대한수혈학회지 : 제 21 권제 3 호, 2010 골수처리키트내잔존하는골수세포로부터중간엽줄기세포의분리 김신영 1 ㆍ허준석 2 ㆍ김한수 1,2 ㆍ김현옥 1,2 = Abstract = 연세대학교의과대학진단검사의학교실 1, 세포치료센터 2 Isolation of Mesenchymal Stem Cells from the Mononuclear Cells Remaining in the Bone Marrow Processing Kit Sinyoung Kim 1, June Seok Heo 2, Han-Soo Kim 1,2, Hyun Ok Kim 1,2 Department of Laboratory Medicine 1, Yonsei Cell Therapy Center 2, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea Background: Mesenchymal stem cells (MSCs) that are capable of extensive self renewal and differentiation have attracted great attention as a promising tool for regenerative medicine and tissue engineering. Although MSCs can be isolated from various tissues, bone marrow currently represents one of the most reliable sources for providing a sufficient yield of cells in a good quality. Herein, used bone marrow processing kits were evaluated as a valuable source of MSCs. Methods: Bone marrow mononuclear cells (MNCs) were recovered from used bone marrow processing kits after routine bone marrow processing by using the COBE 2991 Cell Processor (CaridianBCT Inc.). The MSCs were isolated from the recovered MNCs using a standard plastic adherence method. Immunophenotyping and differentiation assays were performed to clarify the characteristics of the isolated MSCs. Results: An average of 1 10 8 bone marrow MNCs was collected, and the MSCs were successfully isolated from the recovered bone marrow MNCs in all case. The isolated MSCs were positive for essential MSC surface molecules (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105) and they were negative for most hematopoietic and endothelial cell markers (CD34, CD45, CD31, CD14). The isolated MSCs were capable of differentiation along the osteogenic, adipogenic and chondrogenic pathways. Conclusion: MSCs isolated from used bone marrow processing kits are an alternative and ethical source of bone marrow derived MSCs, and they can be used for research purposes. (Korean J Blood Transfus 2010; 21:280-8) Key words: Mesenchymal stem cell, Mononuclear cell, Bone marrow processing kit 접수일 :2010년 11월 18일, 수정일 :2010년 12월 10일, 승인일 :2010년 12월 12일책임저자 : 김현옥 120-752 서울시서대문구성산로 250 연세대학교의과대학진단검사의학교실 TEL: 02) 2228-2444, FAX: 02) 364-1583, E-mail: hyunok1019@yuhs.ac 본연구는 2009년대한수혈학회 CaridianBCT 연구상의지원으로이루어졌음. - 280 -
