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진이 동
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1 식물병연구 Res. Plant Dis. 17(2) : (2011) 보문 Open Access Research in Plant Disease The Korean Society of Plant Pathology 가지과종자에서 Ralstonia solanacearum 의검출을위한 PCR 방법 조정희 임규옥 1 이혁인 1 백지현 1 차재순 * 충북대학교식물의학과, 1 국립식물검역원 Detection of the Causal Agent of Bacterial Wilt, Ralstonia solanacearum in the Seeds of Solanaceae by PCR Jung-Hee Cho, Kyu-Ock Yim 1, Hyok-In Lee 1, Ji-Hyun Baeg 1 and Jae-Soon Cha* Department of Plant Medicine, Chungbuk National University, Cheongju , Korea 1 National Plant Quarantine Service, AnYang , Korea (Received on February 15, 2011; Revised on May 9, 2011; Accepted on May 17, 2011) Ralstonia solanacearum, a causal agent of bacterium wilt is very difficult to control once the disease becomes endemic. Thus, Ralstonia solanacearum is a plant quarantine bacterium in many countries including Korea. In this study, we developed PCR assays, which can detect Ralstonia solanacearum from the Solanaceae seeds. Primers RS-JH-F and RS-JH-R amplified specifically a 401 bp fragment only from Ralstonia solanacearum st race 1 and race 3. The nested PCR primers, RS-JH-F-ne and RS-JH-R-ne that were designed inside of 1 PCR amplicon amplified specifically a 131 bp fragment only from Ralstonia solanacearum race 1 and race 3. The primers did not amplify any non-specific DNA from the seed extracts of the Solanaceae including tomato and pepper. When detection sensitivity were compared using the Solanaceae seeds inoculated with target bacteria artificially, the nested PCR method developed in this study 100 times more sensitive than ELISA and selective medium. Therefore, we believe that the PCR assays developed in this work is very useful to detect Ralstonia solanacearum in the Solanaceae seeds. Keywords : PCR assays, Plant quarantine, Seed detection 서론 Ralstonia solanacearum은종자전염성병원세균으로, 가지과작물에서풋마름병 (bacterial wilt) 을일으킨다 (Lee 등, 2001; Saile 등, 1997). R. solanacearum에의한풋마름병은기주범위가넓고전세계적으로경제적으로중요한작물에큰피해를주고있기때문에유럽등의세계여러나라에서식물검역병으로지정되어있으며, 국내에서도규제비검역병으로지정되어관리되고있다 (Caruso 등, 2002; Weller 등, 2000). 그람음성세균인 R. solanacearum은병을일으키는기주에따라 6개의레이스 (race) 로분류되는데, 이들중경제적으로큰피해를발 *Corresponding author Phone) , Fax) ) jscha@cbnu.ac.kr 생시키는레이스는감자, 토마토, 고추등에서병을일으키는 race 3과담배등에서병을일으키는 race 1으로알려져있다 (Huang 등, 2009; Schonfeld 등, 2003). 현재 R. solanacearum의검출을위해다양한방법들이사용되고있으나, 사용중인방법들은식물검역을위한검출법으로는여러가지문제를가지고있다. 반선택배지 (Engelbrecht, 1994) 의경우다양한시료에적용이가능하고간단하게검출할수있다는장점이있지만, 배지에서 R. solanacearum의전형적인콜로니를확인할때까지 72시간이상이필요하고, 콜로니형태가유사한부생성세균이함께검출되는단점과함께검출민감도가낮은문제점이있다 (Pradhanang 등, 2000). 항혈청을이용한 DAS- ELISA(Caruso 등, 2002; Priou 등, 2006) 을통한검출법의경우선택배지에비해검출시간을단축시킬수있지만, 항체의교차반응 (cross-reaction) 에의해거짓양성반응으로인한검출특이성의문제와낮은검출민감도 (Janse,

