최종보고서정책 - 식품 -2004-56 어묵류등 6 개 HACCP 의무적용품목의 위해관리지침서개발 ( 구축편 ) Development of Guidelines on the Hazard Control of Mandatory HACCP Application Food Items(Establishment) 한국보건산업진흥원 식품의약품안전청
제출문 식품의약품안전청장 귀하 이보고서를 어묵류등 6 개의무적용품목의위해관리지침서개발 ( 한국보 건산업진흥원 / 천석조 ) 과제의연구결과보고서로제출합니다. 2004. 11. 주관연구기관명 : 한국보건산업진흥원 주관연구책임자 : 천석조 제 1세부과제명 : 위해관리지침서개발 ( 제1세부연구기관 / 세부과제책임자 ): 한국보건산업진흥원 / 천석조 연 구 원 : 유의형, 김성조심우창, 노민정김기향, 이영덕조현경, 윤미옥 제 2세부과제명 : 화학적미생물학적위해요소분석 ( 제2세부연구기관 / 세부과제책임자 ) : ( 주 )CJ/ 박희경 연 구 원 : 유보경, 신혜원신한승, 양현석이용관, 박지영김동규, 엄지은이선인
연구사업최종보고서요약문 연구과제명 어묵류등 6 개 HACCP 의무적용품목의위해관리지침서개발 중심단어 위해정보자료 주관연구기관한국보건산업진흥원주관연구책임자천석조 연구기간 2004. 4. 16-2004. 11. 30 본연구는어묵류등 6개의무적용대상영업자들의 HACCP 적용에대한이해를돕고중. 소규모업소에서도보다쉽게 HACCP 계획을수립, 적용할수있도록식품별로발생할가능성이있는위해요소를효율적으로관리할수있는방법등에관하여지침서를제공함으로서 HACCP 의무적용대상업소의 HACCP 시스템도입을활성화시키고식품안전성을제고하는데목적이있다. 위해요소분석을위하여식품별원료및제조공정에서의위해요소관련자료를수집하여정리하였으며, 원료제조공정및제조환경에서의위해요소발생현황을파악하기위하여생물학적, 화학적위해요소분석시험을실시하였다. 그결과원료및제조공정에서타르색소, 보존료는검출되지않았으나 Staphylococcus aureus, L. monocytogenes와같은일부병원성미생물이검출되었으며, 가공용수, 제조설비, 주위환경, 작업자등에서대장균군과곰팡이가검출되어원료및공정품으로교차오염우려가있는것으로판단되었다. HACCP 계획의개발을위하여제품설명서및제조공정도를작성하였으며위해분석을위한시험및관련자료의수집, 생산업체담당자의자문등을통하여위해요소목록표를작성하였다. 또한중요관리점결정도를활용하여중요관리점을설정하였다. 이에따라중요관리점에따른한계기준의설정, 중요관리점을관리하기위한모니터링방법의설정, 이탈시개선조치의확립및검증, 기록등 HACCP의기본적인 7원칙에따라어묵류등 6개의무적용품목생산공장에서 HACCP 시스템을개발하는데활용할수있는품목별 HACCP 위해관리지침서를개발하였다. - 5 -
Project Summary Title of Project Development of Guidelines on the Hazard Control of Mandatory HACCP Application Food Items Key Words HACCP plan, Mandatory HACCP Application Food Items Institute Korea Health Industry Development Institute Project Leader Chun, Seok Jo Project Period 2004. 4. 16-2004. 11. 