식물병연구 Research Article Open Access Res. Plant Dis. 22(3): 158-167 (2016) http://dx.doi.org/10.5423/rpd.2016.22.3.158 Pseudomonas syringae pv. syringae 에의한애호박세균점무늬병 Bacterial Spot Disease of Green Pumpkin by Pseudomonas syringae pv. syringae 박경수 1 ㆍ김영탁 1 ㆍ김혜성 1 ㆍ이지혜 1 ㆍ이혁인 2 ㆍ차재순 3 * 1 ( 주 ) 농우바이오, 2 농림축산검역본부, 3 충북대학교식물의학과 *Corresponding author Tel: +82-43-261-2554 Fax: +82-43-271-4414 E-mail: jscha@cbnu.ac.kr Kyoung-Soo Park 1, Young-Tak Kim 1, Hye-Seong Kim 1, Ji-Hye Lee 1, Hyok-In Lee 2, and Jae-Soon Cha 3 * 1 Nongwoo Bio Co., Ltd., Yeoju 12655, Korea 2 Animal and Plant Quarantine Agency, Gimcheon 39660, Korea 3 Department of Plant Medicine, Chungbuk National University, Cheongju 28644, Korea Received June 28, 2016 Revised August 9, 2016 Accepted August 12, 2016 A pathogen that causes a new disease on green pumpkin in the nursery and the field was characterized and identified. Symptoms of the disease on green pumpkin were water soaking lesions and spots with strong yellow halo on leaf, brown lesion on flower, and yellow spot on fruit. The bacterial isolates from the leaf spot were pathogenic on the 8 curcubitaceae crop plants, green pumpkin, figleaf gourd, wax gourd, young pumpkin, zucchini, cucumber, melon, and oriental melon, whereas they did not cause the disease on sweet pumpkin and watermelon. They were Gramnegative, rod shape with polar flagella, fluorescent on King s B agar and LOPAT group 1a by LOPAT test. Their Biolog substrate utilization patterns were similar to Pseudomonas syringae pv. syringae s in Biolog database. Phylogenetic trees with 16S rrna gene sequences and multilocus sequence typing (MLST) with nucleotide sequences of 4 housekeeping genes, gapa, glta, gyrb, rpod and those of P. syringae complex strains in the Plant Associated and Environmental Microbes Database (PAMDB) showed that the green pumpkin isolates formed in the same clade with P. syringae pv. syringae strains. The clade in MLST tree was in the genomospecies 1 group. The phenotypic and genotypic characteristics suggested that the isolates from green pumpkin lesion were P. syringae pv. syringae. Keywords: Bacterial spot, Green pumpkin, New disease, Pseudomonas syringae pv. syringae 서론 박과작물은전세계적으로재배되고있는채소작물로서 그중애호박을포함한호박은국내에서약 34 만 5 천톤이생 산되고있다. 재배면적은 1991 년약 5,774 ha 였으나 2000 년 대들어와서점차면적이확대되어 2014 년재배면적은 9,659 Research in Plant Disease pissn 1598-2262, eissn 2233-9191 www.online-rpd.org ha로확인되었다 (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, 2015). 호박은덩굴성 1년생초본식물로동양계, 서양계, 폐포계로구분된다. 국내에서많이재배되고있는애호박과풋호박은동양계, 쥬키니호박은폐포계이며, 밤호박은서양계로분류된다. 호박은과육이유연하고비타민및무기질이풍부하여최근에는건강웰빙식품으로각광받고있으며음료, 제과등의가공식품의원료로도널리이용되고있다 (RDA, 2013). 한국식물병명목록 (The Korean Society of Plant Pathology, The Korean Society of Plant Pathology cc This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/ licenses/by-nc/4.0/), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 158