2 가지과종자에서 Ralstonia solanacearum 의검출을위한 PCR 방법 ) 로식물검역을위한풋마름병원균의검출에적합하지않다 (Poussier 등, 2002). 그밖에형광현미경을이용한 FISH(Fluorescent in situ hybridization) 에의한검출 (Wullings 등, 1998) 과 PCR 검출과유사한방법인 RNA를이용한 NASBA(nucleic acid sequence based amplification) 을통한검출 (Van der Wolf 등, 2004) 의경우비용이많이들고일반실험실에서적용하기어렵다는단점을가지고있다. 현재까지가장빠르고, 정확하며일반실험실에서보편적으로적용할수있는방법으로다양한 PCR 검출법이보고되어있다 (Caruso 등, 2003; Huang 등, 2009; Pradhanang 등, 2000; Schonfeld 등, 2003; Weller 등, 2000). 그러나이들방법은주로오염된토양이나물로부터병원세균을검출하는방법들이며, R. solanacearum의 race 1과 race 3중한가지만검출이가능한방법들이다. 수입종자로부터 R. solanacearum의검출을위해서는종자에직접적용이가능하고, 풋마름병병원균중가장문제가되고있는 race 1과 race 3을동시에검출할수있어야한다. 따라서본연구에서는식물검역현장에서적 용이가능한가지과종자로부터 R. solanacearum race 1 과 race 3을한번의 PCR로동시에검출할수있는검출법을개발하고자하였다. 또한검출의민감도를높이기위해 nested-pcr 및 DNA의추출없이종자추출물을직접 PCR에이용하는방법을개발하였다. 재료및방법 세균균주. 본연구에사용된세균균주는 Table 1과같다. 서로다른나라에서분리된 Ralstonia solanacearum race 1, 5개균주와 race 3, 5개균주, Pseudomonas 속의균주들과대표적인식물병원균들을사용하였다. 본연구에사용한균주는한국농업미생물자원센타 (KACC) 와 BCCM(Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms) 로부터분양받았다. Genomic DNA 분리및프라이머제작. R. solanacearum 의 genomic DNA의분리를위해실험에사용한균주들을 Nutrient Broth(NB) 에서 28 o C, 48시간배양하였다. 배 Table 1. Bacterial strains used in this study Bacterial strains a Source b Bacterial strains Source R. solanacearum race 1 LMG2296(Zimbabew) P. saceharophila KCTC2350 R. solanacearum race 1 LMG17138(Brazil) P. maltrophilia KCTC2437 R. solanacearum race 1 LMG17144(Fidji) P. syringae KCTC2440 R. solanacearum race 1 KACC10695(Korea) P. diminute KCTC2473 R. solanacearum race 1 KACC10697(Korea) P. cepacia KCTC2475 R. solanacearum race 3 LMG2294(Colombia) P. reactans ATCC14340 R. solanacearum race 3 LMG2300(Isreal) P. tolaasii ATCC33618 R. solanacearum race 3 LMG2306(Portugal) P. savastanoi pv. phaseolicola LMG2245 R. solanacearum race 3 LMG17142(UK) P. savastanoi pv. glycinea LMG5144 R. solanacearum race 3 KACC10699(Korea) P. syringae pv. tomato LMG5509 P. agarici KACC10143 P. syringae pv. pisi LMG5679 P. viridifova KACC10523 P. syringae pv. syringae CNUPBL0023 P. syringae pv. atrotacients KACC11626 P. syringae pv. hibisci CNUPBL0024 P. syringae pv. maculicola KACC11637 P. syringae pv. morsprunum CNUPBL0025 P. taetrolens KCTC1064 P. syringae pv. actinidiae CNUPBL0026 P. stutzeri KCTC1066 P. syringae pv. lachrymans CNUPBL1557 P. aeruginosa KCTC1637 P. syringae pv. tabaci CNUPBL1559 P. acidovorans KCTC1638 X. oryzae pv. oryzae KACC10331 P. putida KCTC1639 P. carotovora subsp. carotovora KACC10342 P. arvilla KCTC1643 X. campestris pv. vesicatoria KACC11153 P. fluorescens KCTC1751 R. fascians LMG3601 P. testosterone KCTC1772 C. michiganesis subsp. michigenesis LMG3687 P. fragi KCTC2345 X. campestris pv. glycines LMG8026 P. paucimobilis KCTC2346 X. campestris pv. campestris CNUPBL0260 P. pseudoacaligenes KCTC2347 a R, Ralstonia; P, Pseudomonas; X, Xanthomonas; B, Bacillus; R, Rhodococcus; P, Pectobacterium; C, Clavibacter. b LMG, Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms; KACC, Korean Agricultural Culture Collection; KCTC, Korean Collection for Type Cultures, ATCC, American Type Culture Collection; CNUPBL, Chungbuk National University Plant Bacteriology Lab.