30 The objective of this study was to provide guidelines on the control for understanding HACCP in mandatory HACCP application industries and help establishment of HACCP plan in small business. In order to investigate biological and chemical s, microbiological tests and several chemical tests were conducted for a food item from the mandatory HACCP application items(six items containing retorted foods). Tar color and preservatives were not detected from any of the raw materials and products. However Staphylococcus aureus and L. monocytogenes were some producing food. Several critical control points have been identified by analysis of biological, chemical, and physical s. It was suggested that a HACCP plan for practice of HACCP in the production of each item. The HACCP plans of each food items proposed through this study can be used to practice HACCP in six items industries to ensure food safety. However HACCP team of each plant should modify this HACCP plan to establish their own HACCP system to use in their own operations. - 6 -
어묵류등 6개의무적용품목의위해관리지침서개발차례 제출문 / 3 연구사업최종보고서요약문 / 5 Project Summary / 6 제 1 장서론 / 17 제 2 장국내 외기술개발현황 / 23 제 3 장연구개발수행내용및결과 / 29 제 1 절 6 개의무적용품목제조업체의위생관리현황 27 1. 조사방법 27 2. 6 개의무적용품목제조업체현황 27 가. 규모및종사자 27 나. 시험 분석실 28 다. 위생관리 29 라. 인증의종류와현황 제 2 절어묵류등 6 개의무적용품목의제조공정별위해요소분석시험 35 1. 실험방법 35 가. 시료채취 35 나. 시료의전처리 35 다. 미생물분석방법 35 라. 이화학적분석방법 46 2. 재료별분석항목 60 가. 비가열음료 61 나. 빙과류 63 다. 냉동수산식품 65 라. 냉동식품 67 마. 어묵류 69 바. 레토르트식품 71 3. 식품별위해요소분석시험결과 73 가. 비가열음료 73 나. 빙과류 81 다. 냉동수산식품 88 라. 냉동만두류 95 마. 어묵류 103 바. 레토르트식품 110 제 3 절어묵류등 6 개의무적용품목의 HACCP 계획작성방법 118 1. HACCP 계획의작성원칙 118-7 -
2. HACCP 계획작성의세부내용 118 가. HACCP 팀구성 118 나. 제품설명서작성 123 다. 제조공정설비도면의작성 124 라. 위해요소분석 124 마. 중요관리점결정 127 바. 한계기준설정 129 사. 모니터링절차확립 129 아. 개선조치확립 130 자. 검증절차확립 131 차. 기록유지및문서화절차확립 131 제 4 절어묵류등 6 개의무적용품목의 HACCP 계획개발 133 1. 비가열음료 133 가. 관련자료 133 나. 비가열음료의 HACCP 계획실례 137 2. 빙과류 146 가. 관련자료 146 나. 빙과류의 HACCP 계획실례 148 3. 냉동수산식품 160 가. 냉동어류 160 나. 냉동연체류 171 다. 조미가공품 181 1) 관련자료 181 2) 조미가공식품의 HACCP 계획실례 192 4. 냉동식품 205 가. 냉동만두류 205 나. 냉동면류 226 1) 관련자료 226 2) 냉동면류의 HACCP 계획실례 230 다. 냉동피자류 241 5. 어묵류 252 가. 관련자료 252 나. 찐어묵의 HACCP 계획실례 256 다. 튀김어묵 HACCP 계획실례 270 라. 건조어묵 HACCP 계획실례 285 6. 레토르트식품 299 가. 관련자료 299 나. 레토르트식품의 HACCP 계획실례 309 제 4 장연구개발목표달성도및대외기여도 / 319 제 5 장연구개발결과의활용성과및계획 / 320 제 6 장기타중요변경사항 / 321-8 -