Research in Plant Disease Vol. 22 No. 3 159 2009) 에따르면국내의호박에발생하는병은 43종으로, 진균에의한병 23종, 바이러스에의한병 8종, 세균에의한병 2종이보고되어있다. 호박에발생하는세균병은 Pseudomonas syringae pv. lachrymans (Psl) 에의한세균모무늬병과 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum에의한무름병이다. 2013년충남공주의육묘장과충북청원및강원홍천의애호박포장에서기존에서보고된병과다른새로운병이발생하였다. 애호박에서발생한병은호박에발생이보고된세균모늬병과무름병과는차이가있었으며, 본논문의첫번째저자에의해이병의발생을한국식물병리학회에초록으로보고하였다 (Park 등, 2013). 본연구에서는이병을일으키는병원균의병원성및표현형적 유전적특성을자세하게조사하고동정하였다. 재료및방법 병원균분리. 충남공주에서병징을가진애호박를채집하여 Schaad 등 (2001) 의방법에따라병원균을분리하였다. 병징부위와건전부위의경계부위를잘라내어 1% sodium hypochlorite에 3분간표면살균하였으며, 멸균수로 2 회세척한다음 5분간클린벤치에서건조하였다. 이조각을 King s B 배지 (peptone 20 g, magnesium sulphate heptahydrate 1.5 g, dipotassium phosphate 1.5 g, glycerol 15 ml, agar 15 g/l) 에올려놓고 28 o C의배양기에서 2일배양하여병반으로부터자라나온병원균을순수배양하였다. 단일콜로니에서순수분리된병원균은 King s B 배지에서배양한후 20% 글리세롤에현탁하여 80 o C 냉동고에동결보존한후실험에사용하였다. 분리균의병원성확인. 애호박병징에서분리된 NWB SC125, NWB SC127, NWB SC131의 3개균주를박과 10개작물, 애호박 (Cucurbita mochata cv. Nongwooae), 풋호박 (Cucurbita mochata cv. Bokjuput), 흑종호박 (Cucurbita ficifolia), 참박 (Lagenaria leucantha cv. Sunbongzhang), 쥬키니호박 (Cucurbita pepo cv. Teayang), 오이 (Cucumis sativus cv. Seolback), 참외 (Cucumis melo var. makuwa cv. Obokggul), 멜론 (Cucumis melo cv. Earthtalent), 수박 (Citrullus vulgaris cv. Speedggul), 밤호박 (Cucurbita maxima cv. Danbam) 에접종하여병원성을확인하였다. King s B 배지에서 28 o C 48시간배양한세균을분광광도계흡광파장 OD 600nm 에서 0.1 ( 약 5 10 7 cells/ml) 로현탁하였다. 이현탁액을 50구트레이에파종 3주된 1 2 엽기의 10 개의박과작물에분무접종하였다. 균주현탁액 250 ml에 전착제 (siloxane) 100 μl를첨가하였다. 접종후 18시간동안 80% 습도의암조건에둔후, 25 o C 30 o C, 40% 50% 습도의온실로옮겨관리하였다. 접종 7일후발병도를조사하였으며, 발병도조사는병발병의잎면적에따라발병수준을 0, 1, 3, 5, 7까지나누었으며 0은무발병, 1은 1% 10% 발병면적, 3은 11% 25% 발병면적, 5는 26% 50% 발병면적, 7은 50% 이상의발병면적으로정하였다. 발병도 (%) 는각접종구의발병잎의면적지수의총합을각접종구의총조사잎수의총면적지수의백분율로구하였다. 본연구에한국농업미생물은행 (Korean Agriculture Culture Collection, KACC) 에서분양을받은 P. syringae pv. syringae (Pss) KACC17521과 KACC18392 두균주를대조균주로사용하였다. 전자현미경관찰. 애호박병징에서분리한 NWB SC127 균주를투과전자현미경 (transmission electron microscopy, Tecnai G2 Spirit; FEI, Hillsboro, OR, USA) 으로관찰하였다. 시료처리는 200 mash carbon coated grid에시료를올리고 2% uranyl acetate를이용하여염색한후 11,000배배율로관찰하였다. 형광성, 그람반응및생장온도조사. 분리된균들을 King s B 배지에도말하여 28 o C, 3일간배양한후 UV 350nm 파장에서형광발생을확인하였다. 생육온도에대한민감도를확인하기위하여 King s B broth 10 ml에 24시간배양을한후 King s B broth 10 ml에배양액 100 μl를접종하여 48시간동안진탕배양기 (200 rpm) 에서 28 o C와 35 o C 조건으로배양하였다. 배양후균주현탁액을 King s B 배지에도말하여 28 o C에 3 일간배양후콜로니형성을조사하여생육온도를조사하였다. Schaad 등 (2001) 의방법으로그람염색을하여현미경으로관찰하였다. LOPAT 검정. 분리된병원균 NWB SC127 균주의 LOPAT (levan test, oxidase test, potato soft rot test, arginine dihydrolase activity, tobacco hypersensitive reaction) 를조사하였다 (Lelliott 과 Stead, 1987; Schaad 등, 2001). Levan 형성을확인하기위하여 sucrose peptone agar (5% sucrose nutrient agar) 배지에서 28 o C 4일간배양후 dome 모양의콜로니를형성하는지관찰하였다. Oxidase 활성은여과지에 1% 검사용시약 (nitrogen tetramethyl-p-phenolin-diamine dihydrochloride, Sigma) 을적신후 King s B 배지에서 24시간배양된세균을시약으로적신여과지에묻힌후 10초안에보라색또는청색으로변하는지관찰하였다. 감자무름반응을조사하기위하여세척
