한마커이다. 폴리펩타이드에대한표지의예는다음을포함하지만이에제한되지않는다. 방사선동위원소또는방사선핵종 ( 예, 3 H, 14 C, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I, 177 Lu, 166 Ho 또는 153 Sm), 크로마젠, 형광표지 ( 예를들어, FITC, 로다민, 란타니드포스포르스 ), 효소표지 ( 예, 서양고추냉이퍼옥시다제, 루시퍼라제, 알칼리성포스파타제 ); 화학발광마커 ; 비오티닐기 ; 2차리포터 ( 예컨대, 류신지퍼쌍서열, 2차항체에대한결합부위, 금속결합도메인, 에피토프태그 ) 에의해인지되는소정의폴리펩타이드에피토프 ; 및자성제제, 예컨대가돌리늄킬레이트. 면역분석을위해통상적으로사용되는표지의대표적예는빛을생성시키는잔기, 예를들어, 아크리디늄화합물, 및형광을생성하는잔기, 예를들어, 플루오레세인을포함한다. 다른표지는본원에기재되어있다. 이와관련하여잔기자체는검출가능하게표지될수는없지만또다른잔기와반응시검출가능하게될수있다. " 검출가능하게표지된 " 의사용은후자유형의검출가능한표지를포괄하는것으로간주된다. [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] " 접합체 " 란용어는제2 화학잔기, 예컨대치료제또는세포독성제에화학적으로결합된결합단백질을의미한다. 본명세서에사용된 " 제제 " 라는용어는화학적화합물, 화학적화합물의혼합물, 생물학적거대분자또는생물학적물질로부터제조된추출물을의미한다. 하나의양태에서, 치료제또는세포독성제는백일해독소, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스튼, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시안트라신디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤및퓨로마이신및이의유사체또는동족체가포함되나, 이에국한되지않는다. 면역분석에사용되는경우, 접합체항체는검출항체로서사용되는검출가능하게표지된항체일수있다. 본원에사용된바와같은용어 " 결정 " 또는 " 결정화된 " 은결정형태로존재하는결합단백질 ( 예 : 항체 ) 또는이의항원결합부를의미한다. 결정은고체상태의물질의일형태로서, 무정형고체상태또는액정상태와같은다른형태와상이하다. 결정은원자, 이온, 분자 ( 예, 항체와같은단백질 ) 또는분자어셈블리 ( 예, 항원 / 항체복합체 ) 의규칙적이고반복적인입체배열로구성된다. 이러한입체배열은당업계에공지된특이적인수학적관계에따라배열된다. 결정중에서반복되는기본유니트또는빌딩블록은비대칭유니트라한다. 배열내비대칭유니트의반복은분명한소정의결정학적대칭과일치하게하여결정의 " 유니트셀 " 을제공한다. 모든 3차원에서규칙적해독에의한유니트셀의반복은결정을제공한다 [Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York (1999)]. " 폴리뉴클레오타이드 " 란용어는 2개이상의뉴클레오타이드의중합체형태를의미하는것으로서, 리보뉴클레오타이드이거나데옥시리보뉴클레오타이드또는어느한뉴클레오타이드의변형된형태를의미한다. 이용어에는일본쇄및이본쇄표준형태의 DNA가포함된다. 본명세서에사용된 " 분리된폴리뉴클레오타이드 " 란용어는폴리뉴클레오타이드 ( 예컨대, 게놈, cdna 또는합성기원또는이의일부조합 ) 를의미하는데, 그기원에따라서, " 분리된폴리뉴클레오타이드 " 는자연에서발견되는 " 분리된폴리뉴클레오타이드 " 의폴리뉴클레오타이드전부또는일부와관련되어있지않거나, 자연에서는결합되지않았던폴리뉴클레오타이드에작동적으로결합되거나 ; 또는더큰서열의일부로서자연에서발생되지않는폴리뉴클레오타이드이다. " 벡터 " 라는용어는결합된다른핵산을수송할수있는핵산분자를의미하는것으로간주한다. 벡터의한가지형태는추가 DNA 분절이결찰될수있는원형의이본쇄 DNA 루프를의미하는 " 플라스미드 " 이다. 다른형태의벡터는추가 DNA 분절이바이러스게놈에결찰될수있는바이러스벡터이다. 특정벡터는도입된숙주세포에서자율복제할수있다 ( 예컨대, 세균복제기원을보유한세균벡터및에피솜성포유동물벡터 ). 다른벡터 ( 예컨대, 비에피솜성포유동물벡터 ) 는숙주세포에도입시숙주세포의게놈으로통합될수있고, 이로써숙주게놈에따라복제된다. 더욱이, 특정벡터는작동적으로결합된유전자의발현을유도할수있다. 이러한벡터는본명세서에서 " 재조합발현벡터 "( 또는간단히 " 발현벡터 ") 라한다. 일반적으로재조합 DNA법에유용한발현벡터는흔히플라스미드형태이다. 본명세서에 " 플라스미드 " 및 " 벡터 " 는플라스미드가벡터의가장일반적으로사용되는형태이기때문에대체되어사용될수있다. 하지만, 본발명은등가기능을하는바이러스벡터 ( 예 - 32 -
를들어, 복제결함레트로바이러스, 아데노바이러스및아데노관련바이러스 ) 와같은다른형태의발현벡터 도포함한다. [0113] [0114] [0115] [0116] [0117] [0118] " 작동적으로결합된 " 이란용어는기술된성분이의도한방식대로기능할수있는관계에있는병치상태를의미한다. 암호서열에 " 작동적으로결합된 " 조절서열은암호서열의발현이조절서열에적합한조건하에서수행되도록결찰된다. " 작동적으로결합된 " 서열에는당해유전자에근접한발현조절서열번호및당해유전자를조절하기위하여트랜스로작용하거나일정거리에있는발현조절서열이포함된다. 본명세서에사용된바와같은 " 발현조절서열 " 이란용어는이들이결찰된암호서열의발현과프로세싱을수행하는데필요한폴리뉴클레오타이드서열을의미한다. 발현조절서열에는적당한전사개시, 종결, 프로모터및인핸서서열 ; 접목및폴리아데닐화시그날과같은효과적인 RNA 프로세싱시그날 ; 세포질 mrna를안정화시키는서열 ; 해독효율을증강시키는서열 ( 즉, 코작컨센서스서열 ); 단백질안정성을증강시키는서열 ; 필요한경우단백질분비를증강시키는서열번호등이포함된다. 이러한조절서열의성질은숙주유기체에따라다르며, 원핵생물인경우, 이러한조절서열에는일반적으로프로모터, 리보솜결합부위및전사종결서열이있고 ; 진핵생물인경우, 이러한조절서열에는프로모터및전사종결서열이있다. " 조절서열 " 이란용어는그존재가발현및프로세싱에필수적인성분을포함하는것으로간주하고, 리더서열번호및융합파트너서열과같이그존재가유리한추가성분을포함할수도있다. " 형질전환 " 은외인성 DNA가숙주세포로유입되는임의의공정을의미한다. 형질전환은당업계에공지된다양한방법을사용하여자연또는인공조건하에서실시될수있다. 형질전환은이종핵산서열을원핵생물또는진핵생물숙주세포로삽입하기위한임의의공지된방법에따라달라질수있다. 이러한방법은형질전환되는숙주세포에따라선택되는데, 그예로는바이러스감염, 전기천공, 리포펙션및입자충격이있으나, 이에국한되지는않는다. 이러한 " 형질감염된 " 세포는삽입된 DNA가자율복제성플라스미드로서또는숙주염색체의일부로서복제할수있는안정적으로형질감염된세포를포함한다. 또한, 이들세포는삽입된 DNA 또는 RNA를한정된시간동안일시적으로발현하는세포도포함한다. " 재조합숙주세포 "( 또는간단히 " 숙주세포 ") 란용어는외인성 DNA가도입된세포를의미하는것으로간주한다. 하나의양태에서, 숙주세포는예를들어, 미국특허번호제7,262,028호에기재된숙주세포와같이, 항체를암호화하는 2개이상 ( 예를들어, 다중 ) 핵산을포함한다. 이러한용어는특정피검체세포뿐만아니라이세포의자손도의미하는것으로의도된다는것이이해되어야한다. 후속세대에는돌연변이또는환경적영향으로인해특정변형이일어날수있기때문에, 상기자손은사실상모세포와동일하지않지만본명세서에사용된 " 숙주세포 " 란용어의범위에는포함되는것으로간주한다. 하나의양태에서, 숙주세포는임의의생물계에서선택되는원핵생물및진핵생물세포를포함하는것이바람직하다. 또다른양태에서, 진핵생물세포에는원생생물, 진균, 식물및동물세포가포함된다. 또다른양태에서, 숙주세포는원핵생물세포주이. 콜라이 ; 포유동물세포주 CHO, HEK 293, COS, NSO, SP2 및 PER.C6; 곤충세포주 Sf9; 및진균세포사카로마이세스세레비지애를포함하며, 이에국한되지는않는다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드합성및조직배양과형질전환 ( 예, 전기천공, 리포펙션 ) 에는표준기술을사용할수있다. 효소반응과정제기술은제조업자의지침에따라수행하거나당업계에서일반적으로수행하는바와같이또는본명세서에기술된바와같이수행할수있다. 상기기술및절차들은당업계에공지된통상의방법에따라또는본명세서에서인용되고논의된각종일반문헌및특정문헌들에기술된바와같이일반적으로수행할수있다. 본원에임의의목적으로참조로서인용된문헌 Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)) 를참조한다. 당업계에공지된바와같은 " 유전자전이유기체 " 란전이유전자를포함하는세포를가진유기체를의미하는것으로서, 유기체 ( 또는이유기체의선조 ) 에도입된전이유전자는유기체에서자연발현되지않는폴리펩타이드를발현한다. " 전이유전자 " 는유전자전이유기체가발생하는세포의게놈으로안정적이고작동적으로통합되어, 유전자전이유기체의하나이상의세포형태또는조직에서암호화된유전자산물의발현을유도하는 DNA 작제물이다. " 조절하다 " 및 " 조정하다 " 란용어는당해분자의활성 ( 예, 사이토킨의생물학적활성 ) 에있어서변화또는변경을의미한다. 조절은당해분자의특정활성또는기능의정도 (magnitude) 에있어서의증가또는감소일수있다. 분자활성및기능의예에는결합특징, 효소활성, 세포수용체활성화및시그날전달등이있으나, 이에국한되지는않는다. - 33 -
[0119] [0120] [0121] [0122] [0123] [0124] [0125] [0126] [0127] 이와마찬가지로, " 조절인자 " 란용어는당해분자의활성또는기능 ( 예, 사이토킨의생물학적활성 ) 을변화또는변경시킬수있는화합물이다. 예를들어, 조절인자는이조절인자의부재시관찰되는활성또는기능의정도에비교했을때분자의특정활성또는기능의정도에있어서의증가또는감소를유발할수있다. 특정양태에서, 조절인자는분자의하나이상의활성또는기능의정도를감소시키는억제제이다. 억제제의예에는단백질, 펩타이드, 항체, 펩티바디 (peptibody), 탄수화물또는유기소분자가있으나, 이에국한되지않는다. 펩티바디는 WO 01/83525 등에기술되어있다. " 효능제 (agonist)" 란용어는목적하는분자와접촉했을때효능제의부재시관찰되는활성또는기능의정도와비교했을때당해분자의특정활성또는기능의정도에있어서의증가를유발하는조절인자를의미한다. 목적하는특정효능제에는항원에결합하는폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물또는임의의다른분자가포함될수있으나, 이에국한되는것은아니다. " 길항제 " 또는 " 억제제 " 란용어는목적하는분자와접촉했을때, 길항제의부재시관찰되는활성이나기능의정도와비교했을때당해분자의특정활성이나기능의정도에있어서의감소를유발하는조절인자를의미한다. 목적하는특정길항제에는항원의생물학적또는면역학적활성을차단또는조절하는물질이포함된다. 항원의길항제및억제제에는항원에결합하는단백질, 핵산, 탄수화물또는임의의다른분자가포함되나, 이에국한되지는않는다. 본원에사용된바와같은용어 " 유효량 " 은장애또는이의하나이상의증상을경감시키거나완화시키거나장애의진행을차단하거나, 장애를퇴화시키거나, 재발, 발병, 장애와연관된하나이상의증상의개시또는진행을차단하거나, 장애를검출하거나또다른치료의예방학적또는치료학적효과 ( 들 )( 예를들어, 예방학적또는치료학적제제 ) 를증진시키거나개선시키는데충분한치료양을언급한다. " 환자 " 및 " 피검체 " 는본원에서영장류 ( 예를들어, 사람, 원숭이및침팬치 ), 비-영장류 ( 예를들어, 소, 돼지, 낙타, 라마, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니아피그, 고양이, 개, 랫트, 마우스, 고래 ) 를포함하는포유동물, 새 ( 예를들어, 오리또는거위 ) 및상어와같은동물을언급하기위해상호교환적으로사용될수있다. 바람직하게, 환자또는피검체는질환, 장애또는병태에대해치료되거나진단되는사람, 질환, 장애또는병태위험에처한사람, 질환, 장애또는병태를갖는사람및 / 또는질환, 장애또는병태를위해치료되는사람과같은사람이다. 본명세서에사용된 " 시료 " 란용어는가장광범위한의미로사용되고있다. 본명세서에사용된 " 생물학적시료 " 는생물체또는이전생물체에서유래하는임의의양의물질을포함하나, 이에국한되는것은아니다. 이러한생물체에는사람, 마우스, 래트, 원숭이, 개, 토끼및다른동물이있으나, 이에국한되는것은아니다. 상기물질에는혈액 ( 예를들어, 전혈 ), 혈장, 혈청, 뇨, 양막액, 윤활액, 내피세포, 백혈구, 단핵구, 기타세포, 기관, 조직, 골수, 림프절및비장이있으나, 이에국한되지않는다. " 성분 ", " 성분들 " 및 " 하나이상의성분 " 은일반적으로, 본원에기재된방법및당업계에공지된기타방법에따라, 시험시료 ( 예를들어, 환자뇨, 혈청또는혈장시료 ) 의분석을위해키트에포함될수있는포획항체, 검출또는접합체항체, 대조군, 계측기, 일련의계측기, 민감성패널, 컨테이너, 완충액, 희석제, 염, 효소, 효소에대한조인자, 검출시약, 전처리시약 / 용액, 기질 ( 예를들어, 용액으로서 ) 및종료용액등을언급한다. 따라서, 본원에서, " 하나이상의성분 ", " 성분 " 및 " 성분들 " 은예를들어, 항-분석물 ( 예를들어, 항-폴리펩타이드 ) 항체에결합함에의해고형지지체상에임의로고정화된폴리펩타이드와같은분석물을포함하는조성물과같은상기된바와같은폴리펩타이드또는다른분석물을포함할수있다. 몇몇성분들은용액중에있을수있거나분석용으로재구성하기위해동결건조될수있다. " 대조군 " 은분석물을함유하지않는것으로공지된조성물 (" 음성대조군 ") 또는분석물을함유한것으로공지된조성물 (" 양성대조군 ") 을언급한다. 양성대조군은공지된농도의분석물을포함할수있다. " 대조군 ", " 양성대조군 " 및 " 계측기 " 는공지된농도의분석물을포함하는조성물을언급하기위해본원에서상호교환적으로사용될수있다. " 양성대조군 " 은분석수행능특성을설정하기위해사용될수있고시약 ( 예를들어, 분석물 ) 의위상에대해유용한지시기이다. " 예비결정된컷오프 " 및 " 예비결정된수준 " 은일반적으로예비결정된컷오프 / 수준 ( 여기서, 예비결정된컷오프 / 수준은이미다양한임상파라미터 ( 예를들어, 질환의중증도, 진행성 / 비진행성 / 개선등 ) 와연계되어있거나연관되어있다 ) 에대해서분석결과를비교함에의해진단 / 예후 / 치료학적효능을평가하기위해사용되는분석컷오프값을언급한다. 본발명은예시적인예비결정된수준을제공할수있고, 컷오프값이면역분석 ( 예를들어, - 34 -
사용된항체등 ) 의성질에따라다양할수있음은널리공지되어있다. 추가로본원에기재된바를토대로당해다른분석을위한면역분석-특이적컷오프값을수득하기위해, 다른면역분석에대해서본원에기재된내용을채택한다는것은당업자의기술범위내에있다. 예비결정된컷오프 / 수준의정확한값은분석간에다양할수있는반면, 본원에기재된바와같은관련성 ( 존재하는경우 ) 이일반적으로적용가능해야만한다. [0128] [0129] [0130] [0131] [0132] [0133] 본원에기재된바와같은진단분석에사용된바와같은 " 전처리시약 " 예를들어, 용해, 침전및 / 또는가용화시약은임의의용해시키는시약및 / 또는시험시료에존재하는임의의분석물을가용화시키는시약이다. 전처리는본원에서추가로기재한바와같이모든시료에대해필수적인것은아니다. 무엇보다, 분석물 ( 예를들어, 목적하는폴리펩타이드 ) 을가용화시켜시료내존재하는임의의내인성결합단백질로부터분석물을방출시키는것이필수적이다. 전처리시약은동종성 ( 분리단계를요구하지않음 ) 또는이종성 ( 분리단계를요구함 ) 일수있다. 이종성전처리시약을사용하여, 다음단계의분석으로진행하기전에시험시료로부터침전된분석물결합단백질을제거한다. 상기된면역분석및키트에대한내용중에 " 품질대조군시약 " 은계측기, 대조군및민감성패널을포함하지만이에제한되지않는다. " 계측기 " 또는 " 표준물 " 은전형적으로항체또는분석물과같은분석물의농도외삽용계측 ( 표준 ) 곡선을작성하기위해사용된다 ( 예를들어, 하나이상, 예를들어, 다수 ). 또한, 예비결정된양성 / 음성컷오프근처에있는단일계측기가사용될수있다. 다중계측기 ( 즉, 하나이상의계측기또는다양한양의계측기 ( 들 )) 가 " 민감성패널 " 을포함하도록연계하여사용될수있다. " 위험 " 은현재또는향후몇몇시점에서발생하는특정사건의가능성또는가망성을언급한다. " 위험도층별화 (Risk stratification)" 는담당의가환자를저, 중, 고또는최고위험의특정질환, 장애또는병태의발병으로분류할수있게해주는일련의공지된임상적위험인자를언급한다. 특이적결합쌍 ( 예를들어, 항원 ( 또는이의단편 ) 및항체 ( 또는이의항원적으로반응성인단편 )) 의구성원간의상호작용에서 " 특이적 " 및 " 특이성 " 은상호작용의선택적반응성을언급한다. 용어 " 특이적으로결합하는 " 및이의유사용어는항체 ( 또는이의항원적반응성단편 ) 이분석물 ( 또는이의단편 ) 에특이적으로결합하지만다른실체에는특이적으로결합하지않는능력을언급한다. " 특이적결합파트너 " 는특이적결합쌍의구성원이다. 특이적결합쌍은화학적또는물리적수단을통해서로특이적으로결합하는 2개의상이한분자를포함한다. 따라서, 통상의면역분석의항원및항체특이적결합쌍에추가로, 다른특이적결합쌍은비오틴및아비딘 ( 또는스트렙타비딘 ), 탄수화물및렉틴, 상보적뉴클레오타이드서열, 효능인자및수용체분자, 조인자및효소, 효소억제제및효소등을포함할수있다. 추가로, 특이적결합쌍은본래의특이적결합구성원의유사체, 예를들어, 분석물-유사체인구성원을포함할수있다. 면역반응성특이적결합구성원은분리되거나재조합적으로제조되거나상관없이항원, 항원단편및모노클로날및폴리클로날항체를포함하는항체및이의복합체, 단편및변이체 ( 변이체의단편을포함 ) 를포함한다. 본원에사용된바와같은 " 변이체 " 는아미노산의부가 ( 예를들어, 삽입 ), 결실또는보존적치환에의해아미노산서열에있어서소정의폴리펩타이드 ( 예를들어, IL-18, BNP, NGAL 또는 HIV 폴리펩타이드또는항-폴리펩타이드항체 ) 와는상이하지만소정의폴리펩타이드의생물학적활성을보유하는 ( 예를들어, 변이체 IL-18은 IL-18 에결합하는것에대해항-IL-18 항체와경쟁할수있다 ) 폴리펩타이드를의미한다. 아미노산의보존성치환, 즉, 유사한성질 ( 예를들어, 소수성및하전정도및하전영역의분포 ) 을갖는상이한아미노산으로의대체는전형적으로최소의변화를포함하는것으로서인지된다. 이들최소의변화는부분적으로당업계 ( 문헌참조 : Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132(1982)) 에서이해되는바와같이아미노산의하이드로패틱지수 (hydropathic index) 를고려하여동정될수있다. 아미노산의하이드로패틱지수는소수성및하전의고려를기준으로한다. 유사한하이드로패틱지수의아미노산이치환되어여전히단백질기능을보유할수있다는것은당업계에공지되어있다. 하나의측면에서, ± 2의하이드로패틱지수를갖는아미노산이치환된다. 또한아민산의친수성은생물학적기능을보유하는단백질을유도하는치환을밝히기위해사용될수있다. 펩타이드와관련하여아미노산의친수성을고려하여펩타이드의최대국소평균친수성을계산할수있고이는항원성및면역원성과연관된것으로보고된유용한측정치이다 ( 문헌참조 : 미국특허제4,554,101호, 이는본원에참조로서인용된다 ). 유사한친수성값을갖는아미노산의치환은생물학적활성, 예를들어, 당업계에서이해되는바와같은면역원성을보유하는펩타이드를유도할수있다. 하나의측면에서, 치환은서로 ± 2 이내의친수성값을갖는아미노산으로수행된다. 아미노산의소수성지수및친수성값둘다는아미노산의특정측쇄에의해영향받는다. 당해관찰과일관되게생물학적기능과양립할수있는아미노산치환은소수성, 친수성, 하전, 크기및다른성질에의해나타나는바와같이아미노산및특히아미노산의측쇄의상대적유사성에의존하는것으 - 35 -
로이해된다. " 변이체 " 는또한단백질용해, 인산화, 또는기타해독후변형과같은차등적으로가공되었으나이의생물학적활성또는항원반응성, 예를들어, IL-18에결합하는능력을보유하는폴리펩타이드또는이의단편을기재하는사용될수있다. 본원에서 " 변이체 " 의사용은본원에서달리언급되지않는경우변이체의단편을포괄하는것으로의도된다. [0134] [0135] [0136] [0137] [0138] [0139] [0140] I. DVD 결합단백질의제조본발명은하나이상의표적과결합할수있는이원가변도메인결합단백질및이의제조방법에관한것이다. 하나의양태에서, 결합단백질은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[ 여기서, VD1은제1 가변도메인이고, VD2는제 2 가변도메인이고, C는불변도메인이고, X1은아미노산또는폴리펩타이드이고, X2는 Fc 영역이고 n은 0 또는 1이다 ] 를포함하는폴리펩타이드쇄를포함한다. 본발명의결합단백질은다양한기술을사용하여제조될수있다. 본발명은발현벡터, 숙주세포및결합단백질을제조하는방법을제공한다. A. 모모노클로날항체의제조 DVD 결합단백질의가변도메인은목적하는항원에결합할수있는폴리클로날및모노클로날항체를포함하는, 모항체로부터수득될수있다. 이들항체는천연에존재할수있거나재조합기술에의해제조될수있다. MAb는하이브리도마, 재조합및파아지디스플레이기술또는이의조합을포함하는당업계에공지된광범위한기술을사용하여제조될수있다. 예를들어, mab는당업계에공지된기술을포함하여예를들어, 문헌 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)( 상기참조문헌들은그전체가참조로서인용된다 )] 에교시된하이브리도마기술을사용하여제조될수있다. 본원에사용된바와같은용어 " 모노클로날항체 " 는하이브리도마기술을통해생산된항체에제한되지않는다. 용어 " 모노클로날항체 " 는임의의진핵, 원핵또는파아지클론을포함하여단일클론으로부터유래되지만이를생성시키는방법에의해유래되지않는항체를언급한다. 하이브리도마는하기실시예 1에서논의되는바와같이선별하고클로닝하고추가로강한하이브리도마성장, 고항체생산및목적하는항체특성을포함하여목적하는특성에대해스크리닝한다. 하이브리도마는동일유전자계동물, 면역계가결핍된동물, 예를들어, 누드마우스와같은생체내에서또는시험관내세포배양에서배양하고증식시킬수있다. 하이브리도마를선별하고클로닝하고증식시키는방법은당업자에게널리공지되어있다. 특정양태에서, 하이브리도마는상기논의된바와같이마우스하이브리도마이다. 또다른바람직한양태에서, 하이브리도마는랫트, 양, 돼지, 염소, 소또는말과같은비사람, 비마우스종에서제조된다. 또다른양태에서, 하이브리도마는사람하이브리도마이고이때사람비-분비골수종이특이항원과결합할수있는항체를발현하는사람세포와융합된다. 재조합 mab는문헌 [U.S. Patent No. 5,627,052, PCT Publication WO 92/02551 and Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848] 에기재된바와같이선택된림프구항체방법 (SLAM) 과같이당업계에언급된과정을사용하여단일의분리된림프구로부터생성된다. 본방법에서, 목적하는항체를분비하는단일세포, 예를들어, 면역화된동물로부터유래된림프구는동정되고, 중쇄및경쇄가변영역 cdna를역전사효소 PCR에의해세포로부터수득하고이어서이들가변영역을적절한면역글로불린불변영역 ( 예를들어, 사람불변영역 ) 과관련하여 COS 또는 CHO 세포와같은포유동물숙주세포에서발현시킬수있다. 생체내선별된림프구로부터유래된증폭된면역글로불린서열로형질감염된숙주세포를이어서추가분석하고예를들어, 형질감염된세포를선별하여목적하는항원에대한항체를발현하는세포를분리함에의해선별할수있다. 증폭된면역글로불린서열은추가로예를들어, 문헌 [PCT Publication WO 97/29131 and PCT Publication WO 00/56772] 에기재된바와같은시험관내친화성성숙화방법에의해추가로조작할수있다. 모노클로날항체는또한사람면역글로불린좌의일부또는전부를포함하는비-사람동물을목적하는항원으로면역화시켜제조된다. 하나의양태에서, 비-사람동물은사람면역글로불린좌의대형단편을포함하고마우스항체생산이결핍된유전자조작된마우스균주인 XENOMOUSE 유전자전이마우스이다. 문헌 [Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994) 및미국특허 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 및 6,130,364] 을참조한다. 1991년 7월 25일에공개된 WO 91/10741, 1994년 2월 3일에공개된 WO94/02602, 1996년 10월 31일에공개된 WO 96/34096 및 WO 96/33735, 1998년 4월 23일에공개된 WO98/16654, 1998년 6월 11일에공개된 WO 98/24893, 1998년 11월 12일에공개된 WO 98/50433, 1999년 9월 10 일에공기된 WO 99/45031, 1999년 10월 21일에공개된 WO 99/53049, 2000년 2월 24일에공개된 WO 00 09560 및 2000년 6월 29일에공개된 WO 00/037504도참조한다. XENOMOUSE 유전자전이마우스는완전하게사람항체의성인계사람목록을생산하고, 항원특이적인사람 Mab를생성한다. XENOMOUSE 유전자전이마우스는사람중쇄 - 36 -
좌및 x 경쇄좌의메가염기크기의배선형태 YAC 단편의도입을통해사람항체목록의약 80% 를포함한다. 그공개가본원에참조로서인용되는 Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495(1998) 을참조한다. [0141] [0142] [0143] [0144] 또한, 본발명의항체제조에는시험관내방법도사용할수있는데, 여기서항체라이브러리를스크리닝하여목적하는결합특이성을갖는항체를동정한다. 재조합항체라이브러리를선별하는방법은당업계에공지되어있고, 예컨대문헌 [Ladner et al. 미국특허 5,223,409; Kang et al. PCT 공개 WO 92/18619; Dower et al. PCT 공개 WO 91/17271; Winter et al. PCT 공개 WO 92/20791; Markland et al. PCT 공개 WO 92/15679; Breitling et al. PCT 공개 WO 93/01288; McCafferty et al. PCT 공개 WO 92/01047; Garrard et al. PCT 공개 WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81-85 ; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol.Biol. 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad et al.(1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; 및 Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982, 미국출원공개 20030186374, 및 PCT 공개 WO 97/29131] 등에설명된방법을포함하고, 그들각각의내용은본원에참조로서인용된다. 본발명의모항체는또한당업계에공지된다양한파아지디스플레이방법을사용하여제조될수있다. 파아지디스플레이방법에서, 기능성항체도메인은파아지입자를암호화하는폴리뉴클레오타이드서열을갖는파아지입자표면상에나타난다. 특히, 당해파아지는레퍼토리또는조합항체라이브러리 ( 예를들어, 사람또는쥐 ) 로부터발현된항원-결합도메인을나타내는데사용될수있다. 목적하는항원과결합하는항원결합도메인발현파아지는예를들어, 표지된항원또는고형표면또는비드에결합되거나포획된항원을사용하여선별되거나동정될수있다. 이들방법에사용되는파아지는전형적으로파아지유전자 III 또는유전자 VIII 단백질에재조합적으로융합된 Fab, Fv 또는디설파이드안정화된 Fv 항체도메인을갖는파아지로부터발현된 fd 및 M13 결합도메인을포함하는필라멘트형파아지이다. 본발명의항체를제조하는데사용될수있는파아지디스플레이방법의예는문헌 [Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT application No. PCT/GB91/01134; PCT 공보 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; and U.S. Pat. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 and 5,969,108] 에기재된것들을포함하고 ; 이들각각은그전체가본원에참조로서인용된다. 상기문헌에기재된바와같이, 파아지선별후, 파아지로부터항체암호화영역을, 하기에상세히기재되는바와같이분리할수있고이를사용하여포유동물세포, 곤충세포, 식물세포, 효모및세균을포함하는임의의목적하는숙주에서발현되는사람항체또는임의의다른목적하는항원결합단편을포함하는전체항체를생산할수있다. 예를들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을재조합으로생산하기위한기술은또한문헌 [PCT 공보 WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); and Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); and Better et al., Science 240:1041-1043 (1988)( 상기참조문헌들은그들의전체가본원에참조로서인용된다 )] 에기재된것들과같은방법을당업계에공지된방법을사용하여사용될수있다. 단일쇄 Fv 및항체를생산하기위해사용될수있는기술의예는문헌 [U.S. Pat. 4,946,778 and 5,258, 498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); and Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)] 에기재된것들을포함한다. 파아지디스플레이에의한재조합항체라이브러리의스크리닝에대한대안으로, 대형조합라이브러리에대해당업계에공지된기타방법을적용하여본발명의이원특이성항체를동정할수있다. 한가지유형의또다른발현시스템은문헌 [PCT Publication No. WO 98/31700 by Szostak and Roberts, and in Roberts, R.W. and Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302] 에기재된바와같이재조합항체라이브러리가 RNA 단백질융합으로서발현되는것이다. 당해시스템에서, 공유융합은 mrna 및 3' 말단에푸로마이신, 펩티딜수용체항생제를함유하는합성 mrna의시험관내해독에의해, 암호화된펩타이드또는반백질사이에서형성된다. 따라서, 특이적 mrna는암호화된펩타이드또는단백질, 예를들어, 항체또는이의일부 ( 예를들어, 항체결합부또는이의일부 ) 의이원특이성항원에대한성질을기준으로 mrna의배합혼합물 ( 예를들어, 조합라이브러리 ) 로부터집적될수있다. 당해라이브러리의스크리닝으로부터회수된항체또는이의 - 37 -
일부를암호화하는핵산서열은상기된바와같이 ( 예를들어, 포유동물숙주세포에서 ) 재조합수단에의해발현될수있고특히, 본래에선별된서열에돌연변이가도입된 mrna-펩타이드융합을추가로스크리닝함에의해또는상기된바와같은재조합항체의친화성성숙화를위한기타방법에의해친화성이추가로성숙화될수있다. [0145] [0146] [0147] [0148] 또다른방법에서, 본발명의항체는또한당업계에공지된효모디스플레이방법을사용하여제조될수있다. 효모디스플레이방법에서, 유전학적방법을사용하여항체도메인을효모세포벽에부착시키고이들을효모의 표면상에나타나게할수있다. 특히, 당해효모를사용하여레퍼토리또는조합항체라이브러리 ( 예를들어, 사람또는쥐 ) 로부터발현되는항원결합도메인이나타나게할수있다. 본발명의항체를제조하는데사용될 수있는효모디스플레이방법의예는본원에참조로서인용된문헌 [Wittrup, et al. U.S. Patent No. 6,699,658] 에기재된것들을포함한다. 상기된항체는추가로변형시켜 CDR 접목및사람화된모항체를생성시킬수있다. CDR-접목된모항체는사 람항체기원의중쇄및경쇄가변영역서열을포함하고이때, VH 및 / 또는 VL의하나이상의 CDR 영역은목적 하는항원과결합할수있는쥐항체의 CDR 서열로대체된다. 임의의사람항체기원의골격서열은 CDR 접목 을위한주형으로서작용할수있다. 그러나, 당해골격상으로의직쇄대체는흔히항원에대한결합친화성을 약간손상시킨다. 사람항체가본래의쥐항체와보다동일할수록쥐 CDR과사람골격의조합이 CDR내에서뒤 틀림을유발하여친화성을감소시킬가능성이보다적어진다. 따라서, CDR을제외한쥐가변골격을대체하도 록선택된사람가변골격은쥐항체가변영역골격과 65% 이상의서열동일성을갖는것이바람직할수있다. CDR을제외한사람및쥐가변영역은 70% 이상의서열동일성을갖는것이보다바람직할수있다. 하나의양 태에서, CDR을제외한사람및쥐가변영역은쥐항체가변영역골격과 75% 이상의서열동일성을갖는것이 보다더바람직할수있다. 특정양태에서, CDR을제외한사람및쥐가변영역은쥐항체가변영역골격과 80% 이상의서열동일성을갖는것이가장바람직할수있다. 또다른양태에서, 당해항체를제조하는방법은 당업계에공지되어있고 ( 문헌참조 : EP 239,400; PCT 공보 WO 91/09967; U.S. Pat. Nos. 5,225,539; 5,530,101; and 5,585,089), 베니어링또는재표면화 ( 문헌참조 : EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994)), 및쇄셔플링 ( 미국특허제5,565,352호 ) 및항-이디오타입항체가있다. 사람화된항체는비-사람종기원의하나이상의상보성결정영역 (CDR) 및사람면역글로불린분자기원의골 격영역을갖는, 목적하는항원에결합하는비-사람종항체기원의항체분자이다. 공지된사람 Ig 서열은예 를들어, 본원에전반적인내용이참조로서인용되는하기인터넷주소및문헌에기재되어있고, 이들각각은 그전체가본원에참조로서인용된다 : www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez- /query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/sd/it/it.html; www.whfreeman.com/immunology/ch- 05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/immune/antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m- ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/biolinks/immuno- logy.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.- html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html- ; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehimeu.acjp/.about.yasuhito- /Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/aep- Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- blic/intro.html; www.ibt.unam.mx/vir/v_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/ahosem- inar/slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/cc/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h- umanisation/tahhp.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo- ut.fmolina/webpages/pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983). 당해입수된서열을사용하 - 38 -
여당업계에공지된바와같이면역원성을감소시키거나결합, 친화성, 결합율, 해리율, 결합도 (avidity), 특이 성, 반감기또는임의의기타적합한특징을감소시키거나증진시키거나변형시킬수있다. [0149] [0150] [0151] [0152] [0153] [0154] 사람골격영역내골격잔기는상응하는 CDR 공여자항체로대체하여항원결합을변화, 바람직하게는개선시킬수있다. 이들골격대체는예를들어, CDR 및골격잔기의상호작용에대해모델링하여항원결합과서열비교에중요한골격잔기를동정하여특정위치에서의특정골격잔기를동정함에의해당업계에널리공지된방법에의해동정된다. 예를들면, 그전체가본원에참조로서인용되는 Queen et al., U.S. Pat. No. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988) 을참조한다. 입체면역글로불린모델은통상적으로유용하고당업자에게익숙하다. 선택된후보면역글로불린서열의가능한 3차원형태구조를설명하고나타내는컴퓨터프로그램은유용하다. 이들디스플레이의조사는후보면역글로불린서열의기능에있어서가능한잔기의역할에대한분석, 즉, 항원에결합하는후보면역글로불린의능력에영향을주는잔기의분석을가능하게한다. 이러한방식으로, FR 잔기가선별될수있고컨센서스및입수서열로부터조합될수있어표적항원에대한증가된친화성과같은목적하는항체특성이달성된다. 일반적으로, CDR 잔기는직접적으로및가장실질적으로항원결합에영향을주는데관여한다. 항체는문헌 [Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994); PCT 공보 WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, U.S. Pat. Nos. 5,565,332, 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567] 에기재된것들을제한없이포함하는당업계에공지된다양한기술을사용하여사람화될수있고, 이들문헌은각각그전체가본원에참조로서인용되고, 그들에열거된참조문헌을포함한다. B. 모모노클로날항체를선별하기위한기준본발명의한양태는 DVD-Ig 분자내하나이상의목적하는성질을갖는모항체를선별하는것이다. 하나의양태에서, 목적하는성질은하나이상의항체파라미터로부터선택된다. 또다른양태에서, 항체파라미터는항원특이성, 항원에대한친화성, 효능, 생물학적기능, 에피토프인지, 안정성, 용해도, 생산효율, 면역원성, 약동력학, 생체이용률, 조직교차반응성및유사항원결합으로이루어진그룹으로부터선택된다. B1. 항원에대한친화성치료학적 mab의목적하는친화성은항원의성질및목적하는치료학적엔드포인트에따라다양할수있다. 한양태에서, 모노클로날항체는당해상호작용이통상적으로고친화성상호작용 ( 예를들어, <pm - <nm 범위 ) 임으로사이토킨-사이토킨수용체상호작용을차단하는경우보다높은친화성 (Kd = 0.01-0.50 pm) 을갖는다. 이경우에, 이의표적에대한 mab 친화성은이의수용체에대한사이토킨 ( 리간드 ) 의친화성이상이어야만한다. 한편, 보다적은친화성을갖는 mab (> nm 범위 ) 는예를들어, 시퀘스터 (sequester) 및 A-β 아밀로이드의명백한순환종과결합하는, 잠재적으로순환하는병원성단백질, 예를들어, 모노클로날항체를제거하는데치료학적으로효과적일수있다. 다른경우에, 부위지시된돌연변이유발에의해기존의고친화성 mab의친화성을감소시키거나표적에대해낮은친화성을갖는 mab를사용하여잠재적인부작용을피할수있는데, 예를들어, 고친화성 mab는이의의도된표적모두를격리 / 중화시켜표적화된단백질의기능을완전히고갈 / 제거할수있다. 이러한시나리오에서, 저친화성 mab는질환증상 ( 병리학적또는과생성수준 ) 에관여할수있는표적의일부를격리 / 중화시켜표적의일부가계속해서이의정상적인생리학적기능을수행할수있게한다. 따라서, 용량을조정하고 / 하거나부작용을감소시키기위해 Kd를감소시킬수있다. 모 mab의친화성은목적하는치료학적결과를달성하기위해세포표면분자를적당히표적화하는데역할을수행할수도있다. 예를들어, 표적이고밀도로암세포상에및저밀도로정상세포상에발현되는경우, 저친화성 mab는정상세포보다는종양세포상의다수의표적물에결합하여 ADCC 또는 CDC를통해종양세포를제거할수있고따라서치료학적으로바람직할수있는효과를가질수있다. 따라서, 목적하는친화성을갖는 mab의선별은가용성및표면표적둘다를위해적절할수있다. 리간드와의상호작용시수용체를통한시그날전달은수용체리간드상호작용의친화성에의존할수있다. 유사하게, 표면수용체에대한 mab의친화성은세포내시그날전달의성질을결정할수있고 mab는효능제또는길 - 39 -
항제시그날을전달할수있는것으로생각할수있다. mab 매개시그날전달의친화성기반성질은이의부작 용프로필에영향을줄수있다. 따라서, 치료학적모노클로날항체의목적하는친화성및목적하는기능은시 험관내및생체내실험에의해결정될필요가있다. [0155] 결합단백질 ( 예를들어, 항체 ) 의목적하는 Kd 는목적하는치료학적결과에따라실험적으로결정될수있다. 하 나의양태에서, 동일한항원에대한 DVD-Ig 의목적하는친화성이상의특정항원에대한친화성 (K d ) 을갖는모 항체가선택된다. 항원결합친화성및동력학은바이어코어 (Biacore) 또는또다른유사기술에의해평가된다. 하나의양태에서, 각각의모항체는최대약 10-7 M; 최대약 10-8 M; 최대약 10-9 M; 최대약 10-10 M; 최대약 10-11 M; 최대약 10-12 M; 및최대약 10-13 M로이루어진그룹으로부터선택된항원에대한해리상수 (K d ) 를갖는다. VD1이수득된제1 모항체및 VD2가수득된제2 모항체는각각의항원에대해유사하거나상이한친화성 (K D ) 을가질수있다. 각각의모항체는표면플라스몬공명에의해측정된바와같이적어도약 10 2 M -1 s -1 ; 적어도약 10 3 M -1 s -1 ; 적어도약 10 4 M -1 s -1 ; 적어도약 10 5 M -1 s -1 ; 및적어도약 10 6 M -1 s -1 로이루어진그룹으로부터선택된항원에대한결합율상수 (Kon) 를갖는다. VD1이수득된제1 모항체및 VD2가수득되제2 모항체는각각의항원에대해유사하거나상이한결합율상수 (Kon) 를가질수있다. 하나의양태에서, 각각의모항체는표면플라스몬공명에의해측정된바와같이최대약 10-3 s -1 ; 최대약 10-4 s -1 ; 최대약 10-5 s -1 ; 및최대약 10-6 s -1 으로이루어진그룹으로부터선택된항원에대한해리율상수 (Koff) 를갖는다. VD1이수득된제1 모항체및 VD2가수득된제2 모항체는각각의항원에대해유사하거나상이한해리율상수 (Koff) 를가질수있다. [0156] [0157] [0158] [0159] [0160] [0161] B2. 효능모모노클로날항체의목적하는친화성 / 효능은목적하는치료학적결과에의존할것이다. 예를들어, 수용체-리간드 (R-L) 상호작용에대해친화성 (kd) 은 R-L kd (pm 범위 ) 이상이다. 예를들어, 병리학적순환단백질의단순한제거를위해, kd는예를들어, 다양한종의순환 A-β 펩타이드의제거를위해낮은 nm 범위일수있다. 추가로, kd는또한표적이예를들어, Aβ 올리고머에서 mab 표적화특정형태의에피토프인다중카피의동일한에피토프를발현하는지에따라다양할것이다. VD1 및 VD2가동일한항원에결합하지만구분되는에피토프를갖는경우, DVD-Ig는동일한항원에대해 4개의결합부위를함유함에따라서결합가 (avidity) 및 DVD-Ig의겉보기 Kd를증가시킨다. 하나의양태에서, DVD- Ig에서목적하는것이하의 Kd를갖는모항체가선택된다. 모 mab의친화성고려는또한 DVD-Ig가 4개이상의동일한항원결합부위 ( 즉, 단일 mab로부터 DVD-Ig) 를함유하는지에의존할수있다. 이경우에, 겉보기 Kd는결합가로인해 mab 보다클것이다. 이러한 DVD-Ig는표면수용체를가교결합시키거나, 중화효능을증가시키거나병리학적단백질의제거를증진시키는것등을위해사용될수있다. 하나의양태에서동일한항원에대해 DVD-Ig의목적하는중화효능이상의특이적항원에대한중화효능을갖는모항체가선택된다. 중화효능은표적의존적생분석에의해측정될수있고, 이때적당한유형의세포는측정가능한시그날 ( 즉, 증식또는사이토킨생산 ) 을표적자극에응답하여생성하고 mab에의한표적중화는용량-의존적방식으로시그날을감소시킬수있다. B3. 생물학적기능모노클로날항체는잠재적으로여러기능을수행할수있다. 이들기능중몇몇은표 1에기재한다. 이들기능은시험관내분석 ( 예를들어, 세포기반및생화학적분석 ) 및생체내동물모델둘다에의해평가될수있다. - 40 -
표 1 [0162] [0163] [0164] [0165] [0166] [0167] [0168] [0169] 본원의실시예에기재된구분되는기능을갖는 MAb( 표 1) 는목적하는치료학적결과를달성하기위해선택될수있다. 2개이상의선택된모노클로날항체를이어서 DVD-Ig 포맷에사용하여단일 DVD-Ig 분자에 2개의구분된기능을달성할수있다. 예를들어, DVD-Ig는특이적사이토킨의기능을중화시키는모 mab를선별하고, 병리학적단백질의제거를증진시키는모 mab를선별함에의해제조될수있다. 유사하게본발명자는하나의수용체에대해효능제기능을갖는하나의 mab 및다른수용체에대해길항제효능을갖는다른 mab와같은, 2개의상이한세포표면수용체를인지하는 2개의모모노클로날항체를선별할수있다. 각각구분된기능을갖는이들 2개의선택된모노클로날항체를사용하여단일분자에서선택된모노클로날항체의 2개의구분된기능 ( 효능제및길항제 ) 을갖는단일 DVD-Ig 분자를작제할수있다. 유사하게, 각각의수용체리간드 ( 예를들어, EGF 및 IGF) 의결합을각각차단하는세포표면수용체에대한 2개의길항작용모노클로날항체는 DVD-Ig 포맷에사용될수있다. 역으로, 길항작용항-수용체 mab( 예를들어, 항-EGFR) 및중화성항-가용성매개체 ( 예를들어, 항- IGFl/2) mab는 DVD-Ig를제조하기위해선별될수있다. B4. 에피토프인지 : 상이한영역의단백질은상이한기능을수행할수있다. 예를들어, 사이토킨의특정영역이사이토킨수용체와상호작용하여수용체활성화를유도할수있는반면에당해단백질의다른영역은사이토킨을안정화시키기위해요구될수있다. 이경우에사이토킨상에수용체상호작용영역에특이적으로결합하여사이토킨-수용체상호작용을차단하는 mab를선별할수있다. 몇몇경우에, 예를들어다중리간드에결합하는특정케목킨수용체, 단지하나의리간드와상호작용하는에피토프 ( 케목킨수용체상의영역 ) 에결합하는 mab를선별할수있다. 다른경우에, 모노클로날항체는직접적으로생리학적기능의단백질에대해관여하지않는표적상의에피토프에결합할수있지만이들영역으로의 mab의결합은생리학적기능을방해하거나 ( 입체장애 ) 단백질이기능하지않도록 ( 어느리간드도결합할수없도록수용체형태를변화시킨다중리간드를갖는수용체에대한 mab) 단백질의형태를변화시킬수있다. 사이토킨의이의수용체로의결합을차단하지않지만시그날전달은차단하는항-사이토킨모노클로날항체가또한동정되었다 ( 예를들어, 125-2H, 항-IL-18 mab). 에피토프및 mab 기능의예는수용체-리간드 (R-L) 상호작용의차단 (R-상호작용부위에결합하는중화성 mab); 감소된 R-결합또는 R-결합부재를유발하는입체장애를포함하지만이에제한되지않는다. Ab는수용체결합부위와는다른부위에서표적에결합할수있지만형태적변화를유도함에의해수용체결합및표적의기능을방해하고 R에결합하는기능 ( 예를들어, Xolair) 을제거하여시그날전달을차단한다 (125-2H). 하나의양태에서, 모 Ab는최대효능을위해적당한에피토프를표적화할필요가있다. 당해에피토프는 DVD-Ig 에서보존되어야만한다. mab의결합에피토프는공동-결정분석, mab 항원복합체의제한된단백질용해 + 질량분광측정펩타이드맵핑 (Legros V. et al 2000 Protein Sci. 9:1002-10), 파아지디스플레이된펩타이드라이브러리 (O'Connor KH et al 2005 J Immunol Methods. 299:21-35), 및돌연변이유발 (Wu C. et al. 2003 J Immunol 170:5571-7) 를포함하는, 여러방법에의해측정될수있다. B5. 생리화학적및약제학적성질 : 항체를사용한치료학적치료는흔히수 mg/kg의고용량의투여를필요로한다 ( 전형적으로분자량이높은결과로서질량을기초로낮은효능때문에 ). 환자순응을수용하고만성질환치료법및외래환자치료를적당히해결 - 41 -
하기위해, 치료학적 mab를피하 (s.c.) 또는근육내 (i.m.) 투여하는것이바람직할수있다. 예를들어, 피하투여를위한최대바람직한용량은약 1.0 ml이고따라서용량당주사횟수를제한하기위해 >100 mg/ml의농도가바람직할수있다. 하나의양태에서, 치료학적항체는 1회용량으로투여된다. 그러나당해제형의개발은단백질-단백질상호작용 ( 예를들어, 면역원성위험을잠재적으로증가시키는응집 ) 및프로세싱및전달동안에한계 ( 예를들어, 점도 ) 에의해제한된다. 결과적으로, 임상적효능을위해요구되는대용량및관련된개발한계점이항체제형의잠재력및고용량치료계획에서의피하투여를완전하게사용하는것을제한한다. 단백질분자및단백질용액의생리화학적및약제학적성질, 예를들어, 안정성, 용해도및점도특징이가장중요하다는것은명백하다. [0170] [0171] [0172] [0173] [0174] [0175] [0176] [0177] B5.1. 안정성 : " 안정한 " 항체제형은본원의항체가필수적으로이의물리적안정성및 / 또는화학적안정성및 / 또는저장시생물학적활성을보유하는제형이다. 안정성은선택된시간동안선택된온도에서측정될수있다. 하나의양태에서, 제형중의항체는실온 ( 약 30 ) 또는 40 에서 1개월이상동안안정하고 / 하거나약 2 내지 8 에서 1년이상또는 2년이상동안안정하다. 추가로하나의양태에서, 당해제형은이후 " 동결 / 해동사이클 " 로서언급되는제형의동결 ( 예를들어 -70 까지 ) 및해동후안정하다. 또다른예에서, " 안정한 " 제형은약 10% 미만및약 5% 미만의단백질이제형내에응집체로서존재하는제형일수있다. 연장된시간동안다양한온도에서시험관내안정한 DVD-Ig는바람직할수있다. 이것은승온, 예를들어, 40 에서 2 내지 4주동안시험관내안정한모 mab의신속한스크리닝에의해달성될수있고이어서안정성을평가할수있다. 2 내지 8 에서저장동안에, 당해단백질은 12개월이상동안, 예를들어 24개월이상동안안정함을나타낸다. 안정성 ( 단량체성온전한분자의 %) 은양이온교환크로마토그래피, 크기배제크로마토그래피, SDS- PAGE, 및생활성시험과같은다양한기술을사용하여평가될수있다. 공유및형태적변형을분석하기위해사용될수있는분석기술의보다이해할수있는목록은문헌 [ 참조 : Jones, A. J. S. (1993) Analytical methods for the assessment of protein formulations and delivery systems. In: Cleland, J. L.; Langer, R., editors. Formulation and delivery of peptides and proteins, 1st edition, Washington, ACS, pg. 22-45; and Pearlman, R.; Nguyen, T. FL(1990) Analysis of protein drugs. In: Lee, V. H., editor. Peptide and protein drug delivery, 1st edition, New York, Marcel Dekker, Inc., pg. 247-301] 을참조한다. 이종성및응집체형성 : 항체의안정성은제형이약 10% 미만, 및하나의양태에서약 5% 미만, 또다른양태에서약 2% 미만또는하나의양태에서응집체로서존재하는 GMP 항체물질중 0.5% 내지 1.5% 미만의범위내일수있도록한다. 크기배제크로마토그래피는단백질응집체의검출에서민감성이고재생가능하고매우강력한방법이다. 낮은응집체수준뿐만아니라, 항체는하나의양태에서화학적으로안정해야만한다. 화학적안정성은이온교환크로마토그래피 ( 예를들어, 양이온또는음이온교환크로마토그래피 ), 소수성상호작용크로마토그래피, 또는등전점포커싱또는모세관전기영동과같은다른방법에의해측정될수있다. 예를들어, 항체의화학적안정성은 2 내지 8 에서 12개월이상동안저장후양이온교환크로마토그래피에서비변형된항체를나타내는피크를저장시험전의항체와비교하여 20% 이하, 하나의양태에서 10% 이하또는또다른양태에서, 5% 이하로증가시킬수있다. 하나의양태에서, 모항체는구조적위상을나타낸다 ; 올바른디설파이드결합형성및올바른폴딩 : 항체의 2 차또는 3차구조에서의변화로인한화학적불안정성은항체활성에영향을줄수있다. 예를들어, 항체의활성에의해저적된바와같은안정성은 2 내지 8 에서 12개월이상의저장후항체의활성을저장시험전의항체용액과비교하여 50% 이하, 하나의양태에서 30% 이하또는 10% 이하또는하나의양태에서 5% 또는 1% 이하로감소시킬수있다. 적합한항원결합분석을사용하여항체활성을측정할수있다. B5.2. 용해도 : mab의 " 용해도 " 는올바르게폴딩된단량체성 IgG의생성과관련이있다. IgG의용해도는따라서 HPLC에의해평가될수있다. 예를들어, 가용성 ( 단량체성 ) IgG는 HPLC 크로마토그램에단일피크를생성시키는반면불용성 ( 예를들어, 다량체및응집된 ) 은다수의피크를생성시킨다. 당업자는따라서통상적인 HPLC 기술을사용하여 IgG의용해도를증가시키거나감소시킬수있다. 용해도를분석하기위해사용될수있는분석기술의보다이해될수있는목록을위해문헌 ( 참조 : Jones, A. G. Dep. Chem. Biochem. Eng., Univ. Coll. London, London, UK. Editor(s): Shamlou, P. Ayazi. Process. Solid-Liq. Suspensions (1993), 93-117. Publisher: - 42 -