3 186 조정희 임규옥 이혁인 백지현 차재순 양한현탁액을 Exgene TM cell SV(GeneAll, Korea) 을이용하여 DNA를추출하였고, 추출된 Genomic DNA의정량은 Qubit TM fluorometer(invitrogen TM, USA) 을이용하였다. 추출한 DNA는 20ºC에서보관하여실험에사용하였다. 프라이머의제작을위해 GeneBank에보고된 Ralstonia sp. 16S rdna 염기서열 (HQ ) 을 Primer3 프로그램을이용하여증폭크기가 401 bp가되도록 RS-JH-F (5'-TYAMAMAYGMARGYCRARCR-3') 와 RS-JH-R(5'- TYTYTMCRGRCRARARTRCY-3') 을제작하였고, PCR의검출민감도를높이기위해서 1 st PCR의증폭영역의내부의염기서열을이용하여 RS-JH-F-ne(5'-AYGRCYTRA- RGRTRAMARTR-3') 와 RS-JH-R-ne(5'-GYTYAYCRTYC- YCYCRGMCY-3') 의 nested PCR용프라이머를디자인하였다. 모든프라이머는바이오니아 (BioNeer Co., Korea) 에서합성을하였다. PCR 조건. R. solanacearum 검출을위한모든 PCR 실험은 Accupower HotStart PCR용 PreMix(BioNeer Co., Korea) 와 GeneAmp PCR system2400(perkin Elmer, USA) 를이용하여수행하였다. 1 st PCR에는 10 ng의 genomic DNA를사용하였고, 증폭된 1 st PCR 산물을 10배희석후 1 µl를 nested PCR에사용하였다. 병원균의 DNA를사용하지않는 direct PCR법에는인공오염시킨토마토및고추의종자추출액을 PCR 실험에사용하였다. 종자추출액 1 µl을 1 st PCR에사용하였고, nested PCR에는 1 st PCR 산물을 10배희석후그희석액 1µl를사용하였다. PCR 조건은 1 st PCR, nested PCR, direct PCR에모두동일하였다 ; 94ºC에서 10분간전처리한후, 94ºC에서 30초, 58ºC 에서 30초, 72ºC에서 30초로 30 cycle을수행한뒤 72ºC 에서 5분간처리하였다. 검출민감도를조사하기위해 DNA 농도를 10 ng/µl로조정한후 10배희석법을이용하여 DNA 를희석하고각희석액으로 PCR을수행하였다. 종자추출액을이용한 PCR의민감도검정은 R. solanacearum을각각의농도별로인공오염시킨종자로부터조제한종자추출액 1µl씩을 PCR 반응에사용하였다. 종자추출액조제. 종자추출액은기존에보고된조등 (2010) 의방법을사용하여조제하였다. 토마토및고추종자를오염시키기위해서 R. solanacearum을 28ºC에서 48시간배양후세균배양액을 OD 600 =0.1으로맞춘후 10배희석법으로세균을희석하여현탁액을준비하였다. 준비된세균현탁액들의 20 ml에토마토및고추종자각각 1g씩넣고 24시간동안 28ºC의배양기에서 200 rpm 조건으로진탕배양후상온에건조시켰다. ELISA 및반선택배지를이용한검출민감도조사. 인공오염시킨토마토와고추종자추출액을이용하여반 선택배지와 ELISA, PCR 검정을수행하여각방법의검 출민감도를비교하였다. R. solanacearum 반선택배지를이용한검출은 m-smsa 배지 (Casamino acid 1 g, Peptone 10 g, Glucose 5 g, Agar 16 g, Crystal violet 1% 0.5 ml, Polymyxin B sulfate 1% 10 ml, Bacitracin 1% 2.5 ml, Chloromycetin 1% 0.5 ml, Penicillin 0.1% 0.5 ml, Cycloheximide 1% 2.5 ml) 에준비한종자추출액을 100 µl 씩도말하여 28 o C에서 3일간배양하였다. 배양 3일후전형적인모양의콜로니를 positive(+) 반응으로, 아무것도자라지않는것을 negative( ) 반응으로판별하여검출한도를조사하였다. ELISA에의한검출은 R. solanacearum full kit(kisan Biotech, Korea) 와키트가제공하는프로토콜을이용하여 TAS-ELISA 방법으로수행하였다. 실험에서 positive control은키트에서제공된 R. solanacerum의현탁액을이용하였고, O.D. 405 nm의파장에서 3.0 이상을 positive contol로하였다. Negative control은키트에서제공된샘플을이용하였으며, O.D. 405 nm의파장에서 0.03 이하인것을 negative control로하였다. O.D. 405 nm 의파장에서 0.1 이상의값을가진것을 positive(+) 반응으로인정하고 0.1 미만의값이나온것을 negative( ) 반응으로인정하여검출한계농도를조사하였다. 개발한프라이머를이용한 direct PCR의검출한계농도를기존의검출방법들과비교하기위해인공오염시킨종자를이용하여조제한종자추출액 1µl씩을이용하여 1 st PCR과 nested PCR을수행하였다. 결과 PCR 프라이머의특이성및민감도. 본연구에서개발된 Ralstonia solanacearum 검출용프라이머의특이성을확인하기위하여서로다른국가에서분리된 R. solanacearum race 1, 5개균주와 race 3, 5개균주, Pseudomonas 속세균들그리고주요식물세균병원균의 DNA를이용하여 PCR을수행하였다. PCR 결과 R. solanacearum race 1과 race 3의모든균주의 DNA로부터약 401 bp 크기의밴드가증폭되는것을확인할수있었다 (Fig. 1). 그러나 R. solanacearum 이외의 Pseudomonas 속의균주와주요식물병원세균균주의 DNA에서는어떤 DNA 밴드도증폭되지않았다 (Fig. 1). 낮은농도로감염되어있는종자전염병원세균의검출에적합하도록 PCR 검출의민감도를높이기위해서 1 st PCR 프라이머 RS- JH-F와 RS-JH-R의내부영역에서디자인한 nested PCR 용프라이머인 RS-JH-F-ne와 RS-JH-R-ne을이용하여 PCR 을수행하였을때, 모든 R. solanacearum 균주들에서약