160 Research in Plant Disease Vol. 22 No. 3 한감자를화염멸균한칼로 0.5 cm 두께로썰어절편을준비하였다. King s B 배지에 24시간배양한병원균을백금이로떠서감자의절단면에접종하고, 28 o C에서 24 48시간동안에접종한감자에서무름이발생하는지관찰하였다. Arginine dihydrolase 활성을확인하기위하여 Thornley s medium (0.2 g peptone, 1 g NaCl, 0.06 g K 2 HPO 4, 0.6 g agar, 0.02 mg phenol red, 2 g arginine HCl per 200 ml, ph 7.2) 을 10 ml씩시험관에조제하여 24시간 King s B 배지에배양된균주를접종하였다. 접종후멸균된미네랄오일로시험관입구를밀봉한후 28 o C 에배양하여 4일후색의변화를관찰하였다. 담배에서과민성반응은파종후 5주된담배에 King s B 배지에 24시간배양한분리균의현탁액 ( 약 5 10 7 cells/ml) 을담배잎에주입하여과민성반응여부를확인하였다. Biolog 기질이용성조사. 애호박에서분리한 NWB SC127과 Pss KACC18392, Psl LMG5172, Pst DC3000 (P. syringae pv. tomato DC3000), Psp KACC10575 (P. syringae pv. pisi KACC10575) 균주를 Biolog GN2 Microplate (Biolog Inc., Hayward, CA, USA) 를이용하여 Biolog 기질이용성을조사하였다. 각균주를 BUG (Biolog Universal Growth) agar에서 30 o C 24시간배양하였다. 배양된균주를 GN/GP inoculating fluid 용액에현탁하여분광광도계 OD 600nm 에서 52% T 농도가되도록희석하였다. 이현탁액을 Biolog Plate의각 well에 150 μl씩분주하여 30 o C에서 24시간배양한후변색여부를확인하고, Biolog database의 P. syringae pv. syringae data와비교하였다. 16S rrna 염기서열분석. 애호박의병반에서분리된 7개균주를 King s B 배지에 28 o C, 24시간배양하여 ( 주 ) 코스모진텍 (Cosmogenetech, Seoul, Korea) 에 16S rrna sequencing 을의뢰하였다. National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank에등록되어있는 P. syringae complex 균주들의 16S rrna 염기서열을이용하여 CLUSTAL W 프로그램으로염기서열을다중정렬한후분석하였다 (Thompson 등, 1994). 유전자염기서열의상동성은 Mega (version 5.05; Tamura 등, 2011) BioEdit (version 7.01) 프로그램을통하여분석하였다. 정렬된각염기서열의 evolutionary distance matrix는 Kimura 2-parameter (K2P) 로구하였고 phylogenetic tree algorithm은 maximum likelihood (ML) 를이용하여계통도를그렸으며, 지지도를확인하기위하여 1,000번의 bootstrap을수행하여 500 이상의값을표기하였다. Multilocus sequence typing (MLST) 분석. MLST에의한분리균의계통수 (phylogenetic analysis) 분석은 Hwang 등 (2005) 에의해개발된프라이머를이용하였다. MLST 분석에사용된유전자염기서열은총 1,800 bp로 4개의항존유전자 (housekeeping gene) gapa, rpod, glta 및 gyrb의 400 bp, 600 bp, 400 bp, 400 bp이다. 본연구에서사용된각균주들의염기서열은 Plant Associated and Environmental Microbes Database (PAMDB, http://genome.ppws.vt.edu/cgi-bin/mlst/ home.pl) 에등록되어있는 P. syringae complex 64균주의해당항존유전자의염기서열을바탕으로 CLUSTAL W 프로그램을 A B C D Fig. 1. Symptoms of new disease that occurred on the green pumpkin. Water soaking lesions on leaf (A), spots with strong yellow halo on leaf (B), brown lesion on flower (C), and brown and yellow pit on fruit (D) were observed. Arrows point the lesions.