Butterworth-Heinemann, Oxford, UK and Pearlman, Rodney; Nguyen, Tue H, Advances in Parenteral Sciences (1990), 4 (Pept. Protein Drug Delivery), 247-301) 을참조한다. 치료학적 mab의용해도는흔히적당한용량을위해요구되는고농도로제형화시키는데있어서중요하다. 본원에명시된바와같이, > 100 mg/ml의용해도가효율적인항체용량을수용하기위해요구될수있다. 예를들어, 항체용해도는조기연구단계에서약 5mg/ml 이상일수있고하나의양태에서, 진보과정과학단계에서약 25 mg/ml 이상또는하나의양태에서약 100 mg/ml 이상, 또는하나의양태에서약 150mg/ml일수있다. 단백질분자의고유성질, 예를들어, 단백질용액의물리-화학적성질, 예를들어, 안정성, 용해도, 점도가중요함은당업자에게자명하다. 그러나당업자는광범위한부형제가최종단백질제형의특성에이롭게영향을주는첨가제로서사용될수있음을인지할것이다. 이들부형제는다음을포함할수있다 : (i) 액체용매, 공용매 ( 예를들어, 알콜, 예를들어, 에탄올 ); (ii) 완충제 ( 예를들어, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 아미노산완충제 ); (iii) 당또는당알콜 ( 예를들어, 슈크로스, 트레할로스, 프럭토스, 라피노스, 만니톨, 소르비톨, 덱스트란 ); (iv) 계면활성제 ( 예를들어, 폴리소르베이트 20, 40, 60, 80, 폴록사머 ); (v) 등장성개질제 ( 예를들어, 염, 예를들어, NaCl, 당, 당알콜 ); 및 (vi) 기타 ( 예를들어, 방부제, 킬레이팅제, 항산화제, 킬레이팅물질 ( 예를들어, EDTA), 생분해성중합체, 담체분자 ( 예를들어, HSA, PEG). [0178] [0179] [0180] [0181] [0182] [0183] 점도는항체제조및항체프로세싱 ( 예를들어, 정용여과 / 한외여과 ), 충전-마무리공정 ( 펌핑측면, 여과측면 ) 및전달측면 ( 주사능, 정교한장치전달 ) 과관련하여매우중요한파라미터이다. 낮은점도는항체용액이보다높은농도가되도록할수있다. 이것은동일용량이보다적은용적으로투여될수있게해준다. 적은주사용액은주사시통증을보다낮게한다는잇점을갖게하고당해용액은환자내주사시통증을감소시키기위해등장성일필요는없다. 항체용액의점도는 100(1/s) 의전단비율에서항체용액점도는 200mPa s미만이거나하나의양태에서 125mPa s미만이거나또다른양태에서 70mPa s미만이거나또다른양태에서 25mPa s미만이거나심지어 10mPa s미만일수있다. B 5.3. 생성효율차이니즈햄스터난소세포 (CHO) 와같은포유동물세포에서효율적으로발현되는 DVD-Ig의생성은하나의양태에서, 이들자체가포유동물세포에서효율적으로발현되는 2개의모모노클로날항체를요구한다. 안정한세포주 ( 즉, CHO) 로부터생성효율은약 0.5g/L 이상, 하나의양태에서약 1 g/l 이상, 및또다른양태에서약 2 내지 5 g/l 이상이어야만한다 (Kipriyanov SM, Little M. 1999 MoI Biotechnol. 12:173-201; Carroll S, Al- Rubeai M. 2004 Expert Opin Biol Ther. 4:1821-9). 포유동물세포에서항체및 Ig 융합단백질의제조는여러인자에의해영향받는다. 강한프로모터, 인핸서및선별마커의혼입을통한발현벡터는통합된벡터카피로부터목적하는유전자의전사를최대화시킬수있다. 고수준의유전자전사를허용하는벡터통합부위의동정은벡터기원의단백질발현을증강시킬수있다 (Wurm et al, 2004, Nature Biotechnology, 2004, Vol/Iss/Pg. 22/11 (1393-1398)). 추가로, 생성수준은항체중쇄및경쇄의비율및단백질어셈블리및분비공정에서다양한단계에의해영향받는다 (Jiang et al. 2006, Biotechnology Progress, Jan-Feb 2006, vol. 22, no. 1, p. 313-8). B 6. 면역원성치료학적 mab의투여는특정빈도의면역반응 ( 즉, 치료학적 mab에대한내인성항체의형성 ) 을유도할수있다. 면역원성을유도할수있는잠재적인요소는모모노클로날항체의분비동안에분석되어야만하고당해위험을감소시키는단계는 DVD-Ig 작제전에모모노클로날항체를최대화하기위해수행될수있다. 마우스유래된항체는환자에서고도로면역원성인것으로밝혀졌다. 마우스가변및사람불변영역으로이루어진키메라항체의생성은치료학적항체의면역원성을감소시키기위한필연적인다음단계를제공한다 ( 문헌참조 : Morrison and Schlom, 1990). 또한, 치료학적항체에대해문헌 [Riechmann et al., 1988] 에의해기재된바와같이면역원성은쥐 CDR 서열을사람항체골격 ( 재형성 /CDR 접목 / 사람화 ) 으로전달함에의해감소될수있다. 또다른방법은설치류가변경쇄및중쇄도메인으로시작하는 " 재표면화 " 또는 " 베니어링 " 으로언급되고단지표면-접근골격아미노산이사람의것으로변화되고 CDR 및묻혀진아미노산은모설치류항체의것으로유지한다 ( 문헌참조 : Roguska et al., 1996). 또다른유형의사람화에서, 전체 CDR을접목시키는것대신, 하나의기술이항체의이의표적으로의결합에관여하는 CDR 잔기의서브셋으로서정의된단지 " 특이성-결정영역 "(SDR) 을접목시킨다 ( 문헌참조 : Kashmiri et al., 2005). 이것은가용한항체-표적복합체의가용한 3차원구조의분석또는표적과의상호작용하는지를결정하기위한항체 CDR 잔기의돌연변이분석을통해 SDR의동정을가능하게한다. 또한, 완전한사람항체는쥐, 키메라또는사람화된항체와비교하여감소된면역원성을가질수있 - 43 -
다. [0184] [0185] [0186] [0187] [0188] [0189] [0190] 치료학적항체의면역원성을감소시키기위한또다른방법은면역원성인것으로예측되는특정특이적서열의제거이다. 하나의방법에서, 제1 세대생물작용은사람에서시험되었고수용가능하지않게면역원성인것으로밝혀진후, B-세포에피토프는맵핑되고면역검출을피하기위해변화될수있다. 또다른방법은잠재적인 T 세포에피토프를예측하고제거하는방법을사용한다. 컴퓨터방법은 MHC 단백질과결합하는잠재력을갖는생물학적치료제의펩타이드서열을스캐닝하고동정하기위해개발되었다 (Desmet et al., 2005). 또한사람수지상세포계방법을사용하여잠재적인단백질알레르겐에서 CD4+ T-세포에피토프를동정할수있다 ( 문헌참조 : Stickler et al., 2005; S. L. Morrison and J. Schlom, Important Adv. Oncol. (1990), pp. 3-18; Riechmann, L., Clark, M., Waldmann, H. and Winter, G. "Reshaping human antibodies for therapy " Nature (1988) 332: 323-327; Roguska-M-A, Pedersen-J-T, Henry-A-H, Searle-S-M, Roja-C-M, Avery-B, Hoffee-M, Cook-S, Lambert-J-M, Blattler-W-A, Rees-A-R, Guild-B-C. A comparison of two murine mabs humanized by CDR-grafting and variable domain resurfacing.protein engineering, {Protein-Eng}, 1996, vol. 9, p. 895-904; Kashmiri- Sy ed- V- S, De-Pascalis-Roberto, Gonzales-Noreen-R, Schlom- Jeffrey. SDR grafting? a new approach to antibody humanization. Methods (San Diego Calif), {Methods}, May 2005, vol. 36, no. 1, p. 25-34; Desmet-Johan, Meersseman-Geert, Boutonnet-Nathalie, Pletinckx-Jurgen, De-Clercq- Krista, Debulpaep-Maja, Braeckman-Tessa, Lasters-Ignace. Anchor profiles of HLA-specific peptides: analysis by a novel affinity scoring method and experimental validation. Proteins, 2005, vol. 58, p. 53-69; Stickler-M-M, Estell-D-A, Harding-F-A. CD4+ T-cell epitope determination using unexposed human donor peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunotherapy 2000, vol. 23, p. 654-60.) B 7. 생체내효능목적하는생체내효능을갖는 DVD-Ig 분자를생성하기위해, 배합으로주어지는경우유사하게목적하는생체내효능을갖는 mab를생성하고선별하는것이중요하다. 그러나, 몇몇경우에 DVD-Ig는 2개의별도의 mab를배합하여달성될수없는생체내효능을나타낼수있다. 예를들어, DVD-Ig는 2개의표적을근접하게하여 2개의별도의 mab의배합으로달성될수없는활성을유도할수있다. 추가의바람직할수있는생물학적기능은섹션 B3에본원에기재되어있다. DVD-Ig 분자에바람직할수있는특성을갖는모항체는약제동력학 t 1/2; 조직분포 ; 가용성대세포표면표적및표적농도-가용성 / 밀도-표면과같은인자를기초로선택될수있다. B 8. 생체내조직분포목적하는생체내조직분포를갖는 DVD-Ig 분자를생성하기위해, 하나의양태에서, 유사한목적하는생체내조직분포프로필을갖는모 mab가선택되어야만한다. 또한, 이원특이적표적화전략의기작을기준으로, 다른시점에서배합으로주어지는경우유사하게목적하는생체내조직분포를갖는모 mab를선별하는것이요구되지않을수있다. 예를들어, 하나의결합성분이 DVD-Ig를특이적부위로표적화하여제2 결합성분이동일한표적부위에오도록유도하는 DVD-Ig의경우이다. 예를들어, DVD-Ig의하나의결합특이성은췌장 ( 섬세포 ) 을표적화할수있고다른특이성은 GLP1을췌장으로오게하여인슐린을유도할수있다. B 9. 이소타입 : 이소타입, 이펙터기능및순환반감기를포함하지만이에제한되지않는목적하는성질을갖는 DVD-Ig 분자를생성하기위해, 하나의양태에서, 치료학적용도및목적하는치료학적엔드포인트에따라적당한 Fc 이펙터기능을갖는모 mab를선택한다. 5개의주요중쇄부류또는이소타입이있고이중몇몇은여러서브타입을갖고이들은항체분자의이펙터기능을결정한다. 이들이펙터기능은항체분자의힌지영역, CH2 및 CH3 도메인에있다. 그러나, 항체분자의다른부분에서의잔기는또한이펙터기능에효과를가질수있다. 힌지영역 Fc-이펙터기능은다음을포함한다 : (i) 항체의존성세포독성, (ii) 보체 (C1q) 결합, 활성화및보체의존성세포독성 (CDC), (iii) 항원-항체복합체의식세포작용 / 제거, 및 (iv) 몇몇경우에사이토킨방출. 항체분자의이들 Fc-이펙터기능은 Fc-영역과한세트의부류특이적세포표면수용체의상호작용을통해매개된다. IgG1 이소타입의항체는대부분활성이지만최소또는 IgG2 및 IgG4는최소로또는어떠한이펙터기능을갖지않는다. IgG 항체의이펙터기능은 3개의구조적으로유사한세포 Fc 수용체유형 ( 및서브타입 )(FcgRl, FcgRII 및 FcgRIII) 의상호작용을통해매개된다. IgG1의이들이펙터기능은 FcgR 및 C1q 결합을위해요구되는하부힌지영역 ( 예를들어, L234A, L235A) 에서특이적아미노산잔기를돌연변이시켜제거될수있다. Fc 영역에서아미노산잔기, 특히, CH2-CH3 도메인은또한항체분자의순화반감기를결정한다. 이러한 Fc 기능은산성리소좀으로부터항체분자의일반적순환으로복귀시키는재순환에관여하는신생 Fc 수용체 (FcRn) 으로의 Fc-영역의 - 44 -
결합을통해매개된다. [0191] [0192] [0193] [0194] [0195] [0196] [0197] [0198] [0199] [0200] [0201] [0202] [0203] [0204] [0205] [0206] [0207] mab가활성또는불활성이소타입을가져야만하는지의여부는항체에대해목적하는치료학적엔드포인트에의존한다. 이소타입의용도및목적하는치료학적결과에대한몇몇예는하기에열거한다 : a) 목적하는엔드포인트가가용성사이토킨의기능성중화작용인경우, 불활성이소타입이사용될수있고 ; b) 목적하는결과가병리학적단백질의제거인경우활성이소타입이사용될수있고 ; c) 목적하는결과가단백질응집체의제거인경우활성이소타입이사용될수있고 ; d) 목적하는결과가표면수용체를길항시키는것인경우, 불활성이소타입이사용되고 (Tysabri, IgG4; OKT3, 돌연변이된 IgG1); e) 목적하는결과가표적세포를제거하는것인경우, 활성이소타입이사용되고 (Herceptin, IgG1 ( 및증진된이펙터기능과함께 ); f) 목적하는결과가 CNS에진입하는것없이순환으로부터단백질을제거하는것인경우 IgM 이소타입이사용될수있다 ( 예를들어, 순환하는 Ab 펩타이드종의제거 ). 모 mab의 Fc 이펙터기능은당업계에널리공지된다양한시험관내방법에의해측정될수있다. 논의된바와같이, 이소타입의선별및이에의한이펙터기능은목적하는치료학적엔드포인트에의존한다. 순환표적의단순한중화가요구되는경우, 예를들어, 수용체-리간드상호작용을차단시키는경우, 이펙터기능은요구되지않을수있다. 당해경우에이펙터기능을제거하는항체의 Fc-영역내이소타입또는돌연변이가바람직할수있다. 표적세포의제거가치료학적엔드포인트인다른경우에, 예를들어, 종양세포를제거하는경우, 이펙터기능을증진시키는 Fc 영역에서이소타입또는돌연변이또는탈푸코실화가바람직할수있다 ( 문헌참조 : Presta GL, Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656, 2006; Satoh M., Iida S., Shitara K. Expert Opinion Biol. Ther. 6:1161-1173, 2006). 유사하게, 치료하적용도에의존하여항체분자의순환반감기는 Fc 영역에서특이적돌연변이를도입함에의해항체-FcRn 상호작용을조절함에의해감소되거나 / 지연될수있다 ( 문헌참조 : DaIF Acqua WF, Kiener PA, Wu H. J. Biol. Chem. 281 :23514-23524, 2006; Petkova SB., Akilesh S., Sproule TJ. et al. Internal Immunol. 18:1759-1769, 2006; Vaccaro C, Bawdon R., Wanjie S et al. PNAS 103:18709-18714, 2007). 정상의치료학적 mab의상이한이펙터기능에영향을주는다양한잔기에대한공개된정보는 DVD-Ig에대해확인될필요가있을수있다. DVD-Ig 포맷에서모노클로날항체이펙터의조절을위해동정된것들이외에추가의 ( 상이한 ) Fc-영역잔기가중요할수있다. 전반적으로, Fc-이펙터기능 ( 이소타입 ) 이최종 DVD-Ig 포맷에서중요한지에관한결정은질환증상, 치료학적표적, 목적하는치료학적엔드포인트및안정성고려에따라다양할것이다. o IgG1 - 알로타입 : Glmz o IgG1 돌연변이 - A234, A235 o IgG2 - 알로타입 : G2m(n-) o 카파 - Km3 o Lambda를포함하지만이에제한되지않은적당한중쇄및경쇄불변영역이예시된다. Fc 수용체및 C1q 연구 : 세포막상에임의의과발현된표적과복합체를형성하는항체에의한원치않는항체의존적매개된세포독성 (ADCC) 및보체의존성세포독성 (CDC) 의가능성은 ( 예를들어, L234A, L235A) 힌지영역돌연변이에의해제거될수있다. mab의 IgG1 힌지영역에존재하는이들치환된아미노산은 FcgR 결합이 IgG1 힌지영역상의중첩부위내에존재하는것으로사료됨에따라 mab의사람 Fc 수용체 (FcRn이아니라 ) 의결합을감소시킬것으로예상된다. 이러한 mab의특징은야생형 IgG를포함하는항체에대해개선된안전성프로필을유도할수있다. 사람 Fc 수용체로의 mab의결합은 FcgRIIb ( 또는기타 FcgRs) 를발현하는세포주 ( 예를들어, THP-l, K562) 및조작된 CHO 세포주를사용하는유동세포측정실험에의해결정될수있다. IgG1 대조군모노클로날항체와비교하는 mab는 FcgRI 및 FcgRIIa로의감소된결합을보여주는반면 FcgRIIb로의결합은영향받지않는다. 항원 /IgG 면역복합체에의한 C1q의결합및활성화는결과적으로발생하는염증및 / 또는면역조절반응과함께전형적인보체캐스케이드를유발한다. IgG상의 C1q 결합부위는 IgG 힌지영역에위치하는것으로 - 45 -
밝혀졌다. 증가하는농도의 mab에결합하는 C1q는 C1q ELISA에의해평가되었다. 당해결과는야생형대조군 IgG1의결합과비교하는경우예상되는바와같이 mab가 C1q에결합할수없음을입증한다. 전반적으로, L234A, L235A 힌지영역돌연변이는 mab의 FcgRI, FcgRIIa 및 C1q로의결합을제거시키지만 mab와 FcgRIIb의상호작용에는영향을주지않는다. 이러한데이터는돌연변이 Fc를갖는생체내 mab가정상적으로억제 FcgRIIb와상호작용하지만활성화 FcgRI 및 FcgRIIa 수용체또는 C1q와는상호작용하지않을가능성이있음을시사한다. [0208] [0209] [0210] [0211] [0212] [0213] 사람 FcRn 결합 : 신생아수용체 (FcRn) 는태반을거치는 IgG의수송에관여하고 IgG 분자의이화작용반감기를조절한다. 효능을개선시키거나, 용량또는투여횟수를감소시키거나표적물로의국소화를개선시키기위해항체의최종반감기를증가시키는것이바람직할수있다. 또한, 역으로즉, 항체의최종반감기를감소시켜전신노출을감소시키거나표적대비표적결합비율을개선시키는것이유리할수있다. IgG와이의구제수용체 FcRn간의상호작용을조작하는것이 IgG의최종반감기를증가시키거나감소시키는방법을제공한다. 순환내 IgG를포함하는단백질은혈관내피세포와같은특정세포에의한미세음세포작용을통해유체상에흡수된다. IgG는약산성조건 (ph 6.0-6.5) 하에엔도좀내 FcRn과결합할수있고세포표면으로재순환될수있으며, 이것은거의중성조건 (ph 7.0-7.4) 하에방출된다. FcRn80, 16, 17상의 Fc-영역결합부위의맵핑은종 His310 및 His435에걸쳐보존된 2개의히스티딘잔기가당해상호작용의 ph 의존성에관여함을보여주었다. 파아지-디스플레이기술을사용하여, FcRn으로의결합을증가시키고마우스 IgG의반감기를연장시키는마우스 Fc-영역돌연변이가동정되었다 ( 문헌참조 : Victor, G. et al.; Nature Biotechnology (1997), 15(7), 637-640). ph 6.0에서 FcRn에대한사람 IgG의결합친화성을증가시키지만 ph 7.4에서는증가시키지않는 Fc-영역돌연변이가또한동정되었다 ( 문헌참조 : DallAcqua William F, et al., Journal of Immunology (2002), 169(9), 5171-80). 더욱이, 한경우에, 결합에서유사한 ph 의존성증가 (27배이하 ) 는또한레서스 FcRn에대해관찰되었고, 이것은모 IgG와비교하여레서스몽키에서혈청반감기를 2배증가시켰다 ( 문헌참조 : Hinton, Paul R. et al., Journal of Biological Chemistry (2004), 279(8), 6213-6216). 이들발견은 Fc 영역과 FcRn의상호작용을조작함에의해항체치료제의혈장반감기를연장시킬수있음을지적한다. 역으로, FcRn과의상호작용을감쇠시키는 Fc-영역돌연변이는항체반감기를감소시킬수있다. B.10 약동력학 (PK): 목적하는약동력학프로필을갖는 DVD-Ig 분자를생성하기위해, 하나의양태에서, 유사하게목적하는약동력학프로필을갖는모 mab가선택된다. 하나의고려는모노클로날항체에대한면역원성반응 ( 즉, HAHA, 사람항-사람항체반응 ; HACA, 사람항-키메라항체반응 ) 은추가로이들치료학적제제의약동력학을복잡하게한다는것이다. 하나의양태에서, 최소의면역원성을갖거나어떠한면역원성을갖지않는모노클로날항체는수득한 DVD-Ig가또한최소의면역원성을갖거나어떠한면역원성을갖지않도록 DVD-Ig 분자를작제하기위해사용된다. mab의 PK를결정하는인자몇몇은 mab의고유성질 (VH 아미노산서열 ); 면역원성 ; FcRn 결합및 Fc 기능을포함하지만이에제한되지않는다. 선택된모모노클로날항체의 PK 프로필은설치류에서 PK 프로필이시노몰거스몽키및사람에서모노클로날항체의 PK 프로필과양호하게관련됨 ( 또는근접하게 ) 으로써설치류에서용이하게결정될수있다. PK 프로필은실시예섹션 1.2.2.3.A에서기재된바와같이결정된다. 목적하는 PK 특성 ( 및본원에서논의된바와같은기타목적하는기능성성질 ) 을갖는모모노클로날항체가선택된후, DVD-Ig가작제된다. DVD-Ig 분자가 2개의모모노클로날항체기원의 2개의항원결합도메인을함유함으로 DVD-Ig의 PK 성질이또한평가된다. 따라서, DVD-Ig의 PK 성질을결정하면서, 2개의모모노클로날항체기원의항원결합도메인둘다의기능성을기준으로 PK 프로필을결정하는 PK 분석이사용될수있다. DVD- Ig의 PK 프로필은실시예 1.2.2.3.A에기재된바와같이결정될수있다. DVD-Ig의프로필에영향을줄수있는추가의인자는항원-결합도메인 (CDR) 배향 ; 링커크기 ; 및 Fc/FcRn 상호작용을포함한다. 모상체의 PK 특성분석은하기의파라미터를평가함에의해평가될수있다 : 흡수, 분배, 대사및분비. 흡수 : 지금까지, 치료학적모노클로날항체의투여는비경구경로 ( 예를들어, 정맥내 [IV], 피하 [SC], 또는근육내 [IM]) 를통해서이다. 간질공간으로부터 SC 또는 IM 투여후전신순환으로의 mab의흡수는주로림프경로를통해서이다. 포화될수있는, 예비전신성단백질용해분해는혈관외투여후다양한절대적생체이용률을유도할수있다. 일반적으로, 모노클로날항체의용량증가와함께절대적생체이용률의증가는보다높은용량에서포화된단백질용해능력으로인해관찰될수있다. mab에대한흡수과정은통상적으로림프액이서시히혈관계로누출됨에따라서매우느리고흡수의지속시간은수시간내지수일간에걸쳐일어날수있다. SC 투여후모노클로날항체의절대적생체이용률은 50% 내지 100% 이다. DVD-Ig 작제물에의해표적화된혈뇌장벽에서수 - 46 -
송 - 매개구조의경우에, 혈장에서순환시간은혈뇌장벽 (BBB) 에서 CNS 격막으로의증진된세포통과수송으로 인해감소될수있고, 여기서, DVD-Ig 는이의제 2 항원인지부위를통해상호작용할수있도록방출된다. [0214] [0215] [0216] [0217] [0218] [0219] [0220] [0221] [0222] [0223] 분배 : IV 투여후, 모노클로날항체는신속한분배상에이어서느린제거상으로시작하여통상적으로 2상혈청 ( 또는혈장 ) 농도-시간프로필에따른다. 일반적으로, 이중지수적약동력학모델은당해종류의약리동력학적프로필을최상으로기재한다. mab에대한중추격막 (Vc) 내분배용적은통상적으로혈장용적 (2 내지 3 리터 ) 과동일하거나약간크다. 시간프로필에대한혈청 ( 혈장 ) 농도에서구분되는 2상패턴은투여의또다른비경구경로 ( 예를들어, IM 또는 SC) 와함께명백하지않을수있는데그이유는혈청 ( 혈장 ) 농도-시간곡선의분배상이긴흡수부에의해차폐되기때문이다. 물리화학적성질, 부위특이적및표적배향된수용체매개된흡수, 조직의결합능력및 mab 용량을포함하는많은인자는 mab의생분배에영향을줄수있다. 이들요소중일부는 mab에대한생분배에비선형성으로기여할수있다. 대사및분비 : 분자크기로인해, 온전한모노클로날항체는신장을통해뇨로분비되지않는다. 이들은주로대사 ( 예를들어, 이화작용 ) 에의해불활성화된다. IgG-기본치료학적모노클로날항체에대해반감기는전형적으로수시간내지 1 내지 2일에서 20일이상의범위이다. mab의제거는 FcRn 수용체에대한친화성, mab의면역원성, mab의당화정도, 단백질용해에대한 mab의민감성및수용체매개제거를포함하지만이에제한되지않는많은인자에의해영향받을수있다. B.11 사람및 tox 종상의조직교차-반응성패턴 : 동일한염색패턴은잠재적인사람독성이 tox 종에서평가될수있음을시사한다. Tox 종은관련되지않은독성이연구되는동물들이다. 개별항체는 2개의기준을충족하도록선택된다. (1) 항체표적의공지된발현을위해적당한조직염색. (2) 동일한기관으로부터기원하는사람과 tox 조직간의유사한염색패턴. 기준 1 : 면역화및 / 또는항체선별은전형적으로재조합또는합성된항원 ( 단백질, 탄수화물또는기타분자 ) 을사용한다. 관련되지않은항원에대한천연대응물과역스크린에결합하는것은흔히치료학적항체를위한스크리닝퍼넬 (funnel) 이다. 그러나, 다수의항원에대한스크리닝은흔히비현실적이다. 따라서, 모든주요기관기원의사람조직을갖는조직교차-반응성연구는임의의관련되지않은항원으로의항체의원치않는결합을배제하는작용을한다. 기준 2: 사람과 tox 종조직 ( 시노몰거스몽키, 개, 능히설치류및기타, 동일한 36개또는 37개조직이사람연구에서와같이시험된다 ) 은 tox 종의선별을입증하는것을도와준다. 동결된조직절편상의전형적인조직교차반응성연구에서치료학적항체는공지된항원으로의예상된결합및. 또는보다적은정도로낮은수준의상호작용 ( 비특이적결합, 유사한항원으로의낮은수준의결합, 낮은수준의전하에기초한상호작용등 ) 을기초로하는조직으로의결합을입증할수있다. 임의의경우, 대부분의관련독성학동물종은사람및동물조직에동시에고도로결합하는종이다. 조직교차반응성연구는다음지침서 [EC CPMP Guideline 111/5271/94 "Production and quality control of mabs" and the 1997 US FDA/CBER "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use"] 를포함하는적당한조절지침에따른다. 부검또는생검에서수득된사람조직의동결절편 (5 μm) 을고정시키고대물유리상에서건조시킨다. 조직절편의퍼옥시다제염색은아비딘-비오틴시스템을사용하여수행하였다. FDA's 지침 "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use". 관련참조자료는문헌 [Clarke J 2004, Boon L. 2002a, Boon L 2002b, Ryan A 1999] 을포함한다. 조직교차반응성연구는흔히 2개의단계로수행되고제1 단계는사람공여자기원의 32개조직 ( 전형적으로 : 부신, 위장관, 전립선, 방광, 심장, 골격근, 혈액세포, 신장, 피부, 골수, 간, 척수, 유방, 페, 비장, 소뇌, 림프절, 고환, 대뇌피질, 난소, 흉선, 결장, 췌장, 전립선, 갑상선, 내피, 부갑상선, 수뇨관, 눈, 뇌하수체, 자궁, 나팔관및태반 ) 의동결절편을포함한다. 제2 단계에서, 완전한교차반응성연구는 3명의관련되지않은성인기원의 38개이하의조직 ( 부신, 혈액, 혈관, 골수, 소뇌, 대뇌, 자궁경관, 식도, 눈, 심장, 신장, 대장, 간, 폐, 림프절, 유방유선, 난소, 난관, 췌장, 부갑상선, 말초신경, 뇌하수체, 태반, 전립선, 침선, 피부, 소장, 척수, 비장, 위, 횡문근, 고환, 흉선, 갑상선, 편도선, 수뇨관, 뇨방광및자궁 ) 을사용하여수행된다. 연구는전형적으로최소로 2개의용량수준에서수행된다. 치료학적항체 ( 즉, 시험제품 ) 및이소형매치된대조군항체는아비딘-비오틴복합체 (ABC) 검출을위해비오티 - 47 -
닐화될수있다. 기타검출방법은 FITC( 또는그밖에 ) 표지된시험제품에대한 3 차항체검출또는비표지된 시험제품에대한표지된항 - 사람 IgG 와의예비복합체형성을포함할수있다. [0224] [0225] [0226] [0227] [0228] [0229] [0230] [0231] [0232] [0233] [0234] 간략하게, 부검또는생검에서수득된사람조직의동결절편 ( 약 5 μm) 을고정화하고대물글래스상에서건조시킨다. 조직절편의퍼옥시다제염색은아비딘-비오틴시스템을사용하여수행한다. 먼저 ( 예비복합체형성검출시스템의경우 ), 시험제품은 2차비오티닐화된항-사람 IgG로항온처리하고면역복합체가되도록한다. 시험제품 2 및 10 μg/ml의최종농도에서면역복합체는대물글래스상의조직절편상으로첨가하고조직절편은아비딘-비오틴-퍼옥시다제키트와 30분동안반응시켰다. 이어서 DAB (3,3'-디아미노벤지딘), 퍼옥시다제반응을위한기질을조직염색을위해 4분동안적용한다. 항원-세파로스비드는양성대조군조직절편으로서사용한다. 임의의특이적염색은미지의표적항원의공지된발현을토대로예상되거나 ( 예를들어, 항원발현과일치하여 ) 예상치않은반응성인것으로판단된다. 특이적인것으로판단된임의의염색은강도및분포에대해스코어된다. 항원또는혈청경쟁또는차단연구는관찰된염색이특이적또는비특이적인지를결정하는데도움을줄수있다. 2개의선택된항체가선택기준 ( 적당한조직염색, 사람과독성동물조직특이적간에염색의일치 ) 을충족하는것으로밝혀진경우, 이들은 DVD-Ig 생성을위해선택될수있다. 조직교차반응성연구는최종 DVD-Ig 작제물을사용하여반복되어야만하지만이들연구는본원에명시된바와동일한프로토콜을따르고이들은평가를위해보다복잡한데그이유는임의의결합이 2개의모항체중어느하나에기인할수있고임의의설명되지않은결합이복합체항원경쟁연구를사용하여확인될필요가있다. DVD-Ig와같은다특이적분자를사용한복잡한조직교차반응성연구의착수는 2개의모항체가 (1) 예상되지않은조직교차반응성발견의부재및 (2) 상응하는사람과독성동물종조직간의조직교차반응성의적당한유사성에대해선별되는경우크게단순화된다는것은명백하다. B.12 특이성및선택성 : 목적하는특이성및선택성을갖는 DVD-Ig 분자를제조하기위해, 목적하는특이성및선택성프로필이유사한모 mab를제조하고선택할필요가있다. DVD-Ig을사용하는특이성및선택성에대한결합연구는 4개이상의결합부위 (2개각각은 2개항원에대한것이다 ) 로인해복잡할수있다. 간략하게, DVD-Ig와함께 ELISA, BIAcore, KinExA 또는기타상호작용연구는 DVD-Ig 분자에대한 1개또는 2개이상의항원결합을모니터할필요가있다. BIAcore 기술은다중항원의연속적독립적결합을해결할수있지만 KinExA와같은 ELISA 또는보다근대의기술을포함하는보다통상적인방법은할수없다. 따라서각각의모항체의주의깊은특징분석은주요하다. 각각의개별항체가특이성에대해특성분석된후, DVD-Ig 분자에서개별결합부위의특이성보유에대한확인은크게단순화된다. DVD-Ig의특이성을결정하는복잡한연구착수는 2개의모항체가 DVD-Ig로배합되기전에특이성에대해선택되는경우크게단순화된다는것은명백하다. 항원-항체상호작용연구는많은전형적인단배질단백질상호작용연구를포함하는임의의형태를취할수있고, 이는 ELISA ( 효소결합된면역흡착분석 ), 질량분광기, 화학적교차결합, 광산란을갖는 SEC, 평형투석, 겔침투, 한외여과, 겔크로마토그래피, 대형-지대분석 SEC, 미세정제용한외원심분리 ( 침강평형 ), 분광방법, 적정마이크로칼로리측정기, 침강평형 ( 분석한외원심분리기 ), 침강속도 ( 분석적원심분리기에서 ), 표면플라스몬공명 (BIAcore를포함 ) 을포함한다. 관련문헌은문헌 ["Current Protocols in Protein Science", John E. Coligan, Ben M. Dunn, David W. Speicher, Paul T, Wingfield (eds.) Volume 3, chapters 19 and 20, published by John Wiley & Sons Inc., and references included therein and "Current Protocols in Immunology", John E. Coligan, Barbara E. Bierer, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (eds.) published by John Wiley & Sons Inc 및본원에포함된관련문헌 ] 을포함한다. 전혈에서사이토킨방출 : 사람혈액세포외 mab의상호작용은사이토킨방출분석에의해조사될수있다 ( 문헌참조 : Wing, M. G. Therapeutic Immunology (1995), 2(4), 183-190; "Current Protocols in Pharmacology", SJ. Enna, Michael Williams, John W. Ferkany, Terry Kenakin, Paul Moser, (eds.) published by John Wiley & Sons Inc; Madhusudan, S. Clinical Cancer Research (2004), 10(19), 6528-6534; Cox, J. Methods (2006), 38(4), 274-282; Choi, I. European Journal of Immunology (2001), 31(1), 94-106)). 간략하게, 다양한농도 - 48 -
의 mab는 24시간동안사람전혈과함께항온처리한다. 시험된농도는환자에서전형적인혈액수준과유사한 (100 ng/ml - 100μg/ml을포함하지만이에제한되지않음 ) 최종농도를포함하는광범위를포괄해야만한다. 항온처리후, 상등액및세포용해물은 IL-1Rα, TNF-α, IL-1b, IL-6 및 IL-8의존재에대해분석하였다. mab 에대해생성된사이토킨농도프로필은음성사람 IgG 대조군과양성 LPS 또는 PHA 대조군에의해생성된프로필과비교하였다. 세포상등액과세포용해물둘다기원의 mab에의해나타낸사이토킨프로필은대조군사람 IgG와비교할수있었다. 하나의양태에서, 모노클로날항체는염증사이토킨을자발적으로방출하기위해사람혈액세포와상호작용하지않는다. [0235] [0236] [0237] [0238] [0239] DVD-Ig에대한사이토킨방출연구는 4개이상의결합부위로인해복잡하고 2개각각은각각의항원에대한것이다. 간략하게, 사이토킨방출연구는본원에기재된바와같이전혈또는기타세포시스템에대해전체 DVD- Ig 분자의효과를측정하는것이지만분자의어느부분이사이토킨방출을유발하는지를해결할수있다. 일단사이토킨방출이검출된경우, 몇몇보조정제세포성분이사이토킨방출자체를유발할수있기때문에 DVD- Ig 제제의순도가확인되어야만한다. 순도가문제가아닌경우, DVD-Ig(Fc 부분의제거, 결합부위의분리등을포함하지만이에제한되지않음 ) 의단편화, 결합부위돌연변이유발또는기타방법은임의의관찰을평활화하는데사용될필요가있을수있다. 이러한복잡한과정은 2개의모항체가 DVD-Ig로배합되기전에사이토킨방출의부재를위해선택되는경우크게단순화된다는것은명백하다 B.13 독성학적연구를위한다른종에대한교차반응성 : 하나의양태에서, 개별항체는적당한 tox 종, 예를들어, 시노몰구스몽키에대해충분한교차-반응성을갖는것으로선택된다. 모항체는유사종표적 ( 즉, 시노몰구스몽키 ) 에결합하고적당한반응 ( 조절, 중화, 활성화 ) 을유발할필요가있다. 하나의양태에서, 유사종표적에대한교차반응성 ( 친화성 / 효능 ) 은사람표적의 10배이내이어야만한다. 실제로, 모항체는마우스, 랫트, 개, 원숭이 ( 및기타사람을제외한영장류 ) 및질환모델종 ( 즉, 천식모델에대한양 ) 을포함하는다양한종양에대해서평가된다. 모모노클로날항체기원의 tox 종에대해허용가능한교차반응성은동일한종에서 DVD-Ig-Ig의향후독성학연구를허용한다. 그이유때문에, 2개의모모노클로날항체는통상의 tox 종에대해허용가능한교차반응성을가져동일한종에서 DVD-Ig의독성학연구를가능하게해야한다. 모 mab는당업계에널리공지되어있는특정표적에결합할수있는다양한모노클로날항체로부터선택될수있다. 이들은항-TNF 항체 ( 미국특허제6,258,562호 ), 항-IL-12 및 / 또는항-IL-12p40 항체 ( 미국특허제 6,914,128호 ); 항-IL-18 항체 (US 2005/0147610 A1), 항-C5, 항-CBL, 항-CD147, 항-gp120, 항-VLA-4, 항- CD11a, 항-CD18, 항-VEGF, 항-CD40L, 항CD-40( 예 : 참조 WO2007124299), 항-Id, 항-ICAM-1, 항-CXCL13, 항-CD2, 항-EGFR, 항-TGF-베타 2, 항-HGF, 항-Met, 항 DLL-4, 항-NPR1, 항-PLGF, 항-ErbB3, 항-E-셀렉틴, 항-Fact VII, 항-Her2/neu, 항-F gp, 항-CD11/18, 항-CD14, 항-ICAM-3, 항-RON, 항 CD-19, 항-CD80( 예를들어, WO2003039486), 항-CD4, 항-CD3, 항-CD23, 항-베타2-인테그린, 항-알파4베타7, 항-CD52, 항-HLA DR, 항- CD22( 예 : 참조 : 미국특허제5,789,544호 ), 항-CD20, 항-MIF, 항-CD64 (FcR), 항-TCR 알파베타, 항-CD2, 항- Hep B, 항-CA 125, 항-EpCAM, 항-gp120, 항-CMV, 항-gpIIbIIIa, 항-IgE, 항-CD25, 항-CD33, 항-HLA, 항- IGF1,2, 항 IGFR, 항-VNR인테그린, 항-IL-1알파, 항-IL-1베타, 항-IL-1 수용체, 항-IL-2 수용체, 항-IL-4, 항- IL-4 수용체, 항-IL5, 항-IL-5 수용체, 항-IL-6, 항-IL-6R, RANKL, NGF, DKK, 알파V베타3, IL-17A, 항-IL-8, 항-IL-9, 항-IL-13, 항-IL-13 수용체, 항-IL-17 및항-IL-23; IL-23p19을포함하지만이에제한되지않는다 ( 문헌참조 : Presta LG. 2005 Selection, design, and engineering of therapeutic antibodies J Allergy Clin Immunol. 116:731-6 및 http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/antibodies.html). 모 mab는또한임상적시험용또는임상사용개발용으로승인된다양한치료학적항체로부터선택될수있다. 당해치료학적항체는리툭시마브 (Rituxan, IDEC/Genentech/Roche) ( 문헌참조 : 예를들어미국특허제 5,736,137호 ), 비호지킨림프종을치료하기위해승인된키메라항-CD20 항체 ; HuMax-CD20, Genmab에의해현재개발된항-CD20, 미국특허제5,500,362호에기재된항-CD20 항체, AME-133 (Applied Molecular Evolution), ha20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel), 및 PRO70769 (PCT/US2003/040426, entitled "Immunoglobulin Variants and Uses Thereof"), 트라스투즈마브 (Herceptin, Genentech) ( 문헌참조 : 예를들어, 미국특허제5,677,171호 ), 유방암을치료하기위해승인된사람화된항-Her2/neu 항체 ; Genentech에현재개발된퍼투주마브 (rhumab-2c4, Omnitarg ); 미국특허제4,753,894호에기재된항 -Her2 항체 ; 세툭시마브 (Erbitux, Imclone) ( 미국특허제4,943,533호 ; PCT WO 96/40210), 다양한암에대해임상시험중의키메라 - 49 -
항-EGFR; Abgenix-Immunex-Amgen에의해현재개발된 ABX-EGF( 미국특허제6,235,883호 ) ; Genmab에의해현재개발된 HuMax- EGFr ( 미국출원번호제10/172,317호 ),; 425, EMD55900, EMD62000, 및 EMD72000 (Merck KGaA) ( 미국특허제5,558,864호 ; Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4):315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7):773-83); ICR62 (Institute of Cancer Research) (PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3):129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer. 1993, 67(2):247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cancer, 73(2):228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cancer, 105(2):273-80); TheraCIM hr3 (YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba (U.S. Pat. No. 5,891,996; U.S. Pat. No. 6,506, 883; Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3(1):71-81); mab-806 (Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. 2003, Proc Natl Acad Sci USA. 100(2):639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1 (IVAX, National Cancer Institute) (PCT WO 0162931A2); 및 SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138); B-세포만성림프구백혈병의치료를위해현재승인된사람화된모노클로날항체인알렘투주마브 (Campath, Millenium); 무로모나브-CD3 (Orthoclone OKT3 ), Ortho Biotech/Johnson & Johnson에의해개발된항-CD3 항체, 이브리투모마브티욱세탄 (Zevalin ), IDEC/Schering AG에의해개발된항-CD20 항체, 겜시투주마브오조가미신 (Mylotarg ), Celltech/Wyeth에의해개발된항-CD33(p67 단백질 ), 알레파셉트 (Amevive ), Biogen에의해개발된항-LFA-3 Fc 융합체, Centocor/Lilly에의해개발된아브식시마브 (ReoPro ), Novartis에의해개발된바실릭시마브 (Simulect ), Medimmune에의해개발된팔리비주마브 (Synagis ), 인 플릭시마브 (Remicade ), Centocor에의해개발된항-TNF알파항체, 아달리무마브 (Humira), Abbott에의해개발된항-TNF알파항체, 후미카데, Celltech에의해개발된항-TNF알파항체, 골리무마브 (CNTO-148), Centocor 에의해개발된완전한사람 TNF 항체, 에타네르셉트 (Enbrel ), an Immunex/Amgen에의해개발된 p 75 TNF 수용체 Fc 융합체, 레너르셉트, Roche에의해이전에개발된 p55tnf 수용체 Fc 융합체, ABX-CBL, Abgenix에의해개발된항-CD147 항체, ABX-IL8, Abgenix에의해개발된항-IL-8 항체, ABX-MA1, Abgenix에의해개발된항- MUC18 항체, 펨투모마브 (R1549, 90Y-muHMFG1), Antisoma에의해개발중인항-MUC1, 테렉스 (R1550), Antisoma 에의해개발된항-MUC1 항체, Antisoma에의해개발된 AngioMab(AS1405), Antisoma에의해개발된 HuBC-1, Antisoma에의해개발된티오플라틴 (AS1407), Antegren ( 나탈리주마브 ), Biogen에의해개발된항-알파-4-베타 -1 (VLA-4) 및알파 -4-베타 -7 항체, VLA-1 mab, Biogen에의해개발된항-VLA-1 인테그린항체, LTBR mab, Biogen에의해개발된항림포톡신베타수용체 (LTBR) 항체, CAT-152, Cambridge Antibody Technology에의해개발된항-TGF-2 항체, ABT 874(J695), Cambridge Antibody Technology 및 Abbott에의해개발된항-IL- 12 항체, CAT-192, Cambridge Antibody Technology 및 Genzyme에의해개발된항-TGF1 항체, CAT-213, Cambridge Antibody Technology에의해개발된항-에오탁신1 항체, LymphoStat-B, Cambridge Antibody Technology 및 Human Genome Sciences Inc. 에의해개발된항- Blys 항체, TRAIL-R1mAb, Cambridge Antibody Technology 및 Human Genome Sciences, Inc. 에의해개발된항-TRAIL-R1 항체, Avastin 베바시주마브, rhumab-vegf, Genentech에의해개발된항-VEGF 항체, Genentech에의해개발된항-HER 수용체계열항체, 항- 조직인자 (ATF), Genentech에의해개발된항-조직인자항체, Xolair( 오말리주마브 ), Genentech에의해개발된항-IgE 항체, Raptiva ( 에팔리주마브 ), Genentech 및 Xoma에의해개발된항-CD11a 항체, Genentech 및 Millenium Pharmaceuticals에의해개발된 MLN-02 항체 ( 이전에는 LDP-02), HuMax CD4, Genmab에의해개발된항-CD4 항체, HuMax-IL15, Genmab 및 Amgen에의해개발된항-IL15 항체, Genmab 및 Medarex에의해개발된 HuMax-Inflam, HuMax-암, Genmab 및 Medarex 및 Oxford GcoSciences에의해개발된항-헤파라나제 I 항체, Genmab 및 Amgen에의해개발된 HuMax-림프종, Genmab에의해개발된 HuMax-TAC, IDEC-131, 및 IDEC Pharmaceuticals에의해개발된항-CD40L 항체, IDEC-151 ( 클레놀릭시마브 ), IDEC Pharmaceuticals에의해개발된항-CD4 항체, IDEC-114, IDEC Pharmaceuticals에의해개발된항-CD80 항체, IDEC-152, IDEC Pharmaceuticals에의해개발된항-CD23, IDEC Pharmaceuticals에의해개발된항-대식세포이동인자 (MIF) 항체, BEC2, Imclone에의해개발된항-이디오타입항체, IMC-1C11, Imclone에의해개발된항-KDR 항체, DC101, Imclone에의해개발된항-flk-1, Imclone에의해개발된항-VE 캐드헤린항체, CEA-Cide ( 라베투주마브 ), Immunomedics에의해개발된항-암배아항원 (CEA) 항체, LymphoCide ( 에프라투주마브 ), Immunomedics에의해개발된항-CD22 항체, Immunomedics에의해개발된 AFP-Cide, Immunomedics에의해개발된골수종 Cide, - 50 -
Immunomedics에의해개발된 LkoCide, Immunomedics에의해개발된 ProstaCide, MDX-010, Medarex에의해개발된항-CTLA4 항체, MDX-060, Medarex에의해개발된항-CD30 항체, Medarex에의해개발된 MDX-070, Medarex에의해개발된 MDX-018, Osidem (IDM-1), 및 Medarex 및 Immuno-Designed Molecules에의해개발된항-Her2 항체, HuMax -CD4, Medarex 및 Genmab에의해개발된항-CD4 항체, HuMax-IL15, Medarex 및 Genmab에의해개발된항-IL15 항체, CNTO 148, Medarex 및 Centocor/J&J에의해개발된항-TNFα 항체, CNTO 1275, Centocor/J&J 에의해개발된항-사이토킨항체, MOR101 및 MOR102, MorphoSys에의해개발된항-세포간부착분자-1(ICAM- 1)(CD54) 항체, MOR201, MorphoSys에의해개발된항-섬유아세포성장인자수용체 3(FGFR-3), Nuvion ( 비실리주마브 ), Protein Design Labs에의해개발된항-CD3 항체, HuZAF, Protein Design Labs에의해개발된항- 감마인터페론항체, Protein Design Labs에의해개발된항-α5β1 인테그린, Protein Design Labs에의해개발된항-IL-12, ING-1, Xoma에의해개발된항-Ep-CAM 항체, Xolair (Omalizumab), Genentech 및 Novartis에의해개발된사람화된항-IgE 항체, 및 MLN01, Xoma에의해개발된항-베타2 인테그린항체를포함하지만이에제한되지않고, 이문단에서열거된참조들은모두본원에참조로서명확하게인용된다. 또다른양태에서, 치료제는 KRN330 (Kirin); hua33 항체 (A33, Ludwig Institute for Cancer Research); CNTO 95 ( 알파 V 인테그린, Centocor); MEDI-522 ( 알파 Vβ3 인테그린, Medimmune); 볼록이시마브 ( 알파 Vβ1 인테그린, Biogen/PDL); 사람 mab 216 (B 세포당화에피토프, NCI); BiTE MT103 ( 이특이적 CD19 x CD3, Medimmune); 4G7xH22 ( 이특이적 BcellxFc감마R1, Medarex/Merck KGa); rm28 (Bispecific CD28 x MAPG, US Patent No. EP1444268); MDX447 (EMD 82633) ( 이특이적 CD64 x EGFR, Medarex); 카투막소마브 (Catumaxomab)( 레모바브 ) ( 이특이적 EpCAM x 항-CD3, Trion/Fres); 에르투마속마브 (Ertumaxomab) ( 이특이적 HER2/CD3, Fresenius Biotech); 오레고보마브 (OvaRex) (CA-125, ViRexx); 렌카렉스 (Rencarex) (WX G250) ( 카보닉안하이드라제 IX, Wilex); CNTO 888 (CCL2, Centocor); TRC105 (CD105 ( 엔도글린 ), Tracon); BMS-663513 (CD137 효능제, Brystol Myers Squibb); MDX-1342 (CD19, Medarex); 시플리주마브 (MEDI-507) (CD2, Medimmune); 오파투무마브 (Ofatumumab) (Humax-CD20) (CD20, Genmab); 리툭시마브 (Rituximab) (Rituxan) (CD20, Genentech); 벨투주마브 (veltuzumab) (ha20) (CD20, Immunomedics); 에프라투주마브 (Epratuzumab) (CD22, Amgen); 루밀릭시마브 (lumiliximab) (IDEC 152) (CD23, Biogen); 무로모나브 (muromonab)-cd3 (CD3, Ortho); HuM291 (CD3 fc 수용체, PDL Biopharma); HeFi-1, CD30, NCI); MDX-060 (CD30, Medarex); MDX-1401 (CD30, Medarex); SGN-30 (CD30, Seattle Genentics); SGN-33 ( 린투주마브 ) (CD33, Seattle Genentics); 자놀리무마브 (Zanolimumab) (HuMax-CD4) (CD4, Genmab); HCD122 (CD40, Novartis); SGN-40 (CD40, Seattle Genentics); Campath1h ( 알렘투주마브 (Alemtuzumab)) (CD52, Genzyme); MDX-1411 (CD70, Medarex); hll1 (EPB-1) (CD74.38, Immunomedics); 갈릭시마브 (IDEC-144) (CD80, Biogen); MT293 (TRC093/D93) ( 절단된콜라겐, 트라콘 ); HuLuc63 (CS1, PDL Pharma); 이필리무마브 (MDX-010) (CTLA4, Brystol Myers Squibb); 트레멜리무마브 (Tremelimumab)(Ticilimumab, CP- 675,2) (CTLA4, Pfizer); HGS-ETR1 ( 마파투무마브 (Mapatumumab)) (DR4 TRAIL-R1 효능제, Human Genome Science /Glaxo Smith Kline); AMG-655 (DR5, Amgen); 아포마브 (Apomab) (DR5, Genentech); CS-1008 (DR5, Daiichi Sankyo); HGS-ETR2 ( 렉사투무마브 (lexatumumab)) (DR5 TRAIL-R2 효능제, HGS); 세툭시마브 (Cetuximab) (Erbitux) (EGFR, Imclone); IMC-11F8, (EGFR, Imclone); 니모투주마브 (EGFR, YM Bio); 파니투무마브 (Panitumumab) (Vectabix) (EGFR, Amgen); 잘루투무마브 (Zalutumumab) (HuMaxEGFr) (EGFR, Genmab); CDX-110 (EGFRvIII, AVANT Immunotherapeutics); 아데카투무마브 (adecatumumab) (MT201) (Epcam, Merck); 에드레콜로마브 (edrecolomab) (Panorex, 17-1A) (Epcam, Glaxo/Centocor); MORAb-003 ( 폴레이트수용체 a, Morphotech); KW-2871 ( 갱글리오사이드 GD3, Kyowa); MORAb-009 (GP-9, Morphotech); CDX-1307 (MDX-1307) (hcgb, Celldex); 트라스투주마브 (Trastuzumab) (Herceptin) (HER2, Celldex); 페르투주마브 (rhumab 2C4) (HER2 (DI), Genentech); 아폴리주마브 (apolizumab) (HLA-DR 베타쇄, PDL Pharma); AMG-479 (IGF-1R, Amgen); 항-IGF-1R R1507 (IGF1-R, Roche); CP 751871 (IGF1-R, Pfizer); IMC-A12 (IGF1-R, Imclone); BIIB022 (IGF-1R, Biogen); Mik-베타-1 (IL-2Rb (CD122), Hoffman LaRoche); CNTO 328 (IL6, Centocor); 항-KIR (1-7F9) ( 킬러세포 Ig형수용체 (KIR), Novo); Hu3S193 (Lewis (y), Wyeth, Ludwig Institute of Cancer Research); hcbe-11 (LTβR, Biogen); HuHMFG1 (MUC1, Antisoma/NCI); RAV12 (N-연결된탄수화물에피토프, Raven); CAL ( 파라티로이드호르몬-관련단백질 (PTH-rP), University of California); CT-011 (PD1, CureTech); MDX-1106 (ono- 4538) (PD1, Medarex/Ono); MAb CT-011 (PD1, Curetech); IMC-3G3 (PDGFRa, Imclone); 바비툭시마브 ( 포스파티딜세린, 페레그린 ); huj591 (PSMA, Cornell Research Foundation); muj591 (PSMA, Cornell Research Foundation); GC1008 (TGFb (pan) 억제제 (IgG4), Genzyme); 인플릭시마브 (Infliximab) (Remicade) (TNFa, Centocor); A27.15 ( 트랜스페린수용체, Salk Institute, INSERN WO 2005/111082); E2.3 ( 트랜스페린수용체, - 51 -