가지과종자에서 Ralstonia solanacearum 의검출을위한 PCR 방법 187 Fig. 1. PCR was carried out with primers RS-JH-F, RS-JH-R and bacterial DNA. Lane 1 5: R. solanacearum race 1 strains, 6 10: R.

P. putida, 20. P. arvilla, 21. P. fluorescens, 22. P. testosterone, 23. P. fragi, 24. P. paucimobilis, 25. P. pseudoacaligenes, 26. R. solanacearum race 3 LMG2294, 27. P. saceharophila, 28. P. maltrophilia, 29.

P. syringae pv. syringae, 39. P. syringae pv. hibisci, 40. P. syringae pv. morsprunum, 41. P. syringae pv. actinidiae, 42. P. syringae pv. lachrymans, 43. P. syringae pv. tabaci, 44. X. oryzae pv.

4 가지과종자에서 Ralstonia solanacearum 의검출을위한 PCR 방법 187 Fig. 1. PCR was carried out with primers RS-JH-F, RS-JH-R and bacterial DNA. Lane 1 5: R. solanacearum race 1 strains, 6 10: R. solanacearum race 3 strains, 11. P. agarici, 12. P. viridifova, 13. P. syringae pv. atrotacients, 14. P. syringae pv. maculicola, 15. P. taetrolens, 16. P. stutzeri, 17. P. aeruginosa, 18. P. acidovorans, 19. P. putida, 20. P. arvilla, 21. P. fluorescens, 22. P. testosterone, 23. P. fragi, 24. P. paucimobilis, 25. P. pseudoacaligenes, 26. R. solanacearum race 3 LMG2294, 27. P. saceharophila, 28. P. maltrophilia, 29. P. syringae, 30. P. diminute, 31. P. cepacia, 32. P. reactans, 33. P. tolaasii, 34. P. savastanoi pv. phaseolicola, 35. P. savastanoi pv. glycinea, 36. P. syringae pv. tomato, 37. P. syringae pv. pisi, 38. P. syringae pv. syringae, 39. P. syringae pv. hibisci, 40. P. syringae pv. morsprunum, 41. P. syringae pv. actinidiae, 42. P. syringae pv. lachrymans, 43. P. syringae pv. tabaci, 44. X. oryzae pv. oryzae, 45. P. carotovora subsp. carotovora, 46. X. campestris pv. vesicatoria, 47. R. fascians, 48. C. michiganesis subsp. michigenesis, 49. X. campestris pv. glycines, 50. X. campestris pv. campestris. Fig. 2. PCR were carried out with primers and 10 ng DNA purified from the extract of Solanaceae seeds. Lane 1: R. solanacearum race 1 KACC10695, 2 4: tomato seed DNA, 5 9: pepper seed DNA. (A) PCR was carried out RS-JH-F/R, (B) Neseted-PCR was carried out RS-JH-F/R-ne. Fig. 3. PCR was carried out with primers, RS-JH-F, RS-JH-R, and 10ng of DNA of R. solanacearum race 3 KACC10699 (1) and its 10- fold serial dilution (2 6) (A). Nested PCR was carried out with primers, RS-JH-F-ne, RS-JH-R-ne and 1 µl of 10 times dilution of 1 st PCR product (B).