Research in Plant Disease Vol. 22 No. 3 161 이용하여다중정렬한후분석하였다 (Thompson 등, 1994). 유전자염기서열의상동성은 Mega (version 5.05) BioEdit (version 7.01) 프로그램을통하여분석하였다. 정렬된각염기서열의 evolutionary distance matrix는 K2P로구하였고 phylogenetic tree algorithm은 ML을이용하여계통도를그렸으며, 지지도를확인하기위하여 1,000번의 bootstrap을수행하여 500 이상의값을표기하였다. 결과 애호박에나타난병징과분리균의병원성. 충남공주의육묘장과충북청원및강원홍천의재배지에서애호박에발생한병의병징은초기유묘의떡잎가장자리에부정형의강한수침상이나타나고 (Fig. 1A), 잎에서는병반주위에노란색의둘레무리 (halo) 를가진회색 갈색의점무늬가나타났다 (Fig. 1B). 꽃에서는갈색수침상의부정형병반이 (Fig. 1C), 과실에서는갈색의움푹들어간병반이나타났다 (Fig. 1D). 충남공주육묘장의애호박병반으로부터분리된 7개의균 (NWB SC125, NWB SC126, NWB SC127, NWB SC128, NWB SC129, NWB SC130, NWB SC131) 은접종한유묘의애호박에서부정형의점무늬병징을일으켰다. 애호박에서병원성이확인된분리균들중 NWB SC125, NWB SC127, NWB SC131의 3개균들과 KACC에서분양받은 Pss KACC17521과 Pss KACC18392 두개균을박과 10개작물흑종호박, 밤호박, 애호박, 쥬키니호박, 풋호박, 참박, 수박, 참외, 멜론, 오이에접종하여병원성을확인하였다. 그결과분양받은 Pss KACC17521과 Pss KACC18392는접종한박과작물에병을일으키지못하였다. 이두균주는각각산딸기와복숭아에서분리된균으로박과작물에는병원성이없는것으로판단된다. 분리균 NWB SC125, NWB SC127, NWB SC131은애호박에약 70%, 풋호박에 40%, 흑종호박에 60%, 참박에 40%, 쥬키니호박에서는 65% 의발병도를보였으며, 오이와참외는약 10%, 멜론은 5% 이하의발병도를보였다. 수박과밤호박에서는병을일으키지못했다 (Table 1, Fig. 2). 접종한 3개의균주는기주에따른발병도의차이는없었다 (Table 2). 분리균의형태적 생리적특성. 분리균 NWB SC127을투과전자현미경으로관찰한결과막대형으로극에 4개의편모를가진속모균이었다 (Fig. 3). NWB SC125, NWB SC127, NWB SC131 균주는 King s B 배지에서녹색형광을보여주었고, 28 o C 온도에서는생육하였으나, 35 o C의온도에서는생 Table 1. Disease severity on the 10 Cucurbitaceae plants by inoculation of the three green pumpkin isolates from Gongju-si and Pseudomonas syringae pv. syringae strains from the different host plants Disease severity (%) Cucumis sativus cv. Seolback Cucumis melo cv. Earthtalent Cucumis melo var. makuwa cv. Obokggul Citrullus vulgaris cv. Speedggul Lagenaria leucantha cv. Sunbongzhang Cucurbita mochata cv. Bokjuput Cucurbita pepo cv. Teayang Cucurbita mochata cv. Nongwooae Cucurbita maxima cv. Danbam Cucurbita ficifolia Isolate/strain NWB SC125 63b* 0e 45c 65a 72a 41c 0e 12d 3e 11d NWB SC127 59b 0e 46c 67a 71a 42c 0e 10d 4e 14d NWB SC131 62b 0e 44c 65a 73a 46c 0e 10d 3e 12d Pss KACC17521 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e Pss KACC18392 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e *Values denoted by the same letter are not significantly different by Duncan s multiple range test (P 0.05). P. syringae pv. syringae KACC17521 isolated from Korean raspberry. P. syringae pv. syringae KACC18392 isolated from peach.