Salk Institute); 베바시주마브 (Bevacizumab) (Avastin) (VEGF, Genentech); HuMV833 (VEGF, Tsukuba Research Lab-WO/2000/034337, University of Texas); IMC-18F1 (VEGFR1, Imclone); IMC-1121 (VEGFR2, Imclone) 을포함한다. [0240] [0241] [0242] [0243] [0244] B. DVD 분자의작제 : 이원가변도메인면역글로불린 (DVD-Ig) 분자는 2개상이한모 mab 기원의 2개의상이한경쇄가변도메인 (V L) 이직접적으로탠덤으로연결되거나재조합 DNA 기술에의해짧은링커를통해연결되고이어서경쇄불변도메인이연결되도록디자인한다. 유사하게, 중쇄는탠덤으로연결된 2개의상이한중쇄가변도메인 (VH) 에이어서불변도메인 CH1 및 Fc 영역을포함한다 ( 도 1a). 가변도메인은상기된방법중어느하나에의해생성된모항체로부터재조합 DNA 기술을사용하여수득될수있다. 하나의양태에서, 가변도메인은쥐중쇄또는경쇄가변도메인이다. 또다른양태에서, 가변도메인은 CDR 접목되거나사람화된가변중쇄또는경쇄도메인이다. 하나의양태에서, 가변도메인은사람중쇄또는경쇄가변도메인이다. 하나의양태에서, 제1 및제2 가변도메인은재조합 DNA 기술을사용하여서로직접적으로연결된다. 또다른양태에서, 가변도메인은링커서열을통해연결된다. 하나의양태에서, 2개의가변도메인이연결된다. 3개이상의가변도메인은또한직접적으로또는링커서열을통해연결될수있다. 가변도메인은동일한항원에결합할수있거나상이한항원에결합할수있다. 본발명의 DVD 분자는수용체의리간드결합도메인, 효소의활성도메인과같은하나의면역글로불린가변도메인및하나의비-면역글로불린가변도메인을포함할수있다. DVD 분자는또한 2개이상의비-Ig 도메인을포함할수있다. 링커서열은단일아미노산또는폴리펩타이드서열일수있다. 하나의양태에서, 링커서열은 AKTTPKLEEGEFSEAR( 서열번호 1); AKTTPKLEEGEFSEARV( 서열번호 2); AKTTPKLGG( 서열번호 3); SAKTTPKLGG( 서열번호 4); SAKTTP( 서열번호 5); RADAAP ( 서열번호 6); RADAAPTVS ( 서열번호 7); RADAAAAGGPGS ( 서열번호 8); RADAAAA(G 4 S) 4 ( 서열번호 9), SAKTTPKLEEGEFSEARV ( 서열번호 10); ADAAP ( 서열번호 11); ADAAPTVSIFPP ( 서열번 호 12); TVAAP ( 서열번호 13); TVAAPSVFIFPP ( 서열번호 14); QPKAAP ( 서열번호 15); QPKAAPSVTLFPP ( 서열번호 16); AKTTPP ( 서열번호 17); AKTTPPSVTPLAP ( 서열번호 18); AKTTAP ( 서열번호 19); AKTTAPSVYPLAP ( 서열번호 20); ASTKGP ( 서열번호 21); ASTKGPSVFPLAP ( 서열번호 22), GGGGSGGGGSGGGGS ( 서열번호 23); GENKVEYAPALMALS ( 서열번호 24); GPAKELTPLKEAKVS ( 서열번호 25); 및 GHEAAAVMQVQYPAS ( 서열번호 26) 으로이루어진그룹으로부터선택되는링커이다. 링커서열의선택은여러 Fab 분자의결정구조분석을기초로한다. Fab 또는항체분자구조에서가변도메인과 CH1/CL 불변도메인간에는천연유연성연결이있다. 당해천연연결체는약 10 내지 12개의아미노산잔기를포함하고, 이중 4 내지 6개의잔기는 V 도메인의 C-말단으로부터유래된것이고 4 내지 6개의잔기는 CL/CH1 도메인의 N-말단으로부터유래된것이다. 본발명의 DVD Ig는각각 DVD-Ig의경쇄및중쇄에서링커로서 CL 또는 CH1의 N-말단의 5 내지 6개의아미노산잔기또는 11개내지 12개의아미노산잔기를사용하여제조된다. CL 또는 CH1 도메인의 N-말단잔기, 특히처음 5개내지 6개의아미노산잔기는강한 2차구조없이루프형태를취함에따라서 2개의가변도메인간의유연성링커로서작용할수있다. CL 또는 CH1 도메인의 N-말단잔기, 특히처음 5 내지 6개의아미노산잔기는강한 2차구조없이루프형태를취함에따라서 2개의가변도메인간에유연성링커로서작용할수있다. CL 또는 CH1 도메인의 N-말단잔기는천연연장의가변도메인이고이들은 Ig 서열의일부임으로링커및연결부로부터잠재적으로유발되는면역원성을크게감소시킨다. [0245] [0246] 또다른링커서열은임의의길이의 CL/CH1 도메인의임의의서열, 예를들어, CL/CH1 도메인의처음 5 내지 12 개의아미노산잔기를포함할수있지만 CL/CH1 도메인의모든잔기를포함하지는않는다. 경쇄링커는 Cκ 또는 Cλ로부터비롯될수있고 ; 중쇄링커는 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cα1, Cα2, Cδ, Cε, 및 Cμ를포함하는임의의이소형의 CH1으로부터비롯될수있다. 링커서열은또한 Ig-형단백질 ( 예를들어, TCR, FcR, KIR) 과같은기타단백질 ; G/S 기본서열 ( 예를들어, G4S 반복체 ; 서열번호 27); 힌지영역유래서열및기타단백질기원의기타천연단백질로부터유래할수있다. 하나의양태에서, 불변도메인은재조합 DNA 기술을사용하여 2개의연결된가변도메인에연결한다. 하나의양태에서, 연결된중쇄가변도메인을포함하는서열은중쇄불변도메인에연결하고연결된경쇄가변도메인을포함하는서열은경쇄불변도메인에연결한다. 하나의양태에서, 불변도메인은각각사람중쇄불변도메인및사람경쇄불변도메인이다. 하나의양태에서, DVD 중쇄는추가로 Fc 영역에연결한다. Fc 영역은천연서열 Fc 영역또는변이체 Fc 영역일수있다. 또다른양태에서, Fc 영역은사람 Fc 영역이다. 또다른양태 - 52 -
에서, Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 기원의 Fc 영역을포함한다. [0247] 또다른양태에서, 2개의중쇄 DVD 폴리펩타이드및 2개의경쇄 DVD 폴리펩타이드는조합되어 DVD-Ig 분자를형성한다. 표 2는질환을치료하기위해, 예를들어, 암을치료하기위해유용한표적에대한예시적인항체의 VH 및 VL 영역의아미노산서열을열거한다. 하나의양태에서, 본발명은임의의배향으로표 2에열거된 VH 및 / 또는 VL 영역중 2개이상을포함하는 DVD를제공한다. 표 2 [0248] [0249] [0250] [0251] 특정표적에결합할수있는특이적 DVD-Ig 분자및이를제조하는방법의상세한설명은하기의실험부에서제공된다. C. DVD 단백질의제조본발명의결합단백질은당업계에공지된임의의다수의기술에의해제조될수있다. 예를들어, 숙주세포로부터발현되고여기서, DVD 중쇄및 DVD 경쇄를암호화하는발현벡터는표준기술에의해숙주세포로형질감염된다. " 형질감염 " 이란용어의다양한형태는원핵생물또는진핵생물숙주세포에외인성 DNA를도입시키는데일반적으로사용되는다양한기술, 예컨대전기천공, 인산칼슘침전, DEAE-덱스트란형질감염등을포함하는것으로간주한다. 본발명의 DVD 단백질은원핵생물숙주세포또는진핵생물숙주세포에서발현시킬수있지만, 진핵생물예를들어, 포유동물숙주세포에서의 DVD 단백질의발현이바람직한데, 그이유는이러한진핵생물세포 ( 특히포유동물세포 ) 가적당한폴딩을이루어면역학적활성인 DVD 단백질을회합 (assembly) 하여분비하는데원핵생물세포보다더적당하기때문이다. - 53 -
[0252] [0253] [0254] [0255] [0256] [0257] [0258] [0259] [0260] [0261] 본발명의재조합항체를발현하기에바람직한포유동물숙주세포에는중국햄스터난소 (CHO 세포 )( 예컨대, R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982) Mol.Biol. 159:601-621에기술된바와같은 DHFR 선택성마커와함께사용된, Urlaub and Chasin(1980) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77:4216-4220에기술된 dhfr-cho 세포 ), NS0 골수종세포, COS 세포및 SP2 및 PER.C6 세포가있다. DVD 단백질을암호화하는재조합발현벡터가포유동물숙주세포에도입되면, DVD 단백질은숙주세포에서 DVD 단백질이발현되기에또는바람직하게는숙주세포가증식되는배양배지로 DVD 단백질이분비되기에충분한시간동안숙주세포를배양하여생산한다. DVD 단백질은표준단백질정제법을사용하여배양배지로부터회수할수있다. 본발명의 DVD 단백질의재조합발현을위해바람직한시스템에서, DVD 중쇄및 DVD 경쇄둘다를암호화하는재조합발현벡터는인산칼슘매개형질감염에의해 dhfr-cho 세포로도입된다. 재조합발현벡터내에서, DVD 중쇄및경쇄는 CMV 인핸서 /AdMLP 프로모터조절인자에각각작동적으로결합되어상기유전자의높은전사율을유도한다. 또한, 재조합발현벡터는 DHFR 유전자를보유하며, 이유전자는메토트렉세이트선별 / 증폭을통해상기벡터로형질감염된 CHO 세포를선별할수있게해준다. 선별된형질전환숙주세포는 DVD 중쇄및경쇄를발현할수있도록배양하고, 이러한배양배지로부터완전한 DVD를회수한다. 재조합발현벡터제조, 숙주세포형질감염, 형질전환체선별, 숙주세포배양및배양배지로부터 DVD의회수에는표준분자생물학기술을사용한다. 또한, 본발명은본발명의숙주세포를본발명의 DVD 단백질이합성될때까지적당한배양배지에서배양하여본발명의 DVD 단백질을합성하는방법을제공한다. 이방법은추가로배양배지로부터 DVD 단백질을분리하는단계를포함할수있다. DVD-Ig의중요한특징은이것이통상적인항체와유사한방법으로제조되고정제될수있다는것이다. DVD-Ig의제조는목적하는이원-특이적활성을갖는균질의단일주요생성물을유도하고불변영역의임의의서열의변형또는임의의종류의화학적변형이필요없다. " 이특이적 ", " 다특이적 " 및 " 다특이적다가 " 의완전한길이의결합단백질을제조하기위해이전에기재된방법은단일의주요생성물을유도하지못하고대신어셈블리된불활성, 단일특이적, 다특이적, 다가, 완전한길이의결합단백질및다가의완전한길이의결합단백질및상이한결합부위가조합된다가의완전한길이의결합단백질을유도한다. 일례로서, 문헌 [ 참조 :Miller 및 Presta (PCT 공보 WO2001/077342(A1)) 에기재된디자인을기초로, 16개의가능한중쇄및경쇄의조합이있다. 결과적으로단백질의단지 6.25% 만이목적하는활성형태에있을가능성이있으며, 다른 15개조합과비교하여주요생성물또는단일 1차생성물이아니다. 전형적으로대규모제조에사용되는표준크로마토그래피기술을사용한불활성및부분활성형태의단백질로부터완전한활성형태의단백질의분리는아직입증되어야만한다. 놀랍게도, 본발명의 " 이원특이적다가완전한길이의결합단백질 " 의디자인은주로목적하는 " 이원-특이적다가의완전한길이의단백질 " 로어셈블리하는이원가변도메인경쇄및이원가변도메인중쇄를유도한다. 어셈블리되고발현된이원가변도메인면역글로불린분자중 50% 이상, 바람직하게는 75% 이상및보다바람직하게는 90% 이상은목적하는이원-특이적 4가단백질이다. 본발명의당해측면은특히, 본발명의상업적용도를증진시킨다. 따라서, 본발명은 " 이원-특이적 4가완전한길이의결합단백질 " 의단일주요생성물을유도하는단일세포에서이원가변도메인경쇄및이원가변도메인중쇄를발현시키기위한방법을포함한다. 본발명은단일세포에서 " 이원특이적 4가의완전한길이의결합단백질 " 의 " 주요생성물 " 을유도하는, 이원가변도메인경쇄및이원가변도메인중쇄를발현시키기위한바람직한방법을제공하고여기서, " 주요생성물 " 은이원가변도메인경쇄및이원가변도메인중쇄를포함하는 50% 초과의모든어셈블리된단백질이다. 본발명은단일세포에서 " 이원특이적 4가의완전한길이의결합단백질 " 의 " 주요생성물 " 을유도하는, 이원가변도메인경쇄및이원가변도메인중쇄를발현시키기위한바람직한방법을제공하고여기서, " 주요생성물 " 은이원가변도메인경쇄및이원가변도메인중쇄를포함하는 75% 초과의모든어셈블리된단백질이다. 본발명은단일세포에서 " 이원특이적 4가의완전한길이의결합단백질 " 의 " 주요생성물 " 을유도하는, 이원가변도메인경쇄및이원가변도메인중쇄를발현시키기위한바람직한방법을제공하고여기서, " 주요생성물 " 은이원가변도메인경쇄및이원가변도메인중쇄를포함하는 90% 초과의모든어셈블리된단백질이다. II. 유도체화된 DVD 결합단백질 : 일양태는본발명의결합단백질이유도체화되거나또는다른기능성분자 ( 예컨대, 다른펩타이드또는단백질 ) 에결합된표지된결합단백질을제공한다. 예를들어, 본발명의표지된결합단백질은본발명의결합단백질 ( 화학적커플링, 유전자융합, 비공유연합등에의해 ) 을하나이상의다른분자실체, 예컨대다른항체 - 54 -
( 예, 이특이적항체또는이중항체 ), 검출성제제, 세포독성제, 약제및 / 또는다른분자와결합단백질의연합 을매개할수있는단백질이나펩타이드 ( 예컨대, 스트렙타비딘코어영역또는폴리히스티딘태그 ) 등에기능적 으로연결시켜수득할수있다. [0262] [0263] [0264] [0265] [0266] [0267] [0268] [0269] 본발명의결합단백질이유도체화될수있는유용한검출성제제에는형광화합물이포함된다. 검출성형광제제의예에는플루오레세인, 플루오레세인이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐클로라이드, 피코에리트린등이있다. 또한, 결합단백질은검출성효소, 예컨대알칼리성포스파타제, 서양고추냉이퍼옥시다제, 글루코스옥시다제등에의해유도체화될수있다. 결합단백질이검출성효소로유도체화된경우에는, 효소가검출성반응산물을생산하기위해사용하는추가시약을첨가하여검출한다. 예를들어, 검출성제제서양고추냉이퍼옥시다제가존재하는경우, 과산화수소및디아미노벤지딘의첨가는검출가능한발색반응생성물을유도한다. 결합단백질은또한비오틴으로유도체화될수있고, 이경우아비딘이나스트렙타비딘결합의간접측정을통해검출한다. 본발명의다른양태는결정화된결합단백질, 및이러한결정을포함하는제형및조성물을제공한다. 일양태에서, 결정화된결합단백질은이에대응하는가용성결합단백질보다생체내반감기가더길다. 또다른양태에서, 결합단백질은결정화후생물학적활성을보유한다. 본발명의결정화된결합단백질은당업계에공지되어있고본원에참조로서인용된 WO 02072636에개시된바와같이생산할수있다. 본발명의다른양태는항체또는이의항원결합부가하나이상의탄수화물잔기를포함하는당화된결합단백질을제공한다. 생체내생산된초기단백질은해독후변형으로알려진추가프로세싱으로처리될수있다. 구체적으로, 당 ( 글리코실 ) 잔기는당화로알려진방법에의해효소적으로첨가될수있다. 그결과수득되는공유결합된올리고사카라이드측쇄를보유한단백질은당화된단백질또는당단백질로서공지되어있다. 항체는가변성도메인뿐만아니라 Fc 도메인에하나이상의탄수화물잔기를갖는당단백질이다. Fc 도메인내탄수화물잔기는 Fc 도메인의이펙터기능에중요한효과를나타내고항체의항원결합또는반감기에최소의효과를나타낸다 (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11-16). 대조적으로, 가변성도메인의당화는항체의항원결합활성에효과를가질수있다. 가변성도메인내당화는항체결합친화성에대해음성효과를나타낼수있고이는입체장애때문이거나 (Co, M.S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361-1367), 항원에대한친화성을증가시키기때문이다 (Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717 2723). 본발명의한측면은결합단백질의 O- 또는 N- 결합된당화부위가돌연변이된당화부위돌연변이체를제조하는것에관한것이다. 당업자는널리공지된표준기술을사용하여당해돌연변이체를제조할수있다. 생물학적활성을보유하지만결합활성이증가되거나감소된당화부위돌연변이체는본발명의또다른목적이다. 또다른양태에서, 본발명의항체또는항원결합부의당화는변형된다. 예를들어, 당화되지않은항체가제조될수있다 ( 즉, 항체는당화되어있지않다 ). 항원에대한항체의특이성을증가시키기위해당화가변형될수있다. 당해당화변형은예를들어, 항체서열내하나이상의당화부위를변형시킴에의해달성될수있다. 예를들어, 하나이상의아미노산이치환되어하나이상의가변영역당화부위가제거됨으로써그부위에서의당화가제거된다. 당해당화제거는항원에대한항체의친화성을증가시킬수있다. 당해방법은문헌 [PCT Publication WO2003016466A2, and U.S. Pat. Nos. 5,714,350 and 6,350,861] 에상세하게추가로기재되어있고, 상기문헌들은각각그전체가본원에참조로서인용된다. 또한, 본발명의변형된결합단백질은푸코실잔기의양이감소된저푸코실화된항체 ( 문헌참조 : Kanda, Yutaka et al., Journal of Biotechnology (2007), 130(3), 300-310) 또는 GlcNAc 구조의 2등분이증가된항체와같은변형된유형의당화를가질수있다. 당해변형된당화패턴은항체의 ADCC 활성을증가시키는것으로입증되었다. 당해탄수화물변형은예를들어, 변형된당화기구를갖는숙주세포에서항체를발현시켜달성될수있다. 변형된당화기구를갖는세포는당업계에보고되어있고본발명의재조합항체를발현시켜변형된당화를갖는항체를제조하기위한숙주세포로서사용될수있다. 예를들면, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, 및 European Patent No: EP 1,176,195; PCT Publications WO 03/035835; WO 99/54342 80을참조하고, 상기각각의문헌들은그전체가본원에참조로서인용된다. 단백질당화는당해단백질의아미노산서열, 및단백질이발현되는숙주세포에따라달라진다. 다른유기체는 - 55 -
다른당화효소 ( 예컨대, 글리코실트란스퍼라제및글리코시다제 ) 를생산하고, 이용할수있는기질 ( 뉴클레오타이드당 ) 이다를수있다. 이러한요인으로인해, 단백질당화패턴및글리코실잔기의조성은특정단백질이발현되는숙주계에따라다를수있다. 본발명에유용한글리코실잔기는글루코스, 갈락토스, 만노스, 퓨코스, n-아세틸글루코사민및시알산등을이에국한됨이없이포함할수있다. 하나의양태에서, 이러한당화된결합단백질은당화패턴이사람이도록글리코실잔기를포함하는것이바람직하다. [0270] [0271] [0272] [0273] [0274] [0275] 당업자에게공지된바와같이, 상이한단백질당화는상이한단백질특징을제공할수있다. 예를들어, 효모와같은미생물숙주에서생산되고효모내인성경로를이용하여당화된치료단백질의효능은 CHO 세포주와같은포유동물세포에서발현된동일단백질효능에비해저하될수있다. 이러한당단백질은또한사람중에서면역원성일수있고투여후생체내반감기가감소될수있다. 사람및다른동물에존재하는특정수용체는특정당화잔기를인식하고혈류로부터그단백질의신속제거를촉진할수있다. 다른부작용으로, 단백질폴딩, 용해성, 프로테아제에대한민감성, 트래픽킹 (trafficking), 수송, 구획화, 분비, 다른단백질이나인자에의해인식, 항원성또는알레르기원성등의변화를포함할수있다. 따라서, 당업자는특정조성과당화패턴을가진치료단백질, 예컨대사람세포또는의도된피검체동물의종특이적세포에서생산되는것과동일하거나적어도유사한당화조성및패턴을가진치료단백질을선호할수있다. 숙주세포와상이한당화된단백질의발현은숙주세포의유전자변형을통해이종당화효소를발현하도록함으로서수득될수있다. 사람단백질당화를나타내는항체또는항원결합부는당업계에공지된기술을사용하여당업자라면제조할수있다. 예를들어, 효모균주는비자연발생의당화효소를발현하도록유전자변형되어, 이효모균주에서생산된당화된단백질 ( 당단백질 ) 이동물세포, 특히사람세포에서생산된것과동일한단백질당화가수득된바있다 ( 미국특허출원 20040018590 및 20020137134 및 PCT 공개공보 WO2005100584 A2). 결합단백질외에도, 본발명은또한본발명의당해결합단백질에특이적인항-이디오타입 ( 항-Id) 항체에관한것이다. 항-Id 항체는일반적으로또다른항체의항원결합영역과연합된유일한결정인자를인지하는항체이다. 항-Id는결합단백질또는 CDR 함유영역으로동물을면역화시켜제조될수있다. 면역화된동물은면역화항체의이디오타입결정인자를인지하고이에응답하여항-Id 항체를생산한다. 이는 DVD-Ig 분자로 2 개이상의모항체를혼입하여항-이디오타입항체를제조하기가수월하고당업계에널리공지된방법 ( 예를들어, BIAcore, ELISA) 에의해결합연구를확인하여각각의모항체의이디오타입에대해특이적인항-이디오타입항체가또한 DVD-Ig와관련하여당해이디오타입 ( 예를들어, 항원결합부위 ) 을인지함을입증하기가수월해짐은명백하다. DVD-Ig의 2개이상의항원결합부각각에대해특이적인항-이디오타입항체는환자혈청에서사람 DVD-Ig의 DVD-Ig 농도를측정하기위해이상적인시약을제공한다. DVD-Ig 농도분석은 " 샌드위치분석 ELISA 포맷 " 을사용하여확립될수있고여기에사용되는제1 항원결합영역에대한항체는고형상 ( 예를들어, BIAcore 칩, ELISA 플레이트등 ) 상에피복되고세정완충액으로세정되고, 혈청샘플로항온처리하고또다른세정단계를수행하고궁극적으로또다른항원결합부위에대한또다른항-이디오타입항체와항온처리하고그자체를결합반응의정량을위해효소로표지시킨다. 하나의양태에서, 2개이상의상이한결합부위를갖는 DVD-Ig에대해, 최외곽부위 ( 불변영역으로부터가장원거리및근거리 ) 에대한항-이디오타입항체는사람혈청에서 DVD-Ig 농도를결정하는것을도와줄뿐만아니라생체내분자의통합성을입증한다. 각각의항-Id 항체는또한또다른동물에서면역반응을유도하기위한, 소위항-항-Id 항체를제조하는 " 면역원 " 으로서사용될수있다. 또한, 목적하는단백질은다양한당화효소를발현하도록유전자조작된숙주세포의라이브러리를사용하여발현시킬수있음을당업자라면잘알고있을것이며, 이에따라상기라이브러리의구성숙주세포는변형된당화패턴을가진당해의단백질을생산한다. 그다음, 당업자는새로운특정당화패턴을가진당해의단백질을선별하여분리할수있다. 하나의양태에서, 특별하게선별된신규당화패턴을가진단백질은생물학적성질이개선되거나변경된단백질인것이바람직하다. III. DVD-Ig의용도 2개이상의항원에결합하는성질이있다면, 본발명의결합단백질은통상의면역분석법, 예컨대효소결합된면역흡착분석법 (ELISA), 방사선면역분석법 (RIA) 또는조직면역조직화학법을통해항원 ( 예컨대혈청이나혈장과같은생물학적시료에서 ) 을검출하는데사용할수있다. DVD-Ig는결합또는미결합된항체의검출을촉진시키기위해직간접적으로검출성물질로표지화된다. 적당한검출성물질에는각종효소, 보결분자족, 형광물질, 발광물질및방사능물질이있다. 적당한효소의예에는양고추냉이퍼옥시다제, 알칼리성포스파타제, β-갈 - 56 -
락토시다제또는아세틸콜린에스터라제가있고 ; 적당한보결분자족복합체의예에는스트렙타비딘 / 비오틴및아비딘 / 비오틴이있으며 ; 적당한형광물질의예에는움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민플루오레세인, 단실클로라이드또는피코에리트린이있고 ; 발광물질의예에는루미놀이있으며 ; 적당한방사능물질의예에는 3 H, 14 C, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I, 177 Lu, 166 Ho 또는 153 Sm이있다. [0276] [0277] [0278] [0279] [0280] [0281] [0282] [0283] [0284] [0285] [0286] [0287] [0288] [0289] [0290] [0291] 본발명의결합단백질은시험관내및생체내모두에서항원의활성을중화시킬수있다. 따라서, 당해 DVD-Ig 를사용하여, 예를들어, 항원을함유하는세포배양물에서, 사람피검체또는본발명의결합단백질이교차반응하는항원을갖는기타포유동물피검체에서항원활성을억제할수있다. 또다른양태에서, 본발명은항원활성이해로운질환또는장애를앓는피검체에서항원활성을감소시키는방법을제공한다. 본발명의결합단백질은치료목적을위해사람피검체에투여될수있다. 본원에사용된바와같이, 용어 " 항원활성이해로운장애 " 는장애를앓는피검체에서항원의존재가장애의병리에관여하거나장애의악화에기여하는인자이거나의심되는것으로나타나는질환및기타장애를포함하는것으로의도된다. 따라서, 항원활성이해로운장애는항원활성의감소가장애의증상및 / 또는진행을완화시킬것으로예상되는장애이다. 당해장애는예를들어, 장애를앓는피검체의생물학적유체중에항원농도를증가시켜 ( 예를들어, 피검체의혈청, 혈장, 윤활액중의항원농도의증가 ) 입증될수있다. 본발명의결합단백질로치료될수있는장애의비제한적인예는하기에서및본발명의항체의약제학적조성물에관한부분에서논의되는장애를포함한다. 본발명의 DVD-Ig는하나의항원또는다중항원에결합할수있다. 당해항원은본원에참조로서인용되는하기의데이터베이스에열거된표적물을포함하지만이에제한되지않는다. 이들표적데이터베이스는하기와같은목록을포함한다 : 치료학적표적 (http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp); 사이토킨및사이토킨수용체 (http://www.cytokinewebfacts.com/, http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi, and http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/cgf_database/cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/cfc/indexr.html); 케목킨 (http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/cfc/ck/chemokine.html); 케목킨수용체및 GPCRs (http://csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/csp/receptor.html, http://www.gpcr.org/7tm/); 올팩터리수용체 (http://senselab.med.yale.edu/senselab/ordb/default.asp); 수용체 (http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm); 암표적 (http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi); 잠재적항체표적으로서분비된단백질 (http://spd.cbi.pku.edu.cn/); 단백질키나제 (http://spd.cbi.pku.edu.cn/), 및사람 CD 마커 (http://content.labvelocity.com/tools/6/1226/cd_table_final_locked.pdf) 및 (Zola H, 2005 CD molecules 2005: human cell differentiation molecules Blood, 106:3123-6). DVD-Ig는효능 / 안정성을증진시키고 / 시키거나환자의적용범위를증가시키기위해 2개의상이한표적을동시에차단시키는치료제로서유용하다. 당해표적은가용성표적 (TNF) 및세포표면수용체표적 (VEGFR 및 EGFR) 을포함할수있다. 이것은또한암치료를위해종양세포와 T세포 (Her2 및 CD3) 간에, 또는자가면역 / 이식을위해자가반응성세포와이펙터세포간에또는임의의특정질환에서발병세포를제거하기위한임의의표적세포와이펙터세포간에재지시된세포독성을유도하는데사용될수있다. 추가로, 동일한수용체상에 2개의상이한에피토프를표적화하도록디자인되는경우, DVD-Ig는수용체클러스터링및활성화를유도하기위해사용될수있다. 이것은효능성및길항성항-GPCR 치료제를제조하는데이득일수있다. 이경우에, DVD-Ig를사용하여클러스터링 / 시그날전달 (2개의세포표면분자 ) 또는시그날전달 ( 하나의분자상에 ) 을위해하나의세포에대해 2개의상이한에피토프를표적화할수있다. 유사하게, DVD-Ig 분 - 57 -
자는 CTLA-4 연결, 및 CTLA-4 세포외도메인의 2개의상이한에피토프 ( 또는 2개카피의동일한에피토프 ) 를표적화함에의한음성시그날을유발하여면역반응을하향조절하도록디자인될수있다 CTLA-4는다수의면역학적장애의치료를위해임상적으로유효하다. CTLA-4/B7은세포주기진행, IL-2 생성및활성화후 T 세포의증식을약화시킴에의해 T 세포활성화를음성으로조절하고 CTLA-4 (CD152) 관여는 T 세포활성화를하향조절할수있고면역내성의유도를촉진시킬수있다. 그러나, CTLA-4의효능성항체관여에의해 T 세포활성화를약화시키는전략은 CTLA-4 활성화가연결을요구하기때문에성공적이지못하였다. CTLA-4/B7의분자상호작용은결정구조분석 (Stamper 2001 Nature410:608) 에의해입증된바와같이 " 경사진지퍼 " 정렬로있다. 그러나, 항-CTLA-4 모노클로날항체를포함하는, 현재시판되는 CTLA-4 결합시약의어떠한것도연결성질을갖지않는다. 이러한문제를해결하기위한여러시도가있었다. 한경우에, 세포구성원결합단일쇄항체가제조되었고마우스에서동형접합성거부를억제하였다 (Hwang 2002 JI 169:633). 별도의경우에, CTLA-4에대한인공 APC 표면연결된단일쇄항체를제조하고 T세포반응을약화시키는것으로입증되었다 (Griffin 2000 JI 164:4433). 2개의경우에, CTLA-4 연결은인공시스템에서막결합항체를밀접하게국소화시킴으로써달성되었다. 당해실험은 CTLA-4 음성시그날전달에의해면역을하향조절한다는개념의증거를제공하지만이들보고에사용되는시약은치료학적용도로서적합하지않다. 이에대해, CTLA-4 연결은 CTLA-4 세포외도메인의 2 개의상이한에피토프 ( 또는 2개카피의동일한에피토프 ) 에표적화되는 DVD-Ig 분자를사용함에의해달성될수있다. 추론적으로 IgG의 2개의결합부위간의거리는약 150-170A 으로서 CTLA-4의활성연결 (2개의 CTLA-4 동종이량체간에 30 내지 50A ) 에대해서너무크다. 그러나, DVD-Ig( 하나의암 ) 상의 2개의결합부위간의거리는 30 내지 50A 의범위로서훨씬짧고 CTLA-4의적당한연결을허용한다. [0292] [0293] 유사하게, DVD-Ig는 2개의상이한세포표면수용체복합체의구성원 ( 예를들어, IL12-R 알파및베타 ) 을표적화할수있다. 추가로, DVD-Ig는 CR1 및가용성단백질 / 병원체를표적화하여표적가용성단백질 / 병원체의신속한제거를구동시킬수있다. 또한, 본발명의 DVD-Ig는세포내전달 ( 내재화수용체및세포내분자를표적화하는 ) 또는뇌내부로의전달 ( 혈뇌장벽을통과하기위해트랜스페린수용체및 CNS 질환매개체를표적화 ) 을포함하는, 조직-특이적전달 ( 국소 PK가증진됨에따라효능을보다증진시키고 / 시키거나독성을저하시키기위한조직마커및질환매개체를표적화함 ) 을위해사용될수있다. DVD-Ig는또한항원의비중화에피토프에결합함으로써특정위치로항원을전달하고또한항원의반감기를증가시키는캐리어단백질로서작용할수있다. 또한, DVD-Ig는환자에게이식된의료장치에물리적으로연결되거나이들의료장치를표적화하도록디자인될수있다 ( 문헌참조 : Burke, Sandra E.; Kuntz, Richard E.; Schwartz, Lewis B., Zotarolimus (ABT-578) eluting stents. Advanced Drug Delivery Reviews (2006), 58(3), 437-446; Surface coatings for biological activation and functionalization of medical devices, Hildebrand, H. F.; Blanchemain, N.; Mayer, G.; Chai, F.; Lefebvre, M.; Boschin, F., Surface and Coatings Technology (2006), 200(22-23), 6318-6324; Drug/ device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu, Peng; Grainger, David W., Biomaterials (2006), 27(11), 2450-2467; Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices., Marques, A. P.; Hunt, J. A.; Reis, Rui L., Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine (2005), 377-397). 간략하게, 적당한유형의세포를의학적이식체부위에지시함으로써정상적인조직기능을치유하고회복시킬수있다. 또한, 매개체 ( 사이토킨을포함하지만이에제한되지않음 ) 의억제는커플링된 DVD에의한장치이식즉시또는장치에표적화되는즉시제공된다. 예를들어, 스텐트는차단된동맥을청소하고심근으로의혈류를개선시키기위해개재심장학에서수년동안사용되어왔다. 그러나, 통상적인노출된금속스텐트는몇몇환자에서재발협착증 ( 처리된영역에서동맥의재협소화 ) 을일으켜혈액응고를유발할수있는것으로공지되어있다. 최근에, 항-CD34 항체피복된스텐트가보고되었고이는혈액전반에걸쳐순환하는내피선조세포 (EPC) 를포획함으로인해발생되는혈액응고를방지하고재발협착증을감소시킨다. 내피세포는혈관을따라존재하여혈류를원할하게하는세포이다. EPC는스텐트의경표면에부착하여연한층을형성하고치유를촉진시킬뿐만아니라이전에스텐트의사용과연관된합병증인재발협착증및혈액응고를방지한다 (Aoji et al. 2005 J Am Coll Cardiol. 45(10):1574-9). 스텐트를필요로하는환자에대한성과를개선시킬뿐만아니라심혈관우회수술을필요로하는환자와도관련이있다. 예를들어, 항-EPC 항체로피복된보족혈관 ( 인공동맥 ) 은우회수술이식을위해환자다리또는팔로부터동맥을사용할필요가없다. 이것은수술및마취시간을감소시키고이어서관상수술사망을감소시킬것이다. DVD-Ig는세포보강을촉진시키는이식된장치상에피복된단백질 ( 또는지질및폴리사카라이드를포함하지만이에제한되지않는임의의종류의에피토프 ) 뿐만아니라세포표면마커 (CD34와같은 ) 에결합되도록하는방식으로디자인된다. 당해방법은또한일반적으로기타의학적이식체에적용될수있다. 또한, DVD- - 58 -
Ig는의료장치에피복될수있고이식및장치로부터모든 DVD가방출되는즉시 ( 또는이미로딩된 DVD-Ig의노화및변성을포함하는추가의신선한 DVD-Ig를필요로할수있는임의의기타요구시 ), 당해장치는신선한 DVD-Ig를환자에게전신투여하여재로딩될수있고이때, DVD-Ig는목적하는표적 ( 사이토킨, 세포표면마커 ( 예를들어, CD34) 등 ) 에결합하도록디자인되고이는장치상에피복된표적 ( 지질, 폴리사카라이드및중합체를포함하지만이에제한되지않는임의의종류의단백질, 에피토프를포함함 ) 에대한한세트의결합부위와다른결합부위를갖는다. 당해기술은피복된이식체의유용성을연장시키는잇점을갖는다. [0294] [0295] [0296] [0297] [0298] [0299] [0300] A. 다양한질환에서 DVD-Ig의용도본발명의 DVD-Ig 분자는또한다양한질환을치료하기위한치료학적분자로서유용하다. 당해 DVD 분자는특정질환에관련된하나이상의표적에결합할수있다. 다양한질환에서당해표적의예는하기된바와같다. 1. 사람자가면역및염증반응많은단백질은일반적인자가면역및염증반응에연루되어있고다음을포함한다 : C5, CCL1 (I-309), CCL11 ( 에오탁신 ), CCL13 (mcp-4), CCL15 (MIP-1d), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19, CCL2 (mcp-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2 / 에오탁신-2), CCL25 (TECK), CCL26, CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (mcp-3), CCL8 (mcp-2), CXCL1, CXCL10 (IP-10), CXCL11 (I-TAC / IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL2, CXCL3, CXCL5 (ENA-78 / LIX), CXCL6 (GCP- 2), CXCL9, IL13, IL8, CCL13 (mcp-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, IL8RA, XCR1 (CCXCR1), IFNA2, IL10, IL13, IL17C, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, IL22, IL5, IL8, IL9, LTA, LTB, MIF, SCYE1 ( 내피단핵구활성화사이토킨 ), SPP1, TNF, TNFSF5, IFNA2, IL10RA, IL10RB, IL13, IL13RA1, IL5RA, IL9, IL9R, ABCF1, BCL6, C3, C4A, CEBPB, CRP, ICEBERG, IL1R1, IL1RN, IL8RB, LTB4R, TOLLIP, FADD, IRAK1, IRAK2, MYD88, NCK2, TNFAIP3, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, CD28, CD3E, CD3G, CD3Z, CD69, CD80, CD86, CNR1, CTLA4, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, FCGR3A, GPR44, HAVCR2, OPRD1, P2RX7, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, BLR1, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCR4, GPR2, SCYE1, SDF2, XCL1, XCL2, XCR1, AMH, AMHR2, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, C19orf10 (IL27w), CER1, CSF1, CSF2, CSF3, DKFZp451J0118, FGF2, GFI1, IFNA1, IFNB1, IFNG, IGF1, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL8, IL8RA, IL8RB, IL9, IL9R, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17R, IL18, IL18R1, IL19, IL20, KITLG, LEP, LTA, LTB, LTB4R, LTB4R2, LTBR, MIF, NPPB, PDGFB, TBX21, TDGF1, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, TNF, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF11A, TNFRSF21, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF11, VEGF, ZFPM2, 및 RNF110 (ZNF144). 한측면에서, 상기열거된하나이상의표적에결합할수있는 DVD-Ig가제공된다. 2. 천식알레르기성천식은상승된혈청 IgE 수준뿐만아니라호산구증가증, 배상세포이형성증, 상피세포변화, 기도과민반응 (AHR), 및 Th2 및 Th1 사이토킨발현의존재를특징으로한다. 현재기도염증이, T세포, B 세포, 호산구, 비만세포및대식세포의복합상호작용및사이토킨및케목킨을포함하는이들의분비매개체의상호작용을포함하는, 천식병리학의주요인자인것으로광범위하게수긍되고있다. 코르티코스테로이드는오늘날천식에대해가장중요한소염치료제이지만이의작용기작은비특이적이고특히어린환자집단에서안전성문제가존재한다. 따라서보다특이적이고표적화된치료제의개발이요구된다. 마우스에서 IL-13이, 호산구염증과는무관하게, AHR, 점액과분비및기도섬유증을포함하는천식의많은특징을모방하고있다는증거가증가하고있다 (Finotto et al., International Immunology (2005), 17(8), 993-1007; Padilla et al., Journal of Immunology (2005), 174(12), 8097-8105). IL-13은천식과연관된병리학적반응을유발하는데주요역할을가짐으로서관련되어있다. 폐에서 IL-13의효과를감소시키는항-IL-13 모노클로날항체치료제개발은신규천식치료제의개발을위해상당히전망있는흥미로운신규방법이다. 그러나, 상이한면역학적경로의기타매개체가또한천식병리에연루되어있고 IL- 13 뿐만아니라이들매개체를차단하는것이추가의치료학적이득들제공할수있다. 당해표적쌍은 IL-13, - 59 -
및종양괴사인자-α (TNF-α) 와같은프로-염증사이토킨을포함하지만이에제한되지않는다. TNF-α는천식에서염증반응을증폭시킬수있고질환중증도와관련될수있다 (McDonnell, et al., Progress in Respiratory Research (2001), 31(New Drugs for Asthma, Allergy and COPD), 247-250.). 이것은 IL-13 및 TNF-α 둘다의차단이특히, 심각한기도질환에서이로운효과를가질수있음을시사한다. 바람직한양태에서, 본발명의 DVD-Ig는표적 IL-13 및 TNFα에결합하고천식을치료하기위해사용된다. [0301] [0302] [0303] [0304] 염증및 AHR 둘다가평가될수있는 OVA 유도된천식마우스모델과같은동물모델은당업계에공지되어있고천식을치료하는다양한 DVD-Ig의능력을측정하는데사용될수있다. 천식을연구하기위한동물모델은문헌 [ 참조 : Coffman, et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1875-1879; Lloyd, et al., Advances in Immunology (2001), 77, 263-295; Boyce et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1869-1873; and Snibson, et al., Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology (2005), 35(2), 146-52] 에기재되어있다. 당해표적쌍의통상적인안전성평가뿐만아니라, 면역억제정도에대한특이적시험이요구될수있고최상의표적쌍을선별하는데도움이된다 ( 문헌참조 : Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 77 99-102; Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257). 상기된추론및효능및안정성에대한동일한평가모델을사용함을기초로, DVD-Ig 분자가결합할수있고천식을치료하는데유용한기타표적쌍을측정할수있다. 하나의양태에서, 당해표적은 IL-13과 IL-1베타 (IL- 1베타는또한천식에서염증반응에연루되어있다 ); IL-13과염증에관여하는사이토킨과케목킨, 예를들어 IL-13과 IL-9; IL-13과 IL-4; IL-13과 IL-5; IL-13과 IL-25; IL-13과 TARC; IL-13과 MDC; IL-13과 MIF; IL-13 과 TGF-b; IL-13과 LHR 효능제 ; IL-13과 CL25; IL-13과 SPRR2a; IL-13과 SPRR2b; 및 IL-13과 ADAM8을포함하지만이에제한되지않는다. 본발명은또한하기의그룹으로이루어진그룹으로부터선택되는천식에연루된하나이상의표적과결합할수있는 DVD-Ig를제공한다 : CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNA1, IFNB1, IFNG, 히스타민및히스타민수용체, IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, KITLG, PDGFB, IL2RA, IL4R, IL5RA, IL8RA, IL8RB, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24, CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNF, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR, 및키티나제. 3. 류마티스관절염전신성질환인류마티스관절염 (RA) 는관절활막에서의만성염증반응을특징으로하고연골의퇴화및관절인접골의부식과연관되어있다. TNF, 케목킨및성장인자를포함하는많은염증촉진사이토킨은환부관절에서발현된다. RA의마우스모델에항-TNF 항체또는 stnfr 융합단백질융합단백질의전신성투여는소염및관절보호성인것으로나타났다. RA 환자에서 TNF의활성이정맥내투여되는인플릭시마브에차단된임상적연구 (Harriman G, Harper LK, Schaible TF. 1999 Summary of clinical trials in rheumatoid arthritis using infliximab, an anti-tnfαlpha treatment. Ann Rheum Dis 58 Suppl 1:I61-4.) 에서, 키메라항-TNF 모노클로날항체 (mab) 는 TNF가 IL-6, IL-8, MCP-1 및 VEGF의생산, 면역및염증세포의관절로의보강, 혈관형성및매트릭스메탈로프로테이나제-1 및 3의혈액수준의감소를조절한다는증거를제공했다. 류마티스관절염에서염증경로의보다나은이해를통해류마티스관절염에연루된기타치료학적표적을동정하게되었다. 인터류킨-6 길항제, Chugai, Roche에의해개발된 IL-6 수용체항체 MRA( 문헌참조 : Nishimoto, Norihiro et al., Arthritis & Rheumatism (2004), 50(6), 1761-1769), CTLA4Ig (abatacept, Genovese Mc et al 2005 Abatacept for rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor alpha inhibition. N Engl J Med. 353:1114-23.), 및항-B 세포치료 (rituximab, Okamoto H, Kamatani N. 2004 Rituximab for rheumatoid arthritis. N Engl J Med. 351:1909) 와같은전망있는치료제가지난해에걸쳐무작위조절된시험에서이미시험되었다. 인터류킨-15( 치료학적항체 HuMax-IL_15, AMG714, 문헌참조 : Baslund, Bo et al., Arthritis & Rheumatism(2005), 52(9), 2686-2692), 인터류킨-17 및인터류킨-18을포함하는기타사이토킨이동정되었고동물모델에서이로운것으로나타났고이들제제의임상적시험이진행중에있다. 항-TNF와또다른매개체를병용하는이원특이적항체치료는임상적효능및 / 또는환자보호에큰잠재력을갖는다. 예를들어, TNF 및 VEGF 둘다를차단함으로써 RA의병생리학에연루된염증및혈관형성을잠재적으로박멸시킬수있다. TNF와 IL-18; TNF와 IL-12; TNF와 IL-23; TNF와 IL-1베타 ; TNF와 MIF; TNF와 IL-17; 및 TNF와 IL-15를포함하지만이 - 60 -
에제한되지않는 RA에연루된기타표적쌍을특이적 DVD Ig로차단시키는것이또한고려된다. 이들표적쌍에대한통상적인안정성평가뿐만아니라면역억제정도에대한특정시험이요구될수있고표적쌍을선별하는데도움이된다 ( 문헌참조 : Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 77 99-102; Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257). DVD Ig 분자가류마티스관절염치료를위해유용할것인지의여부는콜라겐유도된관절염마우스모델과같은임상전동물 RA 모델을사용하여평가할수있다. 기타유용한모델은또한당업계에널리공지되어있다 ( 문헌참조 : Brand DD., Comp Med. (2005) 55(2):114-22). 사람및마우스유사체에대한모항체의교차반응성을기준으로 ( 예를들어, 사람및마우스 TNF, 사람및마우스 IL-15 등에대한반응성 ), 마우스 CIA 모델에서입증연구는 " 일치된대용항체 " 유래된 DVD-Ig 분자로수행될수있고 ; 간략하게 2개 ( 또는그이상 ) 의마우스표적특이적항체를기초로하는 DVD-Ig는사람 DVD-Ig 작제에대해사용된모사람또는사람화된항체의특성 ( 유사친화성, 유사중화효능, 유사반감기등 ) 에가능한한정도로일치될수있다 [0305] [0306] [0307] [0308] [0309] 4. SLE SLE의면역병리학적특징은폴리클로날 B 세포가활성화되어글로불린과다혈증, 자가항체생산및면역복합체의형성이유도된다는것이다. 기본적인비정상적현상은 T 세포가, 일반화된 T 세포조절불능으로인해막아야될 B 세포클론을억제하지못한다는것이다. 또한, B 및 T-세포상호작용은, 제2 시그날을개시하는 CD40과 CD40L, B7과 CD28 및 CTLA-4와같은공동자극분자뿐만아니라여러사이토킨 ( 예를들어, IL-10) 에의해촉진된다. 이들상호작용은, 면역복합체및아폽토시스물질에대한식세포제거의손상과함께면역반응을존속시키고조직손상이유발된다. 하기의표적이 SLE에연루될수있고잠재적으로치료학적중재를위한 DVD-Ig 방법 (B 세포표적치료 ) 을위해잠재적으로사용될수있다 : CD-20, CD-22, CD-19, CD28, CD4, CD80, HLA-DRA, IL10, IL2, IL4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, BLR1, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, ICOSL, IGBP1, MS4A1, RGS1, SLA2, CD81, IFNB1, IL10, TNFRSF5, TNFRSF7, TNFSF5, AICDA, BLNK, GALNAC4S- 6ST, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, IL10, IL11, IL4, INHA, INHBA, KLF6, TNFRSF7, CD28, CD38, CD69, CD80, CD83, CD86, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRSF8, TNFSF7, CD24, CD37, CD40, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CR2, IL1R2, ITGA2, ITGA3, MS4A1, ST6GAL1, CD1C, CHST10, HLA-A, HLA-DRA, 및 NT5E.; 공동자극시그날 : CTLA4 또는 B7.1/B7.2; B 세포생존억제 : BlyS, BAFF; 보체불활성화 : C5; 사이토킨조절. 주요원리는임의의조직에서총생물학적반응이염증촉진또는소염사이토킨의국소적수준간에이의균형에따른결과인것이다 ( 문헌참조 : Sfikakis PP et al 2005 Curr Opin Rheumatol 17:550-7). SLE는혈청중에서 IL-4, IL-6, IL-10이상승하는것으로입증된 Th-2 유발질환인것으로간주된다. IL-4, IL-6, IL-10, IFN-α, 및 TNF-α로이루어진그룹으로부터선택되는하나이상의표적과결합할수있는 DVD Ig가또한고려된다. 상기논의된표적의조합은 SLE에대한치료학적효능을증진시킬것이고이것은다수의낭창임상전모델에서시험될수있다 ( 문헌참조 : Peng SL (2004) Methods Mol Med.;102:227-72). 사람에대한모항체및마우스유사체의교차반응성을기준으로 ( 예를들어, 사람및마우스 CD20, 사람및마우스인터페론알파등에대한반응성 ), 마우스낭창모델에서 " 일치된대용항체 " 유래된 DVD-Ig 분자를사용하여확인연구를수행할수있다. 간략하게 DVD-Ig 기반 2개 ( 이상 ) 의마우스표적특이적항체는사람 DVD-Ig 작제를위해사용되는모사람또는사라화된항체의특성 ( 유사한친화성, 유사한중화효능, 유사한반감기등 ) 을분석할수있을정도로일치할수있다 ). 5. 다발성경화증다발성경화증 (MS) 은병인이명백하게미지인복합사람자가면역형질환이다. 신경계전반에걸친미엘린염기성단백질 (MBP) 의면역학적파괴는다발성경화증의주요병리이다. MS는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에의한침투를포함하는복합병리질환이고중추신경계내반응질환이다. 사이토킨, 반응성질소종및동시자극인자분자의 CNS내발현은모두 MS에서기재되었다. 주로고려되는것은자가면역발병에기여하는면역학적기작이다. 특히, 항원발현, 사이토킨및백혈구상호작용및조절 T-세포는 Th1 및 Th2 세포와같은기타 T-세포의균형 / 조절을도와주고치료학적표적동정을위해중요한영역이다. IL-12는염증촉진사이토킨이고 APC에의해생성되어 Th1 이펙터세포의분화를촉진한다. IL-12는 MS를앓는환자및 EAE-에걸린동물의발생병변에서생성된다. 이전에, IL-12 경로에서의간섭은설치류에서 EAE를예방하고항-IL-12 mab를사용한 IL-12p40의생체내중화는통상의마모셋에서미엘린유도된 EAE 모델에서이로운효과를갖는다는것을보여주었다. - 61 -