제 7 장참고문헌 / 322 < 부록 > 6 개의무적용품목제조업체의 HACCP 적용을위한현황파악기초조사서 / 326-9 -
어묵류등 6 개의무적용품목의위해관리지침서개발표차례 표 1 어묵류등 6개품목에대한위해요소분석개요 60 표 2 비가열음료의제품에서상되는위해요소 61 표 3 빙과류제품에서상되는위해요소 67 표 4 냉동수산식품제품에서상되는위해요소 61 표 5 냉동만두류제품에서상되는위해요소 67 표 6 어묵류제품에서상되는위해요소 69 표 7 레토르트식품제품에서상되는위해요소 71 표 8 비가열음료의원료에대한일반미생물분석결과 73 표 9 비가열음료의원료에대한병원성미생물분석결과 74 표 10 비가열음료의원료에대한화학적위해요소분석결과 74 표 11 비가열음료의제조공정에대한일반미생물분석결과 76 표 12 비가열음료의제조공정에대한병원성미생물분석결과 77 표 13 비가열음료의제조환경에대한일반미생물분석결과 78 표 14 비가열음료의제조환경에대한병원성미생물분석결과 79 표 15 비가열음료의제품에대한일반미생물분석결과 80 표 16 비가열음료의제품에대한병원성미생물분석결과 80 표 17 비가열음료의제품에대한화학적위해요소분석결과 80 표 18 빙과류의원료에대한일반미생물분석결과 81 표 19 빙과류의원료에대한병원성미생물분석결과 82 표 20 빙과류의원료에대한화학적위해요소분석결과 83 표 21 빙과류의제조공정에대한일반미생물분석결과 84 표 22 빙과류의제조공정에대한병원성미생물분석결과 84 표 23 빙과류의제조환경에대한일반미생물분석결과 85 표 24 빙과류의제조환경에대한병원성미생물분석결과 86 표 25 빙과류의제품에대한일반미생물분석결과 86 표 26 빙과류의제품에대한병원성미생물분석결과 87 표 27 빙과류의제품에대한화학적위해요소분석결과 87 표 28 냉동수산식품의원료에대한일반미생물분석결과 88 표 29 냉동수산식품의원료에대한병원성미생물분석결과 89 표 30 냉동수산식품의원료에대한화학적위해요소분석결과 89 표 31 냉동수산식품의제조공정에대한일반미생물분석결과 90 표 32 냉동수산식품의제조공정에대한병원성미생물분석결과 91 표 33 냉동수산식품의제조환경에대한일반미생물분석결과 92 표 34 냉동수산식품의제조환경에대한병원성미생물분석결과 93 표 35 냉동수산식품의제품에대한일반미생물분석결과 93 표 36 냉동수산식품의제품에대한병원성미생물분석결과 94 표 37 냉동수산식품의제품에대한화학적위해요소분석결과 94 표 38 냉동식품의원료에대한일반미생물분석결과 95 표 39 냉동식품의원료에대한병원성미생물분석결과 96-10 -
표 40 냉동식품의원료에대한화학적위해요소분석결과 97 표 41 냉동식품의제조공정에대한일반미생물분석결과 98 표 42 냉동식품의제조공정에대한병원성미생물분석결과 99 표 43 냉동식품의제조환경에대한일반미생물분석결과 100 표 44 냉동식품의제조환경에대한병원성미생물분석결과 101 표 45 냉동식품의제품에대한일반미생물분석결과 101 표 46 냉동식품의제품에대한병원성미생물분석결과 102 표 47 냉동식품의제품에대한화학적위해요소분석결과 102 표 48 어묵류의원료에대한일반미생물분석결과 103 표 49 어묵류의원료에대한병원성미생물분석결과 104 표 50 어묵류의원료에대한화학적위해요소분석결과 105 표 51 어묵류의제조공정에대한일반미생물분석결과 106 표 52 어묵류의제조공정에대한병원성미생물분석결과 106 표 53 어묵류의제조환경에대한일반미생물분석결과 107 표 54 어묵류의제조환경에대한병원성미생물분석결과 108 표 55 어묵류의제품에대한일반미생물분석결과 108 표 