Isolation of MSCs in the Bone Marrow Processing Kit 서론 대상및방법 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell) 는지난 20여년간재생의학, 조직공학및유전자치료의매력적인연구소재로주목을받으며많은연구가진행되고있다. 이는중간엽줄기세포가지속적인자기재생산 (self renewal) 능력과함께지방세포 (adipocyte), 연골세포 (chondrocyte) 및골세포 (osteocyte) 의중배엽세포로분화할수있으며, 이외에심근세포 (cardiomyocyte) 및근세포 (myocyte), 더나아가비중배엽세포인신경세포 (neuron) 까지분화할수있는유연성 (plasticity) 을가지고있기때문이다. 1-4) 중간엽줄기세포는골수, 2,5) 제대혈, 6) 지방조직, 7) 태반, 8) 양수 9) 등의많은조직에서분리할수있다. 특히중간엽줄기세포를골수로부터분리할경우에는다른조직에비해일정수준이상의질을가진충분한양의중간엽줄기세포를회수할수있다. 10) 하지만, 골수를채취하기위해서는침습적인시술이필요하며, 골수유래중간엽줄기세포가생체외에서빠르게증식하지만 5회이상계대배양하는경우그증식속도와분화능을빠르게상실한다. 특히골수기증자의나이가증가할수록골수유래중간엽줄기세포의증식속도와분화능은감소하는특징을가지고있다. 11) 이에중간엽줄기세포를이용한지속적인연구를위해서는초기에분리한중간엽줄기세포를지속적으로공급받을수있는것이연구에서가장이상적인조건이다. 하지만건강한기증자로부터단순히연구목적으로골수를확보하기는현실적으로매우어렵다. 본연구에서는폐기되는골수처리키트내에남아있는골수세포로부터중간엽줄기세포를분리및배양하고자하였다. 1. 세포분리및배양세브란스병원에서 4명의건강한골수공여자로부터무균적으로채집된골수를 COBE 2991 Cell Processor (CaridianBCT Inc., Lakewood, CO, USA) 를이용하여다음과같이적혈구와혈장의분리제거를시행하였다. 채집된골수백을매달고중력을이용하여골수를장비에장착된골수처리키트에채운후 3,000 rpm에서 8분간원심분리하였다. 원심분리속도를동일하게유지하면서백혈구연층을육안으로확인하여혈장층을먼저분리하여제거한후 super out 속도를조절하면서백혈구연층을별도의백에분리한다. 채집된골수의양에따라서위의과정을반복하며최종적으로생리식염수를이용하여골수백에남아있는골수의성분분리를완료하였다. 최종분리산물인골수농축액은환자에게이식하고, 골수처리키트에남아있는골수세포를채집 2시간내에회수하였다. 본연구에대하여기관임상연구심의위원회의승인 ( 세브란스병원임상연구심의위원회, #4-2008- 0643) 을받았으며, 골수기증전에모든골수공여자로부터폐기되는골수처리키트내의골수세포를연구용으로사용할것에대한서면동의서를받았다. 회수된골수는 Ficoll-Hypaque ( 비중 1.077, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 을이용하여백혈구연층을분리하고 phosphate buffered saline (PBS) 으로두번세척후 1 10 7 cells/dish의농도로 100 mm culture dish (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 에서배양하였다. 배양액은 DMEM-LG (GibcoBRL, Grand Island, NY, USA) 및 10% fetal bovine serum (FBS; PAA laboratories, Ontario, Canada) 을사용하였다. 배양시작 24시간후비부 - 281 -
대한수혈학회지 : 제 21 권제 3 호 착세포들로인한중간엽줄기세포의부착및증식이감소되는것을막기위하여비부착세포를흡입하여제거하였다. 12) 배지는 1주에두번씩교환하였으며, 부착세포의세포충실도가 70 80% 가되는경우 0.05% Trypsin/EDTA (Gibco) 를사용하여회수하여계대배양하거나액체질소에냉동보관하였다. 2. 유세포분석 분리및배양한중간엽줄기세포의성상을파악하기위해 2세대계대배양한후유세포분석기 (Cytomics FC500; Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) 를사용하여다음과같은방법에의하여분석하였다. 배양한중간엽줄기세포의배양액을제거하고, PBS로세척하고 0.05% Trypsin/EDTA로분리한후 2,000 rpm에서 5분간원심분리하고 0.2% bovine serum albumin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 이첨가된 PBS로세척하고각각의단클론항체를반응시킨후분석하였다. 사용된단클론항체는 CD14, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106 (all from Beckman Coulter) 이었다. 반응후분석은 WinMDI (Scripps Institute, La Jolla, CA, USA) 와 CXP software (Beckman Coulter) 를사용하였다. 3. 중간엽줄기세포를이용한분화유도 4명의건강한골수공여자로부터확보한중간엽줄기세포 4주를대상으로다음과같이골세포, 지방세포, 연골세포로의분화를유도하였다. 1) 골세포분화 중간엽줄기세포의골세포로의분화능을확인하기위해 12 well plate (Nunc, Rochester, NY, USA) 에 5 10 4 cells/well의농도로중간엽줄기세포를분주한후배양하였다. 세포충실도가약 70% 가되면 0.1 μm dexamethasone, 50 μm ascorbic acid 및 10 mm β-glycerophosphate를함유한 osteogenic induction medium (Lonza, Walkersville, MD, USA) 으로배지를교체하여 2주동안 3 4일마다새로운배지로교환하였다. 골세포로의분화유도 2주후에세포내 calcium phosphate의축적여부를판단하기위하여 von Kossa staining 13) 을시행하여골세포로의분화여부를확인하였다. 2) 지방세포분화 중간엽줄기세포의지방세포로의분화능을확인하기위해 12 well plate (Nunc) 에 5 10 4 cells/ well의농도로중간엽줄기세포를분주한후배양하였다. 