[0310] [0311] [0312] [0313] [0314] [0315] [0316] TWEAK는 TNF 계열의구성원이고, 염증촉진, 증식또는아폽토시스효과가세포유형에의존하는중추신경계 (CNS) 내에서항상성으로발현된다. 이의수용체인 Fn14는내피세포, 반응성성상세포및뉴런에의해 CNS에서발현된다. TWEAK 및 Fn14 mrna 발현은실험적자가면역뇌척수염 (EAE) 동안에척수에서증가된다. C57BL/6 마우스에서미엘린올리고수지상세포당단백질 (MOG) 유도된 EAA에서항 -TWEAK 항체처리는마우스가적응 (priming) 기간후처리되는경우질환중증도및백혈구침투를감소시킨다. 본발명의한측면은 IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF, CD45RB, CD200, IFN감마, GM-CSF, FGF, C5, CD52, 및 CCR2로이루어진그룹으로부터선택되는하나이상, 예를들어, 2개의표적과결합할수있는 DVD Ig 분자에관한것이다. 하나의양태는 MS의치료에이로운치료제로서이원-특이적항-IL-12/TWEAK DVD Ig를포함한다. MS를치료하기위한 DVD 분자의유용성을평가하기위한여러동물모델은당업계에공지되어있다 ( 문헌참조 : Steinman L, et al., (2005) Trends Immunol. 26(11):565-71; Lublin FD., et al., (1985) Springer Semin Immunopathol.8(3):197-208; Genain CP, et al., (1997) J Mol Med. 75(3):187-97; Tuohy VK, et al., (1999) J Exp Med. 189(7):1033-42; Owens T, et al., (1995) Neurol Clin.13(1):51-73; and 't Hart BA, et al., (2005) J Immunol 175(7):4761-8). 사람및동물종유사체에대한모항체의교차반응성 ( 예를들어, 사람및마우스 IL-12, 사람및마우스 TWEAK 등에대한반응성 ) 을기준으로 " 일치된대용항체 " 유래 DVD-Ig 분자를사용하여마우스 EAE 모델에서확인연구를수행할수있다. 간략하게마우스표적특이적항체에대한것을기초로하는 DVD-Ig는사람 DVD-Ig 작제를위해사용되는모사람또는사람화된항체의특성 ( 유사한친화성, 유사한중화효능, 유사한반감기등 ) 을분석할수있는정도일치될수있다. 동일한개념을기타비-설치류종의동물모델에적용하고, 여기서, " 일치된대용항체 " 유래 DVD-Ig는예상된약리학및가능한안정성연구를위해선별된다. 이들표적쌍의통상적인안전성평가뿐만아니라면역억제정도에대한특정시험이요구될수있고최상의표적쌍을선택하는데도움이된다 ( 문헌참조 : Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 77 99-102; Jones R. 2000 Rovelizumab (ICOS Corp). IDrugs.3(4):442-6). 그러나, MS는면역질환일뿐만아니라, 매우중요한신경퇴행성성분을갖는다. MS에있어서의질환의진행은액손의누적손실및손상으로인한것이고, 환자의최종질환스코어는이들신경퇴행성과정에의해결정된다 (Compston A. & Coles A. (2008) Lancet 372: 1502-1517; Trapp BD. & Nave KA. (2008) Annu.Rev. Neuroscience 31:247-269). 몇몇의메커니즘으로 MS에서의액손손상을설명할수있다. 칼슘-매개된신경독소와관련된신경전달물질글루타메이트의과도한방출, 산화질소방출및후속적인액손손상, 신경영양성지지의손실, 반발성또는 RGM A, NOGO A, 세마포린, 에프린과같은액손성장억제분자의대량축적은액손- 유도된신경퇴행및성공적인액손재생의손실에기여할수있다. 단일 DVD Ig 분자에 IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF, CD45RB, CD200, IFN 감마, GM-CSF, FGF, C5, CD52, 및 CCR2 와같은전염증성사이토킨에대해유도되는중화활성을갖는 RGM A, NOGO A, 세마포린, 에프린과같은성분에대해유도되는중화활성을표적화하는것은염증및신경재생에대한동시집중을가능하게하고, 이는현재치료학적 MS 원칙중어느것에의해서도달성되지않은목표이다. 신경재생을자극하는것은 MS에서관찰되는대량의액손성신경퇴행에의해야기되는기능적손상을보상할수있고, 이는손실된뇌기능의회복을가능하게한다. 6. 패혈증패혈증의병생리학은그람음성유기체의외막성분 ( 리포폴리사카라이드 [LPS], 지질 A, 내독소 ) 및그람양성유기체의외막성분 ( 리포테이코산, 펩티도글리캔 ) 에의해개시된다. 이들외막성분은단핵구의표면상의 CD14 수용체와결합할수있다. 이어서최근에보고된톨 (toll) 형수용체에의해, 시그날은세포로전달되어결국염증촉진사이토킨종양괴사인자-알파 (TNF-알파) 및인터류킨-1(IL-1) 의생성을유발한다. 압도적인염증및면역반응은패혈성쇼크의필수적특징이고조직손상, 다발성기관부전증및패혈증유도된사멸의병리에중추역할을한다. 사이토킨, 특히, 종양괴사인자 (TNF) 및인터류킨 (IL)-1은패혈성쇼크의중요한매개체인것으로밝혀졌다. 이들사이토킨은조직에대한직접적인독성효과를갖고이들은또한포스포리파제 A2를활성화시킨다. 이들및기타효과는혈소판활성화인자의농도를증가시키고산화질소신타제활성을촉진시키고호중구에의한조직침투를촉진시키고호중구활성을촉진시킨다. 패혈증및패혈성쇼크의치료는임상적난제로서남아있고염증반응에겨냥된생물학적반응개질제 ( 즉, 항- TNF, 항-MIF) 를사용한최근기대되는시험이단지약간의임상적이득을나타내었다. 최근에, 관심이면역억 - 62 -
제의수반된기간을역전시키것을목표로하는치료쪽으로전환되었다. 실험동물및중증환자에대한연구는림프성기관및몇몇유조직의증가된아폽토시스가당해면역억제, 아네르기및기관계기능부전에기여하는것임을입증하였다. 패혈증증후군동안에, 림프구아폽토시스는 IL-12의부재또는글루코코르티코이드, 그랜자임또는소위 ' 사멸 ' 사이토킨, 종양괴사인자알파또는 Fas 리간드의방출에의해유발될수있다. 아폽토시스는시토졸및 / 또는미토콘드리아카스파제의자가활성화를통해진행하고, 당해카스파제는 Bcl-2 계열의아폽토시스촉진및항-아폽토시스구성원에의해영향받을수있다. 실험적동물에서, 아폽토시스의억제제를사용한치료로림프구세포아폽토시스를방지할수있을뿐만아니라이것은또한당해결과를개선시킬수있다. 항-아폽토시스제제를사용한임상적시도는대부분이들의투여및조직표적화와연관된기술적어려움으로인해아득하지만림프구아폽토시스의억제는패혈성환자에대한매력적인치료학적표적을나타낸다. 또한, 염증매개체및아폽토시스매개체를표적화하는이원특이적제제는부가이득을가질수있다. 본발명의한측면은하기의표적으로이루어진그룹으로부터선택되는, 패혈증에연루된하나이상의표적, 바람직하게는 2개의표적과결합할수있는 DVD Ig에관한것이다 : TNF, IL-1, MIF, IL-6, IL-8, IL-18, IL-12, IL-23, FasL, LPS, 톨형수용체, TLR-4, 조직인자, MIP-2, ADORA2A, CASP1, CASP4, IL-10, IL-1B, NFKB1, PROC, TNFRSF1A, CSF3, CCR3, IL1RN, MIF, NFKB1, PTAFR, TLR2, TLR4, GPR44, HMOX1, 미드킨, IRAK1, NFKB2, SERPINA1, SERPINE1, 및 TREM1. 패혈증에대한당해 DVD Ig의효능은당업계에공지된임상전동물모델에서평가될수있다 ( 문헌참조 : Buras JA, et al.,(2005) Nat Rev Drug Discov. 4(10):854-65 and Calandra T, et al., (2000) Nat Med. 6(2):164-70). [0317] [0318] [0319] [0320] 7. 신경학적장애 7.1. 신경퇴행성질환신경퇴행성질환은일반적으로연령에의존하는만성이거나급성 ( 예를들어, 졸중, 외상후뇌손상, 척수손상등 ) 이다. 이들은신경기능의점진적인상실 ( 뉴런세포사, 액손손실, 신경이영양증, 탈수초성 ), 운동성상실및기억상실을특징으로한다. 이들은뉴런기능의점진적인상실 ( 뉴런세포사멸, 탈수초화 ), 운동성상실및기억상실을특징으로한다. 만성신경퇴행성질환 ( 예를들어, 알츠하이머질환 ) 을뒷받침하는기작에대한새로운지식은복합적병인을보여주고다양한인자, 예를들어, 혈당상태, 아밀로이드생산및다량체화, 수용체 RAGE(AGE에대한수용체 ) 에결합하는진전된당화최종생성물 (AGE) 의축적, 증가된뇌산화스트레스, 감소된뇌혈류, 염증성사이토킨및케목킨을포함하는신경염증, 뉴런기능부전및소교세포활성화가이들의발병및진행에기여하는것으로인지되었다. 따라서, 이들만성신경퇴행성질환은다발성세포유형및매개체간에복잡한상호작용을나타낸다. 당해질환에대한치료전략은제한되고대부분비특이적소염제 ( 예를들어, 코르티코스테로이드, COX 억제제 ) 로염증과정을차단하거나당해제제로뉴런상실및 / 또는시냅스기능을차단하는것으로구성된다. 이들치료는질환진행을중지시키는데실패한다. 최근연구는가용성 A-b 펩타이드 (A-b 올리고머형태를포함함 ) 에대한항체와같은보다표적화된치료가질환진행의중지를도와줄수있을뿐만아니라기억의유지및다른인식기능들도도와줄수있음을시사한다. 이들예비관찰은하나이상의질환매개체 ( 예를들어, A-b, 및 TNF와같은염증촉진사이토킨 ) 를표적화하는특정치료가단일질환기작 ( 예를들어, 가용성 A-b 단독 ) 을표적화하여관찰되는것보다만성신경퇴행성질환에대해보다우수한치료학적효능을제공할수있음을시사한다 ( 문헌참조 : C.E. Shepherd, et al, Neurobiol Aging. 2005 Oct 24; Nelson RB., Curr Pharm Des. 2005;11:3335; William L. Klein.; Neurochem Int. 2002 ;41:345; Michelle C Janelsins, et al., J Neuroinflammation. 2005 ;2:23; Soloman B., Curr Alzheimer Res. 2004;1:149; Igor Klyubin, et al., Nat Med. 2005;11:556-61; Arancio O, et al., EMBO Journal (2004) 1-10; Bornemann KD, et al., Am J Pathol. 2001;158:63; Deane R, et al., Nat Med. 2003;9:907-13; and Eliezer Masliah, et al., Neuron. 2005;46:857). 본발명의 DVD-Ig 분자는알츠하이머와같은만성신경퇴행성질환에연루된하나이상의표적에결합할수있다. 당해표적은 AD 병리학에연루된임의의매개체, 가용성또는세포표면, 예를들어, AGE(S100A, 암포테린 ), 염증촉진사이토킨 ( 예를들어, IL-1), 케목킨 ( 예를들어, MCP 1), 신경재생을억제하는분자 ( 예를들어, Nogo, RGM A), 신경성장을증진시키는분자 ( 뉴로트로핀 ) 및혈뇌장벽에서수송을매개할수있는분자 ( 예를들어, 트랜스페린수용체, 인슐린수용체또는 RAGE) 를포함하지만이에제한되지않는다. DVD-Ig 분자의효능은아밀로이드전구체단백질또는 RAGE를과발현하고알츠하이머질환유사증상을나타내는유전자전이마우스와같은임상전동물모델에서유효할수있다. 또한, DVD-Ig 분자는작제되고동물모델에서효능에대해시험될수있고사람환자에서시험하기위한최상의치료학적 DVD-Ig 가선택될수있다. DVD-Ig 분자는또한파킨슨질환과같은기타신경퇴행성질환의치료를위해사용될수있다. 알파-시누클레인은파킨슨병 - 63 -
리학에관여한다. 알파 - 시누클레인및염증매개체 ( 예를들어, TNF, IL-1, MCP-1) 를표적화할수있는 DVD- Ig 는파킨슨질환에대해효과적인치료임을입증할수있고본발명에고려된다. [0321] [0322] [0323] [0324] 또한, 알파-시누클레인및 RGM A를표적화할수있는 DVD-Ig는파킨슨질환환자의흑질에있어서의병리학적진행을중단할수있을뿐만아니라, 손상된신경돌기의재생성성장을초래할수도있고, 그이유는최근 RGM A가 PD 환자의상기영역에서강력히상향조절되는것으로나타났기때문이다 (Bosser K, et al. (2009) Brain Pathol. 19: 91-107). 7.2 신경소생및척수손상병리학적기작의지식이증가했음에도불구하고척수손상 (SCI) 은여전히황무지인상태이고고도의의학적요구를특징으로하는의학적징후를나타낸다. 대부분의척수는타박상이거나압착손상이고 1차손상은일반적으로 2차손상기작 ( 염증매개체, 예를들어, 사이토킨및케목킨 ) 에따른것이고이것은초기손상을악화시키고환부를, 때때로 10배이상으로증대시킨다. SCI에서이들 1차및 2차기작은기타수단에의해유발되는뇌손상, 예를들어, 트라우마및뇌졸중의기작과매우유사하다. 어떠한만족할만한치료가존재하지않고메틸프레드니솔론 (MP) 의고투여량의일시주사가손상후 8시간의좁은시간범위에서만사용되는치료이다. 그러나, 당해치료는단지임의의상당한기능적회복없이 2차손상을예방하기위해의도된다. 명백한효능의부재및후속감염및중증조직학적근육변형을갖는면역억제와같이중증역효과때문에가혹하게비판받고있다. 내인성소행잠재력을자극하는어떠한다른약물, 생물학적또는소분자도승인되지않았지만최근해에 SCI의동물모델에서전망있는치료원리및약물후보가효능을나타내었고, 가장유망한임상학적데이터가최근에발표되었다. 사람 SCI에서기능적회복의부재는대부분, 환부, 상처조직, 미엘린에서및손상관련세포상에서신경돌기성장을억제하는인자에의해유발된다. 당해인자는미엘린연관단백질 NogoA, OMgp 및 MAG, RGM A, 상처연관 CSPG( 콘드로이틴설페이트프로테오글리캔 ) 및반응성성상세포에대한억제인자 ( 몇몇세마포린및에프린 ) 이다. 그러나, 환부에는성장억제인자뿐만아니라뉴로트로핀, 라미닌, L1 및기타와같은신경돌기성장자극인자가존재한다. 신경돌기성장억제및성장촉진분자의전체적효과는 NogoA 또는 RGM A와같은단일인자의차단이, 억제영향의감소가성장억제로부터성장촉진으로의균형을전환시킬수있기때문에, 설치류 SCI 모델에서기능적으로상당히회복시킴을설명할수있다. 그러나, 단일신경돌기과증식억제분자를차단함으로써관찰되는회복은완전하지않다. 보다신속하고보다명백한회복을달성하기위해, Nogo 및 RGM A와같은 2개의신경돌기과증식억제분자를차단하거나신경돌기과증식억제분작를차단하고신경돌기과증식증진분자 ( 예를들어 Nogo 및뉴로트로핀 ) 의기능을증진시키거나신경돌기과증식억제분자 (Nogo 및염증촉진분자, 예를들어, TNF) 를차단하는것이바람직할수있다 ( 문헌참조 : McGee AW, et al., Trends Neurosci. 2003;26:193; Marco Domeniconi, et al., J Neurol Sci. 2005;233:43; Milan Makwana1, et al., FEBS J. 2005;272:2628; Barry J. Dickson, Science. 2002;298:1959; Felicia Yu Hsuan Teng, et al., J Neurosci Res. 2005;79:273; Tara Karnezis, et al., Nature Neuroscience 2004; 7, 736; Gang Xu, et al., J. Neurochem. 2004; 91; 1018). 한측면에서, NgR과 RGM A; NogoA와 RGM A; MAG과 RGM A; OMGp와 RGM A; RGM A와 RGM B; RGM A와세마포린 3A; RGM A와세마포린 4; CSPG와 RGM A; 아그레칸, 미드킨, 뉴로칸, 베르시칸, 포스파칸, Te38 및 TNF-α; Aβ 원형체특이적항체와같은표적쌍과결합할수있는 DVD-Ig가수지상세포 & 액손발아를촉진하는항체와배합되어제공된다. 수지상세포병리및액손손상, 또는신경이영양증은 AD에대한매우조기징후이고 NOGO A가수지상세포성장을제한시키는것과미엘린과관련되고상기언급된다른분자, 예를들면 RGM A, MAG, OMGp가액손재성장을손상시키는것으로공지되어있다. 당업자는당해유형의 ab를 SCI-후보물 ( 미엘린-단백질 ) Ab와배합할수있다. 기타 DVD-Ig 표적은 NgR-p75, NgR-Troy, NgR-Nogo66 (Nogo), NgR-Lingo, Lingo-Troy, Lingop75, MAG 또는 Omgp의조합체를포함할수있다. 추가로, 표적은또한신경돌기의억제에연루된임의의매개체, 가용성또는세포표면, 예를들어, Nogo, OMGp, MAG, RGM A, 세마포린, 에프린, 가용성 A-b, 염증촉진사이토킨 ( 예를들어, IL-1), 케목킨 ( 예를들어, MIP 1a), 신경소행을억제하는분자를포함할수있다. 항- Nogo/ 항-RGM A 또는유사한 DVD-Ig 분자의효능은척수손상의임상전동물모델에서유효할수있다. 또한, 이들 DVD-Ig 분자가작제될수있고동물모델에서효능에대해시험될수있고최상의치료학적 DVD-Ig가사람환자에서시험하기위해선택될수있다. 또한, 단일수용체, 예를들어, 3개의리간드 Nogo, Ompg 및 MAG와결합하는 Nogo 수용체및 A-b 및 S100 A와결합하는 RAGE상에 2개의별도의결합부위를표적화하는 DVD-Ig 분자가작제될수있다. 추가로, 신경돌기과증식억제제, 예를들어, nogo 및 nogo 수용체는또한다발성경화증과같은면역학적질환에서신경소생을방지하는역할을한다. nogo-nogo 수용체상호작용의억제는다발성경화증의동물모델에서회복을증진시키는것으로나타났다. 따라서, 하나의면역매개체, 예를들어, IL- - 64 -
12 와같은사이토킨의기능및신경돌기과증식억제제분자, 예를들어, nogo 또는 RGM 의기능을을차단할수 있는 DVD-Ig 분자는면역또는신경돌기억제제분자만을차단하는것보다신속하고보다큰효능을제공할수 있다. [0325] [0326] [0327] [0328] [0329] 일반적으로, 항체는효율적이고적절한방식으로혈뇌장벽 (BBB) 을통과하지못한다. 그러나, 특정신경학적질환에서, 예를들어, 졸중, 외상뇌손상, 다발성경화증등에서 BBB는손상될수있고 DVD-Ig 및항체의뇌로의침투를증가시킬수있다. 예를들어 BBB 누출이발생하지않은다른신경학적병태에서는예를들어, BBB의혈관내피에서글루코스및아미노산캐리어및수용체매개된트랜스사이토시스매개세포구조물 / 수용체를포함하는캐리어매개된수송체의표적화를사용함에따라 DVD-Ig의 BBB를통과하는수송을가능하게할수있다. 당해수송을가능하게하는 BBB에서의구조물은인슐린수용체, 트랜스페린수용체, LRP 및 RAGE를포함하지만이에제한되지않는다. 또한, 전략은저분자량의약물, 나노입자및핵산을포함하는효능있는약물을 CNS로수송하기위한셔틀로서 DVD-Ig를사용할수있게한다 ( 문헌참조 : Coloma MJ, et al. (2000) Pharm Res. 17(3):266-74; Boado RJ, et al. (2007) Bioconjug. Chem. 18(2):447-55). 신경질환을치료하기위해하기표적의쌍에결합할수있는 DVD-Ig가고려된다 : NGF와 PGE2; NGF와 TNF-α; NGF와 IL-1β; 및 NGF와 IL-6R( 실시예 2.1 내지 2.14 참조 ). 8. 종양학적장애모노클로날항체치료는암에대한중요한치료학적방식으로서나타났다 (von Mehren M, et al. (2003) Annu. Rev. Med.54:343-69). 항체는아폽토시스, 재지시된세포독성, 리간드-수용체상호작용의간섭을유도하거나신생물표현형에중요한단백질의발현을차단함에의해항종양효과를발휘할수있다. 또한, 항체는종양미세환경의성분을표적화하여종양연관혈관형성과같은중요한구조물을교란시킬수있다. 항체는또한리간드가성장인자인수용체, 예를들어, 상피성장인자수용체를표적화할수있다. 따라서, 당해항체는표적화된종양세포에결합하여세포성장을자극하는중성리간드를억제한다. 또한, 항체는항-이디오타입네트워크. 보체매개세포독성또는항체의존성세포성세포독성 (ADCC) 를유도할수있다. 2개의별도의종양매개체를표적화하는이원-특이적항체의사용은단일특이적치료에비하여추가의이득을제공한다. 또다른양태에서, 본발명의 DVD는다음과결합할수있다 : VEGF 및포스파티딜세린 ; VEGF 및 ErbB3; VEGF 및 PLGF; VEGF 및 ROBO4; VEGF 및 BSG2; VEGF 및 CDCPl ; VEGF 및 ANPEP; VEGF 및 c-met; HER-2 및 ERB3; HER-2 및 BSG2; HER-2 및 CDCPl ; HER-2 및 ANPEP; EGFR 및 CD64; EGFR 및 BSG2; EGFR 및 CDCPl ; EGFR 및 ANPEP; IGFlR 및 PDGFR; IGFlR 및 VEGF; IGFlR 및 CD20; CD20 및 CD74; CD20 및 CD30; CD20 및 DR4; CD20 및 VEGFR2; CD20 및 CD52; CD20 및 CD4; HGF 및 c-met; HGF 및 NRPl; HGF 및포스파티딜세린 ; ErbB3 및 lgfir; ErbB3 및 IGF 1,2; c-met 및 Her-2; c-met 및 NRPl ; c-met 및 IGFlR; IGF 1,2 및 PDGFR; IGF 1,2 및 CD20; IGF 1,2 및 IGFlR; IGF2 및 EGFR; IGF2 및 HER2; IGF2 및 CD20; IGF2 및 VEGF; IGF2 및 IGFlR; IGFl 및 IGF2; PDGFRa 및 VEGFR2; PDGFRa 및 PLGF; PDGFRa 및 VEGF; PDGFRa 및 c-met; PDGFRa 및 EGFR; PDGFRb 및 VEGFR2; PDGFRb 및 c- Met; PDGFRb 및 EGFR; RON 및 c-met; RON 및 MTSPl ; RON 및 MSP; RON 및 CDCPl ; VGFRl 및 PLGF; VGFRl 및 RON; VGFRl 및 EGFR; VEGFR2 및 PLGF; VEGFR2 및 NRPl ; VEGFR2 및 RON; VEGFR2 및 DLL4; VEGFR2 및 EGFR; VEGFR2 및 ROBO4; VEGFR2 및 CD55; LPA 및 SlP; EPHB2 및 RON; CTLA4 및 VEGF; CD3 및 EPCAM; CD40 및 IL6; CD40 및 IGF; CD40 및 CD56; CD40 및 CD70; CD40 및 VEGFRl; CD40 및 DR5; CD40 및 DR4; CD40 및 APRIL; CD40 및 BCMA; CD40 및 RANKL; CD28 및 MAPG; CD80 및 CD40; CD80 및 CD30; CD80 및 CD33; CD80 및 CD74; CD80 및 CD2; CD80 및 CD3; CD80 및 CD19; CD80 및 CD4; CD80 및 CD52; CD80 및 VEGF; CD80 및 DR5; CD80 및 VEGFR2; CD22 및 CD20; CD22 및 CD80; CD22 및 CD40; CD22 및 CD23; CD22 및 CD33; CD22 및 CD74; CD22 및 CD19; CD22 및 DR5; CD22 및 DR4; CD22 및 VEGF; CD22 및 CD52; CD30 및 CD20; CD30 및 CD22; CD30 및 CD23; CD30 및 CD40; CD30 및 VEGF; CD30 및 CD74; CD30 및 CD19; CD30 및 DR5; CD30 및 DR4; CD30 및 VEGFR2; CD30 및 CD52; CD30 및 CD4; CD138 및 RANKL; CD33 및 FTL3; CD33 및 VEGF; CD33 및 VEGFR2; CD33 및 CD44; CD33 및 DR4; CD33 및 DR5; DR4 및 CD137; DR4 및 IGF1,2; DR4 및 IGFlR; DR4 및 DR5; DR5 및 CD40; DR5 및 CD137; DR5 및 CD20; DR5 및 EGFR; DR5 및 IGF1,2; DR5 및 IGFR, DR5 및 HER-2, 및 EGFR 및 DLL4. 기타표적조합은 EGF/erb-2/erb-3 계열의하나이상의구성원을포함한다. DVD-Ig가결합할수있는종양약적질환에관여하는기타표적 ( 하나이상 ) 은다음으로이루어진그룹으로부터선택된것들을포함하지만이에제한되지않는다 : CD52, CD20, CD19, CD3, CD4, CD8, BMP6, IL12A, ILIA, ILlB, IL2, IL24, INHA, TNF, TNFSFlO, BMP6, EGF, FGFl, FGFlO, FGFl1, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GRP, IGFl, IGF2, IL 12A, ILIA, ILlB, IL2, INHA, TGFA, TGFBl, TGFB2, TGFB3, VEGF, CDK2, FGFlO, FGFl8, FGF2, FGF4, FGF7, IGFlR, IL2, BCL2, CD164, CDKNlA, CDKNlB, - 65 -
CDKNlC, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, GNRHl, IGFBP6, ILIA, ILlB, ODZl, PAWR, PLG, TGFBlIl, AR, BRCAl, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, E2F1, EGFR, ENOl, ERBB2, ESRl, ESR2, IGFBP3, IGFBP6, IL2, INSL4, MYC, NOX5, NR6A1, PAP, PCNA, PRKCQ, PRKDl, PRL, TP53, FGF22, FGF23, FGF9, IGFBP3, IL2, INHA, KLK6, TP53, CHGB, GNRHl, IGFl, IGF2, INHA, INSL3, INSL4, PRL, KLK6, SHBG, NRlDl, NR1H3, NR1I3, NR2F6, NR4A3, ESRl, ESR2, NROBl, NR0B2, NR1D2, NR1H2, NR1H4, NR1I2, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR5A1, NR5A2, NR6A1, PGR, RARB, FGFl, FGF2, FGF6, KLK3, KRTl, APOCl, BRCAl, CHGA, CHGB, CLU, COLlAl, COL6A1, EGF, ERBB2, ERK8, FGFl, FGFlO, FGF11, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GNRHl, IGFl, IGF2, IGFBP3, IGFBP6, IL12A, IL1A, ILlB, IL2, IL24, INHA, INSL3, INSL4, KLKlO, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, MMP2, MMP9, MSMB, NTN4, ODZl, PAP, PLAU, PRL, PSAP, SERPINA3, SHBG, TGFA, TIMP3, CD44, CDHl, CDHlO, CDH19, CDH20, CDH7, CDH9, CDHl, CDHlO, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH7, CDH8, CDH9, ROBO2, CD44, ILK, ITGAl, APC, CD164, COL6A1, MTSSl, PAP, TGFBlIl, AGR2, AIGl, AKAPl, AKAP2, CANTl, CAV1, CDH12, CLDN3, CLN3, CYB5, CYCl, DAB2IP, DES, DNCLl, ELAC2, ENO2, ENO3, FASN, FLJ12584, FLJ25530, GAGEBl, GAGECl, GGTl, GSTPl, HIPl, HUMCYT2A, IL29, K6HF, KAIl, KRT2A, MIBl, PARTl, PATE, PCA3, PIAS2, PIK3CG, PPID, PRl, PSCA, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, STEAP, STEAP2, TPMl, TPM2, TRPC6, ANGPTl, ANGPT2, ANPEP, ECGFl, EREG, FGFl, FGF2, FIGF, FLTl, JAGl, KDR, LAMA5, NRPl, NRP2, PGF, PLXDCl, STABl, VEGF, VEGFC, ANGPTL3, BAIl, COL4A3, IL8, LAMA5, NRPl, NRP2, STABl, ANGPTL4, PECAMl, PF4, PROK2, SERPINFl, TNFAIP2, CCL11, CCL2, CXCLl, CXCLlO, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, IFNAl, IFNBl, IFNG, ILlB, IL6, MDK, EDGl, EFNAl, EFNA3, EFNB2, EGF, EPHB4, FGFR3, HGF, IGFl, ITGB3, PDGFA, TEK, TGFA, TGFBl, TGFB2, TGFBRl, CCL2, CDH5, COLl 8Al, EDGl, ENG, ITGAV, ITGB3, THBSl, THBS2, BAD, BAGl, BCL2, CCNAl, CCNA2, CCNDl, CCNEl, CCNE2, CDHl (E-캐드헤린), CDKNlB (p27kipl), CDKN2A (pl6ink4a), COL6A1, CTNNBl (b-카테닌), CTSB ( 카뎁신 B), ERBB2 (Her-2), ESRl, ESR2, F3 (TF), FOSLl (FRA-I), GATA3, GSN ( 겔솔린 ), IGFBP2, IL2RA, IL6, IL6R, IL6ST ( 당단백질 130), ITGA6 (a6 인테그랄 ), JUN, KLK5, KRT19, MAP2K7 (c-jun), MKI67 (Ki- 67), NGFB (NGF), NGFR, NMEl (NM23A), PGR, PLAU (upa), PTEN, SERPINB5 ( 마스핀 ), SERPINEl (PAI-I), TGFA, THBSl ( 트롬보스폰딘-1), TIE (Tie-1), TNFRSF6 (Fas), TNFSF6 (FasL), TOP2A ( 토포이소머라제 Iia), TP53, AZGPl (zinc-a-당단백질), BPAGl ( 플렉틴 ), CDKNlA (p21wapl/cipl), CLDN7 ( 클라우딘-7), CLU ( 클루스테린 ), ERBB2 (Her-2), FGFl, FLRTl ( 피브로넥틴 ), GABRP (GABAa), GNASl, ID2, ITGA6 (a6 인테그린 ), ITGB4 (b 4 인테그린 ), KLF5 (GC Box BP), KRTl 9 ( 케라틴 19), KRTHB6 ( 모발특이적 II형케라틴 ), MACMARCKS, MT3 ( 메탈로티오넥틴-III), MUCl ( 뮤신 ), PTGS2 (COX-2), RAC2 (p21rac2), S100A2, SCGB1D2 ( 리포필린 B), SCGB2A1 ( 맘마글로빈 2), SCGB2A2 ( 맘마글로빈 1), SPRRlB (Sprl), THBSl, THBS2, THBS4, 및 TNFAIP2 (B94), RON, c-met, CD64, DLL4, PLGF, CTLA4, 포스파티딜세린, ROBO4, CD80, CD22, CD40, CD23, CD28, CD80, CD55, CD38, CD70, CD74, CD30, CD138, CD56, CD33, CD2, CD137, DR4, DR5, RANKL, VEGFR2, PDGFR, VEGFRl, MTSPl, MSP, EPHB2, EPHAl, EPHA2, EpCAM, PGE2, NKG2D, LPA, SIP, APRIL, BCMA, MAPG, FLT3, PDGFR 알파, PDGFR 베타, RORl, PSMA, PSCA, SCDl, 및 CD59. [0330] IV. 약제학적조성물 [0331] [0332] 또한, 본발명은본발명의결합단백질과약제학적으로허용되는담체를포함하는약제학적조성물을제공한다. 본발명의결합단백질을포함하는약제학적조성물은장애를진단, 검출또는모니터링하거나장애또는이의하나이상의증상을예방, 치료, 처리또는완화시키고 / 시키거나연구에사용하기위한것이다. 특정양태에서, 조성물은본발명의하나이상의결합단백질을포함한다. 또다른양태에서, 약제학적조성물은본발명의하나이상의결합단백질, 및본발명의결합단백질이외에장애를치료하기위한하나이상의예방제또는치료제를포함한다. 하나의양태에서, 예방제또는치료제는장애또는이의하나이상의증상을예방, 치료, 처리또는완화시키는데유용한것으로공지되거나이에사용되었거나현재사용중인것들이다. 이들양태에따라, 당해조성물은담체, 희석제또는부형제를추가로포함할수있다. 본발명의결합단백질은피검체에투여하기에적합한약제학적조성물에혼입될수있다. 일반적으로, 약제학적조성물은본발명의결합단백질과약제학적으로허용되는담체를포함한다. 본명세서에사용된바와같은 " 약제학적으로허용되는담체 " 란용어에는생리학적으로화합성인임의의모든용매, 분산매질, 피복, 항균제및항진균제, 등장제및흡수지연제등이포함된다. 약제학적으로허용되는담체의예에는물, 식염수, 인산염완충식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올등중의하나이상또는이의배합물이포함된다. 몇몇양태에서, 조성물에당과같은등장제, 만니톨, 소르비톨과같은폴리알콜또는염화나트륨이포함되는것이바람직하다. 약제학적으로허용되는담체는추가로항체또는항체일부의유효수명이나효과를증강시키는습윤화제또는 - 66 -
유화제, 방부제또는완충액과같은보조물질을소량포함할수도있다. [0333] [0334] [0335] [0336] [0337] 다양한전달시스템이공지되어있고장애또는이의하나이상의증상을예방하거나처리하거나치료하거나완화시키는데유용한본발명의하나이상의항체또는본발명의조합된하나이상의항체및예방제또는치료제를투여하는데사용될수있고, 리포좀내캅셀화제, 미세입자, 미세캅셀제, 항체또는항체단편을발현할수있는재조합세포, 수용체매개된세포내이입 [Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)], 레트로바이러스또는기타벡터등의일부로서핵산의작제를예로들수있다. 본발명의예방제또는치료제를투여하는방법은비경구투여 ( 예를들어, 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내및피하 ), 뇌척수경막외투여, 종양내투여및점막투여 ( 예를들어, 비내및경구경로 ) 를포함하지만이에제한되지않는다. 또한, 흡입기또는분무기및분무제를갖는제형을사용하는폐투여가사용될수있다. 예를들면, U.S. Pat. Nos. 6, 019,968, 5,985, 320, 5,985,309, 5,934, 272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290, 540, and 4,880,078; and PCT Publication Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, 및 WO 99/66903을참조하고, 이들은각각그전체가본원에참조로서인용된다. 하나의양태에서, 본발명의결합단백질, 병용치료제또는본발명의조성물은 Alkermes AIR 폐약물전달기술 (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.) 을사용하여투여된다. 특정양태에서, 본발명의예방또는치료제는근육내, 정맥내, 종양내, 경구적으로, 비내, 폐또는피하로투여된다. 예방제또는치료제는임의의간편한경로, 예를들어, 주입또는일시주사, 상피또는점막내층 ( 예를들어, 경구점막, 직장및장내점막등 ) 을통한흡수에의해투여될수있고기타생물학적활성제와함께투여될수있다. 투여는전신성또는국소적일수있다. 하나의양태에서, 시험관내종양세포로의항체커플링된탄소나노튜브 (CNT) 의특이적결합에이어서근적외선 (NIR) 광을사용한이들의고도로특이적인절제는종양세포를표적화하는데사용될수있다. 예를들어, 비오티오닐화된극성지질은 1개또는 2개의상이한하나이상의종양항원 ( 예를들어, CD22) 에대해지시된뉴트럴라이트아비딘-유도체화된 DVD-Ig에부착된안정한, 생적합성, 비세포독성 CNT 분산제를제조하기위해사용될수있다 ( 문헌참조 : Chakravarty, P. et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:8697-8702). 특정양태에서, 치료를필요로하는영역에본발명의예방제또는치료제를국소적으로투여하는것이요구될수있다. 이것은예를들어, 비제한적으로, 국소주입, 주사또는임플란트에의해달성될수있고당해임플란트는막및매트릭스, 예를들어, 시알라스틱막, 중합체, 섬유성매트릭스 ( 예를들어, Tissuel ) 또는콜라겐매트릭스를포함하는다공성또는비-다공성물질로이루어진다. 한양태에서, 본발명의길항제인유효량의하나이상의항체는장애또는이의증상을예방, 치료, 처리및 / 또는완화시킥위해피검체의환부에국소적으로투여된다. 또다른양태에서, 본발명의유효량의하나이상의항체는장애또는이의하나이상의증상을예방, 치료, 처리및 / 또는완화시키기위해본발명의피검체외에도유효량의하나이상의치료제 ( 예를들어, 하나이상의예방제또는치료제 ) 와병용하여피검체의환부에국소적으로투여된다. 또다른양태에서, 예방제또는치료제는제어방출또는지연방출시스템으로전달될수있다. 한양태에서, 펌프를사용하여조절된또는지연된방출을달성할수있다 (see Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). 또다른양태에서, 중합재를사용하여본발명의치료제의조절되거나지연된방출을달성할수있다 [Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; see also Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); U.S. Pat. No. 5,679,377; U.S. Pat. No. 5, 916,597; U. S. Pat. No. 5,912,015; U.S. Pat. No. 5,989,463; U.S. Pat. No. 5,128,326; PCT Publication No. WO 99/15154; and PCT Publication No. WO 99/20253]. 지연된방출제형에사용되는중합체의예는폴리 (2-하이드록시에틸메타크릴레이트 ), 폴리 ( 메틸메타크릴레이트 ), 폴리 ( 아크릴산 ), 폴리 ( 에틸렌-코-비닐아세테이트 ), 폴리 ( 메타크릴산 ), 폴리글리콜리드 (PLG), 폴리언하이드라이드, 폴리 (N- 비닐피롤리돈 ), 폴리 ( 비닐알콜 ), 폴리아크릴아미드, 폴리 ( 에틸렌글리콜 ), 폴리락티드 (PLA), 폴리 ( 락티드-코-글리콜리드 ) (PLGA) 및폴리오르토에스테르를포함하지만이에제한되지않는다. 하나의양태에서, 지연된방출제형에사용되는중합체는불활성이고, 누출되는불순물이없고, 저장시안정하고생분해성이다. 또다른양태에서, 조절되거나지연된방출시스템은예방제또는치료제와근접하게위치됨에따라서전신투여량의일부만을필요로한다 (Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). 조절된방출시스템은문헌 [Langer (1990, Science 249:1527-1533)] 에서논의되었다. 당업자에게공지된임의 - 67 -
의기술을사용하여본발명의하나이상의치료제를포함하는지연된방출제형을제조할수있다. 예를들면, U. S. Pat. No. 4,526,938, PCT 공보 WO 91/05548, PCT 공보 WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy &Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bfgf Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, and Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760을참조하고, 이들은각각그전체가본원에참조로서인용된다. [0338] [0339] [0340] [0341] [0342] 본발명의조성물이예방제또는치료제를암호화하는핵산인특정양태에서, 핵산은생체내투여되어암호화된예방제또는치료제의발현을촉진시킬수있고당해핵산은적당한핵산발현벡터의일부로서구성되고이것이세포내로투여되도록하며, 예를들어, 레트로바이러스벡터 (U. S. Pat. No. 4,980,286) 또는직접주사또는미세입자충격 ( 예를들어, 유전자총 ; 바이올리스틱, 듀폰트 ) 또는지질또는세포표면수용체또는형질감염제로의피복을투여에사용하거나핵으로진입하는것으로공지된호메오박스형펩타이드에연결시켜투여한다 (Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). 또한, 핵산은세포내로도입되고발현을위해상동성재조합에의해숙주세포 DNA 내로통합된다. 본발명의약제학적조성물은이의의도된투여경로와양립할수있도록제형화된다. 투여경로의예는비경구, 예를들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구, 비내 ( 예를들어, 흡입 ), 경피 ( 예를들어, 국소 ), 경점막및직장투여를포함하지만이에제한되지않는다. 특정양태에서, 당해조성물은사람에게정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비내또는경구투여용으로채택된약제학적조성물로서통상적인과정에따라제형화된다. 전형적으로, 정맥내투여용조성물은멸균등장수성완충액중의용액이다. 필요한경우, 당해조성물은또한가용화제및주사부위에서통증을완화하기위한리그노캠과같은국소마취제를함유할수있다. 본발명의조성물이국소적으로투여되어야만하는경우, 당해조성물은연고, 크림, 경피패취, 로션, 젤, 샴프, 분무제, 에어로졸또는당업자에게널리공지된기타형태로제형화될수있다 [Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)]. 하나의양태에서, 분무불가능한국소투여형태를위해, 통상적으로국소적용과양립할수있는담체또는하나이상의부형제를포함하고바람직하게물보다큰역학점도를갖는조성물이사용될수있다. 적합한제형은제한없이용제, 현탁제, 유제, 크림, 연고, 산제, 도찰제, 고약등을포함하고경우에따라이들은예를들어, 삼투압과같은다양한성질에영향을미치기위해보조제 ( 에를들어, 방부제, 안정화제, 습윤화제, 완충제또는염 ) 과함께멸균되거나혼합된다. 기타적합한국소투여형태는바람직하게고체또는액체불활성담체와배합된활성성분이가압된휘발성물질 ( 예를들어, 가스추진제, 예를들어, 프레온 ) 과의혼합물또는압착병에팩키징된분무가능한에어로졸제제를포함한다. 수분화제또는보습제가또한경우에따라약제학적조성물및투여형태에첨가될수있다. 당해추가의성분의예는당업계에널리공지되어있다. 본발명의방법이조성물의비내투여를포함하는경우, 당해조성물은에어로졸형태, 분무, 연무또는적가형태로제형화될수있다. 특히, 본발명에다라사용하기위한예방제또는치료제는간편하게가압된팩또는분무기로부터에어로졸분무제공형태로적합한추진제 ( 예를들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소또는기타적합한가스 ) 의사용과함께전달될수있다. 가압된에어로졸의경우에, 용량단위는계량된양이전달되도록밸브를설치하여측정될수있다. 흡입기또는취입기에사용하기위한캅셀제및카트릿지 ( 예를들어, 젤라틴으로구성된 ) 는화합물및락토스또는전분과같은적합한분말기제의분말혼합물을함유하도록제형화될수있다. 본발명의방법이경구투여를포함하는경우, 당해조성물은정제, 캅셀제, 카쉐제, 젤캡, 용제, 현탁제의형태로경구적으로제형화될수있다. 정제또는캅셀제는결합제 ( 예를들어, 예비젤화된옥수수전분, 폴리비닐피롤리돈또는하이드록시프로필메틸셀룰로스 ); 충전제 ( 예를들어, 락토스, 미세결정셀룰로스또는인산수소칼슘 ); 윤활제 ( 예를들어, 마그네슘스테아레이트, 탈크또는실리카 ); 붕해제 ( 예를들어, 감자전분또는나트륨전분글리콜레이트 ) 또는습윤화제 ( 예를들어, 나트륨라우릴설페이트 ) 와같은약제학적으로허용되는부형제와함께통상적인수단으로제조될수있다. 정제는당업자에게널리공지된방법으로피복될수있다. 경구투여용액상제제는제한없이용제, 시럽또는현탁제형태를취할수있거나이들은사용전에물또는기타적합한비히클과의구성을위해무수생성물로서제공될수있다. 당해액상제제는현탁화제 ( 예를들어, 소르비톨시럽, 셀룰로스유도체또는수소화된식용지방 ); 유화제 ( 예를들어, 렉시틴또는아카시아 ); 비-수 - 68 -
성비히클 ( 예를들어, 아몬드유, 오일에스테르, 에틸알콜또는분획화된식물성오일 ) 및방부제 ( 예를들어, 메틸또는프로필-p-하이드록시벤조에이트또는소르브산 ) 와같은약제학적으로허용되는첨가제를사용한통상적인수단에의해제조될수있다. 당해제제는또한적절하게완충염, 향제, 착색제및감미제를함유할수있다. 경구투여용제제는적합하게예방제또는치료제의느린방출, 조절된방출또는지연된방출용으로제형화될수있다. [0343] [0344] [0345] [0346] [0347] [0348] [0349] 본발명의방법은예를들어, 흡입기또는분무기를사용함에의해분무화제로제형화된조성물을폐투여함을포함할수있다. 예를들면, 미국특허번호제6,019,968호, 제5,985,320호, 제5,985,309호, 제5,934,272호, 제5,874,064호, 제5,855,913호, 제5,290,540호, 및제4,880,078호 ; 및 PCT Publication Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, 및 WO 99/66903을참조하고, 이들은각각그전체가본원에참조로서인용된다. 특정양태에서, 본발명의결합단백질, 병용치료제및 / 또는본발명의조성물은 Alkermes AIR 폐약물전달기술 (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.) 을사용하여투여된다. 본발명의방법은주사 ( 예를들어, 일시주사또는연속주입 ) 에의해비경구투여용으로제형화된조성물을투여함을포함할수있다. 주사용제형은방부제첨가와함께단위용량형태 ( 예를들어, 앰푸울또는다용량컨테이너 ) 로제공될수있다. 당해조성물은현탁제, 용제또는유제와같은형태를취할수있고현탁화제, 가용화제및 / 또는분산제와같은제형화제를함유할수있다. 또는, 활성성분은사용전에적합한비히클 ( 예를들어, 멸균발연원부재물 ) 과의구성을위해분말형태일수있다. 본발명의방법은추가로데포우제제로서제형화된조성물의투여를포함할수있다. 당해오래지속적인제제는이식 ( 예를들어, 피하또는근육내 ) 에의해또는근육내주사에의해투여될수있다. 따라서, 예를들어, 당해조성물은적합한중합재또는소수성물질 ( 예를들어, 허용되는오일중유제로서 ) 또는이온교환수지, 또는불량한가용성유도체 ( 예를들어, 불량한가용성염으로서 ) 로제형화될수있다. 본발명의방법은중성또는염형태로서제형화된조성물의투여를포함한다. 약제학적으로허용되는염은염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산등으로부터유래된것들과같은음이온과함께형성된것들및나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 제2 수산화철, 이소프로필아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인등으로부터유래된것들과같은양이온과함께형성된것들을포함한다. 일반적으로, 조성물의성분은별도로함께혼합하여, 예를들어, 앰푸울또는사쉐트 ( 활성제의양을나타냄 ) 와같은밀폐된컨테이너에서무수동결건조된분말또는물부재농축물로서단위용량형태로공급된다. 투여방식이주입인경우, 조성물은멸균약제학적등급의물또는식염수를함유하는주입병으로분배될수있다. 투여방식이주사에의한것인경우, 멸균주사용수또는식염수의앰푸울을제공하여성분들이투여전에혼합될수있다. 특히, 본발명은또한예방제또는치료제, 또는본발명의약제학적조성물이제제의양을나타내는앰푸울또는사쉐트와같은밀폐된컨테이너에팩키징된것을제공한다. 한양태에서, 하나이상의예방제또는치료제또는본발명의약제학적조성물은밀폐된컨테이너에서무수멸균된동결건조된분말또는물부재농축물로서공급되고피검체투여용으로적당한농도로재구성 ( 예를들어, 물또는식염수와함께 ) 될수있다. 하나의양태에서, 하나이상의예방제또는치료제또는본발명의약제학적조성물은밀폐된컨테이너에무수멸균동결건조된분말로서제공되고단위용량은 5 mg 이상, 보다바람직하게는 10 mg 이상, 15 mg 이상, 25 mg 이상, 35 mg 이상, 45 mg 이상, 50 mg 이상, 75 mg 이상또는 100 mg 이상이다. 동결건조된예방제또는치료제또는본발명의약제학적조성물은이의본래의컨테이너에 2 내지 8 에서저장되어야만하고본발명의예방제또는치료제또는약제학적조성물은재구성된후 1주이내, 바람직하게는 5일이내, 72시간이내, 48시간이내, 24 시간이내, 12시간이내, 6시간이내, 5시간이내, 3시간이내, 1시간이내에투여되어야만한다. 선택적인양태에서, 본발명의하나이상의예방제또는치료제또는약제학적조성물은제제의양및농도를나타내는밀폐된컨테이너에서액체형태로공급된다. 한양태에서, 투여된조성물의액체형태는밀폐된컨테이너에 0.25 mg/ml 이상, 보다바람직하게는 0.5 mg/ml 이상, 1 mg/ml 이상, 2.5 mg/ml 이상, 5 mg/ml 이상, 8 mg/ml 이상, 10 mg/ml 이상, 15 mg/ml 이상, 25 mg/ml 이상, 50 mg/ml 이상, 75 mg/ml 이상또는 100 mg/ml 이상으로공급된다. 액체형태는이의본래의컨테이너에 2 내지 8 에서저장되어야만한다. 본발명의결합단백질은비경구투여에적합한약제학적조성물에혼입될수있다. 한양태에서, 항체또는항체일부는항체 0.1 내지 250mg/ml를포함하는주사용액으로제조하는것이바람직하다. 주사용액은플린트또는호박색바이엘, 앰플또는사전충진주사기중의액체또는동결건조투여형태로구성될수있다. 완충액은 ph 5.0 내지 7.0( 최적으로는 ph 6.0) 의 L-히스티딘 (1-50mM), 최적으로는 5-10mM일수있다. 다른적당한완 - 69 -