56 어묵류의제품에대한병원성미생물분석결과 109 표 57 어묵류의제품에대한화학적위해요소분석결과 109 표 58 레토르트식품의원료에대한일반미생물분석결과 110 표 59 레토르트식품의원료에대한병원성미생물분석결과 111 표 60 레토르트식품의원료에대한화학적위해요소분석결과 112 표 61 레토르트식품의제조공정에대한일반미생물분석결과 113 표 62 레토르트식품의제조공정에대한병원성미생물분석결과 113 표 63 레토르트식품의제조환경에대한일반미생물분석결과 114 표 64 레토르트식품의제조환경에대한병원성미생물분석결과 115 표 65 레토르트식품의제품에대한일반미생물분석결과 115 표 66 레토르트식품의제품에대한병원성미생물분석결과 116 표 67 레토르트식품의제품에대한화학적위해요소분석결과 116 표 68 HACCP 팀원이력시 121 표 69 비가열음료의제품설명서 137 표 70 비가열음료의공정별가공방법 139 표 71 비가열음료의원부재료별위해요소목록표 140 표 72 비가열음료의공정별위해요소목록표 141 표 73 비가열음료의중요관리점결정표 143 표 74 비가열음료의 HACCP 계획일람표 144 표 75 빙과류의제품설명서 148 표 76 빙과류의공정별가공방법 150 표 77 빙과류의원부재료별위해요소목록표 151 표 78 빙과류의공정별위해요소목록표 153 표 79 빙과류의중요관리점결정표 154 표 80 빙과류의 HACCP 계획일람표 156 표 81 냉동어류의제품설명서 160 표 82 냉동어류의공정별가공방법 162 표 83 냉동어류의원부재료별위해요소목록표 163-11 -
표 84 냉동어류의공정별위해요소목록표 164 표 85 냉동어류의중요관리점결정표 169 표 86 냉동어류의 HACCP 계획일람표 170 표 87 냉동연체류의제품설명서 171 표 88 냉동연체류의공정별가공방법 173 표 89 냉동연체류의원부재료별위해요소목록표 174 표 90 냉동연체류의공정별위해요소목록표 175 표 91 냉동연체류의중요관리점결정표 179 표 92 냉동연체류의 HACCP 계획일람표 180 표 93 냉동수산 ( 조미가공품 ) 의제품설명서 192 표 94 냉동수산 ( 조미가공품 ) 의공정별가공방법 194 표 95 냉동수산 ( 조미가공품 ) 의원부재료별위해요소목록표 195 표 96 냉동수산 ( 조미가공품 ) 의공정별위해요소목록표 198 표 97 냉동수산 ( 조미가공품 ) 의중요관리점결정표 202 표 98 냉동수산 ( 조미가공품 ) 의 HACCP 계획일람표 203 표 99 냉동만두류의제품설명서 205 표 100 냉동만두류의공정별가공방법 207 표 101 냉동만두류의원부재료별위해요소목록표 208 표 102 냉동만두류의공정별위해요소목록표 213 표 103 냉동만두류의중요관리점결정표 219 표 104 냉동만두류의 HACCP 계획일람표 224 표 105 냉동면류의제품설명서 230 표 106 냉동면류의공정별가공방법 232 표 107 냉동면류의원부재료별위해요소목록표 233 표 108 냉동면류의공정별위해요소목록표 234 표 109 냉동면류의중요관리점결정표 237 표 110 냉동면류의 HACCP 계획일람표 238 표 111 냉동피자류의제품설명서 241 표 112 냉동피자류의공정별가공방법 243 표 113 냉동피자류의원부재료별위해요소목록표 245 표 114 냉동피자류의공정별위해요소목록표 247 표 115 냉동피자류의중요관리점결정표 250 표 116 냉동피자류의 HACCP 계획일람표 251 표 117 찐어묵의제품설명서 256 표 118 찐어묵의공정별가공방법 258 표 119 찐어묵의원부재료별위해요소목록표 259 표 120 찐어묵의공정별위해요소목록표 261 표 121 찐어묵의중요관리점결정표 264 표 122 찐어묵의 HACCP 계획일람표 266 표 123 튀김어묵의제품설명서 270 표 124 튀김어묵의공정별가공방법 272 표 125 튀김어묵의원부재료별위해요소목록표 273 표 126 튀김어묵의공정별위해요소목록표 277 표 127 튀김어묵의중요관리점결정표 280-12 -