세포충실도가 100% 가되면 0.1 μg/ml insulin, 0.5 mm 1-methyl-3-isobutylxanthine, 50 μg/ ml indomethacin, 1 μm dexamethasone을함유한 adipogenic induction medium (Lonza) 으로배지를교체하여 2주동안 3 4일마다새로운배지로교환하였다. 지방세포로의분화유도 2주후에세포내지방공포 (vacuole) 의확인을위하여 Oil Red O (Fluka, Taufkirchen, Germany) 염색을시행하여지방세포로의분화여부를확인하였다. 3) 연골세포분화 중간엽줄기세포에서연골세포로의분화는일반적으로 pellet culture system에서 3주정도배양을하지만 monolayer culture만으로도충분히연골세포의분화및확인이가능하기때문에본실험에서는 pellet culture가아닌 12 well plate에세포를 seeding 하여연골세포로분화를유도하였다. 연골세포분화유도를위해 5 10 4 cells /well의농도로중간엽줄기세포를분주한후배양하였다. 세포충실도가약 70% 가되면 0.1 μm dexamethasone, 50 μm ascorbic acid, 40 μg/ml proline을함유한 chondrogenic induction medium (Lonza) 으로배지교체를하여 2주동안 3 4일마다새로운배지로교환하였다. 특히배지교환시연골세포로의분화유도를촉진하는것으로알려진 TGF- - 282 -
Isolation of MSCs in the Bone Marrow Processing Kit β3 (10 ng/ml) 를첨가하였다. 연골세포로의분화유도 2주후에 Safranin-O staining을통해서연골세포분화여부를확인하였다. 결과 1. 부착성세포의분리및배양골수처리키트내에남아있는골수로부터회수한단핵세포는평균 1 10 8 개이었다 (n=4). 모든골수처리키트로부터배양후약 7일이경과된뒤중간엽줄기세포와유사한방추형모양세포들의집락이관찰되었다. 부착된세포들의대량증식을위하여계대배양을시행하였으며, 계대배양후부착된세포들이빠르게증식하는것을확인할수있었다 (Fig. 1). 하나의골수처리키트에남아있는골수단핵세포로부터평균 3 10 7 개의부착성세포를확보할수있었다. 2. 중간엽줄기세포의표지자검사중간엽줄기세포의표지자로알려진 CD29, CD44, CD73, CD90, CD105에서는모두강하게발현되었으며, 조혈모세포의표지자인 CD34, 혈액세포의표지자인 CD45, 단핵구마커인 CD14, 내피세포의마커인 CD31은발현되지않았다 (Fig. 2). 3. 중간엽줄기세포의분화능골세포분화유도 7일째부터중간엽줄기세포들이뭉치게되었으며, 14일째에 von Kossa staining 을통해다량의칼슘이침착되어골세포로의분화가유도되었음을확인하였다 (Fig. 3A). 지방세포로의분화는중간엽줄기세포의방추형세포몸체가짧아지면서둥근모양의형태로바뀌기시작하였으며, 7일째부터서서히지방공포들이세포외벽에서안쪽으로차기시작하였다. 분화유도 14일경과후에상당히많은양의지방공포들이형성되었으며, Oil Red O staining을통하여지 Fig. 1. Isolated mesenchymal stem cells after culturing for 3 weeks grew in colonies that contanined small spindle-shaped fibroblastoid cells. Light inverted microscope, original magnification 40 (A), 100 (B). The figure shows a typical example of one donor of four examined. - 283 -
대한수혈학회지 : 제 21 권제 3 호 Fig. 2. Immunophenotypes of isolated mesenchymal stem cells. Fibroblastoid cells expanded from bone marrow processing kit were trypsinized, labelled with antibodies against the indicated antigen, and analyzed by flow cytometry. A representative example is shown. Values represent the mean percentage of all assessed cells positively stained by the respective antibodies. 방공포들이빨갛게염색되어지방세포로의분화가유도되었음을확인하였다 (Fig. 3B). 연골세포로의분화는분화유도약 7일경과후세포들의모양이변하며다층구조의형상을나타냈으며, 2 주경과후에 Safranin-O staining을통하여붉게염색됨을관찰하여연골세포로분화가된것을확인하였다 (Fig. 3C). 이와같은골세포, 지방세포및연골세포로의분화는 4명의건강한골수공여자로부터확보한중간엽줄기세포 4주에서모두확인되었다. 고찰중간엽줄기세포는중배엽유래의성체줄기세포로적절한배양조건하에서중배엽유래의세포인골세포, 지방세포, 연골세포등으로분화할수있으며, 중배엽이외의다양한유형의세포로분화할수있다. 14,15) 또한자가재생능력이있어체외에서대량증식이가능하다. 14,16) 중간엽줄기세포는골수, 제대혈, 지방조직등다양한조직에서확보할수있으나, 2,5-7) 특히골수는 FBS만을포함한기본적인배지로비교적간단하게많은양의 - 284 -