5 188 조정희 임규옥 이혁인 백지현 차재순 Table 2. Detection of Ralstonia solanacearum in the artificially inoculated Solanaceae seeds by semi-selective medium, ELISA and PCR assays Bacterial concentration (CFU/ml) of inoculum Assay a msmsa TAS-ELISA st PCR Nested PCR a Positive reaction (+), Negative reaction ( ). 131 bp 크기의 DNA가증폭되였다 (data not shown). 본연구에서개발된프라이머가가지과종자 DNA를주형으로 DNA를증폭시킬가능성을확인하기위해토마토 4품종과고추 4품종, 총 8품종의가지과종자 DNA를추출하여 PCR을수행한결과, 실험에사용한모든가지과종자 DNA로부터어떤 DNA도증폭되지않는것을확인할수있었다 (Fig. 2). 풋마름병병원균검출 PCR 민감도를확인하기위해서 DNA를 10 ng 기준으로 10배씩희석하여 PCR을수행하였다. PCR 결과 10 ng의 1000배희석액인 0.01 ng까지특이적 DNA인 401 bp의밴드가증폭되는것을확인하였다 (Fig. 3). 1 st PCR의증폭산물을 10배희석후그희석액 1µl을사용하여 Nested PCR을수행한결과 1 st PCR의보다민감도가 100배증가하는것을확인하였다 (Fig. 3). 가지과종자에서병원균검출. 토마토와고추종자에 R. solanacearum의세균현탁액을 10배희석법으로희석하여농도별로접종후, 종자추출액을이용하여각방법의검출한계농도를비교조사하였다. 반선택배지인 msmsa 에서는배양 72시간후에 R. solanacearum의전형적인콜로니가나타나는것을확인하였고, 배양 4일후부터병원균접종농도 10 3 CFU/ml까지검출이가능하였다 (Table 2). TAS-ELISA을이용하여풋마름병병원균검출결과접종농도 10 3 CFU/ml의종자까지 positive(+) 반응을확인하였고, 토마토와고추종자모두에서동일한민감도를보였다 (Table 2). 본연구에서새롭게개발된프라이머를사용하여 1 st PCR을수행한결과다른두가지의검출법과동일한검출농도인 10 3 CFU/ml까지검출이가능하였다. 1 st PCR의증폭산물을이용하여 nested PCR을수행한결과접종농도 10 CFU/ml까지검출이가능하였다. 이결과는 nested PCR의검출민감도가선택배지, TAS-ELISA 그리고일반 PCR법보다 100배높다는것을의미한다. 고찰 종자전염세균병의경우매우낮은농도의종자감염 에의해서도발병이적합한환경조건에서매우빠르게전반하여심각한피해를가져온다. 또한오염종자는발생하지않는지역에새로운병원균이도입되는매우중요한수단이다. 따라서종자로부터발생하는세균병의피해를최소화하고종자를통해새로운병원균이도입되는것을막기위해서는종자로부터신속하고정확한병원균검출법이필요하다 ( 조등, 2010; Kritzman, 1991). 풋마름병은경제적으로매우중요한작물에서심각한피해를가져오는병으로병원균인 R. solanacearum은세계의여러나라에서검역대상병원균이며, 우리나라에서도식물검역법상규제비검역병으로지정되어관리되고있어종자로부터신속하고정확한검출법이필요하다. 본연구에서가장흔히사용하는 Ralstonia solanacearum 의검출법인반선택배지 (msmsa) 와 ELISA검출법을새롭게개발된 PCR 방법과비교하였다. 반선택배지의경우 R. solanacearum의 race의구별없이검출이가능하다는장점을가지고있지만, 전형적인병원균의콜로니를관찰하기위해서는최소 3일의시간이필요하였다. 또한 ELISA 의경우검출의민감도가낮은문제점이있었다. 이와같은문제점은기존에보고된연구에서도제기되었다 (Caruso 등, 2003; Kang 등, 2007; Priou 등, 2006). 이러한문제점을해결하기위해서다양한 PCR 방법들이개발되었지만, 오염된종자를대상으로풋마름병병원균을검출하는검출법은현재까지거의연구가되지않았다. Huang 등 (2009) 의연구에서는개발된 PCR 방법의경우 R. solanacearum race 1만을특이적으로검출할수있었고, Kang 등 (2007) 에의해개발된 PCR 검출법은 race 3만특이적으로검출할수있었다. 또한두방법모두일반 PCR 용프라이머만을사용했기때문에오염된종자에서풋마름병을검출하기에는검출민감도가낮다는단점을가지고있다. 현재까지오염된토양, 물등에서 R. solanacearum 을검출하는데많이사용되는프라이머인 OLI-1/OLI2을이용한 PCR 검출법의경우 nested PCR 방법까지개발되었지만다양한 race를대상으로실험을수행한결과, race 3만을특이적으로검출할수있었다 (Caruso 등, 2003;