표 128 튀김어묵의 HACCP 계획일람표 282 표 129 건조어묵의제품설명서 285 표 130 건조어묵의공정별가공방법 287 표 131 건조어묵의원부재료별위해요소목록표 289 표 132 건조어묵의공정별위해요소목록표 292 표 133 건조어묵의중요관리점결정표 295 표 134 건조어묵의 HACCP 계획일람표 296 표 135 레토르트식품의제품설명서 309 표 136 레토르트식품의공정별가공방법 311 표 137 레토르트식품의원부재료별위해요소목록표 312 표 138 레토르트식품의공정별위해요소목록표 314 표 139 레토르트식품의중요관리점결정표 315 표 140 레토르트식품의 HACCP 계획일람표 316 그림차례 그림 1 HACCP 팀조직도시 120 그림 2 중요관리점결정도 128 그림 3 비가열음료의제조공정도 138 그림 4 빙과류의제조공정도 160 그림 5 냉동어류의제조공정도 171 그림 6 냉동연체류의제조공정도 157 그림 7 냉동수산 ( 조미가공품 ) 의제조공정도 192 그림 8 냉동만두류의제조공정도 205 그림 9 냉동면류의제조공정도 230 그림 10 냉동피자류의제조공정도 242 그림 11 찐어묵의제조공정도 257 그림 12 튀김어묵의제조공정도 271 그림 13 건조어묵의제조공정도 286 그림 14 레토르트식품의제조공정도 310-13 -
어묵류등 6개 HACCP 의무적용품목의위해관리지침서개발 ( 구축편 ) Development of Guidelines on the Hazard Control of Mandatory HACCP Application Food Items(Establishment) 한국보건산업진흥원 식품의약품안전청
제 1 장 서론 건강한삶과안전한먹거리에대한소비자의욕구가증대됨에따라식품위생에대한관심또한증가하게되었다. 하지만식중독의발생도증가하고있어서연도별식중독발생현황도증가추세이며발생건수및환자수가함께증가추세를나타내고있다. < 연도별식중독발생현황 > 연도별 발생건수 ( 건 ) 환자수 ( 명 ) 환자수 / 건 ( 명 ) 1996 81 2,797 34.5 1997 94 2,942 31.3 1998 119 4,577 38.5 1999 174 7,764 44.6 2000 104 7,269 69.8 2001 93 6,406 68.9 2002 78 2,980 38.2 2003 135 7,909 58.6 소비자보호원에서는 2001년냉동식품및비가열과실채소류즙 ( 녹즙 ) 의안전성실태에대한조사를하였으며그결과를보면냉동식품중만두류의경우조사대상만두류 10개중에서냉동전비가열만두류 1개제품에서대장균이양성으로나타났으며냉동전가열만두류 1개제품에서 1g당 120 cell의대장균군이검출되어서식품공전의기준에부적합한것으로조사되었다. 또한생선까스의경우는 7개중 1개의제품에서병원성리스테리아균이검출되어연도별로비교해보면이전보다오히려냉동식품의위생상태가불량해진것으로나타났다. < 냉동만두류의연도별대장균및대장균군검출제품수 > 구분 1990 년 1999 년 2001 년 대장균 9 개중불검출 16 개중불검출 10 개중 1 개 대장균군 9 개중불검출 16 개중 4 개 10 개중 2 개 - 17 -
녹즙의경우도병원성미생물은검출되지않았으나 17개제품중 12개제품이식품공전의일반세균수기준인 100,000이하 /ml의기준을초과하여기준에부적합한것으로나타나서제조업체의철저한위생관리가필요한것으로나타났다. 이에따라식품의안전성확보에대한필요성이어느때보다도요구되고있으며특히제조물책임법의방지대책으로서식품산업체에서의 HACCP 적용필요성이증가되고있다. HACCP 시스템은 1960년대초안전한우주식량을제조하기위하여 Pillsbury사에서최초로개발하였고 1993년 7월제 20차 Codex( 국제식품규격위원회 ) 위생분과위원회회의에서 HACCP 방식을식품위생의일반원칙으로채택하여각국에대하여 HACCP 개념을근거로한위생규격기준을권고하였으며미국, 일본, 캐나다, 유럽등세계각국에서이제도를도입하고있다. 