Isolation of MSCs in the Bone Marrow Processing Kit Fig. 3. Multiple in vitro differentiation capacity of isolated mesenchymal stem cells. Mesenchymal stem cells were exposed in vitro to differentiation medium to induce osteogenic, adipogenic, and chondrogenic, and differentiation, respectively. (A) Osteogenic differentiation. Calcium mineralization detected by von Kossa stain. Original magnification 40. (B) Adipogenic differentiation. Lipid vaculoes were detected by Oil Red O stain. Original magnification 40. (C) Chondrogenic differentiation. Chondrogenesis was shown by Safranin O staining. Original magnification 200. A representative example is shown. 세포를 확보할 수 있기 때문에 중간엽줄기세포의 가장 좋은 자원으로 알려져 있다. 하지만 골수를 채취하는 과정이 침습적이어서 건강한 기증자로 부터 연구에 사용될 골수를 지속적으로 충분히 확보하는 것은 매우 어려운 일이다. 이에 본 연구 에서는 윤리적인 문제가 없는 골수이식 시 폐기 되는 골수처리키트로부터 골수 유래 중간엽줄기 세포를 분리 및 배양해보고자 하였다. 본 연구에서 하나의 골수처리키트 내에 남아있 8 는 골수로부터 회수한 단핵세포는 평균 1 10 개 이었다. 골수처리키트가 아닌 골수이식 이후의 17) 골수채집백과 필터로부터 Mageed 등 은 평균 8 9.6 10 개의 단핵세포를 회수하였으며, Dvora18) 8 kova 등 은 2.0 10 개의 단핵세포를 회수하였다. 이와 같이 골수처리키트로부터 회수할 수 있는 단핵세포의 수가 상대적으로 적은 것은 첫 번째, 적혈구 또는 혈장성분의 분리를 통하여 골수 내 의 단핵세포를 농축하는 골수처리과정이 매우 효 율적이기 때문이며, 두 번째, 골수 처리 이후의 폐기되는 골수처리키트 내에는 적혈구 성분이 과 다하게 존재하여 Ficoll-Hypaque을 통한 밀도구배 원심분리 시 잔존하는 단핵세포를 선택적으로 농 축시키기 어렵기 때문이다. 하지만, 소량의 골수 단핵세포로부터 중간엽줄기세포를 분리할 경우 285
대한수혈학회지 : 제 21 권제 3 호 대량증식을통하여평균 3 10 7 개의중간엽줄기세포를확보할수있어연구목적의세포공급원으로써는충분하다고판단되었다. 골수처리키트로부터분리된중간엽줄기세포의특성을확인하기위하여유세포분석을통한세포표지자발현여부를조사하였다. 분리된중간엽줄기세포는중간엽줄기세포관련항원 (CD73, CD105, CD90), integrin 수용체관련항원 (CD29) 및 matrix 수용체관련항원 (CD44) 이강하게발현되었으며, 조혈모세포관련항원 (CD14, CD34, CD45), 내피세포항원 (CD31) 은발현되지않아일반적인중간엽줄기세포의세포표지자발현양상과동일하였다. 19) 또한중간엽줄기세포의기능적측면을평가하기위하여골세포, 지방세포및연골세포로의분화를유도하였으며, 세가지세포로모두분화가가능함을확인하였다. 중간엽줄기세포의대량증식능력과다양한유형의세포로분화할수있는능력으로인하여최근조직재생및질환치료에중간엽줄기세포를이용한조직공학적접근과관련연구가활발하게이루어지고있다. 특히골수에서분리된중간엽줄기세포가세포기능적인측면과함께손쉽게분리및배양할수있다는측면에서가장우수한세포공급원이다. 본연구에서는골수이식시폐기되는골수처리키트로부터중간엽줄기세포를다량확보할수있었으며, 추후중요한중간엽줄기세포의공급원으로서의가능성을확인하였다. 요약배경 : 중간엽줄기세포는지속적인자기재생산 (self renewal) 능력과함께다양한조직으로분화할수있는유연성 (plasticity) 을가지고있어재생의학, 조직공학및유전자치료의매력적인연구소재로주목을받으며많은연구가진행되고있 다. 골수에서중간엽줄기세포를분리하는경우다른조직에비해일정수준이상의질을가진충분한양을회수할수있다. 그러나골수를건강한지원자로부터단순히연구목적으로확보하기는현실적으로매우어렵다. 따라서본연구에서는폐기되는골수처리키트에남아있는골수로부터연구목적용골수유래중간엽줄기세포를분리하고자하였다. 방법 : 건강한골수공여자로부터채집된골수를 COBE 2991 Cell Processor (CaridianBCT Inc.) 를이용하여적혈구와혈장의분리제거를시행한후, 골수처리키트에남아있는골수를채집 2시간내에회수하였다. 회수된골수는밀도구배원심분리를이용하여백혈구연층을분리하고부착세포의증식이일어날수있도록배양하였다. 부착세포의세포충실도가 70 80% 가되는경우회수하여계대배양하거나액체질소에냉동보관하였다. 분리배양한중간엽줄기세포의성상을파악하기위해유세포분석및골세포, 지방세포, 연골세포로의분화여부를확인하였다. 결과 : 골수처리키트내에남아있는골수로부터회수한단핵세포의수는평균 1 10 8 개였으며모두에서중간엽줄기세포를분리배양할수있었다 (n=4). 또한 1회의계대배양을통하여약 3주후평균 3 10 7 개의중간엽줄기세포를얻을수있었다. 유세포분석상중간엽줄기세포의표지자인 CD29, CD44, CD73, CD90, CD105는모두강하게발현하였으며, 조혈모세포의표지자인 CD34와 CD45, 내피세포의표지자인 CD31과단핵구의표지자인 CD14은발현되지않았다. 중간엽줄기세포의기능적측면을평가하기위하여골세포, 지방세포및연골세포로의분화를유도하였으며, 세가지세포로모두분화가가능함을확인하였다. 결론 : 골수이식시폐기되는골수처리키트로부 - 286 -