충액으로는석신산나트륨, 구연산나트륨, 인산나트륨또는인산칼륨이있으나, 이에국한되지않는다. 염화나트륨은 0 내지 300mM( 액체투여형태인경우최적으로는 150mM) 의농도로용액의독성을개질하는데사용될수있다. 동결건조투여형태에는동결방지제, 주로 0 내지 10% 슈크로스 ( 최적으로는 0.5 내지 1.0%) 가첨가될수있다. 다른적당한동결방지제에는트레할로스및락토스가있다. 동결건조투여형태에는벌크제제 (Bulking agent), 주로 1 내지 10% 만니톨 ( 최적으로는 2 내지 4%) 이첨가될수있다. 액체및동결건조투여형태에는안정화제, 주로 1 내지 50mM L-메티오닌 ( 최적으로는 5 내지 10mM) 이첨가될수있다. 다른적당한벌크제제 (Bulking agent) 에는글리신, 아르기닌이있으며, 이는 0 내지 0.05% 폴리소르베이트-80( 최적으로는 0.005 내지 0.01%) 으로서포함될수있다. 또다른계면활성제에는폴리소르베이트 20 및 BRIJ 계면활성제가있으나, 이에국한되지않는다. 비경구투여용의주사가능한용액으로제조된본발명의결합단백질을포함하는약제학적조성물은보조제로서유용한제제, 예를들어, 치료학적단백질 ( 예를들어, 항체 ) 의흡수또는분산을증가시키는데사용되는것들을추가로포함할수있다. 특히유용한보조제는 Hylenex 과같은하이알루로니다제 ( 재조합사람하이알루로니다제 ) 이다. 주사가능한용액중에하이알루로니다제의첨가는비경구투여후, 특히피하투여후사람생체이용률을개선시킨다. 이는또한보다큰주사부위용적 ( 즉 1ml 초과 ) 을가능하게하고통증및불괘감이덜하고주사부위반응이최소로발생한다 ( 본원에참조로서인용된 WO2004078140, 및 US2006104968 참조 ). [0350] [0351] [0352] [0353] [0354] 본발명의조성물은다양한형태일수있다. 이러한형태에는예컨대액체, 반고체및고체투여형태, 예컨대액체용액 ( 예, 주사용액및주입용액 ), 분산액또는현탁액, 정제, 환제, 산제, 리포좀및좌약등이포함된다. 바람직한형태는의도하는투여방식및치료용도마다다르다. 일반적으로바람직한조성물은주사용액또는주입용액형태, 예컨대다른항체로사람을수동면역화하는데사용되는조성물과유사한조성물이다. 선택한투여방식은비경구 ( 예컨대, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내 ) 방식이다. 한양태에서, 항체는정맥내주입또는주사로투여된다. 또다른양태에서, 항체는근육내또는피하주사로투여된다. 치료학적조성물은일반적으로멸균될수있고제조및보관조건하에서안정해야한다. 이러한조성물은용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀또는높은약물농도에적당한다른주문구조로조제될수있다. 멸균주사용액은필요량의활성화합물 ( 즉, 항체또는항체일부 ) 을, 필요에따라앞에서열거한성분중하나또는성분의조합과함께적당한용매에서혼합한다음, 여과멸균하여제조할수있다. 일반적으로, 분산액은기본분산매질과필요에따라전술한다른성분을포함하는멸균매개제에활성화합물을첨가하여제조한다. 멸균주사용액의제조에유용한멸균동결건조분말의경우에, 바람직한제조방법은전술한멸균여과용액으로부터활성성분과임의의바람직한추가성분의분말을제공하는진공건조및분무건조이다. 용액의적당한유체성은예컨대레시틴과같은피복의사용, 분산액의경우에필요한입자크기의유지및계면활성제의사용을통해유지될수있다. 주사조성물의지속적흡수는조성물에흡수지연제, 예컨대모노스테아레이트염및젤라틴을첨가하여제공할수있다. 본발명의결합단백질은당업계에공지된다양한방법으로투여할수있지만, 다양한치료학적용도에서바람직한투여경로 / 방식은피하주사, 정맥내주사또는주입이다. 당업자라면잘알고있듯이, 투여경로및 / 또는방식은원하는결과에따라달라진다. 특정양태에서, 활성화합물은이화합물이신속방출되지않게하는담체와함께조제될수있으며, 그예에는임플란트, 경피패치및마이크로캡슐화된전달시스템을비롯한제어방출제형이있다. 여기에는에틸렌비닐아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르및폴리락트산과같은생체분해성, 생체화합성중합체가사용될수있다. 이러한제형을제조하는다수의방법은특허되어있거나당업자에게일반적으로공지되어있다 [ 예컨대, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]. 특정양태에서, 본발명의결합단백질은예컨대불활성희석제또는동화성식용담체와함께경구투여될수있다. 이러한화합물 ( 및필요한경우다른성분 ) 은또한경질또는연질외피의젤라틴캡슐에충진되거나, 정제로압착되거나또는피검체식이에직접첨가될수도있다. 경구치료투여용인경우, 상기화합물은부형제와혼합되어섭취성정제, 협측정제, 트로키, 캡슐 ; 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼등의형태로사용될수있다. 비경구투여외다른방식으로본발명의화합물을투여하기위해서는화합물을불활성화방지용물질로피복하거나또는상기방지용물질과함께공동투여할필요가있을수있다. 또한, 보충적활성화합물이상기조성물에첨가될수도있다. 특정양태에서, 본발명의결합단백질은본발명의결합단백질과함께장애를치료하기에유용한하나이상의추가치료제와공동제형화되고 / 되거나동시투여된다. 예를들어, 본발명의결합단백질은다른표적 ( 예컨대, 다른사이토킨에결합하거나세포표면분자에결합하는항체 ) 에결합하는하나이상의추가항체와공동조제및 / 또는공동투여될수있다. 또한, 본발명의 - 70 -
하나이상의항체는전술한치료제 2 종이상과함께사용될수있다. 이러한병용치료는투여되는치료제를보 다낮은투여량으로사용할수있게하여각종단독치료법과관련된가능한독성또는합병증을피할수있으므 로바람직하다. [0355] [0356] [0357] [0358] 특정양태에서, 결합단백질은당업계에공지된반감기연장비히클에연결되기도한다. 이러한비히클에는 Fc 도메인, 폴리에틸렌글리콜및덱스트란이있으나, 이에국한되는것은아니다. 이러한비히클은미국출원일련번호 09/428,082 및공개된 PCT 출원 WO 99/25044에기술되어있고, 상기참조문헌은임의의목적으로본원에참조로서인용된다. 특정양태에서, 본발명의결합단백질을암호화하는핵산서열또는또다른예방제또는치료제는유전자치료에의해장애또는이의하나이상의증상을치료, 예방, 처리하거나완화시키기위해투여된다. 유전자치료법은피검체에게발현되거나발현가능한핵산을투여함에의해수행되는치료법을언급한다. 본발명의당해양태에서, 핵산은예방또는치료효과를매개하는이의암호화된본발명의항체또는예방제또는치료제를생산한다. 당업계에서유용한임의의유전자치료법이본발명에따라사용될수있다. 유전자치료법의일반적인검토를위해문헌 [Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926-932 (1993); and Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215] 을참조한다. 사용될수있는재조합 DNA 기술에관해당업계에일반적으로공지된방법은문헌 [Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)] 에기재되어있다. 다양한유전자치료법에대한상세한설명은문헌 [US20050042664 A1] 에기재되어있고, 상기문헌은본원에참조로서인용된다. 본발명의결합단백질은결합단백질에의해인식되는표적이해로운각종질환을치료하는데유용하다. 이러한질병에는류마티스성관절염, 골관절염, 소아만성관절염, 패혈성관절염, 라임관절염, 건선관절염, 반응관절염, 척추관절염, 전신홍반루푸스, 크론병, 궤양성결장염, 염증장병, 인슐린의존당뇨병, 갑상샘염, 천식, 알레르기병, 건선, 피부경화증, 이식대숙주병, 기관이식거부, 기관이식과관련된급성또는만성면역병, 사르코이드증, 죽상경화증, 파종혈관내응고, 가와사키병, 그레이브스병, 신장증후군, 만성피로증후군, 베게너육아종증, 헨녹-쇈라인자반증 (Henoch-Schonlein purpurea), 신장의현미경적혈관염, 만성활성간염, 포도막염, 패혈쇼크, 독소쇼크증후군, 패혈증증후군, 악액질, 감염성질병, 기생충병, 후천성면역결핍증후군, 급성횡단척수염, 헌팅톤씨무도병, 파킨슨씨병, 알쯔하이머병, 졸중, 원발성담관성간경화증, 용혈빈혈, 악성암, 심장부전, 심근경색, 애디슨씨병, 산발성, 다선성결핍 I형및다선성결핍 II형, 슈미트씨증후군, 성인 ( 급성 ) 호흡곤란증후군, 탈모증, 원형탈모증, 흠성혈청관절증, 관절증, 라이터씨병, 건선관절증, 궤양성결장염관절증, 창자병윤활막염, 클라미디아증, 예르시니아및살모넬라관련관절증, 척추관절증, 죽상병 / 동맥경화증, 아토피성알레르기, 자가면역수포병, 보통천포창, 낙엽천포창, 유사천포창, 선형 IgA 병, 자가면역용혈빈혈, 쿰스양성용혈빈혈, 후천성악성빈혈, 소아악성빈혈, 근육통성뇌염 / 로얄프리병 (Royal Free Disease), 만성점막피부칸디다증, 거대세포동맥염, 원발성경화증간염, 잠복성자가면역간염, 후천성면역결핍증후군, 후천성면역결핍관련병, B형간염, C형간염, 공통가변성면역결핍 ( 공통가변성저감마글로불린혈증 ), 확장성심근증, 여성불임, 난소부전증, 조숙난소부전, 섬유소성폐질환, 잠복성섬유화폐포염, 염증후간질성폐질환, 간질성폐렴, 결합조직병관련간질성폐병, 복합결합조직병관련폐병, 전신경화증관련간질성폐병, 류마티스성관절염관련간질성폐병, 전신홍반루푸스관련폐병, 피부근육염 / 다발근육염관련폐병, 쇼그렌병관련폐병, 강직척추염관련폐병, 혈관염성광범위폐병, 혈철소증관련폐병, 약물유도간질성폐병, 섬유증, 방사선섬유증, 폐쇄세기관지염, 만성호산구성폐렴, 림프구성침윤폐병, 감염후간질성폐병, 통풍관절염, 자가면역간염, 1형자가면역간염 ( 고전적자가면역또는루푸스간염 ), 2형자가면역간염 ( 항LKM 항체간염 ), 자가면역매개저혈당증, 흑색가시세포증관련 B형인슐린내성, 부갑상샘항진증, 기관이식관련급성면역질환, 기관이식관련만성면역질환, 골관절염, 원발성경화담관염, 1형건선, 2형건선, 특발백혈구감소증, 자가면역호중구감소증, 신장병 NOS, 사구체신염, 신장의현미경적혈관염, 라임병, 원반형홍반루푸스, 특발성또는 NOS 남성불임, 정자자가면역성, 다발성경화증 ( 모든아형 ), 교감성안염, 결합조직질환에부차적인폐고혈압, 굿파스쳐증후군, 결절다발동맥염의폐동맥징후, 급성류마티스열, 류마티스성척추염, 스틸스병, 전신경화증, 쇼그렌증후군, 다카야스씨병 / 동맥염, 자가면역저혈소판증, 특발저혈소판증, 자가면역갑상샘질환, 갑상샘항진증, 갑상샘종자가면역갑상샘항진증 ( 하시모토씨병 ), 위축자가면역갑상샘항 - 71 -
진증, 원발성점액부종, 수정체성포도막염, 원발성혈관염, 백반증, 급성간질환, 만성간질환, 알콜간경화증, 알콜유도간손상, 담즙정체, 특이간질환, 약물유도간염, 비알콜성지방간염, 알레르기및천식, 그룹 B 스트렙토코커스 (GBS) 감염, 정신질환 ( 예, 우울증및정신분열병 ), Th2 타입및 Th1 타입매개병, 급성및만성통증및암, 예컨대폐, 유방, 위, 방광, 결장, 췌장, 난소, 전립선및직장의암및조혈계암 ( 백혈병및림프종 ), A베타지방단백질혈증, 말초청색증, 급성및만성기생충성또는감염성과정, 급성백혈병, 급성림프성모구성백혈병 (ALL), 급성골수백혈병 (AML), 급성또는만성세균감염, 급성췌장염, 급성신부전증, 선암종, 공기이소성심방박동, AIDS 치매합병증, 알콜유도간염, 알레르기성결막염, 알레르기성접촉피부염, 알레르기성비염, 동종이식거부, 알파-1-안티트립신결핍, 근위축성측삭경화증, 빈혈, 앙기나협심증, 전각세포퇴화, 항 cd3 치료, 항인지질증후군, 항-수용체과민성반응, 대동맥및말초결찰증, 대동맥해부, 동맥고혈압, 동맥경화증, 동정맥누공, 운동실조증, 심방세동 ( 지연또는발작성 ), 심방조동, 동정맥막힘, B 세포림프종, 골이식거부, 골수이식 (BMT) 거부, 좌각차단, 버키트림프종, 화상, 심장성부정맥, 심장성기절증후군, 심장종양, 심근증, 심폐우회염증반응, 연골이식거부, 소뇌피질퇴화, 소뇌장애, 혼란또는다초점심방빈맥, 화학치료관련장애, 만성골수성백혈병 (CML), 만성알콜증, 만성염증병리, 만성림프성백혈병 (CLL), 만성폐쇄폐질환 (COPD), 만성살리실레이트중독, 결장직장암종, 울혈성심부전, 결막염, 접촉성피부염, 폐심장, 관상동맥질환, 크루츠펠트-자콥 (Creutzfeldt-Jakob) 질환, 배양음성패혈증, 낭섬유증, 사이토킨치료관련장애, 권투선수치매 (Dementia pugilistica), 탈수초성질환, 댕기출혈열, 피부염, 피부학적증상, 당뇨병, 진성당뇨병, 당뇨병성동맥경화질환 (diabetic ateriosclerotic disease), 광범위루이체질환, 확장성울혈성심근증, 기저핵장애, 중년다운증후군, CNS 도파민수용체차단약물에의해유도된약물유도운동장애, 약물과민증, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비질환, 후두개염, 엡스타인-바르바이러스감염, 피부홍통증, 추체외로및소뇌장애, 가족성적혈구잠식성림프조직구증, 태아흉선이식거부, 프리드리히운동실조증, 기능성말초동맥장애, 진균류패혈증, 가스괴저, 위궤양, 사구체신염, 임의의기관또는조직이식거부, 그람음성패혈증, 그람양성패혈증, 세포내기관으로인한육아종, 모발세포백혈병, 할레포르덴-스파츠질환 (Hallervorden-Spatz disease), 하시모토갑상선염, 고초열, 심장이식거부, 혈색소증, 혈액투석, 용혈성요독증후군 / 혈전성혈소판감소성자반증, 출혈, 간염 (A), 히스다발부정맥, HIV 감염 /HIV 신경병증, 호지킨질환, 과운동성장애, 과민성반응, 과민성폐렴, 고혈압, 운동부족장애, 시상하부-뇌하수체-부신피질계평가, 특발성애디슨질환, 특발성폐섬유증, 항체매개세포독성, 무력증, 유아척추근육위축증, 대동맥염증, 인플루엔자 A, 이온화방사선노출, 홍채섬모체염 / 자궁염 / 광학적신경근염, 허혈관류손상, 허혈뇌졸중, 연소성류마티스관절염, 연소성척추근육위축증, 카포시육종, 신장이식거부, 레지오넬라, 리슈마니아증, 나병, 피질척수계병변, 지방부종, 간이식거부, 림프피부종, 말라리아, 악성림프종, 악성조직구증, 악성흑색종, 뇌막염, 수막염균혈증, 대사 / 특발성, 편두통, 미토콘드리아다중시스템장애, 복합연결조직질환, 모노클로날감마글로불린혈증, 다발성골수종, 다발성시스템퇴화 ( 만셀데제린-토마스쉬-드라거및마차도-조셉 ), 중증근무력증, 세포내마이코박테리움감염증, 마이코박테리움결핵, 골수이형성증후군, 심근경색, 심근허혈장애, 비인두암종, 신생아만성폐질환, 신염, 신증, 신경퇴행성질환, 신경성 I 근육위축증, 호중구감소성발열, 비-호지킨림프종, 복부대동맥및이의지류폐색, 폐색성동맥질환, okt3 치료, 고환염 / 부고환염, 고환염 / 절관절제술반전과정, 기비대, 골다공증, 췌장이식거부, 췌장암종, 부수종양성증후군 / 악성고칼슘혈증, 부갑상선이식거부, 골반염증질환, 다년성비염, 심막질환, 말초동맥경화질환, 말초혈관장애, 복막염, 악성빈혈, 폐포자충폐렴, 폐렴, POEMS 증후군 ( 다발신경병증, 장기비대, 내분비질환, 모노클로날감마글로불린혈증, 및피부변화증후군 ), 관류후증후군, 펌프후증후군, MI 후심장절개증후군, 자간전증, 전진적상핵마비, 원발성폐고혈압, 방사선치료, 레이노드현상및질환, 레이노드질환, 레프섬질환, 일반협소 QRS 심근증, 신혈관성고혈압, 재관류손상, 제한성심근병증, 육종, 피부경화증, 노인무도병, 루이체형노인성치매, 혈청음성관절병증, 쇼크, 겸상적혈구빈혈증, 피부동종이식거부, 피부변화증후군, 소장이식거부, 고형종양, 특이적부정맥, 척수운동실조, 척수소뇌퇴화, 스트렙토코커스근염, 소뇌구조적병변, 아급성경화성범뇌염, 실신, 심혈관계매독, 전신아나팔락시스, 전신염증반응증후군, 전신개시연소성류마티스관절염, T-세포또는 FAB ALL, 말초혈관확장증, 폐색성혈전혈관염, 혈소판감소증, 독성, 이식, 외상 / 출혈, III형과민성반응, IV형과민성, 불안정앙기나, 요독증, 요로패혈증, 두드러기, 승모판심장질환, 하지정맥, 혈관염, 정맥동질환, 정맥종혈전증, 심실세동, 바이러스및진균류감염, 바이탈뇌염 / 무균성수막염, 바이탈-연관적혈구식작용증후군, 웨른니케-코르사코프증후군, 윌슨질환, 임의의기관또는조직의이종이식거부를포함하지만이에제한되지않는다 (Peritt et al. PCT 공보 No. WO2002097048A2, Leonard et al., PCT 공보 No. WO9524918 A1, and Salfeld et al., PCT 공보 No. WO00/56772A1). [0359] 본발명의 DVD-Ig 는또한하기의질환중하나이상을치료할수있다 : 급성관상증후군, 급성특발성다발신 - 72 -
경근염, 급성염증탈수초성다발성신경염, 급성허혈, 성인스틸스질환, 원형탈모증, 아나필락시스증 (anaphylaxis), 항-인지질항체증후군, 재생불량성빈혈, 동맥경화증, 아토피성습진, 아토피성피부염, 자가면역피부염, 스트렙토코커스감염과관련된자가면역장애, 자가면역난청, 자가면역림프구증식성증후군 (ALPS), 자가면역심근염, 자가면역혈소판감소증 (AITP), 안건염, 기관지확장증, 수포성유천포창, 심혈관질환, 악성항인지질증후군, 셀리악질환 (celiac disease), 경추척추증, 만성허혈, 반흔성유천포창, 다발성경화에대한위험을갖는임상적으로분리된증후군 (CIS), 결막염, 유년기개시정신성장애, 만성폐쇄성폐질환 (COPD), 누낭염, 피부근염, 당뇨망막증, 진성당뇨병, 요추간반탈출증, 추간판내장증, 약물유도면역용혈성빈혈, 심내막염, 자궁내막증, 내안구염, 겉공막염, 다형홍반, 중증다형홍반, 임신성유천포창, 길레인바레증후군 (Guillain-Barre syndrome) (GBS), 건초열, 휴즈증후군 (Hughes syndrome), 특발성파킨슨질환, 특발성간질폐렴, IgE 매개된알레르기, 면역용혈성빈혈, 봉입체근염, 감염성안구염증질환, 염증탈수초질환, 염증심장질환, 염증신장질환, IPF/UIP, 홍채염, 각막염, 건성각결막염, 쿠스마울질환또는쿠스마울 -마이어질환, 란드리마비, 랑게르한스세포조직구증, 열성홍반 (livedo reticularis), 황반변성, 미시적혈관염, 경직성척추염, 운동뉴런장애, 점막유천포창, 다발성기관부전증, 중증근무력증, 골수이형성증후군, 심근염, 신경근장애, 신경병증, 비-A 비-B 간염, 시신경염, 골용해, 난소암, 소수관절 JRA, 말초동맥폐색성질환 (PAOD), 말초혈관질환 (PVD), 말초동맥질환 (PAD), 정맥염, 결절성다발동맥염 ( 또는결절성동맥주위염 ), 다발연골염, 측두동맥염, 회색질척수염, 다발성관절 JRA, 다발성내분비결핍증후군, 다발성근염, 류마티스성다발성근육통 (PMR), 펌프후증후군, 1차파킨슨병, 전립선및직장암및조혈악성 ( 백혈병및림프종 ), 전립선염, 순수적혈구저형성증, 1차부신부전증, 재발성시속신경근염, 협착증, 류마티스심장질환, 사포 ( 활막염, 여드름, 농포증, 및골염 ), 피부경화증, 2차아밀로이드증, 폐쇼크, 상공막염, 좌골신경통, 2차부신부전증, 실리콘관련연결조직질환, 스네돈-윌킨슨 (sneddon-wilkinson) 피부증, 강직성척추염, 스티븐- 존슨증후군 (SJS), 전신염증반응증후군, 일시적동맥염, 톡소플라스믹망막증, 독성표피괴사, 횡단척수염, TRAPS ( 종양괴사인자수용체, 1형알레르기반응, II형당뇨병, 두드러기, 통상의간질폐렴 (UIP), 혈관염, 춘계각결막염, 바이러스망막염, 보그트-고야나기-하라다증후군 (VKH 증후군 ), 습윤황반퇴화및상처치료. [0360] [0361] [0362] [0363] [0364] [0365] 본발명의결합단백질은자가면역질환, 특히, 류마티스관절염, 강직성척추염, 알레르기, 자가면역당뇨병및자가면역포도막염을포함하는, 염증과관련된자가면역질환을앓는사람을치료하기위해사용될수있다. 하나의양태에서, 본발명의결합단백질또는이의항원결합부를사용하여류마티스관절염, 크론질환, 다발성경화증, 인슐린의존성진성당뇨병및건선을치료하기위해사용된다. 하나의양태에서, 본발명의조성물과방법으로치료되거나진단될수있는질환은유방암, 결장암, 직장암, 폐암, 구인두암, 두경부암, 식도암, 위암, 췌장암, 간암, 방광암및담관암, 소장암, 뇨관암 ( 신장암, 방광암및요상피암을포함 ), 여성생식관암 ( 경부암, 자궁암및난소암, 및융모막상피종및생식융모상피성질환 ), 남성생식관암 ( 전립선암, 저정낭암, 고환암및생식세포종양을포함 ), 내분비선암 ( 갑상선암, 부신암및뇌하수체암을포함 ), 및피부암, 및혈관종, 흑색종, 육종 ( 골기원암및연조직기원의암및카포시육종을포함 ), 뇌암, 신경암, 안구암, 및수막암 ( 성상세포종, 신경아교종, 아교모세포종, 망막아세포종, 신경종, 신경아세포종, 양성종양, 및수막종을포함 ), 조혈악성종양으로유래되는고형종양, 예를들어, 백혈병및림프종 ( 호지킨및비호지킨림프종둘다 ) 를포함하는, 원발성및전이성암을포함하지만이에제한되지않는다. 하나의양태에서, 본발명의항체또는이의항원결합부는단독으로또는방사선치료및 / 또는다른화학치료제와조합하여사용되는경우암을치료하거나본원에기재된종양으로부터의전이를예방하기위해사용된다. 본발명의항체또는이의항원결합부는항신생물제, 방사선치료및화학치료제 ( 예를들어, DNA 알킬화제, 시스플라틴, 카보플라틴, 항-튜불린제, 파클리탁셀, 도세탁셀, 탁솔, 독소루비신, 겜시타빈, 겜자르, 안트라사이클린, 아드리아마이신, 토포이소머라제 I 억제제, 토포이소머라제 II 억제제, 5-플루오로우라실 (5-FU), 류코보린, 이리노테칸, 수용체티로신키나제억제제 ( 예를들어, 에를로티니브, 게피티니브 ), COX-2 억제제 ( 예를들어, 셀렉콕시브 ), 키나제억제제및 sirna)) 를포함하지만이에제한되지않는제제와배합될수있다. 또한, 본발명의결합단백질은각종질환의치료에유용한하나이상의추가치료제와함께투여될수있다. 본발명의결합단백질은전술한질환의치료에단독으로또는배합물로서사용될수있다. 당해결합단백질은단독으로사용되거나또는의도한목적에따라당업자에의해선택된추가제제, 예컨대치료제와함께사용될수있는것으로이해되어야한다. 예를들어, 추가제제는본발명의항체에의해치료되는질병이나증상의치료에유용한것으로인식된치료제분야일수있다. 또한, 추가제제는치료조성물에유익한특성을부여하 - 73 -
는제제, 예컨대조성물의점도에유효한제제일수있다. [0366] [0367] [0368] 또한, 본발명에포함되어야하는배합물은의도한목적에유용한배합물로이해되어야한다. 이하에설명되는제제는목적에유용한예시적제제로서, 한정하기위한것이아니다. 본발명의일부인배합물은본발명의항체와이하에기술되는목록중에서선택되는하나이상의추가제제일수있다. 이러한배합물은또한하나이상의추가제제를포함할수있으며, 예를들어형성된조성물이의도한기능을수행할수있을정도의배합이라면 2개또는 3개의추가제제가첨가될수도있다. 자가면역및염증질환을치료하기위한바람직한배합물은이부프로펜과같은약물을포함하는 NSAID로언급되기도하는비스테로이드소염약물이다. 다른바람직한배합물은프레드니솔론을비롯한코르티코스테로이드류이며 ; 본발명의 DVD Ig와함께환자를치료하는경우, 필요한스테로이드용량이점감되어스테로이드사용시의공지된부작용이저하되거나심지어제거될수있다. 본발명의항체또는항체결합부와함께류마티스성관절염용치료제의비제한적예에는다음과같은것이있다 : 사이토킨억제성소염제 (CSAID); 다른사람사이토킨또는성장인자 ( 예컨대, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, IL-23, 인터페론, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF) 에대한항체또는길항제. 본발명의결합단백질또는이의항원결합부는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD90, CTLA와같은세포표면분자또는이들의리간드, 예컨대 CD154(gp39 또는 CD40L) 에대한항체와조합될수있다. 치료제의바람직한배합물은자가면역및후속염증캐스캐이드의여러지점에서방해할수있다 ; 바람직한예에는 TNF 길항제, 예를들어, 키메라, 사람화된또는사람 TNF 항체, 아달리무마브, (PCT 공개번호제WO 97/29131), CA2(Remicade TM ) CDP571, 및가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, 이의유도체, (p75tnfr1gg (Enbrel TM ) 또는 p55tnfr1gg (Lenercept), 및또한 TNFα전환효소 (TACE) 억제제가있고, 유사하게 IL-1 억제제 ( 인터류킨-1-전환효소억제제, IL-1RA등 ) 는동일이유때문에유효하다. 다른바람직한배합물에는인터류킨 11 이있다. 또다른바람직한배합물은 IL-12 기능과병행하거나, IL-12 기능에의존적이거나 IL-12 기능과협동적인작용을할수있는자가면역반응의다른주요작용인자를포함하고, 특히 IL-18 항체또는가용성 IL-18 수용체를포함하는 IL-18 길항제또는 IL-18 결합단백질이다. 확인된바에따르면, IL-12와 IL-18이중복되지만독특한기능을보유하여, 이둘에대한길항제의배합물이가장효과적이었다. 또다른바람직한배합물은비고갈성항-CD4 억제제이다. 또다른바람직한배합물에는공동자극경로의길항제 CD80(B7.1) 또는 CD86(B7.2), 예컨대항체, 용해성수용체또는길항제성리간드등이포함된다. [0369] 본발명의결합단백질은또한메토트렉세이트, 6-MP, 아자티오프린설파살라진, 메살라진, 올살라진클로로퀴닌 / 하이드록시클로로퀸, 펜실라민, 오로티오말레이트 ( 근육내및경구 ), 아자티오프린, 콜히친, 코르티코스테로이드 ( 경구, 흡입및국소주사 ), 베타-2 아드레날린수용체효능제 ( 살부타몰, 터부탈린, 살메테랄 ), 크산틴 ( 테오필린, 아미노필린 ), 크로모글리케이트, 네도크로밀, 케토티펜, 이프라트로퓸및옥시트로퓸, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀레이트모페틸, 레플루노미드, NSAID, 예컨대이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예컨대프레드니솔론, 포스포디에스터라제억제제, 아데노신효능제, 항혈전제, 보체억제제, 아드레날린작용제, 전염증성사이토킨, 예컨대 TNFα 또는 IL-1에의한시그날전달을방해하는제제 ( 예, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제억제제 ), IL-1β 전환효소억제제, TNFα전환효소 (TACE) 억제제, T-세포시그날전달억제제 ( 예 : 키나제억제제 ), 메탈로프로테이나제억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신전환효소억제제, 용해성사이토킨수용체및이의유도체 ( 예, 용해성 p55 또는 p75 TNF 수용체및유도체 p75tnfrigg(enbrel 및 p55tnfrigg(lenercept)), sil-1ri, sil-1rii, sil-6r), 소염성사이토킨 ( 예, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ), 셀레콕시브, 엽산, 하이드록시클로로퀸설페이트, 로페콕시브, 에타너셉트, 인플릭시마브, 나프록센, 발데콕시브, 설파살라진, 메틸프레드니솔론, 멜록시캄, 메틸프레드니솔론아세테이트, 골드나트륨티오말레이트, 아스피린, 트리암시놀론아세토나이드, 프로폭시펜나프실레이트 /apap, 폴레이트, 나부메톤, 디클로페낙, 피록시캄, 에토돌락, 디클로페낙나트륨, 옥사프로진, 옥시코돈 hcl, 하이드로코돈비타르트레이트 /apap, 디클로페낙나트륨 / 미소프로스톨, 펜타닐, 아나킨라, 사람재조합체, 트라마돌 hcl, 살살레이트, 설린닥, 시아노코발라민 /fa/ 피리독신, 아세트아미노펜, 알렌드로네이트나트륨, 프레드니솔론, 몰핀설페이트, 리도카인하이드로클로라이드, 인도메타신, 글루코사민설프 / 콘드로이틴, 아미트립틸린 hcl, 설파디아진, 옥시코돈 hcl/ 아세트아미노펜, 올로파타딘 hcl, 미소프로스톨, 나프록센나트륨, 오메프라졸, 시클로포스파미드, 리툭시마브, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18BP, 항-IL-18, 항-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, 로플루밀라스트, IC-485, CDC-801 및메소프람등의제제와도배합될수있다. 바람 - 74 -
직한배합물에는메토트렉세이트또는레플루노미드가있으며, 보통또는중증류마티스성관절염증례에는사 이클로스포린이있다. [0370] 류마티스관절염을치료하기위해결합단백질과배합하여사용될수있는비제한적인추가의제제는하기의제제를포함하지만이에제한되지않는다 : 비-스테로이드소염약물 (NSAID); 사이토킨억제소염약물 (CSAID); CDP-571/BAY-10-3356 ( 사람화된항-TNFα 항체 ; Celltech/Bayer); ca2/ 인플릭시마브 ( 키메라항-TNFα 항체 ; Centocor); 75 kdtnfr-igg/ 에타너셉트 (75 kd TNF 수용체-IgG 융합단백질 ; Immunex; Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55 kdtnf-igg (55 kd TNF 수용체-IgG 융합단백질 ; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 210396 ( 비-고갈영장류화된항-CD4 항체 ; IDEC/SmithKline; Arthritis & Rheumatism (1995) Vol. 38, S185); DAB 486-IL-2 및 / 또는 DAB 389-IL-2 (IL-2 융합단백질 ; Seragen; Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223); 항-Tac ( 사람화된항-IL-2Ra; Protein Design Labs/Roche); IL-4 ( 소염사이토킨 ; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; 재조합 IL-10, 소염사이토킨 ; DNAX/Schering); IL-4; IL-10 및 / 또는 IL-4 효능제 ( 예를들어, 효능제항체 ); IL-1RA (IL-1 수용체길항제 ; Synergen/Amgen); 아나킨라 (Kineret Amgen); TNF-βp/s-TNF ( 가용성 TNF 결합단백질 ; Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol. 268, pp. 37-42); R973401 ( 포스포디에스테라제 IV형억제제 ; Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282); MK-966 (COX-2 Inhibitor; Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S81); 일로프로스트 (Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S82); 메토트렉세이트 ; 탈리도미드 (Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282) 및탈리도미드-관련약물 ( 예를들어, 셀겐 ); 레플루노미드 ( 소염및사이토킨억제제 ; Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S131; Inflammation Research (1996) Vol. 45, pp. 103-107); 트라넥삼산 ( 플라스미노겐활성화억제제 ; Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S284); T-614 ( 사이토킨억제제 ; Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282); 프로스타글란딘 E1 (Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282); 테니댑 ( 비스테로이드소염약물 ; Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S280); 나프록센 ( 비스테로이드소염약물 ; Neuro Report (1996) Vol. 7, pp. 1209-1213); 멜록시캠 ( 비스테로이드소염약물 ); 이부프로펜 ( 비스테로이드소염약물 ); 피록시캠 ( 비스테로이드소염약물 ); 디클로페낙 ( 비스테로이드소염약물 ); 인도메타신 ( 비스테로이드소염약물 ); 설파살라진 (Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S281); 아자티오프린 (Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S281); ICE 억제제 ( 효소인터류킨-1b 전환효소의억제제 ); zap-70 및 / 또는 lck 억제제 ( 타이로신키나제 zap-70 또는 lck의억제제 ); VEGF 억제제및 / 또는 VEGF-R 억제제 ( 혈관내피세포성장인자또는혈관내피세포성장인자수용체의억제제 ; 혈관형성의억제제 ); 코르티코스테로이드소염약물 ( 예를들어, SB203580); TNF-컨버타제억제제 ; 항-IL-12 항체 ; 항-IL-18 항체 ; 인터류킨-11 (Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S296); 인터류킨-13 (Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S308); 인터류킨-17 억제제 (Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S120); 금 ; 페니실라민 ; 클로로퀸 ; 클로람부실 ; 하이드록시클로로퀸 ; 사이클로스포린 ; 사이클로포스파미드 ; 총림프계조사 ; 항-흉선글로불린 ; 항-CD4 항체 ; CD5-독소 ; 경구투여된펩타이드및콜라겐 ; 로벤자리트이나트륨 ; 사이토킨조절제 (CRA) HP228 및 HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); ICAM-1 안티센스포스포로티오에이트올리고-데옥시뉴클레오타이드 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); 가용성보체수용체 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); 프레드니손 ; 오르고테인 ; 글리코사미노글리캔폴리설페이트 ; 미노사이클린 ; 항-IL2R 항체 ; 해양및식물지질 ( 어류및식물종자씨드지방산 ; DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777); 아우라노핀 ; 페닐부타존 ; 메클로페남산 ; 플루페남산 ; 정맥내면역글로불린 ; 질레우톤 ; 아자리빈 ; 마이코페놀산 (RS-61443); 타크롤리무스 (FK-506); 시롤리무스 ( 라파마이신 ); 아미프릴로스 ( 테라펙틴 ); 클라드리빈 (2-클로로데옥시아데노신); 메토트렉세이트 ; bcl-2 억제제 ( 참조 : Bruncko, Milan et al., Journal of Medicinal Chemistry(2007), 50(4), 641-662); 항바이러스제및면역조절제. [0371] 한양태에서, 결합단백질또는이의항원결합부는류마티스관절염치료를위해하기의제제중하나와배합하여투여된다 : KDR의소분자억제제, Tie-2의소분자억제제 ; 메토트렉세이트 ; 프레드니손 ; 셀레콕시브 ; 폴산 ; 하이드록시클로로퀸설페이트 ; 로페콕시브 ; 에타너셉트 ; 인플릭시마브 ; 레플루노미드 ; 나프록센 ; 발데콕시브 ; 설파살라진 ; 메틸프레드니솔론 ; 이부프로펜 ; 멜록시캠 ; 메틸프레드니솔론아세테이트 ; 금나트륨티오말레이트 ; 아스피린 ; 아자티오프린 ; 트리암시놀론아세토니드 ; 프로프시펜나프실레이트 /apap; 폴레이트 ; 나부메톤 ; 디클로페낙 ; 피록시캠 ; 에토돌락 ; 디클로페낙나트륨 ; 옥사프로진 ; 옥시코돈 hcl; 하이드로코돈비타르트레이트 - 75 -
/apap; 디클로페낙나트륨 / 미소프로스톨 ; 펜타닐 ; 아나킨라, 사람재조합트라마돌 hcl; 살살레이트 ; 설린닥 ; 시아노코발라민 /fa/ 피리독신 ; 아세트아미노펜 ; 알렌드로네이트나트륨 ; 프레드니솔론 ; 모르핀설페이트 ; 리도카인하이드로클로라이드 ; 인도메타신 ; 글루코사민설페이트 / 콘드로이틴 ; 사이클로스포린 ; 아미트립틸린 hcl; 설파디아진 ; 옥시코돈 hcl/ 아세트아미노펜 ; 올로파타딘 hcl; 미소프로스톨 ; 나프록센나트륨 ; 오메프라졸 ; 미코페놀레이트모페틸 ; 사이클로포스파미드 ; 리툭시마브 ; IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-IG; IL-18 BP; IL-12/23; 항-IL 18; 항-IL 15; BIRB-796; SCIO-469; VX-702; AMG-548; VX-740; 로플루밀라스트 ; IC-485; CDC-801; 및메소프람. [0372] [0373] [0374] 본발명의결합단백질이배합될수있는염증장병에유용한치료제의비제한적예에는다음과같은것이있다 : 부데노사이드 ; 표피성장인자 ; 코르티코스테로이드 ; 사이클로스포린, 설파살라진 ; 아미노살리실레이트 ; 6-머캅토퓨린 ; 아자티오프린 ; 메트로니다졸 ; 리폭시게나제억제제 ; 메살라민 ; 올살라진 ; 발살라지드 ; 항산화제 ; 트롬복산억제제 ; IL-1 수용체길항제 ; 항-IL-1β 모노클로날항체 ; 항-IL-6 모노클로날항체 ; 성장인자 ; 엘라스타제억제제 ; 피리디닐-이미다졸화합물 ; 다른사람사이토킨또는성장인자, 예컨대 TNF, LT, IL-1, IL-2, IL- 6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF 등에대한항체또는길항제. 본발명의항체또는이의항원결합부는세포표면분자, 예컨대 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 또는이들의리간드에대한항체와조합될수도있다. 본발명의항체또는이의항원결합부는또한제제, 예컨대메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예컨대이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예컨대프레드니솔론, 포스포디에스터라제억제제, 아데노신효능제, 항혈전제, 보체억제제, 아드레날린작용제, TNFα 또는 IL-1과같은전염증성사이토킨에의한시그날전달을방해하는제제 ( 예, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제억제제 ), IL-1β 전환효소억제제, TNFα전환효소억제제, T-세포시그날전달억제제, 예컨대키나제억제제, 메탈로프로테이나제억제제, 용해성사이토킨수용체및이의유도체 ( 예, 용해성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sil-1ri, sil-1rii, sil-6r) 및소염성사이토킨 ( 예, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ) 및 bcl-2 억제제와배합될수있다. 결합단백질이배합될수있는크론병치료제의바람직한예에는다음과같은것이있다 : TNF 길항제, 예컨대항-TNF 항체, 아달리무마브 (PCT 공개 WO 97/29131; HUMIRA), CA2(REMICADE), CDP 571, TNFR-Ig 작제물, (p75tnfr1gg(enbrel) 또는 p55tnfr1gg(lenercept)) 억제제및 PDE4 억제제. 본발명의항체또는이의항원결합부는코르티코스테로이드, 예컨대부데노사이드및덱사메타손과배합될수있다. 본발명의결합단백질또는이의항원결합부는또한설파살라진, 5-아미노살리실산및올살라진과같은제제, 및전염증성사이토킨, 예컨대 IL-1, 예를들어 IL-1β 전환효소억제제및 IL-1ra의합성또는작용을방해하는제제와배합될수있다. 본발명의항체또는이의항원결합부는또한 T 세포시그날전달억제제, 예컨대타이로신키나제억제제 6-머캅토퓨린과함께사용될수있다. 본발명의결합단백질또는이의항원결합부는 IL-11과배합될수있다. 본발명의결합단백질또는이의항원결합부는메살라민, 프레드니손, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 인플릭시마브, 메틸프레드니솔론나트륨석시네이트, 디페녹실레이트 / 아트로프설페이트, 로퍼아미드하이드로클로라이드, 메토트렉세이트, 오메프라졸, 폴레이트, 시프로플록사신 / 덱스트로스-물, 하이드로코돈비타르트레이트 /apap, 테트라사이클린하이드로클로라이드, 플루오시노나이드, 메트로니다졸, 티메로살 / 붕산, 콜레스티라민 / 슈크로스, 시프로플록사신하이드로클로라이드, 하이오시아민설페이트, 메페리딘하이드로클로라이드, 미다졸람하이드로클로라이드, 옥시코돈 hcl/ 아세트아미노펜, 프로메타진하이드로클로라이드, 인산나트륨, 설파메톡사졸 / 트리메토프림, 셀레콕시브, 폴리카르보필, 프로폭시펜나프실레이트, 하이드로코르티손, 멀티비타민, 발살라지드이나트륨, 코데인포스페이트 /apap, 콜레세벨람 hcl, 시아노코발라민, 엽산, 레보플록사신, 메틸프레드니솔론, 나탈리주마브및인터페론-감마와배합될수있다. 본발명의결합단백질과배합될수있는다발성경화증치료제의비제한적예에는다음과같은것이있다 : 코르티코스테로이드 ; 프레드니솔론 ; 메틸프레드니솔론 ; 아자티오프린 ; 사이클로포스파미드 ; 사이클로스포린 ; 메토트렉세이트 ; 4-아미노피리딘 ; 티자니딘 ; 인터페론-β1a(AVONEX; Biogen); 인터페론-β1b(BETASERON; Chiron/Berlex); 인터페론 α-n3(interferon Sciences/Fujimoto), 인터페론-α(Alfa Wassermann/J&J), 인터페론 β1a-if(serono/inhale Therapeutics), 페그인터페론 α2b(enzon/schering-plough), 코폴리머 1(Cop-1; COPAXONE; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); 고압산소 ; 정맥내면역글로불린 ; 클라브리빈 ; 다른사람사이토킨또는성장인자및이의수용체, 예컨대 TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-23, IL-15, IL- 16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF에대한항체또는길항제. 본발명의결합단백질은 CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90과같은세포표면분자또는이의리간드에대한항체와조합될수있다. 본발명의결합단백질은또한제제, 예컨대메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예컨대이부프로펜, 코르티 - 76 -
코스테로이드, 예컨대프레드니솔론, 포스포디에스터라제억제제, 아데노신효능제, 항혈전제, 보체억제제, 아드레날린작용제, TNFα 또는 IL-1과같은전염증성사이토킨에의한시그날전달을방해하는제제 ( 예, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제억제제 ), IL-1β 전환효소억제제, TACE 억제제, T-세포시그날전달억제제, 예컨대키나제억제제, 메탈로프로테이나제억제제, 용해성사이토킨수용체및이의유도체 ( 예, 용해성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sil-1ri, sil-1rii, sil-6r) 및소염성사이토킨 ( 예, IL-4, IL-10, IL-13 및 TGFβ) 및 bcl-2 억제제와배합될수있다. [0375] [0376] [0377] [0378] [0379] [0380] 본발명의결합단백질과배합될수있는다발성경화증치료제의바람직한예에는인터페론 β, 예컨대 IFNβ 1a 및 IFNβ1b; 코팍손, 코르티코스테로이드, 카스파제억제제, 예컨대카스파제-1 억제제, IL-1 억제제, TNF 억제제및 CD40 리간드및 CD80에대한항체가포함된다. 본발명의결합단백질은또한제제, 예컨대알렘투주마브, 드로나비놀, 유니메드, 다클리주마브, 미토크산트론, 크살리프로덴하이드로클로라이드, 팜프리딘, 글라티라머아세테이트, 나탈리주마브, 신나비돌, a-임뮤노킨 NNSO3, ABR-215062, AnergiX.MS, 케목킨수용체길항제, BBR-2778, 칼라구알린, CPI-1189, LEM( 리포좀캡슐화된미토크산트론 ), THC.CBD( 칸나비노이드효능제 ) MBP-8798, 메소프람 (PDE4 억제제 ), MNA-715, 항- IL-6 수용체항체, 뉴로박스, 피르페니돈, 알로트랩 1258(RDP-1258), stnf-r1, 탈람파넬, 테리플루노마이드, TGF-베타2, 티플리모타이드, VLA-4 길항제 ( 예컨대, TR-14035, VLA4 Ultrahaler, Antegran-ELAN/Biogen), 인터페론감마길항제, IL-4 효능제와배합될수있다. 본발명의결합단백질과배합될수있는협심증치료제의비제한적예에는다음과같은것이있다 : 아스피린, 니트로글리세린, 이소소르비드모노니트레이트, 메토프롤롤석시네이트, 아테놀로, 메토프롤롤타르트레이트, 암로디핀베실레이트, 딜티아젬하이드로클로라이드, 이소소르비드디니트레이트, 클로피도그렐비설페이트, 니페디핀, 이토바스타틴칼슘, 염화칼륨, 후로세미드, 심바스타틴, 베라파밀 hcl, 디곡신, 프로프라놀롤, 하이드로클로라이드, 카베딜롤, 리시노프릴, 스피로노락톤, 하이드로클로로티아지드, 에나라프릴말레이트, 나돌로, 라미프릴, 에녹사파린나트륨, 헤라핀나트륨, 발사르탄, 소탈롤하이드로클로라이드, 페노피브레이트, 에제티미브, 부메타니드, 로사탄포타슘, 리시노프릴 / 하이드로클로로티아지드, 펠로디핀, 캅토프릴, 비소프롤롤푸마레이트. 본발명의결합단백질과배합될수있는강직척추염치료제의비제한적예에는다음과같은것이있다 : 이브푸로펜, 디클로페낙및미소프로스톨, 나프록센, 멜록시캄, 인도메타신, 디클로페낙, 셀레콕시브, 로페콕시브, 설파살라진, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 미노시클린, 프레드니손, 에타너셉트, 인플릭시마브. 본발명의결합단백질과배합될수있는천식치료제의비제한적예에는다음과같은것이있다 : 알부테롤, 살메테롤 / 플루티카손, 몬텔루카스트나트륨, 플루티카손프로피오네이트, 부데소니드, 프레드니손, 살메테롤크시나포에이트, 레발부테롤 hcl, 알부테롤설페이트 / 이프라트로퓸, 프레드니솔론나트륨포스페이트, 트리암시놀론아세토나이드, 베클로메타손디프로피오네이트, 이프라트로퓸브로마이드, 아지트로마이신, 피르부테롤아세테이트, 프레드니솔론, 무수테오필린, 메틸프레드니솔론나트륨석시네이트, 클라리트로마이신, 자피르루카스트, 포르모테롤푸마레이트, 인플루엔자바이러스백신, 메틸프레드니솔론, 아목시실린트리하이드레이드, 플루니솔라이드, 알레르기주사, 크로몰린나트륨, 펙소페나딘하이드로클로라이드, 플루니솔라이드 / 멘톨, 아목시실린 / 클라불라네이트, 레보플록사신, 흡입기보조장치, 구아이페네신, 덱사메타손나트륨포스페이트, 목시플록사신 hcl, 독시사이클린하이클레이트, 구아이페네신 /d-메토판, p-에페드린 /cod/ 클로페니르, 가티플록사신, 세테리진하이드로클로라이드, 모메타손퓨로에이트, 살메테롤신나포에이트, 벤조나테이트, 세팔렉신, pe/ 하이드로코돈 / 클로르페니르, 세티리진 hcl/ 슈도에페드, 페닐에프린 /cod/ 프로메타진, 코데인 / 프로메타진, 세프프로질, 덱사메타손, 구아이페네신 / 슈도에페드린, 클로페니라민 / 하이드로코돈, 네도크로밀나트륨, 테르부탈린설페이트, 에피네프린, 메틸프레드니솔론, 메타프로테레놀설페이트. 본발명의결합단백질과배합될수있는 COPD 치료제의비제한적예에는다음과같은것이있다 : 알부테롤설페이트 / 이프라트로퓸, 이프라트로퓸브로마이드, 살메테롤 / 플루티카손, 알부테롤, 살메테롤크시나포에이트, 플루티카손프로피오네이트, 프레드니손, 무수테오필린, 메틸프레드니솔론나트륨석시네이트, 몬텔루카스트나트륨, 부데소니드, 포르모테롤푸마레이트, 트리암시놀론아세토나이드, 레보플록사신, 구아이페네신, 아지트로마이신, 베클로메타손디프로피오네이트, 레발부테롤 hcl, 플루니솔라이드, 세프트리악손나트륨, 아목시실린트리하이드레이트, 가티플록사신, 자피르루카스트, 아목시실린 / 클라불라네이트, 플루니솔라이드 / 멘톨, 클로르페니라민 / 하이드로코돈, 메타프로테레놀설페이트, p-데페드린 / 로라타딘, 테르부탈린설페이트, 티오트로퓸브로마이드, (R,R)-포르모테롤, TgAAT, 실로밀라스트, 로플루밀라스트. - 77 -
[0381] [0382] [0383] [0384] [0385] [0386] [0387] 본발명의결합단백질과배합될수있는 HCV 치료제의비제한적예에는다음과같은것이있다 : 인터페론-알파 -2a, 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파 con1, 인터페론-알파-n1, 페길화된인터페론-알파-2a, 페길화된인터페론-알파-2b, 리바비린, 페그인터페론알파-2b + 리바비린, 우르소데옥시콜린산, 글리시리진산, 티말파신, 막사민, VX-497 및표적, 즉 HCV 폴리머라제, HCV 프로테아제, HCV 헬리카제, HCV IRES( 내부리보솜진입부위 ) 의간섭을통해 HCV를치료하는데사용되는임의의화합물. 본발명의결합단백질과배합될수있는특발폐섬유증치료제의비제한적예에는다음과같은것이있다 : 프레드니손, 아자티오프린, 알부테롤, 콜히친, 알부테롤설페이트, 디곡신, 감마인터페론, 메틸프레드니솔론 sod succ. 로라제팜, 후로세미드, 리시노프릴, 니트로글리세린, 스피로놀락톤, 시클로포스파미드, 이프라트로퓸브로마이드, 악티노마이신 d, 알테플라스, 플루티카손프로피오네이트, 레보플록사신, 메타프로테레놀설페이트, 몰핀설페이트, 옥시코돈 hcl, 염화칼륨, 트리암시놀론아세토나이드, 무수태크로리무스, 칼슘, 인터페론-α, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트모페틸, 인터페론-감마-1β. 본발명의결합단백질과배합될수있는심근경색치료제의비제한적예에는다음과같은것이있다 : 아스피린, 니트로글리세린, 메토프롤롤타르트레이트, 에녹사파린나트륨, 헤파린나트륨, 클로피도그렐비설페이트, 카베딜롤, 아테놀롤, 몰핀설페이트, 메토프롤롤석시네이트, 워파린나트륨, 리시노프릴, 이소소르비드모노니트레이트, 디곡신, 후로세미드, 심바스타틴, 라미프릴, 테넥테플라스, 에나라프릴말레이트, 토르세미드, 레타바스, 로사탄포타슘, 퀴나프릴 hcl/mag carb, 부메타니드, 알테플라스, 아날라프릴라트, 아미오다론하이드로클로라이드, 티로피반 hcl m-하이드레이트, 딜티아젬하이드로클로라이드, 캡토프릴, 이르베사탄, 발사탄, 프로프라놀롤하이드로클로라이드, 호시노프릴나트륨, 리도카인하이드로클로라이드, 엡티피바타이드, 세파졸린나트륨, 아트로핀설페이트, 아미노카프린산, 스피로노락톤, 인터페론, 소탈롤하이드로클로라이드, 염화칼륨, 도큐세이트나트륨, 도부타민 hcl, 알프라졸람, 프라바스타틴나트륨, 아토바스타틴칼슘, 미다졸람염삼염, 메페리딘하이드로클로라이드, 이소소르비드디니트레이트, 에피네프린, 도파민하이드로클로라이드, 비파리루딘, 로수바스타틴, 엑제티미브 / 심바스타틴, 아바시미브, 카리포라이드. 본발명의결합단백질과배합될수있는건선치료제의비제한적예에는다음과같은것이있다 : KDR의소분자억제제, Tie-2의소분자억제제, 칼시포트리엔, 클로베타솔프로피오네이트, 트리암시놀론아세토나이드, 할로베타솔프로피오네이트, 타자로텐, 메토트렉세이트, 플루오시노나이드, 베타메타손 diprop 보강형, 플루오시놀론아세토나이드, 아시트레틴, 타르샴푸, 베타메타손발레레이트, 모메타손후로에이트, 케토코나졸, 프라목신 / 플루오시놀론, 하이드로코르티손발레레이트, 플루안드레놀라이드, 우레아, 베타메타손, 클로베타솔프로피오네이트 / 에몰, 플루티카손프로피오네이트, 아지트로마이신, 하이드로코르티손, 보습포뮬라, 엽산, 데소니드, 피메크로리무스, 콜타르, 디플로라손디아세테이트, 에타너셉트폴레이트, 젖산, 메톡살렌, hc/ 비스무스 subgal/znox/resor, 메틸프레드니솔론아세테이트, 프레드니손, 선스크린, 할시노나이트, 살리실산, 안트랄린, 클로코르톨론피발레이트, 석탄추출물, 콜타르 / 살리실산, 콜타르 / 살리실산 / 황, 데속시메타손, 디아제팜, 피부연화제, 플루오시노나이드 / 피부연화제, 광유 / 피마자유 /na lact, 광유 / 땅콩유, 석유 / 이소프로필미리스테이트, 프소랄렌, 살리실산, 비누 / 트리브롬살란, 티메로살 / 붕산, 셀레콕시브, 인플릭시마브, 사이클로스포린, 알레파셉트, 에팔리주마브, 태크로리무스, 피메크로리무스, PUVA, UVB, 설파살라진. 본발명의결합단백질과배합될수있는건선관절염치료제의비제한적예에는다음과같은것이있다 : 메토트렉세이트, 에타너셉트, 로페콕시브, 셀레콕시브, 엽산, 설파살라진, 나프록센, 레플루노미드, 메틸프레드니솔론아세테이트, 인도메타신, 하이드록시클로로퀸설페이트, 프레드니손, 설린닥, 베타메타손 diprop 보강형, 인플릭시마브, 메토트렉세이트, 폴레이트, 트리암시놀론아세토나이드, 디클로페낙, 디메틸설폭사이드, 피록시캄, 디클로페낙나트륨, 케토프로펜, 멜록시캄, 메틸프레드니솔론, 나부메톤, 톨메틴나트륨, 칼시포트리엔, 사이클로스포린, 디클로페낙나트륨 / 미소프로스톨, 플루오시노나이드, 글루코사민설페이트, 골드나트륨티오말레이트, 하이드로코돈비타르트레이트 /apap, 이부프로펜, 리세드로네이트나트륨, 설파디아진, 티오구아닌, 발데콕시브, 알레파셉트, 에팔리주마브및 bcl-2 억제제. 본발명의결합단백질과배합될수있는재협착증치료제의비제한적예에는다음과같은것이있다 : 시로리무스, 파클리탁셀, 에버로리무스, 타크로리무스, 조타롤리무스, 아세타미노펜. 본발명의결합단백질과배합될수있는좌골신경통치료제의비제한적예에는다음과같은것이있다 : 하이드로코돈비타르트레이트 /apap, 로페콕시브, 시클로벤자프린 hcl, 메틸프레드니솔론, 나프록센, 이부프로펜, 옥시코돈 hcl/ 아세타미노펜, 셀렉코시브, 발데콕시브, 메틸프레드니솔론아세테이트, 프레드니손, 코데인포스페이트 /apap, 트라마돌 hcl/ 아세타미노펜, 메탁사론, 멜록시캄, 메토카르바몰, 리도카인하이드로클로라, 디플로페 - 78 -