162 Research in Plant Disease Vol. 22 No. 3 Figleaf groud (Cucurbita ficifolia) Cucumber ( Cucumis sativus cv. Seolback) Young pumpkin ( Cucurbita mochata cv. Bokjuput) Zucchini ( Cucurbita pepo cv. Teayangzucchini) Melon ( Cucumis melo cv. Earthtalent) Green pumpkin ( Cucurbita mochata cv. Nongwooae) Wax gourd ( Lagenaria leucantha cv. Sunbongzhang) Oriental melon ( Cucumis melo var. makuwa cv. Obokggul) Sweet pumpkin ( Cucurbita maxima cv. Danbamhobak) Watermelon ( Citrullus vulgaris cv. Speedggul) Fig. 2. Symptoms on the 10 Cucurbitaceae plants at 7 days after inoculation of the NWB SC127 isolate in green house. Table 2. Physiological characteristics of the isolates from lesions on green pumpkin Isolate/strain Levan test Oxydase test Potato soft rot test Arginine dihydrolase activity Tobacco hypersensitive reaction Fluorescence on KB Gram staining Growth temperature sensitivity 28 o C 35 o C NWB SC125 + + + + NWB SC127 + + + + NWB SC131 + + + + Pss* + + + + KB, King s B. +, positive reaction;, negative reaction. *Pseudomonas syringae pv. syringae KACC18392. 육하지못하였으며, 그람반응은모두음성으로나타났다 (Table 2). 3가지분리균은 levan를형성하였고 ( 양성 ), oxidase 와 arginine dihydrolase의활성은음성이었다. 감자무름반응은음성이었고담배과민성반응은양성으로 5개의 LOPAT group 중 group 1a로확인되었다 (Table 2). 애호박에서분리한균주 NWB SC127, Pss KACC18392, Psl LMG5172, Pst DC3000, Psp KACC10575 균주의 Biolog GN2 기질이용성을조사한결과, 분리균주 NWB SC127 균주와 Pss KACC18392는 Pss Biolog database와 91% 의동일한기질이용성을확인하였다. Pss Biolog database와다른 P. syringae 균주들과비교한결과, Psl LMG5172는 86%, Pst DC3000은 73%, 그리고 Psp KACC10575와 81% 의동일한기질이용성이확인되었다. 분리균주 NWB SC127과 Pss KACC18392 두균주간에는 96% 의동일한기질이용성이확인되었다. 특히, L-Histidine과 D,L-carnitine 기질은 Pss 균들만양성반응을보였다 (Table 3, Supplementary Table 1). 분리균의유전적특성. NWB SC125, NWB SC127, NWB SC131 균주들의 16S rrna 염기서열을얻어 NCBI GenBank 에등록된 P. syringae complex 균들의 16S rrna 염기서열과비교하여계통수를분석하였다. 분리한 3개균주들은모두동일한 clade로그룹화되었고, 비교한 P. syringae complex 의균주중에서 Pss IPPBC-R30과같은 clade로그룹화되었다 (Fig. 4). 항존유전자 4개유전자의염기서열을이용한 MLST 분석에서는 NWB SC125, NWB SC127, NWB SC131 균주들은독립된 clade를형성하였고, P. syringae Cit7, Pss 1212R, Pss 61
Research in Plant Disease Vol. 22 No. 3 163 과가장유사한그룹으로확인되었다 (Fig. 5). 이 clade 는 P. syringae pv. pisi, P. syringae pv. atrofaciens, P. syringae pv. japonica 균주들을포함하고있는 genomospecies group 1에속하였다 (Fig. 5). 오이및호박에서세균모무늬병을일으키는 Psl은 genomospecies group 2에속해애호박분리균과는다른계통군이었다 (Fig. 5). 고찰 Fig. 3. Morphology of the NWB SC127 by transmission electron microscopy. 본연구에서는 2013년충남공주의육묘장과국내의일부재배지에서새롭게발생한애호박점무늬병증상에서병원균을분리하고, 분리된균들의병원성을확인하였으며, 표현적유전적특성을분석하여동정하였다. 애호박에서발생한병징은강한수침상, 점무늬주위의노란색둘레무리등의전형적인세균에의한병의특징을보였으며, 병반에서진균은관찰되지않았다. 