Isolation of MSCs in the Bone Marrow Processing Kit 터중간엽줄기세포를다량확보할수있었으며, 추후중요한중간엽줄기세포의공급원으로서의가능성을확인하였다. 참고문헌 1. Makino S, Fukuda K, Miyoshi S, Konishi F, Kodama H, Pan J, et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J Clin Invest 1999;103:697-705 2. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999;284:143-7 3. Ferrari G, Cusella-De Angelis G, Coletta M, Paolucci E, Stornaiuolo A, Cossu G, et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science 1998;279:1528-30 4. da Silva Meirelles L, Chagastelles PC, Nardi NB. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci 2006;119:2204-13 5. Horwitz EM, Prockop DJ, Fitzpatrick LA, Koo WW, Gordon PL, Neel M, et al. Transplantability and therapeutic effects of bone marrowderived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. Nat Med 1999;5:309-13 6. Bieback K, Kern S, Klüter H, Eichler H. Critical parameters for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Stem Cells 2004;22:625-34 7. Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell 2002;13:4279-95 8. In 't Anker PS, Scherjon SA, Kleijburg-van der Keur C, de Groot-Swings GM, Claas FH, Fibbe WE, et al. Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta. Stem Cells 2004;22:1338-45 9. De Coppi P, Bartsch G Jr, Siddiqui MM, Xu T, Santos CC, Perin L, et al. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat Biotechnol 2007;25:100-6 10. Kemp KC, Hows J, Donaldson C. Bone marrowderived mesenchymal stem cells. Leuk Lymphoma 2005;46:1531-44 11. D'Ippolito G, Schiller PC, Ricordi C, Roos BA, Howard GA. Age-related osteogenic potential of mesenchymal stromal stem cells from human vertebral bone marrow. J Bone Miner Res 1999;14:1115-22 12. Hung SC, Chen NJ, Hsieh SL, Li H, Ma HL, Lo WH. Isolation and characterization of sizesieved stem cells from human bone marrow. Stem Cells 2002;20:249-58 13. Cheng SL, Yang JW, Rifas L, Zhang SF, Avioli LV. Differentiation of human bone marrow osteogenic stromal cells in vitro: induction of the osteoblast phenotype by dexamethasone. Endocrinology 1994;134:277-86 14. Digirolamo CM, Stokes D, Colter D, Phinney DG, Class R, Prockop DJ. Propagation and senescence of human marrow stromal cells in culture: a simple colony-forming assay identifies samples with the greatest potential to propagate and differentiate. Br J Haematol 1999;107:275-81 15. Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, Schwartz RE, Keene CD, Ortiz-Gonzalez XR, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 2002;418:41-9 16. Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science 1997;276: 71-4 17. Mageed AS, Pietryga DW, DeHeer DH, West RA. Isolation of large numbers of mesen- - 287 -
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