낙나트륨, 가바펜틴, 덱사메타손, 카리소프로돌, 케토롤락트로메타민, 인도메타신, 아세타미노펜, 디아제팜, 나부메톤, 옥시코돈 hcl, 티자니딘 hcl, 디클로페낙나트륨 / 미소프로스톨, 프로폭시펜냅실레이트 /apap, asa/oxycod/ 옥시코돈 ter, 이부프로펜 / 하이드로코돈 bit, 트라마돌 hcl, 에토돌락, 프로폭시펜 hcl, 아미트립틸린 hcl, 카리소프로돌 / 코데인 phos/asa, 몰핀설페이트, 멀티비타민, 나프록센나트륨, 오르페나드린시트레이트, 테마제팜. [0388] [0389] [0390] [0391] [0392] [0393] [0394] 본발명의결합단백질과배합될수있는 SLE( 루푸스 ) 치료제의바람직한예에는다음과같은것이있다 : NSAID, 예컨대디클로페낙, 나프록센, 이부프로펜, 피록시캄, 인도메타신 ; COX2 억제제, 예컨대셀레콕시브, 로페콕시브, 발데콕시브 ; 항말라리아제, 예컨대하이드록시클로로퀸 ; 스테로이드, 예컨대프레드니손, 프레드니솔론, 부데노사이드, 덱사메타손 ; 세포독성제, 예컨대아자티오프린, 시클로포스파미드, 미코페놀레이트모페틸, 메토트렉세이트 ; PDE4 억제제또는퓨린합성억제제, 예컨대셀레셉트. 본발명의결합단백질은또한설파살라진, 5-아미노살리실산, 올살라진, 이뮤란및 IL-1과같은전염증성사이토킨의합성, 생산또는작용을방해하는제제, 예컨대 IL-1β 전환효소억제제및 IL-1ra와같은카스파제억제제와배합될수있다. 본발명의결합단백질은또한 T 세포시그날전달억제제, 예컨대티로신키나제억제제 ; 또는 T 세포활성화분자를표적으로하는분자, 예컨대 CTLA-4-IgG 또는항-B7계항체, 항-PD-1계항체등과함께사용될수있다. 본발명의결합단백질은 IL-11 또는항사이토킨항체, 예컨대포노토리주마브 ( 항-IFNg 항체 ) 또는항수용체항체, 예컨대항-IL-6 수용체항체및 B-세포표면분자에대한항체와조합될수있다. 또한, 본발명의항체또는이의항원결합부는 LJP 394( 아베티무스 ), B-세포를불활성화시키거나고갈시키는제제, 예컨대리툭시마브 ( 항-CD20 항체 ), 림포스태트-B( 항-BlyS 항체 ), TNF 길항제, 예컨대항-TNF 항체, D2E7(PCT 공개 WO 97/29131; HUMIRA), CA2(REMICADE), CDP571, TNFR-Ig 작제물 (P75TNFRIgG(ENBREL) 및 p55tnfrigg(lenercept)) 및 bcl-2 억제제와함께사용될수있는데그이유는유전자전이마우스에서 bcl-2 과발현이낭창과같은표현형을유발하는것으로입증되었고 ( 문헌참조 : Marquina, Regina et al., Journal of Immunology(2004), 172(11), 7177-7185) 따라서이의억제가치료학적효과를가질것으로예상되기때문이다. 본발명의약제학적조성물은본발명의결합단백질의 " 치료학적유효량 " 또는 " 예방학적유효량 " 을포함할수있다. " 치료학적유효량 " 이란용어는원하는치료결과를수득하기위한투여량과필요기간동안의유효한양을의미한다. 상기항체또는항체일부의치료학적유효량은당업자라면결정할수있는것으로서, 질병상태, 연령, 성별및개체의체중과개체내에서원하는반응을유도해내는항체또는항체일부의능력과같은요인에따라달라질수있다. 또한, 치료학적유효량은치료학적유익효과가항체또는항체일부의임의의독성또는유해효과를능가하는양이다. " 예방학적유효량 " 은원하는예방학적결과를수득하기위한투여량및필요기간동안의유효한양을의미한다. 일반적으로, 예방학적용량은질병의초기단계전이나초기단계에피검체에사용되기때문에예방학적유효량은치료학적유효량보다적은양일것이다. 투여계획은원하는최적반응 ( 예컨대, 치료학적또는예방학적반응 ) 을제공하도록조정될수있다. 예를들어, 1회의일시주사를투여할수도있고, 여러분할용량을경시적으로투여할수도있으며또는치료상황의위급성에따라비례하여감소또는증가된용량을투여할수도있다. 특히, 투여용이성과투여량의균일성을위해비경구조성물을투여단위형태로조제하는것이유리하다. 본명세서에사용된투여단위형태는치료하는포유동물피검체에대하여단일투여량으로서적당한물리적으로분리된단위를의미한다. 따라서, 각단위는필요한약제학적담체와관련하여원하는치료효과를제공하도록계산된소정양의활성화합물을포함한다. 본발명의투여단위형태에대한세부사항은 (a) 활성화합물의독특한특징및수득하고자하는특정치료또는예방학적효과, 및 (b) 개체의민감도치료에있어서상기활성화합물을배합하는기술고유의제한에따라결정되고직접좌우된다. 본발명의결합단백질의치료학적또는예방학적유효량에대한비제한의예시적범위는 0.1 내지 20mg/kg, 더바람직하게는 1 내지 10mg/kg 이다. 용량값이완화될병태의유형및중증도에따라다양할수있음을주지해야한다. 또한, 투여량값은개체의필요및조성물투여를관리하거나감독하는자의전문가적판단에따라경시적으로조정되어야하며, 본명세서에제시된투여량범위는예시적일뿐이며청구된조성물의범위또는실시를제한하고자하는것이아님을명심해야한다. V. 진단본원에기재된내용은또한진단적용을제공한다. 이것은하기에서추가로설명된다. I. 분석방법 - 79 -
[0395] [0396] [0397] [0398] [0399] [0400] 본발명은또한본원에기재된바와같은하나이상의 DVD-Ig를사용하여시험샘플에서분석물 ( 또는이의단편 ) 의존재, 양또는농도를결정하는방법을제공한다. 당업계에공지된바와같은임의의적합한분석이당해방법에사용될수있다. 이의예는면역분석, 예를들어, 샌드위치면역분석 ( 예를들어, 모노클로날, 폴리클로날및 / 또는 DVD-Ig 샌드위치면역분석또는이의임의의변형 ( 예를들어, 모노클로날 /DVD-Ig, DVD-Ig/ 폴리클로날등 ) 을포함하지만이에제한되지않고방사성동위원소검출 ( 방사성면역분석 (RIA)) 및효소검출 ( 효소면역분석 (EIA) 또는효소결합된면역흡착분석 (ELISA) ( 예를들어, Quantikine ELISA 분석, R&D Systems, Minneapolis, MN))), 경쟁억제면역분석 ( 예를들어, 정배향및역배향 ), 형광편광면역분석 (FPIA), 효소다중면역분석기술 (EMIT), 생물발광공명에너지전달 (BRET), 및균일한화학발광분석등을포함한다. SELDI 기본면역분석에서, 목적하는분석물 ( 이의단편 ) 에특이적으로결합하는포획시약은질량분광측정프로브, 예를들어, 예비활성화된단백질칩어레이에부착된다. 당해분석물 ( 또는이의단편 ) 은이어서바이오칩상에특이적으로포획되고포획된분석물 ( 또는이의단편 ) 은질량분광측정에의해검출된다. 또는분석물 ( 또는이의단편 ) 은포획시약으로부터용출되고통상의 MALDI ( 매트릭스원조레이저탈착 / 이온화또는 SELDI에의해검출된다. 화학발광나노입자면역분석, 특히, ARCHITECT 자동화분석기 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) 를사용하는면역분석은바람직한면역분석의한예이다. 뇨, 혈액, 혈청및혈장및기타체액을수거하고, 취급하고프로세싱하기위해당업계에널리공지된방법이본발명의수행을위해사용되고, 예를들어, 본원에기재된바와같은 DVD-Ig가면역진단시약으로서및 / 또는분석물면역분석키트에서사용되는경우이다. 시험샘플은목적하는분석물에추가로항체, 항원, 합텐, 호르몬, 약물, 효소, 수용체, 단배질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 올리고뉴클레오타이드및 / 또는폴리뉴클레오타이드와같은잔기를포함할수있다. 예를들어, 당해샘플은피험체로부터수득되는전혈샘플일수있다. 본원에기재된바와같은면역분석전에시험샘플, 특히, 전혈을전처리시약으로처리될필요가있거나요망될수있다. 전처리가필요하지않은경우라도 ( 예를들어, 대부분뇨샘플 ), 전처리가임의로수행될수있다 ( 예를들어, 상업적플랫폼상의계획의일부로서 ). 전처리시약은본발명의면역분석및키트와함께사용하기에적당한임의의시약일수있다. 전처리는임의로다음을포함한다 : (a) 하나이상의용매 ( 예를들면, 메탄올및에틸렌글리콜 ) 및임의로염, (b) 하나이상의용매및염, 및임의로세제, (c) 세제, 또는 (d) 세제및염. 전처리시약은당업계에공지되어있고이러한전처리는예를들어, 문헌 [ 참조 : 예를들어, Yatscoff et al., Abbott TDx Monoclonal Antibody Assay Evaluated for Measuring Cyclosporin in Whole Blood, Clin. Chem. 36: 1969-1973 (1990), and Wallemacq et al., Evaluation of the New AxSYM Cyclosporine Assay: Comparison with TDx Monoclonal Whole Blood and EMIT Cyclosporine Assays, Clin. Chem. 45: 432-435 (1999)) 에기재된바와같은 Abbott TDx, AxSYM, 및 ARCHITECT 분석기 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), 및 / 또는상업적으로시판되는것으로서사용될수있다. 추가로전처리는문헌 [ 참조 : Abbott's U.S. Pat. No. 5,135,875, European Pat. Pub. No. 0 471 293, U.S Provisional Pat. App. 60/878,017, filed December 29, 2006, and U.S. Pat. App. Pub. No. 2008/0020401 ( 전처리에관하여이의전반적인기재내용이본원에참조로서인용된다 ) 에기재된바와같이수행될수있다. 전처리시약은이종성제제또는동종성제제일수있다. 이종성전처리시약의사용으로, 전처리시약은샘플에존재하는분석물결합단백질 ( 예를들어, 분석물또는이의단편에결합할수있는단백질 ) 을침전시킨다. 당해전처리단계는샘플에전처리제제의첨가로형성된혼합물의상등액을침전된분석물결합단백질로부터분리함에의해임의의분석물결합단백질을제거함을포함한다. 당해분석에서, 임의의결합단백질이부재인혼합물의상등액이당해분석에사용되고직접항체포획단계로진행한다. 동종의전처리시약의사용시에는당해분리단계가없다. 시험샘플및전처리시약의전체혼합물을표지된항-분석물항체 ( 또는항원적으로반응성인이의단편 ) 와같은분석물 ( 또는이의단편 ) 에대해표지된특이적결합파트너와접촉시킨다. 당해분석을위해사용되는전처리시약은제1 특이적결합파트너에의한포획전또는포획동안에전처리된시험샘플혼합물중에희석시킨다. 당해희석에도불구하고, 특정양의전처리시약은포획동안에시험샘플혼합물중에존재 ( 또는잔류 ) 한다. 본발명에따라, 표지된특이적결합파트너는 DVD-Ig ( 또는이의단편, 변이체, 또는변이체의단편 ) 일수있다. 이종성포맷에서, 시험샘플이피험체로부터수득된후제1 혼합물을제조한다. 당해혼합물은분석물 ( 또는이의단편 ) 에대해평가된시험샘플및제1 특이적결합파트너를포함하고, 여기서, 제1 특이적결합파트너및시험샘플중에함유된임의의샘플은제1 특이적결합파트너-분석물복합체를형성한다. 바람직하게, 제1 특이적결합파트너는항-분석물항체또는이의단편이다. 제1 특이적결합파트너는본원에기재된바와같은 - 80 -
DVD-Ig ( 또는단편, 변이체또는변이체의단편 ). 혼합물을형성하기위해시험샘플및기타특이적결합파트너가첨가되는순서는중요하지않다. 바람직하게, 제1 특이적결합파트너는고형상에고정화된다. 면역분석 ( 제1 특이적결합파트너및임의로제2 특이적결합파트너에대해 ) 에사용되는고형상은자기입자, 비드, 시험튜브, 미세적정플레이트, 큐벳, 막, 스캐폴딩분자, 필름, 여과지, 디스크및칩 ( 이에제한되지않음 ) 과같은당업계에공지된임의의고형상일수있다. [0401] [0402] [0403] [0404] [0405] 제1 특이적결합파트너-분석물복합체를함유하는혼합물이형성된후, 임의의결합되지않은분석물이당업계에공지된임의의기술을사용하여복합체로부터제거된다. 예를들면, 비결합된분석물은세척에의해제거될수있다. 바람직하게, 그러나, 제1 특이적결합파트너는시험샘플중에존재하는임의의분석물을초과하여존재하여시험샘플중에존재하는모든분석물은제1 특이적결합파트너에의해결합되어있다. 임의의비결합된분석물이제거된후, 제1 특이적결합파트너는제1 특이적결합파트너-분석물-제2 특이적결합파트너복합체를형성하기위해혼합물에첨가된다. 제2 특이적결합파트너는바람직하게제1 특이적결합파트너에의해결합된분석물상의에피토프와는상이한분석물상의에피토프에결합하는항-분석물항체이다. 더욱이, 또는바람직하게, 제2 특이적결합파트너는상기된바와같은검출가능한표지로표지되거나이를포함한다. 제2 특이적결합파트너는본원에기재된바와같은 DVD-Ig ( 또는단편, 변이체또는변이체의단편 ) 일수있다. 당업계에공지된바와같은임의의적합한검출가능한표지가사용될수있다. 예를들어, 검출가능한표지는방사성활성표지 ( 예를들어, 3H, 1251, 35S, 14C, 32P, 및 33P), 효소적표지 ( 예를들어, 서양고추냉이퍼옥시다제, 알칼린퍼옥시다제, 글루코스 6-포스페이트데하이드로게나제등 ), 화학발광표지 ( 예를들어, 아크리디늄에스테르, 티오에스테르, 또는설폰아미드 ; 루미놀, 이소루미놀, 펜안트리디늄에스테르등 ), 형광표지 ( 예를들어, 플루오레세인 ( 예를들어, 5 -플루오레세인, 6-카복시플루오레세인, 3'6-카복시플루오레세인, 5(6)-카복시플루오레세인, 6-헥사클로로-플루오레세인, 6-테트라클로로플루오레세인, 플루오레세인이소티오시아네이트등 )), 로다민, 물리화학적단백질, R-피지코에리트린, 쿠안텀도트 ( 예를들어, 황화아연-캡핑된셀렌화카드뮴 ), 온도측정표지, 또는면역-폴리머라제연쇄반응표지일수있다. 표지로의도입, 표지과정및표지검출은문헌 [ 참조 : Polak and Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 2nd ed., Springer Verlag, N.Y. (1997), and in Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996)( 조합된핸드북및문헌 ( 참조 : Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon에의해공개된카탈로그 )] 에서밝혀졌다. 형광표지는 FPIA( 문헌참조 : 미국특허제5,593,896호, 제5,573,904호, 제5,496,925호, 제5,359,093호, 및제5,352,803호, 이들문헌은그전체가본원에참조로서인용된다 ) 에사용될수있다. 아크리디늄화합물은동종또는이종화학발광분석중에검출가능한표지로서사용될수있다 ( 문헌참조 : Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006); Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313-2317 (2004); Adamczyk et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917-3921 (2004); and Adamczyk et al., Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003)). 바람직한아크리디늄화합물은아크리디늄-9-카복스아미드이다. 아크리디늄 9-카복스아미드를제조하는방법은문헌 [ 참조 : Methods for preparing acridinium 9-carboxamides are described in Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107-114 (1991); Adamczyk et al., J. Org. Chem. 63: 5636-5639 (1998); Adamczyk et al., Tetrahedron 55: 10899-10914 (1999); Adamczyk et al., Org. Lett. 1 : 779-781 (1999); Adamczyk et al., Bioconjugate Chem. 11 : 714-724 (2000); Mattingly et al., In Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; Dyke, K. V. Ed.; CRC Press: Boca Raton, pp. 77-105 (2002); Adamczyk et al., Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003); 및미국특허제5,468,646호, 제5,543,524호및제5,783,699호 ] 에기재되어있다 ( 상기문헌들은각각그전체가동일한것으로간주되는교시에대해본원에참조로서인용된다 ). 또다른바람직한아크리디늄화합물은아크리디늄-9-카복실레이트아릴에스테르이다. 아크리디늄-9-카복실레이트에스테르의예는 10-메틸-9-( 페녹시카보닐 ) 아크리디늄플루오로설포네이트 ( 제조원 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) 으로부터시판됨 ) 이다. 아크리디늄 9-카복실레이트아릴에스테르를제조하는방법은문헌 [ 참조 : McCapra et al., Photochem. Photobiol. 4: 1111-21 (1965); Razavi et al., Luminescence 15: 245-249 (2000); Razavi et al., Luminescence 15: 239-244 (2000); 및미국특허제5,241,070호 ] 에기재되어있다 ( 상기문헌들은각각그전체가동일한것으로간주되는교시에대해본원에참조로서인용된다 ). 아크리디늄-9-카복실레이트아릴에스테르및이의용도에관한추가의세부사항은 US 2008-0248493에기재되어있다. 화학발광분석 ( 상기된바와같은아크리디늄또는다른화학발광제를사용하는 ) 은문헌 [ 참조 : Adamczyk et al., Anal. Chim. Acta 579(1): 61-67 (2006)] 에기재된방법에따라수행할수있다. 임의의적합한분석포맷이사용될수있지만, 미세플레이트화학발광측정기 (Mithras LB-940, Berthold Technologies U.S.A., LLC, Oak - 81 -
Ridge, TN) 로신속하게소량의다발성샘플분석을수행할수있다. [0406] [0407] [0408] [0409] [0410] 시험샘플및특이적결합파트너가화학발광분석용혼합물을형성하기위해첨가되는순서는중요하지않다. 제1 특이적결합파트너가화학발광제 ( 예를들어, 아크리디늄화합물 ) 로표지되는경우, 검출가능하게표지된제1 특이적결합파트너-분석물복합체가형성된다. 또한, 제2 특이적결합파트너가사용되고제2 특이적결합파트너가아크리디늄화합물과같은화학발광제로검출가능하게표지되는경우, 검출가능하게표지된제1 특이적결합분석물제2 비특이적결합파트너복합체가형성된다. 임의의비결합된특이적결합파트너는표지된또는비표지된것에상관없이세척과같은당업계에공지된임의의기술을사용하여혼합물로부터제거될수있다. 과산화수소는혼합물중에서동일계에서생성될수있거나상기된아크리디늄화합물첨가전, 이와동시에또는이후에혼합물에제공되거나공급될수있다 ( 예를들어, 과산화수소의공급원은과산화수소를함유하는것으로공지된하나이상의완충액또는기타용액이다 ). 과산화수소는당업자에게자명한바와같은다수의방식으로동일계에서생성될수있다. 샘플에하나이상의염기성용액의동시또는후속적첨가시, 검출가능한시그날, 즉, 화학발광시그날 ( 분석물의존재를지적함 ) 이생성된다. 염기성용액은 10 이상, 바람직하게는 12 이상의 ph를갖는다. 염기성용액의예는수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화암모늄, 수산화마그네슘, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 수산화칼슘, 탄산칼슘, 및중탄산칼슘을포함하지만이에제한되지않는다. 샘플에첨가된염기성용액의양은염기성용액의농도에의존한다. 사용되는염기성용액의농도를기준으로, 당업자는샘플에첨가하기위한염기성용액의양을용이하게결정할수있다. 생성된화학발광시그날은당업자에게공지된통상적인기술을사용하여검출될수있다. 생성된시그날강도를기준으로, 샘플중의분석물의양은정량될수있다. 구체적으로, 샘플중의분석물의양은생성된시그날의강도에비례한다. 존재하는분석물의양은분석물에대한표준곡선에대해생성된빛의양을비교하거나참조표준물질과비교하여정량할수있다. 표준곡선은질량분광측정, 중력측정방법및당업계에공지된다른기술에의해공지된농도의분석물의연속희석액또는용액을사용하여생성될수있다. 화학발광제로서아크리디늄화합물의사용에대한강조와함께기재되지만당업자는기타화학발광제의사용을위해당해기내내용을용이하게적용할수있다. 분석물면역분석은일반적으로샌드위치포맷 ( 이에제한되지않음 ) 과같은당업계에공지된임의의포맷을사용하여수행할수있다. 구체적으로, 하나의면역분석포맷에서, 2개이상의항체를사용하여샘플중의사람분석물또는이의단편과같은분석물을분리하고정량한다. 보다구체적으로, 2개이상의항체는 " 샌드위치 " 로서언급되는면역복합체를형성하는분석물 ( 또는이의단편 ) 상에상이한에피토프에결합한다. 일반적으로, 면역분석에서, 하나이상의항체 ( 이들항체는 " 포획 " 항체또는 " 포획 " 항체들로서흔히언급된다 ) 를사용하여시험샘플중에분석물 ( 또는이의단편 ) 을포획하고하나이상의항체를사용하여샌드위치에검출가능한 ( 즉, 정량가능한 ) 표지를결합시킬수있다 ( 이들항체는흔히 " 검출항체 ", " 검출항체들 ", " 접합체 " 또는 " 접합체들 " 로서언급된다 ). 따라서, 샌드위치면역분석포맷과관련하여, 본원에기재된바와같은 DVD-Ig ( 또는단편, 변이체또는변이체의단편 ) 를포획항체, 검출항체또는둘다로서사용될수있다. 예를들어, 분석물 ( 또는이의단편 ) 상에제1 에피토프에결합할수있는도메인을갖는하나의 DVD-Ig는포획항체로서사용될수있고 / 있거나분석물 ( 또는이의단편 ) 상에제2 에피토프와결합할수있는도메인을갖는또다른 DVD-Ig는검출항체로서사용될수있다. 이와관련하여, 분석물 ( 이의단편 ) 상에제1 에피토프와결합할수있는제1 도메인및분석물 ( 또는이의단편 ) 상에제2 에피토프와결합할수있는제2 도메인을갖는 DVD-Ig는포힉항체및 / 또는검출항체로서사용될수있다. 또한, 제1 분석물 ( 또는이의단편 ) 상에에피토프를결합할수있는제1 도메인및제2 분석물 ( 또는이의단편 ) 상에에피토프와결합할수있는제2 도메인을갖는하나의 DVD-Ig는 2개이상의분석물을검출하고임의로정량하기위해포획항체및 / 또는검출항체로서사용될수있다. 분석물이동종성또는이종성일수있는단량체형태및이량체 / 다량체형태와같은 1개이상의형태로샘플중에존재할수있는경우에, 단량체형태상에서만노출된에피토프에결합할수있는도메인을갖는하나의 DVD-Ig 및이량체 / 다량체형태의상이한부분상의에피토프와결합할수있는도메인을갖는또다른 DVD-Ig는포획항체및 / 또는검출항체로서사용되어검출을가능하게하고상이한형태의소정의분석물을정량할수있게한다. 추가로, 단일 DVD-Ig내및 / 또는 DVD-Ig 사이에차등적친화성을갖는 DVD-Ig를사용하여결합가잇점을제공할수있다. 본원에기재된면역분석과관련하여, 이것은일반적으로 DVD-Ig의구조물내하나이상의링커를혼입시키기위해도움을줄수있거나요망될수있다. 존재하는경우, 최적으로링커는외곽도메인에의한또다른에피토프의결합뿐만아니라내부도메인에의한에피토프의결합을가능하게하기위해충분한길이및구조적실행가능성을가져야만 - 82 -
한다. 이와관련하여, DVD-Ig 가 2 개의상이한분석물과결합할수있고하나의분석물이또다른분석물보다큰 경우, 바람직하게대형분석물은외곽도메인에의해결합된다. [0411] [0412] [0413] [0414] [0415] 일반적으로말해서, 분석물 ( 또는이의단편 ) 에대해 ( 함유된것으로의심되는 ) 시험된샘플은동시에또는후속적으로및임의의순서로하나이상의포획항체 ( 또는항체들 ) 및하나이상의검출항체 ( 이것은제2 검출항체또는제2 검출항체일수있거나심지어연속적으로번호를매긴항체, 예를들어, 경우에따라포획및 / 또는검출항체가다중항체를포함한다 ) 와접촉시킬수있다. 예를들어, 시험샘플은먼저하나이상의포획항체와접촉시킴에이어서연속적으로하나이상의검출항체와접촉시킬수있다. 또한시험샘플은먼저하나이상의검출항체와접촉시키고이어서 ( 연속적으로 ) 하나이상의포획항체와접촉시킬수있다. 또다른양태에서, 시험샘플은포획항체및검출항체와동시에접촉시킬수있다. 샌드위치분석포맷에서, 분석물 ( 또는이의단편 ) 을함유하는의심되는샘플은먼저제1 항체 / 분석물복합체의형성을허용하는조건하에서하나이상의제1 포획항체와접촉시킨다. 하나이상의포획항체가사용되는경우, 2개이상의포획항체를포함하는제1 포획항체 / 분석물복합체가형성된다. 샌드위치분석에서, 당해항체, 즉, 바람직하게하나이상의포획항체가시험샘플에서예상되는몰과량의최대량의분석물 ( 또는이의단편 ) 에사용된다. 예를들어, 완충액 ( 예를들어, 미세입자피복완충액 ) ml당약 5 μg 내지약 1 mg의항체가사용될수있다. 단지하나의항체에의한결합이요구되기때문에작은분석물을측정하기위해흔히사용되는경쟁억제면역분석은연속적및통상적포맷을포함한다. 연속적경쟁억제면역분석에서, 목적하는분석물에대한포획항체를미세적정플레이트또는기타고체지지체의웰상으로피복시킨다. 목적하는분석물을함유하는샘플이웰에첨가되는경우, 목적하는분석물은포획항체에결합한다. 세척후, 공지된양의표지된 ( 예를들어, 비오틴또는서양고추냉이퍼옥시다제 (HRP)) 분석물을당해웰에첨가한다. 효소적표지에대한기질은시그날을생성할필요가있다. HRP를위해적합한기질의예는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 이다. 세척후, 표지된분석물에의해생성된시그날은측정하고샘플중의분석물의양과반비례한다. 통상적인경쟁억제면역분석에서, 목적하는분석물에대한항체는고형상지지체 ( 예를들어, 미세역가플레이트의웰 ) 상으로피복시킨다. 그러나, 연속적인경쟁억제면역분석같지않게당해샘플및표지된분석물은동시에웰에첨가한다. 샘플중의임의의분석물은포획항체에결합하는것에대해표지된분석물과경쟁한다. 세척후, 표지된분석물에의해생성된시그날을측정하고샘플중의분석물의양에반비례한다. 임의로, 시험샘플을하나이상의포획항체 ( 예를들어, 제1 포회항체 ) 와접촉시키기전에, 하나이상의포획항체를, 시험샘플로부터제1 항체 / 분석물 ( 또는이의단편 ) 복합체의분리를촉진시키는고형지지체상에결합시킬수있다. 포획항체가결합된기질은샘플로부터포획항체-분석물복합체의분리를촉진시키는임의의적합한고형지지체또는고형상일수있다. 이의예는미세적정플레이트와같은플레이트의웰, 시험튜브, 다공성겔 ( 예를들어, 실리카겔, 아가로스, 덱스트란, 또는젤라틴 ), 중합체필름 ( 예를들어, 폴리아크릴아미드 ), 비드 ( 예를들어, 폴리스티렌비드또는자기비드 ), 여과기 / 막 ( 예를들어, 니트로셀룰로스또는나일론 ) 스트립, 미세입자 ( 예를들어, 라텍스입자, 자기화될수있는미세입자 ( 예를들어, 산화철또는산화크로뮴및동종또는이종중합체피복물을갖고반경이약 1 내지 10μm ) 를포함한다. 당해기질은항원과결합하기에적합한표면친화성및검출항체에의한접근을허용하기에충분한다공성을갖는적합한다공성물질을포함할수있다. 수화된상태의젤라틴성물질이사용될수있지만미세다공성물질이일반적으로바람직하다. 당해다공성기질은바람직하게두께가약 0.01 내지약 0.5mm, 바람직하게는약 0.1mm인쉬트형태이다. 공극크기는상당히다양할수있지만바람직하게공극크기는약 0.025에서약 15μm이고보다바람직하게는약 0.15에서약 15μm이다. 당해기질의표면은항체의기질로의공유결합을유발하는화학적공정에의해활성화될수있다. 일반적으로항원또는항체의기질로의소수성힘을통한흡착에의한비가역적결합이생성된다. 또한, 화학적커플링제제또는기타다른수단을사용하여항체를기질로공유결합시킬수있고단, 당해결합은분석물에결합하는항체의능력을방해하지않는다. 또는, 당해항체는사전에스트렙트아비딘 ( 예를들어, DYNAL Magnetic Beads, Invitrogen, Carlsbad, CA) 또는비오틴으로피복된미세입자 ( 예를들어, Power-BindTM-SA-MP 스트렙트아비딘피복된미세입자 (Seradyn, Indianapolis, IN)) 또는항-종-특이적모노클로날항체와결합될수있다. 필요하다면, 당해기질은다양한기능성그룹과의반응을허용하기위해유도체화될수있다. 당해유도체화는특정커플링제의사용을요구하고이의예는말레산무수물, N-하이드록시숙신이미드, 및 l-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 ) 카보디이미드를포함하지만이에제한되지않는다. 경우에따라, 하나이상의포획시약, 예를들어, 항체 ( 또는이의단편 ) 를포함하지만이에제한되지않고분석물에특이적인이의각각은상이한물리적또는허용가능한위치 ( 예를들어, 바 - 83 -
이오칩배위 ( 문헌참조 : 예를들어, 미국특허제6,225,047호 ; Int'l Pat. App. Pub. No. WO 99/51773; 미국특허제6,329,209호 ; Int'l Pat. App. Pub. No. WO 00/56934, and U.S. Pat. No. 5,242,828)] 에서고형상에부착될수있다. 포획시약이고형지지체로서질량분광측정프로브에부착되는경우, 당해프로브에결합된분석물의양은레이져탈착이온화질량분광측정에의해검출될수있다. 또는, 단일칼럼은상이한비드로팩킹될수있고당해비드는하나이상의포획시약으로유도체화되어단일위치에서분석물을포획한다 ( 참조 : 항체유도체화된비드기본기술, 예를들어, 루미넥스 xmap 기술 (Austin, TX)). [0416] [0417] [0418] [0419] [0420] 분석물 ( 또는이의단편 ) 에대해분석된시험샘플을하나이상의포획항체 ( 예를들어, 제1 포획항체 ) 와접촉시킨후, 당해혼합물을, 제1 항체 ( 또는다중항체 )-분석물( 이의단편 ) 복합체가형성되도록항온처리한다. 항온처리는약 2 내지약 45 의온도에서약 4.5 내지약 10.0의 ph에서적어도약 1분내지약 18시간, 바람직하게는약 1 내지약 24분, 가장바람직하게는약 4 내지약 18분동안수행될수있다. 본원에기재된면역분석은 1단계 ( 샘플, 하나이상의포획항체및하나이상의검출항체가모두연속적으로또는동시에반응용기에첨가됨을의미하는 ) 또는 1개이상의단계, 예를들어, 1단계이상, 예를들어, 2단계, 3단계등으로수행할수있다. ( 제1 또는다중 ) 포획항체 / 분석물 ( 또는이의단편 ) 복합체의형성후, 당해복합체를이어서 ( 제1 또는다중 ) 포획항체 / 분석물 ( 또는이의단편 )/ 제2 검출항체복합체 ) 의형성을허용하는조건하에서하나이상의검출항체와접촉시킨다. 명백하기위해 " 제2" 항체로서 ( 예를들어, 제2 검출항체 ) 포획되지만, 사실다중항체가포획및 / 또는검출을위해사용되는경우, 하나이상의검출항체가면역분석에서사용되는제2, 제3, 제4 항체등일수있다. 포획항체 / 분석물 ( 또는이의단편 ) 복합체가하나이상의검출항체와접촉되는경우, ( 제1 또는다중 ) 포획항체 / 분석물 ( 또는이의단편 )/( 다중 ) 검출항체복합체가형성된다. 포획항체 ( 예를들어, 제1 포획항체 ) 에대하여, 하나이상의 ( 예를들어, 제2 및임의의연속 ) 검출항체가포획항체 / 분석물 ( 또는이의단편 ) 복합체와접촉되는경우상기된것들과유사한조건하에서항온처리가 ( 제1 또는다중 ) 포획항체 / 분석물 ( 또는이의단편 )/( 제2 또는다중 ) 검출항체복합체의형성을위해요구된다. 바람직하게, 하나이상의검출항체는검출가능한표지를포함한다. 검출가능한표지는 ( 제1 또는다중 ) 포획항체 / 분석물 ( 또는이의단편 )( 제2 또는다중 ) 포획항체 / 분석물 ( 또는이의단편 )/( 제2 또는다중 ) 검출항체복합체의형성전, 이와동시에이후에하나이상의검출항체 ( 예를들어, 제2 검출항체 ) 에결합될수있다. 당업계에공지된임의의검출가능한표지가사용될수있다 ( 상기논의를참조 :the Polak and Van Noorden (1997) and Haugland (1996)). 검출가능한표지는항체에직접적으로또는커플링제를통해결합될수있다. 사용될수있는커플링제의예는 EDAC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 ) 카보디이미드, 하이드로클로라이드 )( 제조원 : Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 이다. 사용될수있는다른커플링제제는당업계에공지되어있다. 항체에검출가능한표지를결합시키는방법은당업계에공지되어있다. 추가로, 많은검출가능한표지는구입될수있거나합성될수있고당해표지는항체로의검출가능한표지의커플링을촉진시키는목적그룹을이미함유하고있고예를들어, CPSP-아크리디늄에스테르 ( 즉, 9-[N-토실-N-(3-카복시프로필 )]-10-(3-설포프로필) 아크리디늄카복스아미드 ) 또는 SPSP-아크리디늄에스테르 ( 즉, N10-(3-설포프로필 )-N-(3-설포프로필)-아크리디늄-9- 카복스아미드 ) 가있다. ( 제1 또는다중 ) 포획항체 / 분석물 /( 제2 또는다중 ) 검출항체복합체는표지의정량전에시험샘플의나머지로부터분리될수있거나분리될필요가없다. 예를들어, 하나이상의포획항체 ( 예를들어, 제1 포획항체 ) 가웰또는비드와같은고형지지체에결합되는경우, 분리는고형지지체와의접촉으로부터유체 ( 시험샘플의유체 ) 를제거함에의해달성될수있다. 또는, 적어도제1 포획항체가고형지지체에결합되는경우, 이것은분석물-함유샘플및하나이상의제2 검출항체와동시에접촉시켜제1( 다중 ) 항체 / 분석물 / 제2 ( 다중 ) 항체복합체를형성할수있고이어서당해고형지지체와의접촉으로부터유체 ( 시험샘플 ) 을제거한다. 적어도제1 포획항체가고형지지체에결합되지않은경우 ( 제1 또는다중 ) 포획항체 / 분석물 /( 제2 또는항체 ) 검출항체복합체는표지양의정량을위해시험샘플로부터제거될필요는없다. 표지된포획항체 / 분석물 / 검출항체복합체 ( 예를들어, 제1 포획항체 / 분석물 / 제2 검출항체복합체 ) 의형성후, 복합체내표지의양은당업계에공지된기술을사용하여정량한다. 예를들어, 효소적표지가사용되는경우, 표지된복합체는발색과같이반응이정량가능할수있는표지에대한기질과반응시킨다. 표지가방사성활성표지인경우, 당해표지는섬광계수기와같은적당한수단을사용하여정량한다. 표지가형광표지인경우, 당해표지는한색상의빛 (" 여기파장 " 으로서공지됨 ) 으로표지를자극시키고자극에반응하여표지에의해방출되는또다른색상 (" 방출파장 " 으로서공지됨 ) 을검출함에의해정량한다. 표지가화학발광표지인경우, 당해표지는가시적으로또는발광측정기, X-선필름, 고속사진필름, CCD 필름등을사용함에의해방출되는빛을검출함에의해정량된다. 일단복합체내표지의양이정량된경우시험샘플중의분석물또는이의단편의 - 84 -
농도는적당한수단, 예를들어, 공지된농도의분석물또는이의단편의연속희석을사용하여생성된표준곡 선을사용함에의해결정한다. 분석물또는이의단편의연속의석을사용하는것외에표준곡선은질량분광 측정및다른당업계에공지된기술에의한중력측정으로생성될수있다. [0421] [0422] [0423] [0424] [0425] ARCHITECT 분석기를사용하는화학발광미세입자분석에서, 접합체희석 ph는약 6.0 +/- 0.2이어야만하고, 미세입자피복완충액은약실온 ( 즉, 약 17 내지약 27 에서 ) 에서유지되어야만하고, 미세입자피복완충액 ph는약 6.5 +/- 0.2이어야만하고, 미세입자희석 ph는약 7.8 +/- 0.2이어야만한다. 고체는바람직하게약 0.2% 미만, 예를들어, 0.15% 미만, 약 0.14% 미만, 약 0.13% 미만, 약 0.12% 미만, 또는약 0.11% 미만, 예를들어, 약 0.10% 이다. FPIA는경쟁결합면역분석원리를기초로한다. 형광표지된화합물이선형편광빛에의해여기되는경우이의회전율에역비례하는편광정도를갖는형광을방출한다. 형광표지된추적-항체복합체가서형편광된빛에의해여기되는경우, 방출된빛은형광단이, 빛이흡수되고방출되는시간사이에회전하는것으로제약을받기때문에고도로편광된상태로있다. " 자유 " 추적화합물 ( 즉, 항체에결합되지않은화합물 ) 이선형편광빛에의해여기되는경우, 이의회전은경쟁결합면역분석에서생성되는상응하는추적-항체접합체보다훨씬신속하다. FPIA는특별한취급및처리를요하는방사성활성물질이없기때문에 RIA 보다잇점을갖는다. 또한, FPIA는용이하게및신속하게수행될수있는균일한분석이다. 상기관점에서, 시험샘플중에분석물 ( 또는이의단편 ) 의존재, 양또는농도를결정하는방법을제공한다. 당해방법은 (i) (i') 분석물에결합할수있는항체또는항체의단편, 분석물에결합할수있는항체의변이체, 분석물에결합할수있는항체의변이체의단편및분석물에결합할수있는 DVD-Ig( 또는단편, 변이체또는이의변이체의단편 ) 및 (ii') 하나이상의검출가능한표지를사용하고 (ii) 대조군또는계측기내분석물 ( 또는이의단편 ) 의존재, 양또는농도의직간접적인징후로서생성된시그날과, 시험샘플중의분석물 ( 또는이의단편 ) 의존재, 양또는농도의직간접적인징후로서검출가능한표지에의해생성된시그날을비교함을포함하는분석에의해분석물 ( 또는이의단편 ) 에대해시험샘플을분석함을포함한다. 계측기는임의로일련의계측기의일부이고여기서, 계측기각각은분석물의농도에의해다른계측기로부터상이하다. 당해방법은 (i) 분석물에결합할수있는항체, 항체의단편, 분석물에결합할수있는항체의변이체, 분석물에결합할수있는항체의변이체의단편및분석물에결합할수있는 DVD-Ig( 또는단편, 변이체또는이의변이체의단편 ) 로이루어진그룹으로부터선택되는분석물 ( 또는이의단편 ) 에대한하나이상의제1 특이적결합파트너를시험샘플과접촉시켜제1 특이적결합파트너 / 분석물 ( 또는이의단편 ) 을형성하는단계, (ii) 분석물에결합할수있는검출가능하게표지된항-분석물항체또는검출가능하게표지된항-분석물항체의단편, 분석물과결합할수있는항-분석물항체의검출가능하게표지된변이체, 분석물과결합할수있는항-분석물항체의변이체의검출가능하게표지된단편및검출가능하게표지된 DVD-Ig( 또는단편, 변이체, 이의변이체의단편 ) 로이루어진그룹으로부터선택된분석물 ( 또는이의단편 ) 에대한하나이상의제2 특이적결결합파트너와제1 특이적결합파트너 / 분석물 ( 또는이의단편 ) 복합체를접촉시켜제1 특이적결합파트너 / 분석물 ( 또는이의단편 )/ 제2 특이적결합파트너복합체를형성하는단계및 (iii) (ii) 에서형성된제1 특이적결합파트너 / 분석물 ( 또는이의단편 / 제2 특이적결합파트너복합체 ) 에서검출가능한표지에의해생성된시그날을검출하거나측정함에의해시험샘플내분석물의존재, 양또는농도를결정하는단계를포함한다. 분석물 ( 또는이의단편 ) 에대한하나이상의제1 특이적결합파트너및 / 또는분석물 ( 또는이의단편 ) 에대한하나이상의제2 특이적결합파트너가본원에기재된 DVD-Ig( 또는단편, 변이체또는변이체의단편 ) 인방법이바람직할수있다. 또는, 당해방법은분석물에결합할수있는항체, 항체의단편, 분석물에결합할수있는항체의변이체, 분석물에결합할수있는항체의변이체의단편및 DVD-Ig( 또는단편, 변이체또는변이체의단편 ) 로이루어진그룹으로부터선택된분석물 ( 또는이의단편 ) 에대한하나이상의제1 특이적결합파트너와시험샘플을접촉시키는단계및동시에또는연속으로어느한순서로하나이상의제1 특이적결합파트너에결합하는것에대해분석물 ( 또는이의단편 ) 과경쟁할수있고, 제1 특이적결합파트너에결합할수있는검출가능하게표지된분석물, 검출가능하게표지된분석물의단편, 제1 특이적결합파트너와결합할수있는분석물의검출가능하게표지된변이체, 제1 특이적결합파트너와결합할수있는분석물의변이체의검출가능하게표지된단편으로이루어진그룹으로부터선택되는하나이상의제2 특이적결합파트너와시험샘플을접촉시키는단계를포함할수있다. 시험샘플에존재하는임의의분석물 ( 또는이의단편 ) 및하나이상의제2 특이적결합파트너는서로경쟁하여각각제1 특이적결합파트너 / 분석물 ( 또는이의단편 ) 복합체및제1 특이적결합파트너 / 제2 특이적결합파트너복합체를형성한다. 당해방법은추가로 (ii) 에서형성된제1 특이적결합파트너 / 제2 특이적결합파트너복합체중에서검출가능한표지에의해생성된시그날을검출하거나측정함에의해시험샘플내분석물의 - 85 -
존재, 양또는농도를결정하는단계를포함하고, 이때, 제 1 특이적결합파트너 / 제 2 특이적결합파트너복합 체내검출가능한표지에의해생성된시그날은시험샘플중에분석물의양또는농도에반비례한다. [0426] [0427] [0428] [0429] [0430] [0431] [0432] [0433] 상기방법은추가로시험샘플이수득된환자의치료학적 / 예방학적치료의효능을진단하거나, 예후하거나평가함을포함할수있다. 당해방법이추가로시험샘플이수득된환자의치료학적 / 예방학적치료의효능을평가하는단계를포함하는경우, 당해방법은임의로효능을개선시킬필요가있는환자의치료학적 / 예방학적치료를변형시키는단계를추가로포함한다. 당해방법은자동화시스템또는반자동화시스템에서사용하기위해채택될수있다. 분석방법 ( 및이에대한키트 ) 과관련하여상업적으로시판되는항-분석물항체또는문헌에기재된바와같은항분석물의제조방법을사용할수있다. 다양한항체의공급원은다음을포함한다 : Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), Gen Way Biotech, Inc. (San Diego, CA), 및 R&D Systems (RDS; Minneapolis, MN). 일반적으로, 미리결정된수준은분석물또는이의단편에대한시험샘플을분석시, 예를들어, 질환또는질환의위험을검출하기위해수득된결과를평가하기위한벤치마크로서사용될수있다. 일반적으로, 비교를하는데있어서, 미리결정된수준은질환, 장애또는병태의특정단계및종점또는특정임상적지적과관련하여분석물존재, 양또는농도의연계또는연합이만들어질수있도록충분한횟수및적당한조건하에서특정분석을수행함에의해수득된다. 전형적으로미리결정된수준은참조피험체 ( 또는피험체집단 ) 의분석과함께수득된다. 측정된분석물은이의단편, 이의분해생성물및 / 또는이의효소적절단생성물을포함할수있다. 특히, 질환진행및 / 또는치료를모니터링하기위해사용되는바와같은미리결정된수준과관련하여, 분석물또는이의단편의양또는농도는 " 비변화 ", " 선호적으로 " ( 또는 " 선호적으로변형된 ") 또는 " 비선호적으로 "( 또는 " 비선호적으로변형된 ) 일수있다. " 상승된 " 또는 " 증가된 " 은전형적인또는정상의수준또는범위 ( 예를들어, 미리결정된수준 ) 보다높은또는또다른참조수준또는범위 ( 예를들어, 보다조기에또는기본샘플 ) 보다높은시험샘플내양또는농도를언급한다. 용어 " 저하된 " 또는 " 감소된 " 은전형적이거나정상의수준또는범위 ( 예를들어, 미리결정된수준 ) 보다낮거나또다른참조수준또는범위 ( 예를들어, 조기또는기본샘플 ) 보다낮은, 시험샘플내양또는농도를언급한다. 용어 " 변화된 " 은전형적이거나정상의수준또는범위 ( 예를들어, 미리결정된수준 ) 또는또다른표준수준또는범위 ( 예를들어, 조기또는기본샘플 ) 에비해변화된샘플내양또는농도를언급한다. 분석물에대해전형적이거나정상의수준또는범위는표준관행에따라정의된다. 몇몇경우에분석물수준은매우낮기때문에, 소위변화된수준또는변화는실험적오차또는샘플변화에의해설명될수없는전형적이거나정상적인수준또는범위또는표준수준또는범위와비교하여임의의총변화가있는경우발생한것으로고려될수있다. 따라서, 특정샘플에서측정된수준은소위정상의피험체로부터유사한샘플내에서결정된수준또는수준범위과비교한다. 이와관련하여, " 정상의피험체 " 는예를들어, 어떠한감지할만한질환이없는개체이고 " 정상 "( 때때로, " 대조군 " 으로서언급됨 ) 환자또는집단은예를들어, 각각검출가능한질환을나타내지않는환자또는집단이다. 추가로, 분석물이대부분의사람집단에서고준에서통상적으로발견되지않는경우, " 정상의피험체 " 는어떠한실질적인검출가능한증가되거나상승된양또는농도의분석물이없는피험체로서고려될수있고 " 정상 " ( 때때로 " 대조군 " 으로서언급됨 ) 환자또는집단은어떠한실질적으로검출가능한증가되거나상승된양또는농도의분석물을나타내지않는환자또는집단이다. " 명백하게정상인피험체 " 는분석물이아직존재하지않거나현재존재하지않는것으로평가된피험체이다. 분석물수준은분석물이정상적으로는검출될수없지만 ( 예를들어, 정상수준은제로이거나정상집단의약 25 내지약 75% 의범위내에있다 ) 시험샘플에서는검출되는경우및분석물이정상수준보다높은수준으로시험샘플에존재하는경우인경우 " 상승된 " 것으로말한다. 따라서, 특히, 당해기재내용은특정질환, 장애또는병태를갖거나가질위험에처한환자를스크리닝하는방법을제공한다. 당해분석방법은또한다른마커등의분석을포함할수있다. 따라서, 본원에기재된방법은또한피험체가소정의질환, 장애또는병태를갖거나가질위험에처해있는지를결정하는데사용될수있다. 구체적으로당해방법은 : (a) 분석물 ( 또는이의단편 ) 의피험체로부터시험샘플내농도또는양을결정하는단계 ( 본원에기재된방법또는당업계에공지된방법을사용하여 ); 및 (b) 단계 (a) 에서결정된분석물 ( 또는이의단편 ) 의양을, 미리결정된수준과비교하는단계를포함할수있고, - 86 -
이때, 단계 (a) 에서결정된분석물의농도또는양이미리결정된수준과관련하여선호되는경우피험체는소정의질환, 장애또는병태를갖지않거나위험에처하지않는것으로결정된다. 그러나, 단계 (a) 에서결정된분석물의농도또는양이미리결정된수준과비선호되는경우피험체는소정의질환, 장애또는병태를갖거나이의위험에처한것으로결정된다. [0434] [0435] [0436] [0437] [0438] [0439] [0440] [0441] [0442] 추가로, 피험체에서질환의진행을모니터링하는방법이제공된다. 최적으로당해방법은 : (a) 분석물피험체로부터시험샘플내농도또는양을측정하는단계 ; (b) 분석물의피험체로부터후반시험샘플내농도또는양을측정하는단계 ; 및 (c) 단계 (a) 에서결정된분석물의농도또는양과단계 ( b) 에서결정된바와같은분석물의농도또는양을비교하는단계를포함하고단계 (b) 에서결정된농도또는양이단계 (a) 에서결정된분석물의농도또는양과비교하는경우변화되지않거나비선호성인경우, 피험체내질환은게속되는진행성또는악화된것으로결정된다. 비교에의해, 단계 (b) 에서결정된바와같은분석물의농도또는양이단계 (a) 에서결정된바와같은분석물의농도또는양과비교하여선호성인경우, 피험체내질환은중단되거나퇴행성이거나개선된것으로결정된다. 임의로, 당해방법은추가로예를들어, 미리결정된수준과단계 (b) 에서결정된바와같은분석물의농도또는양을비교함을추가로포함한다. 추가로, 임의로당해방법은비교시단계 (b) 에서결정된바와같은분석물의농도또는양이예를들어, 미리결정된수준과비교하여비선호성으로변화됨을보여주는경우일정시간동안피험체를하나이상의약제학적조성물로치료함을포함한다. 여전히추가로, 당해방법은하나이상의약제학적조성물로치료받은환자에서치료를모니터링하는데사용될수있다. 구체적으로, 당해방법은피험체에하나이상의약제학적조성물을투여하기전에피험체로부터제1 시험샘플을제공함을포함한다. 다음에분석물의피험체로부터제1 시험샘플에서의농도또는양을결정한다 ( 예를들어, 본원에기재된방법또는당업계에공지된방법을사용한다 ). 분석물의농도또는양을결정한후, 임의로분석물의농도또는양을이어서미리결정된수준과비교한다. 제1 시험샘플에결정된바와같은분석물의농도또는양이미리결정된수준보다낮은경우, 피험체는하나이상의약제학적조성물로치료되지않는다. 그러나, 분석물의농도또는양이미리결정된수준보다높은경우, 피험체는일정시간동안하나이상의약제학적조성물로치료된다. 피험체가하나이상의약제학적조성물로치료되는시간은당업자에의해결정될수있다 ( 예를들어, 시간은약 7일내지약 2년일수있고능히약 14일내지약 1년일수있다 ). 하나이상의약제학적조성물을사용한치료과정동안에, 제2 및후속시험샘플을이어서피험체로부터수득한다. 시험샘플의수및시험샘플이피험체로부터수득되는시간은중요하지않다. 예를들어, 제2 시험샘플은피험체에먼저하나이상의약제학적조성물을투여한지 7일후제2 시험샘플이투여될수있고제3 시험샘플은피험체에하나이상의약제학적조성물을투여한지 2주후수득될수있고, 제4 시험샘플은피험체에먼저하나이상의약제학적조성물을투여한지 3주후수득될수있고제5 시험샘플은피험체에먼저하나이상의약제학적조성물등을투여한지 4주후에수득될수있다. 각각제2 또는후속시험샘플이피험체로부터수득된후, 분석물의농도또는양을제2 또는후속시험샘플에서결정된다 ( 예를들어, 본원에기재되거나당업계에공지된방법을사용한다 ). 제2 및후속샘플각각에서결정된바와같은분석물의농도또는양은이어서제1 시험샘플 ( 예를들어, 본래에임의로미리결정된수준과비교된시험샘플 ) 에서결정된바와같은분석물의농도또는양과비교한다. 단계 (c) 에서결정된바와같은분석물의농도또는양이단계 (a) 에서결정된바와같은분석물의농도또는양과비교하여선호성인경우피험체내질환은중단되거나퇴행성이거나개선된것으로결정되고피험체에는단계 (b) 의하나이상의약제학적조성물이계속투여되어야만한다. 그러나, 단계 (c) 에서결정된농도또는양이단계 (a) 에결정된분석물의농도또는양과비교하여변화되지않은경우피험체내질환은게속되거나진행성이거나악화된것으로결정되고피험체는단계 (b) 에서피험체에보다높은농도의약제학적조성물이투여되어치료되어야만하거나피험체는단계 (b) 에서피험체에투여되는하나이상의약제학적조성물과는상이한하나이상의약제학적조성물로치료되어야만한다. 구체적으로, 당해피험체가피험쳉의분석물수준을감소시키거나저하시키기위해사전에투여받은하나이상의약제학적조성물과는상이한하나이상의약제학적조성물로치료될수있다. 일반적으로, 반복시험이수행될수있는분석을위해 ( 예를들어, 치료에대한질환진행및 / 또는반응을모니터링하기위한 ), 제2 또는후속시험샘플은제1 시험샘플이피험체로부터수득된후시점에수득된다. 구체적으로피험체로부터제2 시험샘플은제1 시험샘플이피험체로부터수득된지수분, 수시간, 수일또는수년후 - 87 -
수득될수있다. 예를들어, 제2 시험샘플은피험체로부터제1 시험샘플이수득된지약 1분, 약 5 분, 약 10 분, 약 15분, 약 30분, 약 45 분, 약 60 분, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8시간, 약 9 시간, 약 10 시간, 약 11 시간, 약 12 시간, 약 13 시간, 약 14 시간, 약 15 시간, 약 16 시간, 약 17 시간, 약 18 시간, 약 19 시간, 약 20 시간, 약 21 시간, 약 22 시간, 약 23 시간, 약 24 시간, 약 2일, 약 3일, 약 4 일, 약 5일, 약 6 일, 약 7 일, 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주, 약 6 주, 약 7 주, 약 8 주, 약 9 주, 약 10 주, 약 11 주, 약 12 주, 약 13 주, 약 14 주, 약 15 주, 약 16 주, 약 17 주, 약 18 주, 약 19 주, 약 20 주, 약 21 주, 약 22 주, 약 23 주, 약 24 주, 약 25 주, 약 26 주, 약 27 주, 약 28 주, 약 29 주, 약 30 주, 약 31 주, 약 32 주, 약 33 주, 약 34 주, 약 35 주, 약 36 주, 약 37 주, 약 38 주, 약 39 주, 약 40 주, 약 41 주, 약 42 주, 약 43 주, 약 44 주, 약 45 주, 약 46 주, 약 47 주, 약 48 주, 약 49 주, 약 50 주, 약 51 주, 약 52 주, 약 1.5 년, 약 2 년, 약 2.5 년, 약 3.0 년, 약 3.5 년, 약 4.0 년, 약 4.5 년, 약 5.0 년, 약 5.5. 년, 약 6.0 년, 약 6.5 년, 약 7.0 년, 약 7.5 년, 약 8.0 년, 약 8.5 년, 약 9.0 년, 약 9.5 년또는약 10.0 년후시점에피험체로부터수득될수있다. [0443] [0444] [0445] [0446] 질환진행을모니터링하기위해사용되는경우, 상기분석을사용하여급성병태를앓는피험체에서질환의진행을모니터링할수있다. 또한임상적치료병병태로서공지된급성병태는예를들어, 심혈관계또는분비계가관여하는급성, 생명위협질환또는기타위독한의학적병태를언급한다. 전형적으로, 중요한치료병태는병원기반세팅 ( 응급실, 중환자실, 외상후센터또는기타응급치료세팅을포함하지만이에제한되지않는다 ) 에서급성의학적간섭또는위생또는기타분야별의료진에의한투여를요하는병태를언급한다. 위독한치료병태에대해반복투여는일반적으로보다짧은시간프레임내에, 즉, 수분, 수시간또는일 ( 예를들어, 약 1 분, 약 5 분, 약 10 분, 약 15 분, 약 30 분, 약 45 분, 약 60 분, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8 시간, 약 9 시간, 약 10 시간, 약 11 시간, 약 12 시간, 약 13 시간, 약 14 시간, 약 15 시간, 약 16 시간, 약 17 시간, 약 18 시간, 약 19 시간, 약 20 시간, 약 21 시간, 약 22 시간, 약 23 시간, 약 24 시간, 약 2 일, 약 3 일, 약 4 일, 약 5 일, 약 6 일또는약 7일 ) 에투여되고초기분석은또한일반적으로보다짧은시간프레임내에, 예를들어, 질환또는병태의발병약수분, 수시간또는수일에수행된다. 또한당해분석을사용하여만성또는비-급성병태를앓는피험체에서질환의진행을모니터링할수있다. 비- 위독성치료또는비-급성병태는예를들어, 심혈관계및 / 또는분비계가관여하는급성생명위협질환또는기타위독한의학적병태이외의병태를언급한다. 전형적으로, 비-급성병태는장기또는만성의지속적인병태를포함한다. 비-급성병태에대해, 반복모니터링은보다긴시간프레임내에, 예를들어, 수시간, 수일, 수주, 수개월또는수년 ( 예를들어, 약 1 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8 시간, 약 9 시간, 약 10 시간, 약 11 시간, 약 12 시간, 약 13 시간, 약 14 시간, 약 15 시간, 약 16 시간, 약 17 시간, 약 18 시간, 약 19 시간, 약 20 시간, 약 21 시간, 약 22 시간, 약 23 시간, 약 24 시간, 약 2 일, 약 3 일, 약 4 일, 약 5 일, 약 6 일, 약 7 일, 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주, 약 6 주, 약 7 주, 약 8 주, 약 9 주, 약 10 주, 약 11 주, 약 12 주, 약 13 주, 약 14 주, 약 15 주, 약 16 주, 약 17 주, 약 18 주, 약 19 주, 약 20 주, 약 21 주, 약 22 주, 약 23 주, 약 24 주, 약 25 주, 약 26 주, 약 27 주, 약 28 주, 약 29 주, 약 30 주, 약 31 주, 약 32 주, 약 33 주, 약 34 주, 약 35 주, 약 36 주, 약 37 주, 약 38 주, 약 39 주, 약 40 주, 약 41 주, 약 42 주, 약 43 주, 약 44 주, 약 45 주, 약 46 주, 약 47 주, 약 48 주, 약 49 주, 약 50 주, 약 51 주, 약 52 주, 약 1.5 년, 약 2 년, 약 2.5 년, 약 3.0 년, 약 3.5 년, 약 4.0 년, 약 4.5 년, 약 5.0 년, 약 5.5. 년, 약 6.0 년, 약 6.5 년, 약 7.0 년, 약 7.5 년, 약 8.0 년, 약 8.5 년, 약 9.0 년, 약 9.5 년또는약 10.0 년 ) 에수행되고, 초기분석은또한일반적으로장시간프레임내에질환또는병태의발병약시간, 수일, 수개월또는수년에수행된다. 추가로, 상기분석은제1 시험샘플이하나의공급원, 예를들어, 뇨, 혈청또는혈장으로부터수득되는피험체로부터수득된제1 시험샘플을사용하여수행될수있다. 임의로, 상기분석은이어서제2 시험샘플이또다른공급원으로부터수득된피험체로부터수득된제2 시험샘플을사용하여반복될수있다. 예를들어, 제1 시험샘플이뇨로부터수득된경우, 제2 시험샘플은혈청또는혈장으로부터수득될수있다. 제1 시험샘플및제2 시험샘플을사용한분석으로부터수득된결과를비교할수있다. 당해비교를사용하여피험체내질환또는병태의상태를평가할수있다. 더욱이, 본원의기재는또한소정의질환, 장애또는병태를앓거나예비진단된피험체가치료로부터이득을얻을것인지를결정하는방법에관한것이다. 특히, 본원의기재는분석물기반진단방법및제품에관한것이다. 따라서, 본원에기재된바와같은 " 피험체내질환치료를모니터링 " 하는방법은또한추가로최적으로치료 - 88 -