따라서병징은세균에의한점무늬병병징으로추정되었으며, 이병징의특징들은국내에보고된 2종의호박세균병인세균모무늬병과무름병의병징과는차이가있었다 (The Korean Society of Plant Pathology, 2009). 이병반에서분리된분리균은박과 10개작물중에서 Table 3. Utilization of the Biolog GN2 substrates by the NWB SC127 and the different strains of Pseudomonas syringae Substrates* Pss Biolog data NWB SC127 Pss KACC18392 Psl LMG5172 Pst DC3000 Psp KACC10575 Glycogen + + + + + i-erythritol + + + + D-Mannitol + + + + + D-Sorbitol + + + + + Turanose + + + + D-Galacturonic acid + + + + + D-Glucosaminic acid + + + + + D-Glucuronic acid + + + + + γ- Hydroxybutyric acid + α-keto Butyric acid + + + + + α-keto Glutaric acid + + + + D,L-Lactic acid + + + + Glucuronamide + + + + L-Histidine + + + Hydroxy-LProline + + + L-Leucine + + + + D-Serine + + + + L-Threonine + + + + + D,L-Carnitine + + + Pss, Pseudomonas syringae pv. syringae; Psl, Pseudomonas syringae pv. lachrymans; Pst, Pseudomonas syringae pv. tomato; Psp, Pseudomonas syringae pv. pisi. +, positive reaction;, negative reaction. *Biolog substrates that gave different response depending on bacterial strains. Full results were given in the Supplementary Table 1.
164 Research in Plant Disease Vol. 22 No. 3 Fig. 4. Maximum likelihood tree inferred from 16S rrna gene sequences of the green pumpkin isolates (NWB SC125, 127, 131) and Pseudomonas syringae strains. Bootstrap values ( 50%) based on 1,000 replicates are shown at the branches. The bar indicates the nucleotide substitutions per site. 애호박, 쥬키니호박, 풋호박, 흑종호박, 참박, 참외, 멜론, 오이에서병원성이확인되었고, 수박과밤호박에서는병반을형성하지않았다. 분리균은밤호박을제외한호박류에서높은발병도를보였다. 애호박, 풋호박은동양계 (Cucurbit moschata) 이고, 쥬키니호박은폐포계 (Cucurbit pepo) 이며흑종호박 (Cucurbita ficifolia) 하나의종으로분류되고있으며, 분리균이병반을형성하지않은밤호박은서양계 (Cucurbit maxima) 였다 (RDA, 2013). 따라서애호박분리균은호박의계통에따라병원성이차이가나는것으로생각된다. 호박류에서병원성이확인된분리균주는 King s B 배지에서형광을보이는그람음성의균이었고, 막대형의 4개의편 모를가진속모균이었다. 또한 35 o C 이상의온도에서는생육이불가능하였으며, Lelliott 등 (1966) 이제안한 LOPAT test를통하여 LOPAT group 중 group 1a에속하는것을확인하였다. 이상의결과는분리균이 P. syringae의특성을가졌음을의미한다. 16S rrna 염기서열과 NCBI GenBank database에등록되어있는다른 P. syringae complex의 16S rrna 염기서열을이용한계통도에서애호박분리균들은 P. syringae pv. syringae (Pss) 의균주와같은그룹 (clade) 으로분류되었지만, 일부다른 Pss는다른그룹 (clade) 으로그룹화되었다. 16S rrna 유전자염기서열은균주사이의유사도가매우높아 P. syringae complex 내의 pathovar (pv.) 의분류기준으로적합하지않는
Research in Plant Disease Vol. 22 No. 3 165 Fig. 5. Maximum likelihood tree inferred from gapa, rpod, glta, gyrb sequences of the green pumpkin isolates (NWB SC125, 127, 131) and Pseudomonas and other bacteria. The 4 gene sequences of Pseudomonas and other bacteria were obtained from the Plant Associated and Environmental Microbes Database (PAMDB, http://genome.ppws.vt.edu/ cgi-bin/mlst/home.pl). Bootstrap values ( 70%) based on 1,000 replicates are shown at the branches. The bar indicates the nucleotide substitutions per site. Gsp is genomospecies. 