6 가지과종자에서 Ralstonia solanacearum 의검출을위한 PCR 방법 189 Poussier 등, 2002; Pradhanang 등, 2000). PCR 검출법중 TaqMan probe를이용한 real-time PCR 검출법 (Huang 등, 2009; Weller 등, 2000) 은높은민감도와거짓양성반응을막을수있다는장점을가지고있지만, 비용이많이들고특별한 probe를제작해야되는단점들때문에실제적으로검역현장및종자검사에서사용되지못하고있다. 본연구에서는 16S ribosomal DNA의염기서열을이용하여 PCR 프라이머를제작하였다. 16S rdna의경우세균에서고유의기능을잘보존하고있는부분이기때문에다양한세균을특이적으로검출하는프라이머를개발하는데적합한것으로알려져왔다 (Jeng 등, 2001; Saglani 등, 2005). 본연구에서개발한 PCR과 nested PCR용프라이머는한번의 PCR로 R. solanacearum race 1과 race 3 균주을특이적으로검출이가능하며, 가지과종자 DNA 와는반응하지않는다. 또한본연구에서는 DNA의추출없이종자추출액을직접 PCR에이용하는방법을제시하였다. 종자추출액을직접 PCR에이용하는방법은, DNA를사용하는 PCR 방법들 (Kang 등, 2007; Poussier 등, 2002; Schonfeld 등, 2003) 에비해시간을절약할수있고 DNA 오염에의해나타날수있는거짓양성반응을방지할수있는장점을가졌다. 따라서본연구에서개발된 PCR 방법은가지과종자로부터신속하고정확하게 R. solanacearum의검출에이용될수있을것으로생각된다. 요약 Ralstonia solanacearum은풋마름병 (bacterial wilt) 을일으키는종자전염병원세균으로한번발생하면방제가매우어려운병이다. 따라서 Ralstonia solanacearum는한국을비롯한여러나라에서식물검역병으로지정되어있다. 본연구에서는가지과종자로부터 Ralstonia solanacearum 검출할수있는 PCR 방법을개발하였다. 프라이머 RS- JH-F와 RS-JH-R는오직 Ralstonia solanacearum race 1, 3 으로부터 401 bp 크기의 DNA를증폭하였다. 1차 PCR 증폭산물의내부에서디자인된 nested PCR 프라이머인 RS-JH-F-ne and RS-JH-R-ne는오직 Ralstonia solanacearum 로부터 131 bp 크기의 DNA를증폭하였다. 이들프라이머들은토마토, 고추를포함한가지과종자추출액으로부터어떤비특이적 DNA도증폭하지않았다. 인공적으로병원균을접종한가지과종자를이용하여병원균검출민감도를비교하였을때, 본연구에서개발한 nested PCR 방법이 ELISA나반선택배지보다 100배높은민감도를보여주었다. 따라서, 본연구에서개발한 PCR 방법들은가지과종자로부터 Ralstonia solanacearum를검출하는매 우유용한방법으로생각된다. Acknowledgement This work was supported by National Plant Quarantine Service, Republic of Korea. 참고문헌 조정희, 정민정, 송민지, 임규옥, 이혁인, 김정희, 백지현, 차재순 강낭콩종자에서 Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola 의검출을위한 PCR 프라이머의개발. 식물병연구 16: Caruso, P., Bertolini, E., Cambra, M. and Lopez, M. M A new and sensitive co-operational polymerase chain reaction for rapid detection of Ralstonia solanacearum in water. J. Microbiol. Methods 55: Caruso, P., Gorris, M. R., Cambra, M., Palomo, J. L., Collar, J. and Lopez, M. M Enrichment double antibody sandwich indirect enzyme linked immunosorbent assay that uses a specific monoclonal antibody for sensitive detection of Ralstonia solanacearum in asymptomatic potato tubers. Appl. Environ. Microbiol. 68: Engelbrecht, M. C Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10: 3 5. Huang, J., Wu, J., Li, C., Xiao, C. and Wang, G Specific and sensitive detection of Ralstonia solanacearum in soil with quantitative, real-time PCR assays. J. Appl. Microbiol. 107: Janse, J. D A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and som data on its sensitivity and specificity. Bull OEPP 18: Jeng, R. S., Svircev, A. M., Myers, A. L., Beliaeva, L., Hunter, D. M. and Hubbes, M The use of 16S and 16S-23S rdna to easily detect and differentiate common gram-negative orchard epiphytes. J. Microbiol. Methods 44: Kang, M. J., Lee, M. H., Shim, J. K., Seo, S. T., Shrestha, R., Cho, M. S., Hahn, J. H. and Park, D. S PCR-based specific detection of Ralstonia solanacearum by amplification of cytochrome c1 signal peptide sequences. J. Microbiol. Biotechnol. 