를위한후보물을선별하거나동정하는것을포함할수있다. [0447] [0448] [0449] [0450] [0451] [0452] [0453] [0454] [0455] 따라서, 특정양태에서, 본원의기재는또한소정의질환, 장애또는병태를갖거나이의위험에처한피험체가치료를위한후보물인지를결정하는방법을제공한다. 일반적으로, 피험체는소정의질환, 장애또는병태의몇몇증상을경험하거나실제로소정의질환, 장애또는병태를갖거나이의위험에처한것으로진단되고 / 되거나본원에기재된바와같은분석물또는이의단편의비선호성농도또는양을입증하는피험체이다. 당해방법은임의로본원에기재된바와같은분석을포함하고여기서분석물은하나이상의약제학적조성물 ( 예를들어, 특히분석물이관련된작용기작과관련된약제 ), 면역억제치료또는면역흡착치료에의한피험체의치료전및후에평가되거나여기서, 분석물은당해치료후평가되고분석물의농도또는양은미리결정된수준과비교한다. 치료후관찰되는분석물의양의비선호성농도는피험체가추가로또는계속되는치료를받는것으로부터이득을받지못하는것으로확인되는반면, 치료후관찰되는분석물의선호성농도또는양은피험체가추가로또는계속되는치료로부터이득을받을것으로확인된다. 이러한확증은임상적연구의관리및개선된환자치료를원조한다. 본원의특정양태는본원에논의된바와같은소정의질환, 장애또는병태를평가하기위해사용되는데유리하지만당해분석및키트는기타질환, 장애및병태에서분석물을평가하기위해사용될수있는것은말할필요도없다. 분석방법은또한기타마커등의분석을포함할수있다. 또한분석방법을사용하여소정의질환, 장애또는병태를완화시키는화합물을동정할수있다. 예를들어, 분석물을발현하는세포는후보화합물과접촉시킬수있다. 당해화합물과접촉된세포에서분석물의발현수준은본원에기재된분석방법을사용하는대조군세포의수준과비교할수있다. II. 키트시험샘플내분석물 ( 또는이의단편 ) 의존재, 양또는농도에대한시험샘플을평가하기위한키트가또한제공된다. 당해키트는분석물 ( 또는이의단편 ) 에대한시험샘플을평가하기위한하나이상의성분및분석물 ( 또는이의단편 ) 에대해시험샘플을평가하기위한지침서를포함한다. 분석물 ( 또는이의단편 ) 에대한시험샘플을평가하기위한하나이상의성분은임의로고형상에고정화된항-분석물 DVD-Ig( 또는단편, 변이체또는변이체의단편 ) 를포함하는조성물을포함할수있다. 당해키트는면역분석, 예를들어, 화학발광미세입자면역분석에의한분석물에대한시험샘플을평가하기위한하나이상의성분및면역분석, 예를들어, 화학발광나노입자면역분석에의한분석물에대한시험샘플을평가하기위한지침서를포함할수있다. 예를들어, 당해키트는분석물에대한하나이상의특이적결합파트너, 예를들어, 항-분석물, 모노클로날 / 폴리클로날항체 ( 또는분석물에결합할수있는이의단편, 분석물에결합할수있는이의변이체또는분석물에결합할수있는변이체의단편 ) 또는항-분석물 DVD-Ig( 또는이의단편, 변이체또는변이체의단편 ) 을포함할수있고이중어느하나는검출가능하게표지될수있다. 또한추가로, 당해키트는항-분석물, 모노클로날 / 폴리클로날항체 ( 또는분석물과결합할수있는단편, 분석물과결합할수있는변이체또는분석물과결합할수있는변이체의단편 ) 또는항-분석물 DVD-Ig( 또는단편, 변이체또는변이체의단편 )( 이중하나는고형지지체상에고정화될수있다 ) 에결합하는것에대해시험샘플내임의의분석물과경쟁할수있는검출가능하게표지된분석물 ( 또는항분석물, 모노클로날 / 폴리클로날항체또는항분석물 DVD-Ig( 또는단편, 변이체또는변이체의단편 )) 를포함할수있다. 당해키트는계측기또는대조군, 예를들어, 분리된또는정제된분석물을포함할수있다. 당해키트는분석및 / 또는완충액, 예를들어, 분석완충또는세척완충 ( 이중어느하나는농축용액, 검출가능한표지 ( 예를들어, 효소적표지 ) 용기질용액또는종료용액으로서제공될수있다 ) 을수행하기위해하나이상의컨테이너 ( 예를들어, 제1 특이적결합파트너로이미피복될수있는튜브, 미세적정플레이트또는스트립 ) 를포함할수있다. 바람직하게는당해키트는분석을수행하기위해필요한모든성분, 즉, 시약, 표준물, 완충액, 희석제등을포함한다. 지침서는종이형태또는디스크, CD, DVD 등과같은컴퓨터판독할수있는형태일수있다. 항-분석물항체또는항분석물 DVD-Ig와같은임의의항체또는추적자는본원에기재된바와같은검출가능한표지, 예를들어, 형광단, 방사성활성잔기, 효소, 비오틴 / 아비딘표지, 발색단, 화학발광표지등을혼입시킬수있거나당해키트는검출가능한표지화를수행하기위한시약을포함할수있다. 항체, 계측기및 / 또는대조군은별도의컨테이너에제공될수있거나적당한분석포맷으로, 예를들어, 미세적정플레이트내로제공될수있다. 임의로, 당해키트는품질대조군성분 ( 예를들어, 민감성패널, 계측기및양성대조군 ) 을포함한다. 품질대 - 89 -
조군시약의제법은당업계에널리공지되어있고다양한면역진단제품에대한삽입쉬트상에기재된다. 민감 성패널구성원은임의로분석수행능특성을확립하기위해사용되고임의로추가로면역분석키트시약의통 합성및분석의표준화에대해유용한지표이다. [0456] [0457] [0458] [0459] [0460] [0461] [0462] [0463] 당해키트는또한임의로진단분석을수행하거나품질대조군평가를촉진시키기위해요구되는기타시약, 예를들어, 완충제, 염, 효소, 효소조인자, 효소기질, 검출시약등을포함한다. 완충제및시험샘플의분리및 / 또는치료용용액 ( 예를들어전처리시약 ) 과같은기타성분들이또한키트에포함될수있다. 당해키트는하나이상의기타대조군을포함할수있다. 키트의하나이상의성분은동결건조될수있고이경우에당해키트는추가로동결건조된성분의재구성을위해적합한시약을포함할수있다. 키트의다양한성분은임의로필요한만큼적합한컨테이너, 예를들어, 미세적정플레이트로제공된다. 당해키트는추가로샘플을유지하거나저장하기위한컨테이너 ( 예를들어, 뇨샘플용컨테이너또는카트릿지 ) 를포함할수있다. 경우에따라, 당해키트는임의로또한반응용기, 혼합용기및시약또는시험샘플의제조를촉진시키는기타성분을포함할수있다. 당해키트는또한시험샘플을수득하기위한하나이상의장비, 예를들어, 시린지, 피펫, 포르셋, 측정스푼등을포함할수있다. 검출가능한표지가하나이상의아크리디늄화합물인경우, 키트는하나이상의아크리디늄-9-카복스아미드, 하나이상의아크리디늄-9-카복실레이트아릴에스테르, 또는이의임의의배합물을포함할수있다. 검출가능한표지가하나이상의아크리디늄화합물인경우, 당해키트는또한과산화수소공급원, 예를들어, 완충액, 용액및 / 또는하나이상의염기성용액을포함할수있다. 경우에따라, 당해키트는고형상, 예를들어, 자기입자, 비드, 시험튜브, 미세적정플레이트, 큐벳, 막, 스캐폴딩분자, 필름, 여과지, 디스크또는칩을함유할수있다. III. 키트및방법의변형본원에기재된바와같은면역분석과같은분석에의한시험샘플중에분석물의존재, 양또는농도를결정하는방법뿐만아니라키트 ( 또는이의성분들 ) 은예를들어, 미국특허제5,089,424호및제5,006,309호에기재된바와같이및제조원 [Abbott Laboratories (Abbott Park, IL)] 에서 ARCHITECT 로서시판되는바와같이다양한자동화된반-자동화된시스템 ( 고형상이미세입자를포함하는것들을포함 ) 에사용하기위해변형될수있다. 비자동화된시스템 ( 예를들어, ELISA) 과비교하여자동화되거나반자동화된시스템간의몇몇차이는제1 특이적결합파트너 ( 예를들어, 항-분석물, 모노클로날 / 폴리클로날항체 ( 또는이의단편, 이의변이체또는이의변이체의단편 ) 또는항-분석물 DVD-Ig( 또는이의단편, 이의변이체또는변이체의단편 ) 이부착되는기질 ( 어느방식으로든지샌드위치형성및분석물반응이영향받을수있다 ) 및포획길이및시간, 검출및 / 또는임의의선택적세척단계들을포함한다. 비자동화된포맷, 예를들어, ELISA는샘플및포획시약과비교적긴항온처리시간 ( 예를들어약 2시간 ) 을필요할수있는반면자동화또는반자동화된포맷 ( 예를들어, ARCHITECT, Abbott Laboratories) 은비교적짧은항온처리시간 ( 예를들어, 대략 ( 예를들어, ARCHITECT 에대해 18분 ) 을가질수있다. 유사하게, 비자동화된포맷, 예를들어, ELISA는비교적긴항온처리시간 ( 예를들어, 약 2시간 ) 동안접합체시약과같은검출항체를항온처리할수있는반면자동화또는반자동화포맷 ( 예를들어, ARCHITECT ) 은비교적짧은항온처리시간 ( 예를들어, ARCHITECT 에대해약 4분 ) 을가질수있다. 제조원 [Abbott Laboratories] 으로부터시판되는다른플랫폼은 AxSYM, IMx ( 참조 : 예를들어, 미국특허제 5,294,404호, 이문헌은그전체가본원에참조로서인용된다 ), PRISM, EIA ( 비드 ), 및 Quantum II, 및기타플랫폼을포함하지만이에제한되지않는다. 추가로, 당해분석, 키트및키트성분들을다른포맷, 예를들어, 전기화학적또는기타수동또는포인트오브케어분석시스템에사용될수있다. 본발명은예를들어, 샌드위치면역분석을수행하는시판되는제품 [Abbott Point of Care (i-stat, Abbott Laboratories)] 전기화학적면역분석시스템에적용될수있다. 단일용도시험장치에서면역센서및이들의제조및작동방법은예를들어, 미국특허제 5,063,081호, 미국특허원공개번호제2003/0170881호, 미국특허원공개번호제 2004/0018577호, 미국특허원공개번호제2005/0054078호, 및미국특허원공개번호제2006/0160164호에기재되어있고, 상기문헌들은그전체가동일한것으로간주되는교시에대해본원에참조로서인용된다. 특히, I-STAT 시스템에대한분석물분석적용과관련하여, 하기의배열이바람직하다. 마이크로조립된규소칩은한쌍의골드전류측정작동전극및실버-실버클로라이드표준전극과함께제조된다. 작동전극중하나에대해, 고정화된항-분석물, 모노클로날 / 폴리클로날항체 ( 또는이의단편, 변이체또는변이체의단편 ) 또는항-분석물 DVD-Ig( 또는이의단편, 변이체또는변이체단편 ) 이고정화된폴리스티렌비드 (0.2mm 직경 ) 을전극 - 90 -
에대해패턴화된폴리비닐알콜의중합체피복물에부착시킨다. 이러한칩은면역분석에적합한유체공학적포맷을갖는 I-STAT 카트릿지로어셈블리된다. 카트릿지샘플유지챔버벽부분상에분석물에대한특이적결합파트너, 예를들어, 항-분석물인모노클로날 / 폴리클로날항체 ( 또는분석물에결합할수있는이의단편, 변이체또는변이체의단편 ) 또는항-분석물 DVD-Ig( 또는분석물에결합할수있는이의단편, 변이체또는변이체의단편 )( 이중어느하나는검출가능하게표지될수있다 ) 를포함하는층이있다. 카트릿지의유체파우치내에는 p-아미노페놀포스페이트를포함하는수성시약이있다. [0464] [0465] [0466] 작업에서, 분석물을함유하는것으로의심되는샘플은시험카트릿지의보유챔버에첨가되고당해카트릿지는 I-STAT 판독기로삽입된다. 분석물에대한특이적결합파트너가샘플에용해된후, 카트릿지내펌프요소는샘플을, 칩을함유하는회로로강제이동시킨다. 여기서, 이것은샌드위치의형성을촉진시키기위해진동시킨다. 분석의끝에서두번째단계에서, 유체를파우치로부터당해회로로강제배출시켜칩으로부터샘플을세척하고폐기챔버내로보낸다. 분석의두번째단계에서, 알칼린포스파타제표지를 p-아미노페놀포스페이트와반응시켜포스페이트그룹을절단하고유리된 p-아미노페놀이작동전극에서전기화학적으로산화되도록한다. 측정된전류를기준으로판독기는내장된알고리듬및공장-결정된계산곡선을수단으로샘플내분석물의양을계산할수있다. 또한본원에기재된바와같은방법및키트는필수적으로면역분석을수행하기위한다른시약및방법을포함한다. 예를들어, 당업계에공지되고 / 되거나용이하게제조되거나, 예를들어, 접합체희석제로서, 미세입자희석제로서및 / 또는계산기희석제로서세척을위해사용되도록최적화된다양한완충제가포함된다. 예시적인접합체희석제는특정키트 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) 에사용되는 ARCHITECT 접합체희석제이고 2-(N-모르폴리노 ) 에탄설폰산 (MES), 염, 단백질차단제, 항미생물제제및세제를함유한다. 예시적인계산기희석제는특정키트 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) 에사용되는 ARCHITECT 사람계산기희석제이고이는 MES, 기타염, 단백질차단제및항미생물제를함유하는완충액을포함한다. 추가로 2008년 12월 31일자로출원된미국특허원제61/142,048호에기재된바와같이예를들어, 시그날증폭기로서시그날항체에연결된핵산서열을사용하여 I-Stat 카트릿지포맷에서개선된시그날생성이수득될수있다. 본원에기재된발명의방법이기타적합하게변형되고적용될수있고본발명의범위또는본원에기재된양태로부터벗어나지않고서도적합한등가물을사용하여변형되고적용될수있다는것은당업자에게자명하다. 현재본발명을상세하게설명했고이와동일하게하기의실시예를참조로보다명백하게이해될수있을것이고당해실시예는설명을목적으로포함된것이지본발명을제한하고자한것은아니다. [0467] [0468] [0469] [0470] [0471] [0472] [0473] [0474] 실시예실시예 1: DVD-Ig의디자인, 작제및분석실시예 1.1: 모항체및 DVD-Ig를동정하고특성분석하기위해사용되는분석하기의분석은달리언급되지않는경우실시예전반에걸쳐사용되어모항체및 DVD-Ig를동정하고특성분석하였다. 실시예 1.1.1: 이들의표적항원에대한모항체및 DVD-Ig의결합및친화성을결정하기위해사용되는분석실시예 1.1.1.A: 직접적인결합 ELISA 목적하는표적항원에결합하는항체를스크리닝하기위한효소연결된면역흡착분석을다음과같이수행하였다. 고결합 ELISA 플레이트 (Corning Costar # 3369, Acton, MA) 를포스페이트완충식염수 (1OX PBS, Abbott Bioresearch Center, Media Prep# MPS-073, Worcester, MA) 중에서 4 에서밤새 looμl/ 웰의 loμg/ml의목적하는표적항원 (R&D Systems, Minneapolis, MN) 또는목적하는표적항원세포외도메인 /FC 융합단백질 (R&D Systems, Minneapolis, MN) 또는모노클로날마우스항-폴리히스티딘항체 (R&D Systems # MAB050, Minneapolis, MN) 로피복시켰다. 플레이트를 0.02% 트윈 20을함유하는 PBS로 4회세척하였다. 플레이트를실온에서 1/2 시간동안 300 μl/ 웰차단용액 (PBS중에서 2% 로희석된비지방무수밀크분말, 다양한소매공급업체 ) 을첨가하여차단시켰다. 플레이트를, 0.02% 트윈 20을함유하는 PBS로차단시킨후 4회세척하였다. 또한, 히스티딘 (His) 태그된목적하는표적항원 (R&D Systems, Minneapolis, MN) 의 10μg /ml의웰당 100μl를상기된바와같이모노클로날마우스항-폴리히스티딘항체로피복된 ELISA 플레이트에첨가하고실온에서 1시간 - 91 -
동안항온처리하였다. 웰을 0.02% 트윈 20 을함유하는 PBS 로 4 회세척하였다. [0475] [0476] [0477] [0478] [0479] [0480] 상기된바와같은차단용액중에희석된항체또는 DVD-Ig 제제의 100μl를상기된바와같이제조된목적하는표적항원플레이트또는목적하는표적항원 /FC 융합플레이트또는항-폴리히스티딘항체 /His 태그된목적하는표적항원플레이트에첨가하고실온에서 1시간동안항온처리하였다. 웰을 0.02% 트윈 20을함유하는 PBS로 4회세척하였다. 1Ong/mL 염소항-사람 IgG-FC 특이적 HRP 접합된항체 (Southern Biotech # 2040-05, Birmingham, AL) 의 100μl를목적하는표적항원플레이트또는항-폴리히스티딘항체 / 히스티딘태그된목적하는표적항원플레이트의각각의웰에첨가하였다. 또한, 10ng/mL 염소항-사람 IgG-카파경쇄특이적 HRP 접합된항체 (Southern Biotech # 2060-05 Birmingham, AL) 100μl를목적하는표적항원 /FC 융합플레이트의각각의웰에첨가하고실온에서 1시간동안항온처리하였다. 플레이트를 0.02% 트윈 20을함유하는 PBS로 4회세척하였다. 증진된 TMB 용액 (Neogen Corp. #308177, K Blue, Lexington, KY) 100μl를각각의웰에첨가하고실온에서 10분동안항온처리하였다. 당해반응은 50 μl 1N 황산을첨가하여종료시켰다. 플레이트를 450nm 파장에서분광측정으로판독하였다. 실시예 1.1.1.B: 포획 ELISA ELISA 플레이트 (Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY) 는항-사람 Fc 항체 (PBS 중 5μg/ml, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) 와 4 에서밤새항온처리한다. 플레이트를세척완충액 (0.05% 트윈 20을함유하는 PBS) 중에서 3회세척하고, 차단완충액 (1% BSA 함유 PBS) 중에서 25 에서 1시간동안차단시켰다. 웰을 3회세척하고, 0.1% BSA 함유 PBS 중에서각각의항체또는 DVD-Ig의연속희석액을웰에첨가하고 1시간동안 25 에서항온처리하였다. 웰을 3회세척하고비오티닐화된항원 (2nM) 을플레이트에첨가하고 25 에서 1시간동안항온처리한다. 당해웰을 3회세척하고스트렙트아비딘-HRP(KPL #474-3000, Gaithersburg, MD) 로 25 에서 1시간동안항온처리하였다. 당해웰을 3회세척하고 100μ1의 ULTRA-TMB ELISA(Pierce, Rockford, IL) 를웰마다첨가한다. 색변화후반응을 1N HCL로종료시키고 450nM에서의흡광도를측정한다. 실시예 1.1.1.C: 바이아코어기술을사용한친화성측정 표 3 [0481] [0482] [0483] 바이아코어방법 : 바이아코어분석 (Biacore, Inc, Piscataway, NJ) 으로결합속도및해리속도상수의역학적측정으로항체또는 DVD-Ig의친화성을측정한다. 표적항원 ( 예를들어, 정제된재조합표적항원 ) 에대한항체또는 DVD-Ig의결합은 25 에서 Biacore 1000 또는 3000 장치 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)( 작동 HBS-EP (10 mm HEPES [ph 7.4], 150 mm NaCl, 3 mm EDTA, 및 0.005% 계면활성제 P20을사용함 ) 으로표면플라스몬공명기반측정으로측정한다. 모든화학물질은 Biacore AB (Uppsala, Sweden) 로부터구입하거나텍스트에기재된바와같은다른공급원으로부터구입한다. 예를들어, 10mM 나트륨아세테이트 (ph 4.5) 에희석된대략 5000 RU의염소항-마우스 IgG, (Fcγ), 단편특이적폴리클로날항체 (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL) 는 25μg /ml에서제조업자의지침및과정에따라표준아민커플링키트를사용하는 CM5 연구등급바이오센서칩전반에걸쳐직접고정화시킨다. 바이오센서표면상에미반응된잔기는에탄올아민으로차단시킨다. 플로우셀 2 및 4에서변형된카복시메틸덱스트란표면은반응표면으로서사용한다. 플로우셀 1 및 3에서염소항-마우스 IgG 없이변형되지않은카복시메틸덱스트란은표준표면으로서사용한다. 역학적분석을위해, 1:1 랑그뮈르결합모델로 - 92 -
부터유래된속도방정식은 Biaevaluation 4.0.1 소프트웨어를사용한모든 8개주사 ( 범용적용분석 ) 의연합및해리단계에동시에적용한다. 정제된항체또는 DVD-Ig는염소항-마우스 IgG 특이적반응표면에걸친포획을위해 HEPES 완충식염수에희석시킨다. 리간드 (25μg/ml) 로서포획된항체또는 DVD-Ig는 5μl / 분의유속에서반응매트릭스상에주사한다. 결합및해리속도상수, k on (M -1 s -1 ) 및 k Off (s -1 ) 는 25μl / 분의연속적인유속하에측정한다. 속도상수는 10 내지 200nM 범위의상이한항원농도에서역학적결합측정을수행함에의해유도된다. 항체또는 DVD-Ig와표적항원간의반응의평형결합상수 (M) 는이어서하기식에의해역학적속도상수로부터계산한다 : K D = k Off /k on. 결합은시간의함수로서기록하고역학적속도상수를계산한다. 본분석에서, 10 6 M -1 s -1 로신속한결합속도및 10-6 s -1 로느린해리속도가측정될수있다. 그결과는표 4에나타낸다. 표 4 [0484] [0485] [0486] [0487] [0488] 바이아코어기술에의해특성분석된모든 DVD-Ig 작제물의결합은유지되고모항체의결합에필적할수있다. 모든 N-말단가변도메인은모항체와유사한고친화성으로결합한다. 실시예 1.1.2: 모항체및 DVD-Ig의기능적활성을결정하기위해사용되는분석실시예 1.1.2.A: 사이토킨생분석항-사이토킨또는항-성장인자모항체또는항-사이토킨또는항-성장인자서열을함유하는 DVD-Ig가표적사이토킨또는성장인자생화성을억제하거나중화시키는능력은항체또는 DVD-Ig의억제능력을결정함에의해분석한다. 예를들어, IL-4 매개된 IgE 생성을억제하는항-IL-4 항체의능력을사용할수있다. 예를들어, 사람순수 B 세포는피콜-플라크밀도원심분리에이어서사람 sigd FITC 표지된염소 F(ab)2 항체에대해특이적인 MACS 비드 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) 에이어서항-FITC MACS 비드를사용한자기적분리에의해각각말초혈액, 연막으로부터분리한다. 자기적으로분류된순수 B 세포는 XV15에서 ml당 3 x 10 5 세포로조정하고 5% CO 2 의존재하에 37 에서배양 10일동안에 PBS 채워진웰에의해둘려싸여진플레이트의중앙에 6 x 6 배열로 96웰플레이트웰당 100 μl로분주하였다. 각각의하나의플레이트는시험될항체당제조하고각각비유도된및유도된대조군, 및 7μg /ml에서시작하여항체적정의 4회반복체및 50μl 4회농축된예비희석에첨가된 29ng/ml 최종농도로하향된 3배희석으로의작동의각각의 3개의웰로이루어진다. IgE 생산을유도하기위해, 20ng/ml에서 rhil-4 및 50μl중의 0.5ug/ml 최종농도에서항-CD40 모노클로날항체 (Novartis, Basel, Switzerland) 각각을각각의웰에첨가하고 IgE 농도는표준샌드위치 ELISA 방법에의한배양시기의말기에측정한다. - 93 -
[0489] [0490] 실시예 1.1.2.B: 사이토킨방출분석사이토킨방출을유발하는모항체또는 DVD-Ig의능력을분석한다. 말초혈액을혈관구멍에의해헤파린처리된혈관튜브내로 3명의건강한공여자로부터인출한다. 전혈을 RPMI-1640 배지로 1:5로희석하고웰당 0.5ml에서 24웰조직배양플레이트에첨가한다. 항-사이토킨항체 ( 예를들어, 항-IL-4) 를 RPMI-1640상으로희석하고 200, 100, 50, 10, 및 1 μg/ml의최종농도가되도록 0.5mL/ 웰로플레이트에첨가한다. 배양플레이트내전혈의최종희석은 1:10이다. LPS 및 PHA를사이토킨방출을위한양성대조군으로서별도의웰에 2 μg/ml 및 5 μg/ml의최종농도로가한다. 폴리클로날사람 IgG를네가티브대조군항체로서사용한다. 당해실험을 2회수행한다. 플레이트를 5% CO 2 에서 37 에서배양한다. 24시간후웰의내용물을시험관으로옮기고 1200rpm에서 5 분동안회전시킨다. 무세포상등액을수거하고사이토킨분석을위해동결시킨다. 플레이트상및튜브내에잔류하는세포를 0.5 ml의용해용액으로용해시키고 -20 에놓고해동시킨다. 0.5 ml의배지를첨가하고 ( 용량이무세포상등액샘플과동일한수준이되도록하면서 ) 세포제제를수거하고사이토킨분석을위해동결시킨다. 세포부재상등액및세포용해물을 ELISA에의해사이토킨수준, 예를들어, IL-8, IL-6, IL-1β, IL-1RA, 또는 TNF-α 수준에대해분석한다. [0491] [0492] [0493] [0494] [0495] [0496] [0497] 실시예 1.1.2.C: 사이토킨교차-반응성연구목적하는사이토킨에대해지시된항-사이토킨모항체또는 DVD-Ig가기타사이토킨과교차반응하는능력을분석한다. 모항체또는 DVD-Ig를바이아코어바이오센서매트릭스상에고정화시킨다. 항-사람 Fc mab를유리아민그룹을통해 10OmM N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 및 40OmM N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필 )-카보디이미드하이드로클로라이드 (EDC) 와함께매트릭스상에제1 활성화카복실그룹에의해덱스트란매트리그로공유결합시킨다. 나트륨아세테이트 (ph 4.5) 에서희석된 25μg /ml의농도에서각각의항체또는 DVD-Ig 제제각각의대략 50μL를활성화된바이오센서를거쳐주사하고단백질상의유리아민을활성화된카복실그룹으로직접결합시킨다. 전형적으로, 5000 공명유니트 (RU' s) 를고정화시킨다. 미반응된매트릭스 EDC-에스테르를 1M 에탄올아민의주사에의해불활성화시킨다. 1초유속세포를표준아민커플링키트를사용하여사람 IgG1/K를고정화시킴에의해표준물질로서제조한다. SPR 측정은 CM 바이오센서칩을사용하여수행한다. 바이오센서표면상에분석될모든항원은 0.01% P20을함유하는 HBS-EP 작동완충액중에희석시킨다. 사이토킨특이성을조사하기위해, 목적하는과량의사이토킨 (10OnM, 예를들어, 가용성재조합사람 ) 을항-사이토킨모항체또는 DVD-Ig 고정화된바이오센서표면 (5분접촉시간 ) 에걸쳐주사한다. 목적하는사이토킨의주사전및이후즉시, HBS-EP 완충액단독을각각의유동셀을통해유동시킨다. 사이토킨주입완료후대략 30 초에상응하는시점및기준선간의총차이는최종결합값을나타내도록취한다. 다시, 당해반응은공명유니트로측정한다. 바이오센서매트릭스는결합반응이관찰되는다음샘플의주사전에 10mM HCl을사용하여소행시키거나작동완충액을매트릭스상에주사하였다. 사람사이토킨 ( 예를들어, IL-1 α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-1l, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-22, IL-23, IL-27, TNF-α, TNF-β, 및 IFN-γ) 은또한동시에고정화된마우스 IgG1/K 표준표면상에주사하여임의의비특이적결합배경을기록한다. 표준및반응표면을제조함에의해, 바이아코어는굴절지수변화및주사노이즈의대부분을제거하기위해반응표면으로부터참조표면데이터를자동적으로공제할수있다. 따라서, 항-사이토킨항체또는 DVD-Ig 결합반응으로인한튜브결합반응을확인할수있다. 목적하는사이토킨이고정화된항-사이토킨항체를거쳐주사되는경우, 상당한결합이관찰된다. 1OmM HCl 소생은완전히모든비-공유결합된단백질을제거한다. 센서그람의조사는가용성사이토킨에결합하는고정화된항-사이토킨항체또는 DVD-Ig가강함을보여준다. 목적하는사이토킨과예상된결과를확인한후재조합사람사이토킨을잔류하는패널을각각의항체또는 DVD-Ig에대해별도로시험한다. 각각의주사사이클에대해항- 사이토킨항체또는 DVD-Ig 결합되거나미결합된사이토킨의양을기록한다. 3개의독립적인실험으로부터의결과를사용하여각각의항체또는 DVD-Ig의특이성프로필을결정한다. 목적하는사이토킨에대한예상되는결합을갖고임의의다른사이토킨에는결합하지하지않는항체또는 DVD-Ig를선별한다. 실시예 1.1.2.D: 조직교차반응성조직교차반응성연구는 3단계로수행하고제1 단계는 32개조직의냉동절편을포함하고, 제2 단계는 38개이하의조직을포함하고제3 단계는하기에기재된바와같은관련없는 3명의성인으로부터의추가의조직을포함한다. 연구는통상 2개의용량수준에서수행된다. - 94 -
[0498] [0499] [0500] [0501] [0502] [0503] 단계 1: 사람조직 ( 부검또는생검으로부터수득된하나의사람공여자기원의 32개조직 ( 전형적으로, 부신, 위장관, 전립선, 방광, 심장, 골격근, 혈액세포, 신장, 피부, 골수, 간, 척수, 유방, 폐, 비장, 소뇌, 림프절, 고환, 대뇌피질, 난소, 흉선, 결장, 췌장, 갑상선, 내피, 부갑상선, 수뇨관, 안구, 뇌하수체, 나팔관및태반 )) 의냉동절편 ( 약 5 μm) 을대물글래스상에고정시키고건조시킨다. 조직절편의퍼옥시다제염색은아비딘- 비오틴시스템을사용하여수행한다. 단계 2: 부검또는생검에서수득된 3명의비관련성인기원의 38개조직 ( 부신, 혈액, 혈관, 골수, 소뇌, 대뇌, 자궁경관, 식도, 안구, 심장, 신장, 대장, 간, 폐, 림프절, 유방유선, 난소, 난관, 췌장, 부갑상선, 말초신경, 뇌하수체, 태반, 전립선, 침샘, 피부, 소장, 척수, 비장, 위, 횡문근, 고환, 흉선, 갑상선, 편도선, 수뇨관, 뇨방광및자궁을포함함 ) 기원의사람조직의냉동절편 ( 약 5 μm) 을대물글래스상에고정시키고건조시킨다. 조직절편의퍼옥시다제염색은아비딘-비오틴시스템을사용하여수행한다. 단계 3: 부검또는생검에서수득된 3명의비관련성숙한원숭이기원의 38개조직 ( 부신, 혈액, 혈관, 골수, 소뇌, 대뇌, 자궁경관, 식도, 안구, 심장, 신장, 대장, 간, 폐, 림프절, 유방유선, 난소, 난관, 췌장, 부갑상선, 말초신경, 뇌하수체, 태반, 전립선, 침샘, 피부, 소장, 척수, 비장, 위, 횡문근, 고환, 흉선, 갑상선, 편도선, 수뇨관, 뇨방광및자궁을포함함 ) 기원의시노몰구스원숭이조직의냉동절편 ( 약 5 μm) 을대물글래스상에고정시키고건조시킨다. 조직절편의퍼옥시다제염색은아비딘-비오틴시스템을사용하여수행한다. 항체또는 DVD-Ig는제2 비오티닐화된항-사람 IgG로항온처리하고면역복합체가되도록한다. 항체또는 DVD- Ig의최종농도 2 및 10 μg/ml에서면역복합체를대물글래스상의조직절편상으로첨가함에이어서조직절편을아비틴-비오틴퍼옥시다제키트를사용하여 30분동안반응시킨다. 후속적으로, 퍼옥시다제반응을위한기질인 DAB (3,3'-디아미노벤지딘) 은조직염색을위해 4분동안적용한다. 항원-세파로스비드를양성대조군조직절편으로서사용한다. 표적항원및사람혈청차단연구는추가의대조군으로서작용한다. 항체또는 DVD- Ig의최종농도 2 및 10 μg/ml에서의면역복합체는표적항원 ( 최종농도 100 μg/ml) 또는사람혈청 ( 최종농도 10%) 과미리 30분동안항온처리함에이어서대물글래스상의조직절편상으로첨가함에이어서조직절편을 30분동안아비딘-비오틴-퍼옥시다제키트와반응시킨다. 후속적으로, 퍼옥시다제반응을위한기질인 DAB (3,3'-디아미노벤지딘) 을조직염색을위해 4분동안적용한다. 임의의특이적염색은미지의표적항원의공지된발현시예상치않은반응성또는예상된 ( 예를들어, 항원발현과일치 ) 것으로판단된다. 특정판단된염색은강도및횟수에대해스코어한다. 단계 2( 사람조직 ) 와단계 3( 시노몰구스원숭이조직 ) 사이의조직염색은유사하거나상이한것으로판단된다. 실시예 1.1.2.E: IL-1α/β 생분석및중화분석 [0504] MRC5 세포를 100 μl 용적으로웰당 1.5-2 x 10 4 세포로플레이팅하고 37, 5% CO 2 에서밤새항온처리한다. 항 체 (4배농축 ) 의 20 μg/ml 작동스톡을완전 MEM 배지에서제조하였다. 8점연속희석을마쉬희석플레이트에서완전 MEM(5 μg/ml- 0.0003 μg/ml) 에서수행하였다. 각각의항체희석의웰당 65 μl를 4회 96웰v-기저 (Costar# 3894) 플레이트에첨가하고, 65 μl의 IL-1α 또는 IL-1β의 200 pg/ml 용액또는 IL-1α 및 IL-1β 둘다의 50pg/ml 용액을함유하는혼합용액 65μl도첨가하였다. 대조군웰에 65 μl의 200 pg/ml의 IL-1α 또는 IL-1β 또는 50 pg/ml 혼합 IL-1α/β (4x 농축 ) + 65 μl MEM 배지를첨가하고대조군웰에는 130 μl의배지를첨가하였다. 1시간항온처리후, 100 μl의 Ab/Ag 혼합물을 MRC5 세포에첨가하였다. 모든웰용적은 200 μ L와동일하였다. 모든플레이트시약을이어서 1x 농축시켰다. 16 내지 20시간항온처리후, 웰함량 (150 μl) 을 96웰환저플레이트 (Costar# 3799) 로옮기고 -20 동결기에놓았다. 상등액을사람 IL-8 ELISA 키트 (R&D Systems, Minneapolis, MN) 또는 hil-8 화학발광키트 (MDS) 를사용함에의해 hil-8 수준에대해시험하였다. 중화효능은 IL-1α, IL-1β, 또는 IL-1α/β 단독의대조군값에상대적인순환 % 억제에의해측정하였다. 그결과는표 5에나타낸다. - 95 -
표 5 [0505] [0506] [0507] [0508] [0509] N-말단또는 C-말단위치에서 AB066 기원의 VD를함유하는모든 DVD-Ig는 MRC5 IL-1Iα/β 중화분석에서중화를보여주었다. 실시예 1.1.2.F: hutnfα의중화 L929 세포를반-컨플루언트밀도로성장시키고 0.05% 트립신 (Gibco#25300) 을사용하여수거하였다. 세포를 PBS 로세척하고계수하고 4 μg/ml의액티노마이신 D를함유하는분석배지에서 1E6 세포 /ml로재현탁시켰다. 당해세포를 50 μl의용적및 5E4 세포 / 웰에서 96-웰플레이트 (Costar#3599) 로씨딩하였다. DVD-Ig 및대조군 IgG를분석배지에서 4 x 농축으로희석시키고연속 1:3 희석물을제조하였다. hutnfα를분석배지에서 400 pg/ml로희석시켰다. 항체샘플 (200 μl) 을 1:2 희석계획으로 hutnfα (200 μl) 에첨가하고실온에서 0.5시간동안항온처리하였다. DVD-Ig / hutnfα 용액을 100 pg/ml hutnfα 및 25 nm - 0.00014 nm DVD-Ig 의최종농도를위해 100μl로플레이팅된세포에첨가하였다. 당해플레이트를 37, 5% CO 2 에서 20시간동안항온처리하였다. 생존성을정량 하기위해, 100 μl를웰로부터제거하고 10 μl의 WST-I 시약 (Roche cat# 11644807001) 을첨가하였다. 플레이트를 3.5시간동안분석조건하에항온처리하고 500 x g에서원심분리하고 75μl의상등액을 ELISA 플레이트 (Costar cat#3369) 로옮겼다. 당해플레이트를 Spectromax 190 ELISA 플레이트판독기상에서 OD 420-600 nm에서판독하였다. 그결과는표 6에제공된다. 표 6 [0510] [0511] [0512] [0513] N-말단또는 C-말단위치중어느하나에 AB017 유래의 VD를함유하는모든 DVD-Ig는 L929 TNFα 중화분석에서중화를나타내었다. 실시예 1.1.2.G: IL-6 유도된 pstat3 분석 TF-1 세포를 2 mm 1-글루타민, 10 mm HEPES, 100 U/mL Pen/strep, 1.5g/L 중탄산나트륨, 4.5 g/l 글루코스, 1-96 -
mm 나트륨피루베이트, 10% FBS, 및 2 ng/ml GM-CSF와함께 DMEM중에서배양한다. TF-1 세포를 10 μl 용적에서웰당 1.5-2 x 10 5 세포로플레이팅하고분석배지 ( 완전 DMEM - GM-CSF) 에서 37, 5% CO 2 에서밤새배양한다. 세포를 96 1/2 웰백색분석플레이트로플레이팅한다. 항체 (4 x 농축 ) 의 500 μg/ml 작동스톡을 PBS중에서제조한다. 항체및 DVD-Ig를마쉬희석플레이트에서분석배지에서 1:5로연속희석한다. 각각의항체희석의웰당 5 ul를, 당해세포를함유하는 96 1/2 웰백색분석플레이트에 3회첨가한다. 세포및항체또는 DVD- Ig를빙상에서 30분동안예비항온처리한다. IL-6을내독소유리 D-PBS(0.1% BSA) 중 loμg/ml 스톡및분석배지로제조된 10ng/ml(4 x 농축 ) 의작동스톡으로제조한다. 5μL/ 웰의 100 ng/ml IL-6을각각의웰에첨가한다. 플레이트를 37 에서 30분동안항온처리한다. 세포를모든웰에 5μL의 5 X 세포용해완충액을첨가함에의해용해시키고당해플레이트를실온에서 10분동안진탕시킨다. 플레이트를 -20 에서동결시키고 pstat3 SureFire 분석을수행한다 (Perkin Elmer). [0514] 당해플레이트를실온에서해동시키고알파스크린수용체비드 (40부반응완충액, 10부활성화완충액및 1부수용체비드 ) 를함유하는 30 μl/ 웰의반응완충액 + 활성화완충액믹스를각각의웰에첨가한다. 당해플레이트를호일로밀봉하여이를빛으로부터보호하고 37 에서약하게 2시간동안진탕시킨다. 알파스크린비드 (1부공여체비드에대한 20부희석완충액 ) 를함유하는희석완충액 (12.5μL/ 웰 ) 을각각의웰에첨가한다. 당해플레이트를호일로밀봉하고 2시간동안 37 에서약하게진탕시킨다. 당해플레이트를실온으로하고알파스크린플레이트판독기상에서판독한다. 표 7 [0515] [0516] [0517] [0518] N-말단또는 C-말단위치에서 AB054 기원의 VD를함유하는모든 DVD-Ig는 IL-6 억제분석에서중화를보여주었다. 실시예 1.1.2.H: EP4 생분석에서의 PGE2의억제항-PGE2 항체및 DVD-Ig 분자를함유하는항-PGE2의 PGE2의세포반응을억제하는능력은인간 EP4 수용체로안정하게형질감염된 HEK293Gα16 세포에서의 Ca++ 플럭스분석으로측정하였다. 상기세포를블랙 / 클리어폴리- D-라이신플레이트 (Corning #3667, Corning, N.Y.) 에플레이팅하고, Ca++ 민감성염료 (Molecular Devices) 와함께 90분동안항온처리하였다. (200프루프에탄올중의 ) 스톡 PGE2를 FLIPR 완충액 [1xHBSS(Invitrogen, Carlsbad, California), 20mM HEPES(Invitrogen, Carlsbad, California), 0.1% BSA(Sigma, St. Louis, Mo.) 및 2.5mM 프로베네시드 (Sigma, St. Louis, Mo.) 함유 ] 로희석시켰다. 또한, 항-PEG2 항체, DVD-Ig 분자또는이소형매칭된대조군항체도 FLIPR 완충액에서예비희석시켰다. 25μL의 PGE2 또는예비항온처리된 PGE2/ 항체혼합물 EH는예비항온처리된 PGE2/DVD-Ig 분자혼합물을세포로예비플레이팅된웰에첨가하였다. PGE2의용량반응은 PGE2의일련의적정에의해행하여 FLIPR1 또는 Tetra(Molecular Devices) 로측정하였다. EC50은 Graph Pad Prism 5(GraftPad Software, La Jolla, California) 를이용하여측정하였다. 항체및 DVD-Ig 분자를시험하기위해서, EC50 농도에서 PGE2를다양한농도의시험물또는이소형매칭된항체 ( 음성대조군 ) 와 20 분동안항온처리하고, HEK293Gα16 세포중의염료-부하된사람 EP4에첨가하였다. FLIPR1을이용하여 Ca++ - 97 -
플럭스를모니터링하고, GraphPad Prism 5 를이용하여데이터를분석하였다. 표 8 [0519] [0520] [0521] [0522] N-말단또는 C-말단위치에서 AB048 기원의 VD를함유하는모든 DVD-Ig는 PGE2 억제분석에서중화를나타내었다. 실시예 1.1.2.I: Neuroscreen 생분석에서의 NGF의억제 Neuroscreen-1 세포 (Cellomics) 는신경돌기성장에대해최적화된뉴런세포주이다. 상기세포는랫트 PC12 크롬친화성세포종세포의서브클론이다. 상기세포를 RPMI 1640 + 10% 말혈청 + 5% 소배아혈청 + PenStrep + L-글루타민 + 10mM HEPES에서배양한다. 상기세포를콜라겐-I 피복된플라스크및플레이트에서배양한다. Neuroscreen-1 세포를 100μL 체적중웰당 5x10 4 세포로콜라겐-I 피복된 96-웰플레이트에플레이팅하고, 배양배지에서 37, 5% CO 2 로밤새항온처리한다. 세포를 RPMI + 10mM HEPES(100μL/ 웰 ) 에서 24시간동안혈청 결핍시킨다. 이어서, 상기플레이트를 RT에서 15분동안항온처리하여이들을실온이되도록한다. 상기세포에 NGF/DVD-Ig 또는항체를첨가함으로써세포를자극한다. 시험된 DVD-Ig 또는항체의최종농도는 1μg /ml이다. 항체또는 DVD-Ig의워킹스톡 (6배농축 ) 을 RPMI + 10mM HEPES + 0.1% BSA( 분석배지 ) 에서제조한다. 항체및 DVD-Ig를 Marsh 희석플레이트의분석배지에서 10개의포인트에대해 1:3 연속희석한다. NGF의스톡용액은 10μg /ml이다. NGF의최종농도는 3.3ng/mL이다. NGF는 6X(19.8ng/mL) 로계산되고, RPMI + 10mM HEPES + 0.1% BSA 중에구성된다. 상기항체또는 DVD-Ig 희석액에 NGF를첨가하고, 이들을 15분동안실온에서항온처리한다. Biomek을이용하여, 50μL의 NGF +/- DVD-Ig 또는항체를 16분동안실온에서첨가한다. 모든웰에 40μL의 1X 세포용해완충액을첨가하여세포를용해시키고, 플레이트를 60분동안실온에서진탕시킨다. SureFire ERK 1/2 인산화키트분석 (Perkin Elmer) 을행하였다. [0523] ERK 분석을행하기위해서, 세포플레이트로부터 4μL/ 웰의용해물을제거하여 384 웰화이트플레이트 (Corning #3652) 에기포가생기지않도록 2회옮긴다. 각각의웰에알파스크린수용체비드 ( 반응완충액 60부, 활성화완충액 10부및스트렙트아비딘피복된공여체비드 1부 ; 단백질 A-피복된수용체비드 1부 ) 를함유하는반응완충액을 7μL 첨가한다. 상기플레이트를접착성커버로밀봉하고, 1 내지 2분동안약하게교반시킨다. 호일로커버하여광을차단하고, 실온에서 1시간동안항온처리한다. 상기플레이트를표준알파스크린플레이트설정을이용한 Envision 상에서판독한다. - 98 -
표 9 [0524] [0525] [0526] [0527] N-말단또는 C-말단위치에서 AB020 또는 AB118 기원의 VD를함유하는모든 DVD-Ig는 NGF 억제분석에서중화를나타내었다. 실시예 1.1.2.J: 시험관내종양수용체모노클로날항체또는 DVD-Ig의성장억제효과 D-PBS-BSA (0.1% BSA를사용한듈베코포스페이트완충식염수 ) 에희석된종양수용체모노클로날항체또는 DVD-Ig 20μL를 180uL 중의 0.01 μg/ml-100 μg/ml의최종농도로사람종양세포에첨가하였다. 당해플레이트를 3일동안습한 5% CO 2 대기에서 37 에서항온처리하였다. 각각의웰에서생존세포수를제조업자의지침 에따라 MTS 시약 (Promega, Madison, WI) 을사용하여정량하여종양성장억제 % 를측정하였다. 항체처리없이 웰을 0% 억제대조군으로서사용하는반면, 세포부재웰은 100% 억제를나타내는것으로고려된다. [0528] [0529] 실시예 1.1.2.K: 시험관내모항체또는 DVD-Ig 항체의살종양효과종양세포상의표적항원에결합하는모항체또는 DVD-Ig 항체는살종양활성에대해분석될수있다. 간략하게, 모항체또는 DVD-Ig 항체는 D-PBS-BSA (0.1% BSA를갖는듈베코포스페이트완충식염수 ) 에희석시키고최종농도 0.01 μg/ml 내지 100 μg/ml 200μL로사람종양세포에첨가한다. 당해플레이트를 3일동안습한 5% CO 2 대기에서 37 에서항온처리한다. 각각의웰에서생존세포수를제조업자의지침에따라 MTS 시약을사용 하여정량하고종양성장억제 % 를측정한다. 항체처리되지않은세포를 0% 억제의대조군으로서사용하는반면 세포가없는세포를 100% 억제를보여주는것으로고려한다. [0530] 아폽토시스평가를위해, 카스파제 -3 활성화는하기의프로토콜을사용하여측정한다 : 96 웰플레이트에서항체 처리된세포는 120 μl 의 1 x 용해완충액 (1.67mM Hepes, ph 7.4, 7mM KCl, 0.83mM MgCl 2, 0.11mM EDTA, 0.11mM EGTA, 0.57% CHAPS, 1mM DTT, 1 x 프로테아제억제제칵테일정제 ; EDTA-부재 ; Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ) 중에서실온에서 20분동안진탕시키면서용해시킨다. 세포용해후, 80 μl의카스파제-3 반응완충액 (48mM Hepes, ph 7.5, 252mM 슈크로스, 0.1 % CHAPS, 4mM DTT, 및 20 μm Ac-DEVD-AMC 기질 ; Biomol Research Labs, Inc., Plymouth Meeting, PA) 을첨가하고플레이트를 37 에서 2시간동안항온처리한다. 당해플레이트를하기의셋팅을사용하여 1420 VICTOR 다중표지계수기 (Perkin Elmer Life Sciences, Downers - 99 -
Grove, IL) 상에서판독한다 : 여기 = 360/40, 방출 = 460/40. 이소타입항체대조군처리된세포와비교하여항체 처리된세포기원의형광단위의증가는아폽토시스를지적한다. [0531] [0532] 실시예 1.1.2.L: 모항체및 DVD-Ig 작제물에의한세포증식의억제 U87-MG 사람신경아교종종양세포를 5% 태아소혈청이보충된 RPMI 배지의 96 웰디쉬에 100 μl로웰당 2,000 의 세포로플레이팅하고 37, 5% CO 2 에서밤새항온처리한다. 다음날세포를연속희석된항체또는 DVD-Ig (0.013 nm 내지 133 nm 용량범위 ) 로처리하고, 5 일동안습한 5% CO 2 대기에서 37 에서항온처리한다. 세포생 존 / 증식은제조업자의지침에따라 ATPlite 키트 (Perkin Elmer, Waltham, MA) 를사용하여 ATP 수준을평가함으 로써간접적으로측정한다. [0533] [0534] 실시예 1.1.2.M: 시험관내모항체또는 DVD-Ig 작제물에의한수용체인산화의억제 사람암종세포를 180μl 무혈청배지 (DMEM+ 0.1% BSA) 에서웰당 40,000 세포로 96 웰플레이트에플레이팅하고, 37, 5% CO 2 에서밤새항온처리한다. 코스타르 EIA 플레이트 (Lowell, MA) 를웰당 100 μl 의수용체포획 Ab(4 μg/ml 최종농도 ) 피복하고진탕시키면서실온에서밤새항온처리한다. 다음날, 수용체항체-피복된 ELISA 플레이트를세척하고 ( PBS 중의 PBST = 0.05% Tween 20으로 3회세척, ph 7.2-7.4), 200μl의차단용액을첨가하여 (1% BSA, PBS 중 0.05% NaN 3, ph 7.2-7.4.) 락커상에서실온에서 2시간동안차단한다. 사람종양세포를항체또는 DVD-Ig 및리간드와동시항온처리한다. D-PBS-BSA (0.1% BSA를갖는듈베코포스페이트완충식염수 ) 중에희석된모노클로날항체 DVD-Ig를최종농도 0.01 μg/ml-100 μg/ml로사람암종세포에첨가한다. 성장인자를 1-lOOng/mL (200μL) 의농도로세포에동시에첨가하고, 세포를 1시간동안습한 5% CO 2 대기에서 37 에서항온처리한다. 세포를웰당 120μl의냉각세포추출완충액 (10 mm Tris, ph 7.4, 100 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 1 mm NaF, 1 mm 나트륨오르토바나데이트, 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 0.1% SDS, 및프로테아제억제제칵테일 ) 중에서용해시키고, 진탕시키면서 20분동안 4 에서항온처리한다. 세포용해물 (loo μl) 을 ELISA 플레이트에첨가하고약하게진탕시키면서 4 에서밤새항온처리한다. 다음날, ELISA 플레이트를세척하고웰당 100 μl의 ptyr-hrp 검출 Ab를첨가하고 (p-igflr ELISA 키트, R&D System # DYC 1770, Minneapolis, MN), 플레이트를암실에서 25 에서 2시간동안항온처리한다. 플레이트를발색시켜제조업자의지침에따라인산화를측정한다. [0535] [0536] 실시예 1.1.2.N: 사람암종피하옆구리이종이식체의성장에대한 DVD-Ig 의효능 A-431 사람편평세포암종세포를생체내에서조직배양플라스크에서 99% 생존력, 85% 컨플루언스까지성장시킨 다. 0 일째에 19 내지 25g 의 SCID 암컷마우스 (Charles Rivers Labs, Wilmington, MA) 의오른쪽옆구리에 1 x 10 6 사람종양세포 (1:1 마트리겔 ) 을피하주사한다. 사람 IgG 대조군또는 DVD-Ig 의투여 (IP, QD, 3x/ 주 ) 는 마우스를평균종양용적이대략 200 내지 320 mm 3 인마우스그룹으로크기별로일치시킨후개시하였다. 종양 은대략세포주사 10 일후에개시하여주당 2 회측정한다. [0537] [0538] 실시예 1.1.2.O: 유동세포측정에의해평가된바와같이사람종양세포주의표면으로의모노클로날항체의결합목적하는세포표면항원을과발현하는안정한세포주또는사람종양세포주를조직배양플라스크로부터수거하고 5% 태아소혈청 (PBS/FBS) 를함유하는포스페이트완충식염수 (PBS) 에재현탁시켰다. 염색전에, 사람종 양세포를빙상에서 PBS/FCS중의 (looμl) 사람 IgG 5μg/ml로항온처리하였다. 1-5 x lo 5 세포를빙상에서 30 내지 60분동안 PBS/FBS에서항체또는 DVD-Ig(2 μg/ml) 로항온처리하였다. 세포를 2회세척하고 looμl의 F(ab')2 염소항사람 IgG, Fcγ-피코에리트린 (PBS중의 1:200 희석 ) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Cat.# 109-116-170) 을첨가하였다. 빙상에서 30분항온처리한후, 세포를 3회세척하고 PBS/FBS중에재현탁시켰다. 형광을 Becton Dickinson FACSCalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA) 을사용하여측정하였다. [0539] [0540] 실시예 1.1.2.P: 유동세포측정에의해평가된바와같이사람종양세포주의표면에대한모수용체항체및 DVD-Ig 작제물의결합세포표면수용체또는사람종양세포주를과발현하는안정한세포주는조직배양플라스크로부터수거하고 1% 태아소혈청 (DPBS/FCS) 을함유하는듈베코포스페이트완충식염수 (DPBS) 중에재현탁시켰다. 1-5 x lo 5 세포를빙상에서 30 내지 60분동안 DPBS/FCS중에서 looμl 항체또는 DVD-Ig (loug/ml) 로항온처리하였다. 세포를 2회 - 100 -