것으로알려져있다 (Young, 2010). Biolog의기질이용성을다른 P. syringae 균주들과비교한결과애호박분리균은 Biolog 의 database에등록되어있는 Pss 균주의기질이용성과 91% 동일한것으로나타났다. 특히 Krejzar 등 (2004) 의발표따르면 Pss는다른 P. syringae 균들과는다르게 D,L-carnitine 기질이용성에양성반응을보인다고보고하였는데, 본연구결과에서 NWB SC127과 Pss KACC18392 균주들만 D,L-carnitine 기질이용성에양성반응을보여분리된 NWB SC127 균주는 P. syringae pv. syringae일가능성이높은것으로나타났다. P. syringae complex를 1999년 Gardan 등이 DNA-DNA hybridization을통한 9개의 genomospecies group 으로분류 하였고, Bull 등 (2011) 이 MLST 분석으로 P. syringae complex의 9개 genomospecies group이존재함을다시확인하였다. 애호박에서분리한 3가지균주의 4가지 (gapa, rpod, glta, gyrb) 항존유전자염기서열을이용한계통수는이균주들이 Pss 와가장유사한 clade에속하며, genomospecies group 1에속한것으로보여주었다. 박과에서세균모무늬병을일으키는 P. syringae pv. lachrymans는 genomospecies group 2에속한다. 본연구의결과로확인된애호박분리균의형태적, 생리생화학적, 유전적특성을바탕으로이들분리균을 P. syringae pv. syringae로판단하였다. 국내에서는 Pss가호박에병을일으키는것이아직까지보
166 Research in Plant Disease Vol. 22 No. 3 고되지않았지만국외에서는여러번있었다. 미국의조지아주에서폐포계호박에서 Pss에의한잎점무늬병의발생이보고되었다 (Langston Jr 등, 2003). 세르비아의폐포계호박 (oil pumpkin) 에서 Pss에의해잎에점무늬병이발생하여피해를주었고 (Balaž 등, 2014), 최근에는미국플로리다, 조지아, 캘리포니아주에서수박, 멜론, 호박의병든잎에서 27개의 P. syringae strain을분리하였고, MLST와 BOX-PCR 분석으로 27개의균들중 26개의균이 genomospecies group 1에속한다고보고하였다 (Newberry 등, 2016). 따라서 Pss에의해호박에서병이발생하는것은전세계적으로이번이처음은아니다. 본연구를통해애호박의점무늬병징에서분리한균주들은동양계호박과폐포계호박, 흑종호박에병원성을가지고있었으며, P. syringae pv. syringae로동정되었다. 현재까지국내에서애호박에 P. syringae pv. syringae 에의한병명은등록되어있지않다. 따라서애호박에서새롭게발생한이병을 애호박세균점무늬병 으로제안한다. 요약 육묘장과재배포장의애호박에서새롭게발생한병원균의특성을분석하여동정하였다. 병징은잎에수침상의병반과강한노란색의둘레무리를가진점무늬, 꽃에서갈색병반, 열매에노란색의점무늬였다. 잎의점무늬로부터분리된세균은박과작물 8개의식물체, 흑종호박, 애호박, 쥬키니호박, 풋호박, 참박, 참외, 멜론, 오이에병원성이있었지만수박과밤호박에서는병을일으키지못했다. 분리세균은다발모를가진막대형으로그람음성이며 King s B 배지에서형광성이었으며, LOPAT 1a 그룹에속했다. 그들의 Biolog 기질이용성은 Biolog database의 P. syringae pv. syringae 이용성과유사하였다. 16S rrna 유전자염기서열을이용한계통수와 4개의항존유전자 (gapa, glta, gyrb, rpod) 의염기서열과 PAMDB에있는 P. syringae 균주들의염기서열을이용한 MLST 는애호박분리균주들이 P. syringae pv. syringae 균주들과동일한그룹 (clade) 으로그룹화되었고, MLST 계통수에서애호박분리균주들의그룹 (clade) 은 genomospecies 1에속하였다. 표현형적, 유전적특성은애호박분리균이 P. syringae pv. syringae임을제시하였다. Conflicts of Interest No potential conflict of interest relevant to this article was reported. References Balaž, J., Iličić, R. and Maširević, S. 2014. First report of Pseudomonas syringae pv. syringae causing bacterial leaf spots of oil pumpkin (Cucurbita pepo) in Serbia. Plant Dis. 98: 684. Bull, C. T., Clarke, C. R., Cai, R., Vinatzer, B. A. and Jardini, T. M. 2011. Multilocus sequence typing of Pseudomonas syringae sensu lato confirms previously described genomospecies and