17: Kritzman, G A method for detection of seedborne bacterial diseases in tomato seeds. Phytoparasitica 19: Lee, Y. A., Fan, S. C., Chiu, L. Y. and Hsia, K. C Isolation of an insertion sequence from Ralstonia solanacearum race 1 and its potential use for strain characterization and detection. Appl. Environ. Microbiol. 67: Poussier, S., Cheron, J. J., Couteau, A. and Luisetti, J Evaluation of procedures for reliable PCR detection of

7 190 조정희 임규옥 이혁인 백지현 차재순 Ralstonia solanacearum in common natural substrates. J. Microbiol. Methods 51: Pradhanang, P. M., Elphinstone, J. G. and Fox, R. T. V Sensitive detection of Ralstonia solanacearum in soil: a comparison of different detection techniques. Plant Pathol. 49: Priou, S., Gutarra, L. and Aley, P An improved enrichment broth for the sensitive detection of Ralstonia solanacearum (biovars 1 and 2A) in soil using DAS-ELISA. Plant Pathol. 55: Saglani, S., Harris, K. A., Wallis, C. and Hartley, J. C Empyema: the use of broad rage 16s rdna PCR for pathogen detection. Arch. Dis. Child. 90: Saile, E., McGarvey, J. A., Schell, M. A. and Denny, T. R Role of extracellular polysaccharide and endoglucanase in root invasion and colonization of tomato plants by Ralstonia solanacearum. Phytopathol. 87: Schonfeld, J., Heuer, H., Van Elsas, J. D. and Smalla, K Specific and sensitive detection of Ralstonia solanacearum in soil on the basis of PCR amplification of filc fragments. Appl. Environ. Microbiol. 69: Van der Wolf, J. M., Van Beckhoven, J. R. C. M., Haan, E. G. De., Van den Bovenkamp, G. W. and Leone, G. O. M Specific detection of Ralstonia solanacearum 16S rrna sequences by ampilidet RNA. Euro. J. Plant Pathol. 110: Weller, S. A., Elphinstone, J. G., Smith, N. C., Boonham, N. and Stead, D. E Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay. Appl. Environ. Microbiol. 66: Wullings, B. A., Van Beuningen, A. R., Janse, J. D. and Akkermans, A. D. L Detection of Ralstonia solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23S rrna targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64:

Research in Plant Disease Vol. 21 No A. citrulli Pseudomonas,, 16S rrna Acidovorax (Willems, 1990). A. citrulli (Latin, 1995; Schaad, 2003). A.

Research in Plant Disease Vol. 21 No A. citrulli Pseudomonas,, 16S rrna Acidovorax (Willems, 1990). A. citrulli (Latin, 1995; Schaad, 2003). A. 식물병연구 Research Article Open Access Res. Plant Dis. 21(2) : 74-81(2015) http://dx.doi.org/10.5423/rpd.2015.21.2.074 Acidovorax citrulli nested-pcr Development of Nested-PCR Assay to Detect Acidovorax citrulli,