세척하고 50μl의염소항-사람 IgG-피코에리트린 (DPBS/BSA중에 1 :50 희석 ) (Southern Biotech Associates, Birmingham, AL cat#2040-09) 을첨가한다. 빙상에서 30 내지 45 분항온처리후, 세포를 2회세척하고 DPBS/FCS중에서 125uL/ 웰 1% 포름알데하이드중에재현탁시켰다. Becton Dickinson LSRII (Becton Dickinson, San Jose, CA) 을사용하여형광을측정하였다. [0541] [0542] [0543] [0544] [0545] [0546] [0547] [0548] [0549] 실시예 1.2: 목적하는사람항원에대한모모노클로날항체의생성목적하는사람항원에결합하고이를중화시킬수있는모마우스 mab 및이의변이체를다음과같이수득하였다 : 실시예 1.2.A: 목적하는사람항원을사용한마우스의면역화완전프룬트보조제또는면역분석보조제 (Qiagen, Valencia, CA) 와혼합된 20μg의재조합정제된사람항원 ( 예를들어, IGF 1,2) 을 1일째에 5마리의 6-8 주령 Balb/C, 5마리의 C57B/6 마우스, 및 5마리의 AJ 마우스로피하주사하였다. 24일, 38일및 49일째에, 불완전프룬트보조제또는면역분석보조제와혼합된 20μg의재조합정제된사람항원변이체를동일한마우스에피하주사한다. 84일째또는 112일째또는 144일째에, 마우스를목적하는 1ug의재조합정제된사람항원으로정맥내주사한다. 실시예 1.2.B: 하이브리도마의생성실시예 1.2.A에기재된면역화된마우스로부터수득된비장세포는문헌 [ 참조 : Kohler, G. and Milstein (1975) Nature, 256:495] 에기재된확립된방법에따라 5:1의비율로 SP2/O-Ag-14 세포와융합시켜하이브리도마를생성한다. 웰당 2.5 x 10 6 비장세포의밀도로 96 웰플레이트에서아자세린및하이포산틴을함유하는선택배지에플레이팅하였다. 융합한지 7일내지 10일후, 거시적하이브리도마콜로니를관찰한다. 하이브리도마콜로니를함유하는각각의웰기원의상등액은목적하는항원에대한항체의존재에대해 ELISA로시험한다 ( 실시예 1.1.1.A에기재된바와같이 ). 항원-특이적활성을나타내는상등액을이어서활성 ( 실시에 1.1.2의분석에기재된바와같이 ), 예를들어, 실시예 1.1.2.I에기재된바와같이생분석에서목적하는항원을중화시키는능력에대해시험한다. 실시예 1.2.C: 목적하는사람표적항원에대한모모노클로날항체의동정및특성분석실시예 1.2.C.1: 모모노클로날항체중화활성의분석하이브리도마상등액은실시예 1.2.A 및 1.2.B에따라생성된목적하는항원에결합하고또한목적하는항원의변이체 (" 항원변이체 ") 에결합할수있는모항체의존재에대해분석한다. 2개분석에서양성인항체를갖는상등액은이어서예를들어, 실시예 1.1.2.I의사이토킨생분석에서이들의항원중화효능에대해시험한다. 생분석에서 1000pM 미만, 하나의양태에서, 100pM 미만의 IC 50 값으로항체를생성하는하이브리도마는제한희 석에의해스케일업하고클로닝한다. 하이브리도마세포를 10% 낮은 IgG 태아소혈청 (Hyclone #SH30151, Logan, UT) 을함유하는배지로증식시킨다. 평균적으로, 250 ml의각각의하이브리도마상등액 ( 클론집단으로부터유래함 ) 을문헌 [ 참조 : Harlow, E. and Lane, D. 1988 "Antibodies: A Laboratory Manual"] 에기재된바와같이수거하고농축시키고정제한다. 표적항원의활성을억제하는정제된 mab의능력은예를들어, 실시예 1.1.2.I에기재된바와같은사이토킨생분석을사용하여측정한다. [0550] [0551] [0552] [0553] 실시예 1.2.C.2: 목적하는시노몰구스표적항원에대한모모노클로날항체교차반응성의분석본원에기재된선별된 mab가목적하는시노몰구스항원을인지하는지의여부를측정하기위해, 본원 ( 실시예 1.1.1.G) 에기재된바와같이재조합시노몰구스표적항원을사용하여 BIACORE 분석을수행한다. 또한, 목적하는재조합시노몰구스항원에대한 mab의중화효능은또한사이토킨생분석 ( 실시예 1.1.2.I) 에서측정할수있다. 양호한 cyno 교차반응성 ( 하나의양태에서, 사람항원의반응성의 5배이내 ) 을갖는 MAb는향후특성분석을위해선별한다. 실시예 1.2.D: 각각의쥐항-사람모노클로날항체에대한가변영역의아미노산서열의측정 cdna의분리, 재조합항-사람마우스 mab의발현및특성분석은다음과같이수행한다. 각각의아미노산서열측정을위해, 대략 1 x 10 6 하이브리도마세포를원심분리로분리하고프로세싱하여제조업자의지침에따라트리졸 (Gibco BRL/Invitrogen, Carlsbad, CA.) 을사용하여총 RNA를분리한다. 총 RNA를제조업자의지침에따라 Superscript 제1 쇄합성시스템 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 을사용하여제1 쇄 DNA 합성에적용한다. 올리고 - 101 -
(dt) 를사용하여제1 쇄합성을프라이밍하여폴리 (A)+ RNA에대해선별한다. 제1 쇄 cdna 생성물은이어서쥐면역글로불린가변영역 (Ig-프라이머세트, Novagen, Madison, WI) 의증폭을위해디자인된프라이머를사용하여 PCR로증폭시킨다. PCR 생성물을아가로스겔상에서분리하고절단하고정제함에이어서 TOPO 클로닝키트를사용하여 pcr2.1-topo 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 로서브클로닝하고 TOP10 화학적컴피턴트이. 콜라이 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 를형질전환시킨다. 콜로니 PCR은형질전환체상에서수행하여삽입체를함유하는클론을동정한다. 플라스미드 DNA를 QIAprep 미니프렙키트 (Qiagen, Valencia, CA) 를사용하여삽입체를함유하는클론으로부터분리한다. 플라스미드내삽입체를양쇄에대해서열분석하여 M13 정배향및 M13 역배향프라이머 (Fermentas Life Sciences, Hanover MD) 를사용하여가변중쇄또는가변경쇄 DNA 서열을측정한다. mab의가변중쇄및가변경쇄서열을동정한다. 하나의양태에서, 다음단계로의전개 ( 사람화 ) 를위해선행 mab의판넬에대한선별기준은다음을포함한다 : [0554] [0555] [0556] [0557] [0558] [0559] [0560] [0561] [0562] [0563] [0564] [0565] [0566] [0567] [0568] [0569] [0570] [0571] [0572] 항체는 CH2내표준물을제외하고는임의의 N-연결된당화부위 (NXS) 를함유하지않는다. 항체는항체마다정상적인시스테인에추가로임의의여분의시스테인을함유하지않는다. 항체서열은 VH 및 VL에대한가장밀접한사람배선서열과정렬시키고임의의범상한아미노산은다른천연사람항체에서의존재에대해검사되어야만한다. N-말단글루타민 (Q) 은이것이항체의활성에영향을주지않는다면글루탐산 (E) 로대체시킨다. 이것은 Q의폐환으로인해이종성을감소시킬것이다 효율적인시그날서열절단은질량분광측정기로확인한다. 이것은 COS 세포또는 293 세포물질로수행할수있다 단백질서열은실활시킬수있는 Asn의탈아미드화의위험성에대해검사한다 항체는저수준의응집을갖는다 항체는 >5-10 mg/ml용해도 ( 연구단계에서 ) ; >25 mg/ml의용해도를갖는다. 항체는동력광산란 (DLS) 에의한표준크기 ((5-6 nm) 를갖는다 항체는낮은전하이종성을갖는다. 항체는사이토킨분비가없다 ( 참조 : 실시예 1.1.2.B) 항체는의도된사이토킨에대해특이성을갖는다 ( 참조 : 실시예 1.1.2.C) 항체는예상된조직교차반응성이없다 ( 참조 : 실시예 1.1.2.D) 항체는사람과시노몰구스조직교차반응성간에유사성을갖는다 ( 참조 : 실시예 1.1.2.D) 실시예 1.2.2: 재조합사람화된모항체실시예 1.2.2.1: 재조합키메라항사람모항체의작제및발현마우스항-사람모 mab의중쇄불변영역을암호화하는 DNA는세균에서상동성재조합에의해 2 힌지-영역아미노산돌연변이를함유하는사람 IgG1 불변영역을암호화하는 cdna 단편으로대체한다. 이들돌연변이는 234 위치 (EU 넘버링 ) 에서류신의알라닌으로의대체이고 235위치에서류신의알라닌으로의대체이다 ( 문헌참조 : Lund et al., 1991, J. Immunol., 147:2657). 3개항체각각의경쇄불변영역은사람카파불변영역으로대체한다. 전장키메라항체는 pbos 발현플라스미드 (Mizushima and Nagata, Nucleic Acids Research 1990, VoI 18, pg 5322) 로연결된키메라중쇄및경쇄 cdna의동시형질감염에의해 COS 세포에서일시적으로발현된다. 재조합키메라항체를함유하는세포상등액을단백질 A 세파로스크로마토그래피로정제하고결합된항체를산완충액의첨가로용출시킨다. 항체를중화시키고 PBS내로투석시킨다. 키메라 mab를암호화하는중쇄 cdna를이의키메라경쇄 cdna ( 이둘다는 pbos 벡터에서연결된다 ) 와함께 COS 세포내로동시형질감염시킨다. 재조합키메라항체를함유하는세포상등액은단백질 A 세파로스크로마토그래피에의해정제하고결합된항체를산완충액의첨가로용출시킨다. 항체를중화시키고 PBS내로투석시킨다. 정제된키메라항-사람환자 mab를이어서결합하는능력 ( 바이어코어에의해 ) 및기능성활성, 예를들어, 실시예 1.1.1.G 및 1.1.2.B에기재된바와같은 IgE의사이토킨유도된생산을억제하는능력에대해시험한다. 모하이브리도마 mab의활성을유지하는키메라 mab는추가의전개를위해선별한다. - 102 -
[0573] [0574] [0575] [0576] [0577] [0578] [0579] 실시예 1.2.2.2: 사람화된항사람모항체의작제및발현실시예 1.2.2.2.A: 사람항체골격의선별각각의쥐가변중쇄및가변경쇄유전자서열은별도로벡터 NTI 소프트웨어를사용하여 44개사람면역글로불린배선가변중쇄또는 46개배선가변경쇄서열 (NCBI Ig Blast 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/retrieveig.html. 로부터유래됨 ) 에대해정렬시킨다. 사람화는아미노산서열상동성, CDR 클러스터분석, 발현된사람항체중에서사용횟수및사람항체의결정구조에대한가용한정보를기초로한다. 항체결합, VH-VL 쌍형성및기타인자에대한가능한효과를고려하여, 쥐잔기를사람잔기로돌연변이시키고여기서쥐및사람골격잔기는몇가지를제외하고는상이하다. 추가의사람화전략은쥐항체가변영역의아미노산서열과고도의상동성, 즉서열유사성을갖는사람배선항체서열또는이의서브그룹을기초로디자인한다. 상동성모델링을사용하여항체결합부위, CDR의구조에중요한것으로예상되는쥐항체서열에독특한잔기를동정한다. 상동성모델링은컴퓨터방법으로서이에의해대략적인 3차원배위가단백질에대해생성된다. 이들의배위의출처및추가쇄신을위한가이드는제2 단백질인참조단백질이고이에대한 3차원배위는공지되어있고이의서열은제1 단백질의서열과관련된다. 2개단백질의서열간의관계를사용하여참조단백질및이에대한배위가요망되는단백질인표준단백질간에상응성을생성시킨다. 참조및표적단백질의 1차서열은표준단백질로부터표적단백질로직접전달된 2개단백질의동일한부분의배위로정렬한다. 2개단백질의불일치부분, 예를들어, 잔기돌연변이, 삽입또는결실로부터의불일치부분에대한배위는일반적인구조주형및이미전달된모델배위와의일치성을보장하기위해개량된에너지로부터작제한다. 이러한컴퓨터단백질구조는모델링연구에서추가로개량되거나직접적으로사용될수있다. 모델구조의질은표준및표적단백질이관련되는내용의정확성및서열정렬이작제되는정밀성에의해결정된다. 쥐 mab에대해, BLAST 탐색및육안조사의조합을사용하여적합한표준구조를동정한다. 표준및표적아미노산서열간의 25% 의서열동일성은상동성모델링관행을시도하는데필요한최소값으로고려된다. 서열정렬은수동으로작제하고모델배위는프로그램 Jackal로생성시킨다 ( 문헌참조 : Petrey, D. et al. (2003) Proteins 53 (Suppl. 6): 430-435). 선택된항체의쥐및사람골격영역의 1차서열은상당한동일성을공유한다. 상이한잔기위치는쥐항체의관찰된결합효능을보유하기위해사람화된서열에서쥐잔기내포에대한후보이다. 사람과쥐서열간에상이한골격잔기의목록은수동으로작제한다. 표 10은당해연구에대해선택된골격서열을보여준다. 표 10 [0580] - 103 -
[0581] [0582] [0583] [0584] 주어진골격잔기가항체의결합성질에영향을줄가능성은 CDR 잔기로의이의접근성에의존한다. 따라서, 모델구조를사용하여, 쥐와사람서열간에상이한잔기는 CDR 내임의의원자로부터이들의거리에따라등급화된다. 임의의 CDR 원자의 4.5A 내에있는잔기가가장중요한것으로동정되고사람화된항체 ( 즉, 역돌연변이 ) 내쥐잔기의보유에대한후보물로추천된다. 특히, 작제된사람화된항체는올리고뉴클레오타이드를사용하여작제된다. 각각의가변영역 cdna에대한, 60 내지 80개뉴클레오타이드의 6개올리고뉴클레오타이드각각은각각의올리고뉴클레오타이드의 5' 및 / 또는 3' 말단에서 20개뉴클레오타이드까지서로중첩하도록디자인한다. 어닐링반응에서, 모든 6개올리고뉴클레오타이드를 dntp의존재하에조합하고, 비등시키고어닐링시킨다. DNA 폴리머라제 I, 대형 (Klenow) 단편 (New England Biolabs #M0210, Beverley, MA.) 을중첩올리고뉴클레오타이드간에대략 40bp의갭을채우도록첨가한다. 변형된 pbos 벡터에서다중클로닝부위에상보적인오버행서열을함유하는 2개의최외곽프라이머를사용하는 PCR을수행하여전체가변영역유전자를증폭시킨다 ( 문헌참조 : Mizushima, S. and Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 17). 각각의 cdna 어셈블리로부터유래된 PCR 생성물을아가로스겔상에서분리하고예측된가변영역 cdna 크기에상응하는밴드를절개하고정제한다. 가변중쇄영역을세균에서상동성재조합에의해 2개힌지-영역아미노산돌연변이를함유하는사람 IgG1 불변영역을암호화하는 cdna 단편상으로프레임내삽입한다. 이들돌연변이는 234번위치 (EU 넘버링 ) 에서류신의알라닌의대체및 235번위치에서류신의알라닌으로의대체이다 ( 문헌참조 : Lund et al. (1991) J. Immunol. 147:2657). 가변경쇄영역은상동성재조합에의해사람카파불변영역과함께프레임내삽입한다. 세균콜로니를분리하고플라스미드 DNA를추출한다. cdna 삽입물은이들의전체를서열분석한다. 각각의항체에상응하는올바른사람화된중쇄및경쇄를 COS 세포내로동시형질감염시켜일시적으로전장사람화된항-사람항체를제조한다. 재조합키메라항체를함유하는세포상등액은단백질 A 세파로스크로마토그래피로정제하고결합된항체를산완충액을첨가하여용출시킨다. 항체는중화시키고 PBS내로투과시킨다. 실시예 1.2.2.3: 사람화된항체의특성분석기능적활성을억제하는정제된사람화된항체의능력은예를들어, 실시예 1.1.2.A에기재된바와같은사이토킨생분석을사용하여측정한다. 재조합사람항원에대한사람화된항체의결합친화성은실시예 1.1.1.B에기재된바와같은표면플라스몬공명 (Biacore ) 측정을사용하여결정한다. 사람화된항체의생분석및친화성으로부터의 IC 50 값을등급화한다. 모하이브리도마 mab의활성을완전히유지하는사람화된 mab는향후전개를 위한후보물로서선택한다. 최상의 2 내지 3 개의가장선호되는사람화된 mab 는추가로특징분석한다. [0585] [0586] [0587] [0588] [0589] [0590] [0591] 실시예 1.2.2.3.A: 사람화된항체의약리역학적분석약리역학적연구는스프라그돌리랫트및시노몰구스몽키에서수행한다. 수컷및암컷랫트및시노몰구스몽키에게단일용량의 4mg/kg mab를정맥내또는피하투여하고샘플을항원포획 ELISA를사용하여분석하고약리역학적파라미터를비격막분석에의해측정한다. 간략하게, ELISA 플레이트를염소항-비오틴항체로피복시키고 (5 mg/ml, 4 C, 밤새 ), Superblock (Pierce) 으로차단시키고, 실온에서 2시간동안 10% Superblock TTBS에서 50ng/ml의비오티닐화된사람항원으로항온처리한다. 혈청샘플을연속으로희석하고 (TTBS중의 0.5% 혈청, 10% Superblock) 실온에서 30분동안플레이트상에서항온처리한다. 검출은 HRP-표지된염소항사람항체로수행하고농도는 4개파라미터로그피트를사용하여표준곡서의도움으로결정한다. 약리역학적계수에대한값은 WinNonlin 소프트웨어 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA) 를사용한비격막모델에의해결정한다. 양호한약리역학적프로필 (T1/2는 8 내지 13일또는그보다양호하고낮은제거및우수한생체이용률 50 내지 100%) 을갖는사람화된 mab를선별한다. 실시예 1.2.2.3.B: 사람화된모노클로날항체의물리화학적및시험관내안정성분석크기배제크로마토그래피항체는물을사용하여 2.5mg/ml로희석하고 20ml를 TSK 겔 G3000 SWXL 칼럼 (Tosoh Bioscience, cat# k5539-05k) 을사용하여시마즈 HPLC 시스템상에서분석한다. 샘플은 211mM 황산나트륨, 92 mm 인산나트륨, ph 7.0, 유속 0.3ml/ 분을사용하여칼럼으로부터용출시킨다. HPLC 시스템작동조건은다음과같다 : 이동상 : 211 mm Na 2 SO 4, 92 mm Na 2 HPO 4 *7H 2 O, ph 7.0 농도구배 : 등용매 - 104 -
[0592] [0593] [0594] [0595] [0596] [0597] 유속 : 0.3 ml/ 분검출파장 : 280 nm 자동샘플채취기냉각기온도 : 4 C 칼럼오븐온도 : 주위온도수행시간 : 50분표 11은상기프로토콜에의해측정되는바와같이 % 단량체 ( 예측된분자량을갖는비응집된단백질 ) 로서발현되는모항체및 DVD-Ig 작제물의순도데이터를포함한다. 표 11 [0598] [0599] [0600] [0601] [0602] [0603] DVD-Ig는 90% 초과의단량체를보여주는대부분의 DVD-Ig를갖는우수한 SEC 프로필을보여주었다. 이러한 DVD- Ig 프로필은모항체에대해관찰된것과유사하다. SDS-PAGE 항체는환원및비환원조건둘다에서나트륨도데실설페이트-폴리아크릴아미드겔전기영동 (SDS-PAGE) 에의해분석한다. Adalimumab lot AFP04C를대조군으로서사용한다. 환원조건을위해, 샘플은 1:1로 2X 트리스글라이신 SDS-PAGE 샘플완충액 (Invitrogen, cat# LC2676, lot# 1323208) 및 100 mm DTT와함께혼합하고, 30분동안 60 에서가열한다. 비환원조건을위해, 당해샘플은샘플완충액과 1:1로혼합하고 5분동안 100 에서가열한다. 환원된샘플 ( 레인당 10mg) 을 12% 프리캐스트트리스-글라이신겔 (Invitrogen, cat# EC6005box, lot# 6111021) 상에로딩하고, 비환원된샘플 ( 레인당 10 mg) 을 8%-16% 프리캐스트트리스-글라이신겔 (Invitrogen, cat# EC6045box, lot# 6111021) 상에로딩한다. SeeBlue Plus 2 (Invitrogen, cat#lc5925, lot# 1351542) 를분자량마커로서사용한다. 당해겔을 XCeIl SureLock 소형세포겔박스 (Invitrogen, cat# EIOOOl) 내에서전개하고단백질은먼저 75 전압을적용하여샘플을겔에첨가하고이어서선행염료가겔의바닥에도달할때까지 125의정전압을걸어분리한다. 사용되는전개완충액은 10 x 트리스글라이신 SDS 완충액 (ABC, MPS-79-080106) 으로부터제조된 1 x 트리스글라이신 SDS 완충액이다. 당해겔은콜로이드블루염색 (Invitrogen cat# 46-7015, 46-7016) 을사용하여밤새염색시키고배경이청명해질때까지 Milli-Q 물을탈염색시킨다. 염색된겔을이어서 Epson Expression 스캐너 (model 1680, S/N DASX003641) 를사용하여스캐닝한다. 침강속도분석항체는 3개의표준 2-섹터카본에폰센터피스의샘플챔버로로딩한다. 이들센터피스는 1.2cm 광학경로길이 - 105 -
를갖고사파이어윈도우로구성된다. PBS 는표준완충액으위해사용되고각각의챔버는 140 μl 를함유한다. 모든샘플은 Beckman ProteomeLab XL-I 분석초원심분리 (serial # PL106C01) 에서 4- 구멍 (AN-60Ti) 를사용하여 동시에조사한다. [0604] [0605] [0606] [0607] [0608] [0609] [0610] [0611] [0612] [0613] [0614] [0615] [0616] [0617] [0618] [0619] 수행조건은프로그램화되어있고원심분리조절은 ProteomeLab (v5.6) 를사용하여수행한다. 샘플및로터는분석전에 1시간동안열이균질해지도록한다 (20.0 ± 0.1 ). 적당한세포로딩의확인은 3000rpm에서수행하고단일스캔은각각의세포에대해기록한다. 침강속도조건은하기와같다 : 샘플세포용적 : 420 ml 표준셀용적 : 420 ml 온도 : 20 로터속도 : 35,000 rpm 시간 : 8:00 시간 UV 파장 : 280nm 방사상단계크기 : 0.003cm 데이터수집 : 시그날평균화없이단계마다원데이터포인트스캔총수 : 100 온전한항체의 LC-MS 분자량측정온전한항체의분자량은 LC-MS에의해분석한다. 각각의항체는물을사용하여대략 1mg/ml로희석시킨다. 단백질마이크로트랩 (Michrom Bioresources, Inc, cat# 004/25109/03) 을사용한 1100 HPLC (Agilent) 시스템을사용하여탈염시키고 5mg의샘플을 API Qstar 펄서 i 질량분광측정기 (Applied Biosystems) 에도입한다. 짧은농도구배를사용하여샘플을용출시킨다. 농도구배는분당 50ml의유속으로이동상 A(HPLC 물중의 0.08% FA, 0.02% TFA) 및이동상 B ( 아세토니트릴중의 0.08% FA 및 0.02% TFA) 를사용하여수행한다. 질량분광측정기는질량대전하비율이 2000 내지 3500인스캔범위로 4.5 k볼트분무전압으로수행한다. 항체경쇄및중쇄의 LC-MS 분자량측정항체경쇄 (LC), 중쇄 (HC) 및탈당화된 HC의분자량측정은 LC-MS에의해분석한다. 항체는물을사용하여 1 mg/ml로희석시키고샘플은 37 에서 30분동안 10mM DTT의최농농도로 LC 및 HC로감소시킨다. 항체탈당화시키기위해, 100 mg의항체를 37 에서총용적 100ml중에서밤새 2 ml의 PNGase F, 5 ml의 10% N-옥틸글루코사이드로항온처리한다. 탈글루코실화후샘플은 37 에서 30분동안 10mM DTT의최종농도로감소한다. C4 칼럼 (Vydac, cat# 214TP5115, S/N 060206537204069) 을갖는 Agilent 1100 HPLC 시스템을사용하여샘플 (5mg) 을탈염시키고 API Qstar 펄서 i 질량분광측정기 (Applied Biosystems) 에도입한다. 짧은농도구배를사용하여샘플을용출시킨다. 농도구배는분당 50ml의유속으로이동상 A(HPLC 물중의 0.08% FA, 0.02% TFA) 및이동상 B ( 아세토니트릴중의 0.08% FA 및 0.02% TFA) 를사용하여수행한다. 질량분광측정기는질량대전하비율이 800 내지 3500인스캔범위로 4.5 k볼트분무전압으로수행한다. 펩타이드맵핑항체를실온에서 15분동안 75mM의중탄산암모늄중의 6M 구아니딘하이드로클로라이드의농도로변성시킨다. 변성된샘플을 60분동안 37 에서 10mM DTT의최종농도로감소시킴에이어서 30분동안 37 에서암실에서 50mM 요오도아세트산 (IAA) 를사용하여알킬화시킨다. 알킬화후, 샘플을 4 에서 4리터의 10mM 중탄산암모늄에대해밤새투석시킨다. 투석된샘플을 10mM 중탄산암모늄, ph 7.8을사용하여 1mg/ml로희석시키고 100 mg의항체를 4시간동안 37 에서트립신 /Lys-C: 항체 1:20(w/w) 비율에서트립신 (Promega, cat# V5111) 또는 Lys-C (Roche, cat# 11 047 825 001) 로분해시킨다. 분해물을 1 ml의 1 N HCl로켄칭시킨다. 질량분광측정기검출을사용한펩타이드맵핑을위해 40ml의분해물을, Agilent 1100 HPLC 시스템을사용한 C18 칼럼상의역상고성능액체크로마토그래피 (RPHPLC) 에의해분리한다 (Vydac, cat# 218TP51, S/N NE 9606 10.3.5). 펩타이드분리는분당 50ml의유속으로이동상 A(HPLC 물중의 0.02% TFA, 0.08% FA) 및이동상 B ( 아세토니트릴중의 0.02% TFA 및 0.08% FA) 를사용하여수행한다. API QSTAR 펄서 i 질량분광측정기를 4.5k볼트분무전압및질량대하전비가 800 내지 2500인스캔범위에서양성모드로작동시킨다. - 106 -
[0620] [0621] [0622] [0623] [0624] [0625] [0626] 디설파이드결합맵핑항체를변성시키기위해, 100 ml의항체를 100mM의중탄산암모늄중의 300ml의 8M 구아니딘과혼합한다. ph가 7 내지 8이되도록조사하고샘플을 6M 구아니딘 HCl의최종농도에서실온에서 15분동안변성시킨다. 변성된샘플의일부 (100mL) 를 Milli-Q 물로 600ml로희석시켜최종구아니딘-HCl 농도가 1M이되게한다. 샘플 (220 mg) 을대략 16시간동안 37 에서 1:50 트립신또는 1:50 Lys-C: 항체 (w/w) 비율 (4.4mg 효소 : 220mg 샘플 ) 에서트립신 (Promega, cat # V5111, lot# 22265901) 또는 Lys-C (Roche, cat# 11047825001, lot# 12808000) 를사용하여분해시킨다. 추가 5mg의트립신또는 Lys-C를샘플에첨가하고 37 에서추가로 2시간동안분해가진행되도록한다. 분해는 1mg의 TFA를각각의샘플에첨가함에의해종료시킨다. 분해된샘플은 Agilent HPLC 시스템상에서 C18 칼럼을사용하는 RPHPLC(Vydac, cat# 218TP51 S/N NE020630-4-1A) 에의해분리한다. 당해분리는분당 50ml의유속으로이동상 A(HPLC 등급물중의 0.02% TFA, 0.08% FA) 및이동상 B ( 아세토니트릴중의 0.02% TFA 및 0.08% FA) 를사용하는펩타이드맵핑을위해사용되는동일한농도구배로수행한다. HPLC 작동조건은펩타이드맵핑을위해사용되는것들과동일하다. API QSTAR 펄서 i 질량분광측정기는 4.5k볼트분무전압및 800 내지 2500 질량대하전비율의스캔범위에서양성모드로작동시킨다. 디설파이드결합은페타이드의관찰된 MW와디설파이드결합에의해결합된트립신또는 Lys-C 펩타이드의예측된 MW를일치시켜할당한다. 유리된설프하이드릴측정항체에서유리된시스테인을정량하기위해사용되는방법은특징적인발색단생성물, 5-티오-(2-니트로벤조산 ) (TNB) 을유발하는설프하이드릴그룹 (SH) 과엘만시약, 5,5 -디티오-비스 (2-니트로벤조산) (DTNB) 의반응을기초로한다. 반응은하기의식에서설명된다 : DTNB + RSH RS-TNB + TNB- + H+ TNB-의흡광도는 Cary 50 분광측정기를사용하여 412nm에서측정한다. 흡광도곡선은유리된 SH 표준물로서 2 머캅토에탄올 (b-me) 의희석물을사용하여플롯팅하고단백질내유리된설프하이드릴그룹의농도는샘플의 412nm에서의흡광도로부터측정한다. b-me 표준스톡은 HPLC 등급의물로 14.2M b-me를최종농도 0.142mM로연속희석시켜제조한다. 이어서각각의농도에대해 3회표준물을제조한다. 항체는아미콘울트라 10,000 MWCO 원심분리여과기 (Millipore, cat# UFC801096, lot# L3KN5251 ) 를사용하여 10mg/ml로농축시키고완충액을아달리무마브용제제완충액 (5.57 mm 1염기성인산나트륨, 8.69 mm 2염기성인산나트륨, 106.69 mm NaCl, 1.07 mm 나트륨시트레이트, 6.45 mm 시트르산, 66.68 mm 만니톨, ph 5.2, 0.1% (w/v) Tween) 으로대체시킨다. 당해샘플을 20분동안실온에서진탕기상에서혼합한다. 이어서 180 ml의 100 mm Tris 완충액, ph 8.1을각각의샘플및표준물에첨가하고이어서 10mM 인산완충액 (ph 8.1) 중의 2mM DTNB의 300ml를첨가한다. 완전히혼합한후, 샘플및표준물을 Cary 50 분광측정기상의 412nm에서의흡광도에대해측정한다. 표준곡선은 b-me 표준물의유리된 SH의양및 OD 412 을플롯팅함에 의해수득한다. 샘플의유리된 SH 함량은블랭크공제후당해곡선을기준으로계산한다. [0627] [0628] [0629] [0630] [0631] [0632] 약양이온교환크로마토그래피항체는 10 mm 인산나트륨, ph 6.0을사용하여 0.1mg/ml로희석시킨다. 하전이종성은 WCX-10 ProPac 분석칼럼 (Dionex, cat# 054993, S/N 02722) 을갖는시마쯔 HPLC 시스템을사용하여분석한다. 당해샘플은 80% 이동상 A(10mM 인산나트륨, ph 6.0) 및 20% 이동상 B(10mM 인산나트륨, 500mM NaCl, ph 6.0) 중에서칼럼상으로로딩하고분당 1.0ml의유속으로용출시킨다. 올리고사카라이드프로파일링항체의 PNGase F 처리후방출된올리고사카라이드는 2-아미노벤즈아미드 (2-AB) 표지화시약을사용하여유도체화한다. 형광표지된올리고사카라이드를정상의고성능액체크로마토그래피 (NPHPLC) 로분리하고사이한형태의올리고사카라이드를공지된표준물과의체류시간비교를기초로특징분석한다. 항체를먼저 PNGaseF로분해시켜중쇄의 Fc 부분으로부터 N-연결된올리고사카라이드를절단한다. 당해항체 (200 mg) 를 2 ml의 PNGase F 및 3 ml의 10% N-옥틸글루코시드와함께 500mL의에펜도르프튜브에첨가한다. 인산완충식염수를첨가하여최종용적이 60ml이되게한다. 당해샘플을 700RPM으로설정된에펜도르프열혼합기중에서 37 에서밤새항온처리한다. 아달리무마브로트 AFP04C는또한대조군으로서 PNGase F로분해시킨다. PNGase F 처리후, 샘플은 750RPM으로설정된에펜도르프열혼합기에서 5분동안 95 에서항온처리하고단백질 - 107 -
을침출시킴에이어서샘플을 2 분동안 10,000 RPM 에서에펜도르프원심분리기에놓고침전된단백질을침강시킨 다. 올리고사카라이드를함유하는상등액을 500ml 에펜도르프튜브로옮기고 65 에서스피드 - 백에서건조시킨 다. [0633] [0634] [0635] [0636] [0637] [0638] [0639] [0640] [0641] 올리고사카라이드를제조원 (Prozyme (cat# GKK-404, lot# 132026)) 으로부터구입한 2AB 표지화키트를사용하여 2AB로표지시킨다. 표지시약은제조업자의지침에따라제조한다. 아세트산 (150 ml, 키트로제공됨 ) 을 DMSO 바이엘 ( 키트로제공됨 ) 에첨가하고용액을피펫팅으로수회상승하강시켜혼합한다. 아세트산 /DMSO 혼합물 (100 ml) 을사용직전에 2-AB 염료바이알에옮기고염료가완전히용해될때까지혼합한다. 이어서염료용액을환원제의바이알 ( 키트로제공됨 ) 에첨가하고잘혼합한다 ( 표지화시약 ). 표지화시약 (5 ml) 을각각의건조된올리고사카라이드샘플바이알에첨가하고완전히혼합한다. 당해반응바이알을반응 2시간동안 65 에서및 700 내지 800 RPM으로설정된에펜도르프열혼합기에놓는다. 표지화반응후, 과량의형광염료를제조원 (Prozyme (cat# GKI -4726)) 으로부터글리코클린에스카트릿지를사용하여제거한다. 샘플을첨가하기전에, 카트릿지를 1 m의밀리-q 물로세척하고이어서 1ml의 30% 아세트산용액으로 5회세척한다. 샘플첨가하기직전에, 1 ml의아세토니트릴 (Burdick and Jackson, cat# AHO15-4) 을카트릿지에첨가한다. 모든아세토니트릴이카트릿지를통과한후, 샘플을새로이세척된디스크의중앙에점적하고 10분동안디스크상으로흡수되도록한다. 디스크를 1ml의아세토니트릴로세척함에이어서 96% 아세토니트릴 1ml로 5회세척한다. 카트릿지를 1.5mL 에펜도르프튜브상에놓고 2-AB 표지된올리고사카라이드를밀리 Q 물로 3회세척 ( 각세척당 400ml) 으로용출시킨다. 올리고사카라이드를시마즈 (Shimadzu) HPLC 시스템에연결된 Glycosep N HPLC (cat# GKI-4728) 칼럼을사용하여분리한다. 시마즈 HPLC 시스템은시스템조절자, 탈기장치, 이원펌프, 샘플냉각기가있는자동샘플채취기및형광검출기로이루어진다. 승온에서의안정성항체완충액은 Amicon 초원심분리여과기를사용하는 5.57 mm 1염기성인산나트륨, 8.69 mm 2염기성인산나트륨, 106.69 mm NaCl, 1.07 mm 나트륨시트레이트, 6.45 mm 시트르산, 66.68 mm 만니톨, 0.1% (w/v) Tween, ph 5.2; 또는 10 mm 히스티딘, 10 mm 메티오닌, 4% 만니톨, ph 5.9이다. 항체의최종농도는적당한완충액으로 2 mg/ml로조정한다. 항체용액은이어서여과멸균하고 0.25 ml의적정액을멸균조건하에제조한다. 적정액을 1, 2 또는 3주동안 -80, 5, 25, 또는 40 에서방치한다. 항온처리기간말기에, 샘플은크기배제크로마토그래피및 SDS-PAGE로분석한다. 안정성샘플은환원및비환원조건하에 SDS-PAGE로분석한다. 사용되는과정은본원에기재된바와동일하다. 당해겔은콜로이드성블루염색 (Invitrogen cat# 46-7015, 46-7016) 으로염색시키고배경이청명해질때까지 Milli-Q 물로탈염색시킨다. 염색된겔을이어서 Epson Expression 스캐너 (model 1680, S/N DASX003641) 를사용하여스캔한다. 보다높은민감성을수득하기위해, 동일한겔을실버염색키트 (Owl Scientific) 를사용하여염색하고제조업자에의해추천된과정을사용한다. 실시예 1.2.2.3.C: 사람화된모노클로날항체그자체또는화학치료요법과조합된사람암종이종이식체의성장에대한효능사람암세포는조직배양플라스크에서시험관내에서 99% 생존성, 85% 컨플루언스때까지성장시킨다. 19 내지 25g의 SCID 암컷또는수컷마우스의귀에태그하고면도시킨다. 이어서 0일째에마우스의오른쪽옆구리에 0.2ml의 2 x 10 6 사람종양세포 (1:1 마트리겔 ) 을피하접종하였다. 비히클 (PBS), 사람화된항체및 / 또는화학 치료제의투여 (IP, Q3D/ 주 ) 는마우스를평균종양용적이대략 150 내지 200 mm 3 인마우스의별도의케이지에크기별로일치시킨후개시하였다. 접종후대략 10일째에개시하여 1주일에 2회한쌍의캘리퍼로측정하고종양용적은수학식 V = L x W 2 /2 (V: 용적, mm 3 ; L: 길이, mm; W: 너비, mm) 에따라계산하였다. 종양용적의감소는비히클또는이소타입대조군 mab만을투여받은동물에서의종양과비교하여 mab 단독또는화학치료요법과조합된 mab로처리된동물에서나타난다. [0642] [0643] 실시예 1.2.2.3.D: FACS 기본재지시된세포독성 (rctl) 분석 사람 CD3+ T 세포는음성선별집적칼럼 (R&D Systems, Minneapolis, MN; Cat.#HTCC-525) 에의해이전에동결 - 108 -
된분리된말초혈액단핵세포 (PBMC) 로부터분리하였다. T 세포는 D-PBS (Invitrogen, Carlsbad, CA) 중의 lo μg/ml 항-CD3 (OKT-3, ebioscience, Inc., San Diego, CA) 및 2μg/mL 항-CD28 (CD28.2, ebioscience, Inc., San Diego, CA) 로피복된플라스크 (vent cap, Corning, Acton, MA) 에서 4일동안자극시키고 L-글루타민, 55mM β-me, Pen/Strep, 10% FBS를갖는완전 RPMI 1640 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 중의 30U/mL IL-2 (Roch e) 에서배양하였다. T 세포는이어서분석에사용하기전에 30U/mL IL-2에서밤새방치시킨다. DoHH2 또는 Raji 표적세포는제조업자의지침에따라 PKH26 (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) 로표지시킨다. L-글루타민및 10% FBS(Hy clone, Logan, UT) 를함유하는 RPMI 1640 배지 ( 페놀부재, Invitrogen, Carlsbad, CA) 를 rctl 분석전반에걸쳐사용하였다 ( 문헌참조 : See Dreier et al. (2002) Int J Cancer 100:690). [0644] [0645] [0646] [0647] [0648] 이펙터 T 세포 (E) 및표적 (T) 은각각 96웰플레이트 (Costar #3799, Acton, MA) 에서웰당 10 5 및 10 4 의최종세포농도로플레이팅하여 E:T비가 10:1이되도록한다. DVD-Ig 분자를희석하여농도의존적적정곡선을수득한다. 밤새항온처리후세포를펠렛화하고 D-PBS중의 0.1% BSA(Invitrogen, Carlsbad,CA), 0.1% 아지드화나트륨및 0.5μg/mL 프로피듐요오다이드 (BD) 를함유하는 FACS 완충액중에재현탁시키기전에 D-PBS로 1회세척하였다. FACS 데이터를 FACS Canto II 기계 (Becton Dickinson, San Jose, CA) 상에서수집하고 Flowjo (Treestar) 에서분석하였다. % 총표적 ( 대조군, 무처리 ) 으로나눈 DVD-Ig 처리된샘플내 % 생존표적을계산하여 % 특이적용해를측정한다. IC50은 Prism (Graphpad) 에서계산하였다. 실시예 1.4: DVD-Ig의생성 2개의항원에결합할수있는 DVD-Ig 분자는 2개의모모노클로날항체, 즉, 본원에기재된바와같이선별된사람항원 A에대한항체및사람항원 B에대한다른항체를사용하여작제한다. 실시예 1.4.1: 2개의링커길이를갖는 DVD-Ig의생성 234번, 및 235번에서돌연변이를갖는 1μl의 Fc를포함하는불변영역은 ADCC/CDC 이펙터기능을제거하기위해사용한다. 4개의상이한항-A/B DVD-Ig 작제물을생성한다 : 2개는짧은링커를갖고 2개는긴링커를갖고, 각각은 2개의상이한도메인배향 : V A -V B -C 및 V B -V A -C으로있다 ( 표 12 참조 ). 사람 Cl/Ck 또는 CHl 도메인의 N-말 단서열유래의링커서열은다음과같다 : [0649] [0650] [0651] [0652] [0653] [0654] [0655] [0656] [0657] [0658] DVDAB 작제물에대해 : 경쇄 ( 항-A가 λ를갖는경우 ): 짧은링커 : QPKAAP ( 서열번호 15); 긴링커 : QPKAAPSVTLFPP ( 서열번호 16) 경쇄 ( 항-A가 κ를갖는경우 ): 짧은링커 : TVAAP ( 서열번호 13); 긴링커 : TVAAPSVFIFPP ( 서열번호 14) 중쇄 (γ1): 짧은링커 : ASTKGP ( 서열번호 21); 긴링커 : ASTKGPSVFPLAP ( 서열번호 22) DVDBA 작제물에대해 : 경쇄 ( 항-B가 λ를갖는경우 ): 짧은링커 : QPKAAP ( 서열번호 15); 긴링커 :QPKAAPSVTLFPP ( 서열번호 16) 경쇄 ( 항-B가 k를갖는경우 ): 짧은링커 : TVAAP ( 서열번호 13); 긴링커 : TVAAPSVFIFPP ( 서열번호 14) 중쇄 (γl): 짧은링커 : ASTKGP ( 서열번호 21); 긴링커 : ASTKGPSVFPLAP ( 서열번호 22) 중쇄및경쇄작제물은 pbos 발현벡터에서브클로닝하고 COS 세포에서발현시킴에이어서단백질 A 크로마토그래피로정제한다. 정제된물질은 SDS-PAGE 및 SEC 분석에적용한다. 표 12는각각항-A/B DVD-Ig 단백질을발현하기위해사용되는중쇄및경쇄를기재한다. - 109 -
표 12 [0659] [0660] [0661] [0662] [0663] [0664] [0665] [0666] [0667] [0668] 실시예 1.4.2: DVDABSL 및 DVDABLL에대한 DNA 작제물의분자클로닝중쇄작제물 DVDABHC-LL 및 DVDABHC-SL를제조하기위해, A 항체의 VH 도메인을특이적프라이머 (3 ' 프라이머는각각 SL/LL 작제물에대해짧은 / 긴링커서열을포함한다 ) 를사용하여 PCR 증폭시키고 ; B 항체의 VH 도메인은특이적프라이머 (5' 프라이머는각각 SL/LL 작제물에대해짧고 / 긴서열을포함한다 ) 를사용하여증폭시킨다. PCR 반응둘다는표준 PCR 기술및과정에따라수행한다. 2개의 PCR 생성물은겔정제하고후속중첩 PCR 반응에대해중첩주형으로서함께사용한다. 중첩 PCR 생성물은표준상동성재조합방법을사용함에의해 Srf I 및 Sal I 이중분해된 pbos-hcγl,z 비-a 포유동물발현벡터 (Abbott) 에서브클로닝한다. 경쇄작제물 DVDABLC-LL 및 DVDABLC-SL를제조하기위해, A 항체의 VL 도메인을특이적프라이머 (3 ' 프라이머는각각 SL/LL 작제물에대해짧은 / 긴링커서열을포함한다 ) 를사용하여 PCR 증폭시키고 ; B 항체의 VL 도메인은특이적프라이머 (5' 프라이머는각각 SL/LL 작제물에대해짧고 / 긴서열을포함한다 ) 를사용하여증폭시킨다. PCR 반응둘다는표준 PCR 기술및과정에따라수행한다. 2개의 PCR 생성물은겔정제하고표준 PCR 조건하에서후속중첩 PCR 반응에대해중첩주형으로서함께사용한다. 중첩 PCR 생성물은표준상동성재조합방법을사용함에의해 Srf I 및 Sal I 이중분해된 pbos-hck 포유동물발현벡터 (Abbott) 에서브클로닝한다. 유사한방법을사용하여하기에기재된바와같은 DVDBASL 및 DVDBALL을제조한다 : 실시예 1.4.3: DVDBASL 및 DVDBALL에대한 DNA 작제물의분자클로닝중쇄작제물 DVDBAHC-LL 및 DVDBAHC-SL를제조하기위해, B 항체의 VH 도메인을특이적프라이머 (3 ' 프라이머는각각 SL/LL 작제물에대해짧은 / 긴링커서열을포함한다 ) 를사용하여 PCR 증폭시키고 ; A 항체의 VH 도메인은특이적프라이머 (5' 프라이머는각각 SL/LL 작제물에대해짧고 / 긴서열을포함한다 ) 를사용하여증폭시킨다. PCR 반응둘다는표준 PCR 기술및과정에따라수행한다. 2개의 PCR 생성물은겔정제하고표준 PCR 조건을사용하여후속중첩 PCR 반응에대해중첩주형으로서함께사용한다. 중첩 PCR 생성물은표준상동성재조합방법을사용함에의해 Srf I 및 Sal I 이중분해된 pbos-hcγl,z 비-a 포유동물발현벡터 (Abbott) 에서브클로닝한다. 경쇄작제물 DVDBALC-LL 및 DVDBALC-SL를제조하기위해, B 항체의 VL 도메인을특이적프라이머 (3 ' 프라이머는각각 SL/LL 작제물에대해짧은 / 긴링커서열을포함한다 ) 를사용하여 PCR 증폭시키고 ; A 항체의 VL 도메인은특이적프라이머 (5' 프라이머는각각 SL/LL 작제물에대해짧고 / 긴서열을포함한다 ) 를사용하여증폭시킨다. PCR 반응둘다는표준 PCR 기술및과정에따라수행한다. 2개의 PCR 생성물은겔정제하고표준 PCR 조건을사용하여후속중첩 PCR 반응에대해중첩주형으로서함께사용한다. 중첩 PCR 생성물은표준상동성재조합방법을사용함에의해 Srf I 및 Sal I 이중분해된 pbos-hck 포유동물발현벡터 (Abbott) 에서브클로닝한다. 실시예 1.4.4: 추가 DVD-Ig의작제및발현실시예 1.4.4.1: DVD-Ig 벡터작제물의제조 DVD-Ig로의혼입을위한, 특이적항원또는이의에피토프를인지하는특이적항체에대한모항체아미노산서열은상기된바와같이하이브리도마를제조함에의해수득될수있거나공지된항체단백질또는핵산을서열 - 110 -
분석함에의해수득될수있다. 추가로공지된서열은문헌으로부터수득될수있다. 당해서열은세포에서의 발현을위해표준 DNA 합성또는증폭기술을사용하여핵산을합성하고목적하는항체단편을발현벡터로어 셈블리하기위해사용될수있다. [0669] [0670] [0671] 예를들어, 핵산코돈은아미노산서열로부터측정하고올리고뉴클레오타이드 DNA는제조원 (Blue Heron Biotechnology, Inc. (www.blueheronbio. com) Bothell, WA USA) 에의해합성하였다. 올리고뉴클레오타이드는플라스미드벡터에클로닝되고서열입증된 300 내지 2,000 염기쌍이본쇄 DNA 단편으로어셈블리하였다. 클로닝된단편은효소과정을사용하여어셈블리하여완전한유전자를수득하고발현벡터에서브클로닝한다 ( 문헌참조 : 7,306,914; 7,297,541 ; 7,279,159; 7,150,969; 20080115243; 20080102475; 20080081379; 20080075690; 20080063780; 20080050506; 20080038777; 20080022422; 20070289033; 20070287170; 20070254338; 20070243194; 20070225227; 20070207171; 20070150976; 20070135620; 20070128190; 20070104722; 20070092484; 20070037196; 20070028321; 20060172404; 20060162026; 20060153791; 20030215458; 20030157643). phybe 벡터그룹 (US 특허원제61/021,282호 ) 은모항체및 DVD-Ig 클로닝을위해사용하였다. pjp183로부터유래된 V1; phybe-hcgl,z,non-a V2는야생형불변영역을갖는항체및 DVD 중쇄의클로닝을위해사용하였다. pjp191로부터유래된 V2; phybe-hck V2는카파불변영역을갖는항체및 DVD 경쇄의클로닝을위해사용하였다. pjp192로부터유래된 V3; phybe-hcl V2는람다불변영역을갖는항체및 DVD 경쇄의클로닝을위해사용하였다. 람다시그날펩타이드및카파불변영역으로구성된 V4는람다-카파하이브리드 V 도메인을갖는 DVD 경쇄클로닝을위해사용하였다. 카파시그날펩타이드및람다불변영역으로구성된 V5는카파-람다하이브리드 V 도메인을갖는 DVD 경쇄의클로닝을위해사용하였다. pjp183로부터유래된 V7; phybehcgl,z,non-a V2는 (234, 235 AA) 돌연변이불변영역을갖는항체및 DVD 중쇄의클로닝을위해사용하였다. 표 13에따라, 다수의벡터는모항체및 DVD-Ig VH 및 VL 쇄의클로닝에사용하였다. 표 13 [0672] [0673] 실시예 1.4.4.2: 293 세포에서형질감염및발현 - 111 -
[0674] [0675] DVD-Ig 단백질의제조를위해 DVD-Ig 벡터작제물을 293 세포로형질감염시킨다. 사용된 293 일시적형질감염절차는문헌 [ 참조 : Durocher et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30(2): E9 및 Pham et al. (2005) Biotech. Bioengineering 90(3):332-44] 에의해공개된방법의변형이다. 형질감염에사용된시약은하기를포함한다 : ㆍ 130rpm, 37 및 5% CO 2 로설정된습윤항온처리기내의 1회용 Erlenmeyer 플라스크에서배양된 HEK 293-6E 세포 (EBNA1 을안정하게발현하는사람배아신장세포주 ; National Research Council Canada 로부터수득 ). [0676] [0677] [0678] [0679] [0680] [0681] ㆍ배양배지 : FreeStyle 293 발현배지 (Invitrogen 12338-018) + 25μg /ml Geneticin(G418)(Invitrogen 10131-027) 및 0.1% Pluronic F-68(Invitrogen 24040-032). ㆍ형질감염배지 : FreeStyle 293 발현배지 + 10mM HEPES(Invitrogen 15630-080). ㆍ폴리에틸렌이민 (PEI) 스톡 : 1mg/mL 멸균스톡용액, ph 7.0, 직선상 25kDa PEI(Polysciences) 을이용하여제조되고, -15 미만에서저장됨. ㆍ트립톤공급배지 : FreeStyle 293 발현배지중의 5% w/v 멸균스톡의트립톤 N1(Organotechnie, 19554). 형질감염을위한세포제조 : 형질감염의약 2 내지 4시간전에 HEK 293-6E 세포를원심분리에의해수거하고, ml 당약 1,000,000개의생세포의세포농도로배양배지에현탁시킨다. 각각의형질감염에대해, 40mL의세포현탁액을일회용 250-mL Erlenmeyer 플라스크로이동시키고, 2 내지 4시간동안항온처리한다. 형질감염 : 형질감염배지및 PEI 스톡을실온 (RT) 으로예열한다. 각각의형질감염에대해 25μg의플라스미드 DNA 및 50μg의폴리에틸렌이민 (PEI) 을 5mL의형질감염배지와합하고, RT에서 15 내지 20분동안항온처리하여 DNA:PEI 복합체를형성한다. BR3-Ig 형질감염에대해서, 25μg의 BR3-Ig 플라스미드를아용하여형질감염마다사용한다. 각각의 5-mL의 DNA:PEI 복합체혼합물을미리제조된 40-mL의배양액에첨가하고, 130rpm, 37 및 5% CO 2 로설정된습윤항온처리기에다시넣는다. 20 내지 28시간후, 트립톤공급배지 5mL를각각의형질감 염에첨가하고, 배양을 6 일동안지속한다. [0682] 표 14 는 293 세포에서리터당밀리그램으로서나타낸모항체또는 DVD-Ig 작제물의수율을포함한다. 표 14 [0683] - 112 -
[0684] [0685] [0686] [0687] [0688] [0689] 모든 DVD는 293 세포에서잘발현하였다. DVD는단백질 A 칼럼에대해용이하게정제될수있다. 대부분의경우, >5 mg/l 정제된 DVD-Ig는 293 세포의상등액으로부터용이하게수득될수있다. 실시예 1.4.5: A/B DVD-Ig의특성분석및선두선별항-A/B DVD-Ig의결합친화성은단백질 A 및단백질 B 둘다에대해분석한다. DVD-Ig의 4가성질은바이어코어상의다중결합연구에의해조사한다. 한편, 단백질 A 및단백질 B에대한 DVD-Ig의중화성효능은각각본원에기재된바와같이생분석에의해평가한다. 본래의모 mab의친화성및효능을최상으로보유하는 DVD-Ig 분자는각각 mab에대해본원에기재된바와같이면밀한물리화학적및생분석적 ( 랫트 PK) 특성분석을위해선별한다. 일련의분석을기초로, 최종선두 DVD-Ig는 CHO 안정한세포주개발단계로진행시키고 CHO-유래물질은시노몰구스원숭이및및예비제형활성에서안정성, 약리역학적및효능연구에사용한다. 실시예 2: 이원가변도메인면역글로불린 (DVD-Ig) 의생성및특징분석공지된아미노산서열을갖는모항체를사용하는이원가변도메인면역글로불린 (DVD-Ig) 은 DVD-Ig 가변중쇄및 DVD-Ig 가변경쇄서열을암호화하는폴리뉴클레오타이드단편을합성하고당해단편을실시예 1.4.4.1에따라 phybc-d2 벡터로클로닝하여제조하였다. DVD-Ig 작제물을실시예 1.4.4.2에기재된바와같이클로닝시키고 293 세포에서발현시켰다. DVD-Ig 단백질은표준방법에따라정제하였다. 기능적특성분석은지적된바와같이실시예 1.1.1 및 1.1.2에기재된방법에따라측정하였다. 본발명의 DVD-Ig에대한 DVD-Ig VH 및 VL 쇄는하기에제공된다. 실시예 2.1: 긴링커-짧은링커를이용한 NGF( 서열번호 1) 및 IL-6R DVD-Ig의생성 표 15 [0690] [0691] 실시예 2.2: 짧은링커 - 짧은링커를이용한 NGF( 서열번호 2) 및 PGE2 DVD-Ig 의생성 - 113 -
표 16 [0692] [0693] 실시예 2.3: 긴링커 - 긴링커를이용한 NGF( 서열번호 2) 및 PGE2 DVD-Ig 의생성 표 17 [0694] [0695] 실시예 2.4: 긴링커 - 짧은링커를이용한 NGF( 서열번호 2) 및 PGE2 DVD-Ig 의생성 - 114 -
표 18 [0696] [0697] 실시예 2.5: 짧은링커 - 긴링커를이용한 NGF( 서열번호 2) 및 PGE2 DVD-Ig 의생성 표 19 [0698] [0699] 실시예 2.6: 짧은링커 - 짧은링커를이용한 NGF( 서열번호 2) 및 TNF DVD-Ig 의생성 - 115 -
표 20 [0700] [0701] 실시예 2.7: 긴링커 - 긴링커를이용한 NGF( 서열번호 2) 및 TNF DVD-Ig 의생성 표 21 [0702] [0703] 실시예 2.8: 긴링커 - 짧은링커를이용한 NGF( 서열번호 2) 및 TNF DVD-Ig 의생성 - 116 -
표 22 [0704] [0705] 실시예 2.9: 짧은링커 - 긴링커를이용한 NGF( 서열번호 2) 및 TNF DVD-Ig 의생성 표 23 [0706] [0707] 실시예 2.10: 짧은링커 - 짧은링커를이용한 NGF( 서열번호 2) 및 IL-1 베타 DVD-Ig 의생성 - 117 -
표 24 [0708] [0709] 실시예 2.11: 긴링커 - 긴링커를이용한 NGF( 서열번호 2) 및 IL-1 베타 DVD-Ig 의생성 표 25 [0710] [0711] 실시예 2.12: 긴링커 - 짧은링커를이용한 NGF( 서열번호 2) 및 IL-1 베타 DVD-Ig 의생성 - 118 -
표 26 [0712] [0713] 실시예 2.13: 짧은링커 - 긴링커를이용한 NGF( 서열번호 2) 및 IL-1 베타 DVD-Ig 의생성 표 27 [0714] [0715] 실시예 2.14: 짧은링커 - 긴링커를이용한 NGF( 서열번호 2) 및 IL-6R DVD-Ig 의생성 - 119 -
표 28 [0716] [0717] 실시예 2.15: 모항체및 DVD-Ig 서열을클로닝하는데사용된클로닝벡터서열 - 120 -
표 29 [0718] - 121 -
[0719] - 122 -
[0720] - 123 -
[0721] - 124 -
[0722] - 125 -
[0723] - 126 -
[0724] - 127 -
[0725] - 128 -
[0726] - 129 -
[0727] - 130 -
[0728] - 131 -
[0729] - 132 -
[0730] [0731] 본발명은분자생물학및약물전달분야에서널리공지된전반적인기술에대한참조문헌을인용한다. 이들기 술은하기의공개문헌에기재된기술을포함하지만이에제한되지않는다 : - 133 -