permits rapid identification of P. syringae pv. coriandricola and P. syringae pv. apii causing bacterial leaf spot on parsley. Phytopathology 101: 847-858. Gardan, L., Shafik, H., Belouin, S., Broch, R., Grimont, F. and Grimont, P. A. 1999. DNA relatedness among the pathovars of Pseudomonas syringae and description of Pseudomonas tremae sp. nov. and Pseudomonas cannabina sp. nov. (ex Sutic and Dowson 1959). Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 469-478. Hwang, M. S., Morgan, R. L., Sarkar, S. F., Wang, P. W. and Guttman, D. S. 2005. Phylogenetic characterization of virulence and resistance phenotypes of Pseudomonas syringae. Appl. Environ. Microbiol. 71: 5182-5191. Krejzar, V., Jeřábková, R. and Kůdela, V. 2004. Suitability of biolog system for differentiating fluorescent pseudomonads associated with premature dying of apricot trees. Acta fytotechnica et zootechnica 7: 147-149. Langston Jr, D. B., Sanders, F. H., Brock, J. H. and Gitaitis, R. D. 2003. First report of a field outbreak of a bacterial leaf spot of cantaloupe and squash caused by Pseudomonas syringae pv. syringae in Georgia. Plant Dis. 87: 600. Lelliott, R. A., Billing, E. and Hayward, A. C. 1966. A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads. J. Appl. Microbiol. 29: 470-489. Lelliott, R. A. and Stead, D. E. 1987. Methods for the Diagnosis of Bacterial Diseases of Plants. Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, UK. pp. 169-199. Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs. 2015. Greenhouse state of facility vegetable and production records of vegetables. Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Sejong, Korea. 83 pp. Newberry, E. A., Jardini, T. M., Rubio, I., Roberts, P. D., Babu, B., Koike, S. T., Bouzar, H., Goss, E. M., Jones, J. B., Bull, C. T. and Paret, M. L. 2016. Angular leaf spot of cucurbits is associated with genetically diverse Pseudomonas syringae strains. Plant Dis. 100: 1397-1404. Park, K. S., Kim, Y. T., Jung, J. H., Kim, H. S. and Park, S. J. 2013. First report of leaf spot disease caused by Pseudomonas syringae pv. syringae on green pumpkin (Cucurbita spp L). Res. Plant Dis. 19: 343. [RDA] Rural Development Administration. 2013. Squash cultivation. Rural Development Administration, Korea. 152 pp. Schaad, N. W., Jones, J. B. and Chun, W. 2001. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. APS Press, St. Paul, MN, USA. pp. 84-120. Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M. and Kumar, S. 2011. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maxi-
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