우리나라에서도 1996년에식품위해요소중점관리기준을마련하여 HACCP 제도를도입하였다. 미국 FDA는 1995년 12월수산식품의가공에 HACCP의적용을의무화하는규정인 어류및수산식품의안전하고위생적인가공및수입절차 (21 CFR Part 123) 를공포하고이를 1997년 12월부터국내 외수산식품에강제적용토록하였으며 2001년 1월에는 HACCP; 주스의안전하고위생적인가공및수입절차 (21 CFR Part 120) 를공포하고규모에따라 2002년 1월부터 2004년 1월까지단계적으로강제적용토록하였다. 농무부식품안전검사국 (USDA Food Safety and Inspection Service : USDA/ FSIS) 에서도도축장, 식육처리장, 도계처리장및식육식품제조시설에 HACCP 규정을강제적으로도입하는규정을 1996년 7월최종고시하고 1998년 1월부터 2000년 1월까지단계적으로적용하였다. 일본에서는 1995년 5월 24일 HACCP 개념에따른 총합위생관리제조과정 의승인제도를도입하여유 유제품및식육제품 (1996년 5월 ), 어육연제품 (1997년 3월 ), 용기포장후가압가열살균식품 (1997년 11월 ), 청량음료수 (1999년 7월 ) 에적용하고있으며 2003년 6월까지 545개시설에서 861건에대하여승인이이루어졌다. 1998년 7월부터는 식품제조과정관리고도화에관한임시조치법 (HACCP 수법지원법 ) 을제정하여시행하고있으며식품의제조또는가공을하는자가 HACCP 수법을도입하기위하여시설의정비를하기위한계획즉고도화계획을작성하여지정인정기관의인정을받으면금융, 세제상의지원조치를받을수있으며 2003년 3월까지 150건의지원이이루어졌고, 20개의기관이지정인정기관으로인정을받았다. - 18 -
캐나다의경우는 1991년부터농무성 (Agriculture Canada : AC) 의식품안전강화계획 (Food Safety Enhancement Program : FSEP) 에의해 HACCP 제도를도입하였으며수산해양성 (Fisheries and Oceans Canada : DFO) 에서는 1992년 2월부터수산식품에대하여 HACCP에기초한품질관리프로그램 (Quality Management Program : QMP) 을시행하였다. 1997년 4월에는식품안전강화계획의효과적수행을위해농무성산하에캐나다식품감시청 (Canadian Food Inspection Agency : CFIA) 을창설하여품질관리프로그램과식품안전강화계획을통합관리하고있다. 유럽연합 (EU) 에서는지령 (Council Directive) 에의하여 HACCP에기초한 식품위생에관한지침 (93/43/EEC) 을제정하여 1995년 12월까지 EU 회원국에서법제화할것을규정하였으며, 수산식품, 식육및식육제품, 유 유제품등에대하여는개별적으로위생규제에관한 EU지령이제시됨으로써 HACCP 제도의실시를요구하고있다. 그리고 EU 지역내만이아니라 EU 지역내로수출하는식품을제조하고있는역외의식품제조시설에대해서도같은지령을적용하도록요구하고있다. 우리나라의경우는 1995년 12월식품위생법제32조의 2( 식품위해요소중점관리기준 ) 을신설하여법적근거를마련하고, 1996년 12월 식품위해요소중점관리기준 을제정하였다. 1998년 6월축산물위생관리업무가농림부로이관됨에따라 1998년 8월에는 축산물위해요소중점관리기준 을제정하였다. 식육가공품중햄류 소시지류 (1996년 12월 ), 어육가공품중어묵류 (1997년 10월 ), 냉동수산식품중어류 연체류 패류 갑각류 조미가공품 (1998년 2월 ), 유가공품중우유 발효유 가공치즈 자연치즈 (1998년 5월 ), 냉동식품중기타빵및떡류 면류 일반가공식품의기타가공품및빙과류 (1999년 6월 ), 유가공품중우유류 발효유류 가공유류 버터류 (2000년 2월 ), 집단급식소와식품접객업소의조리식품 도시락류 (2000년 10월 ), 식육가공품중포장육 (2001년 6월 ), 비가열음료및레토르트식품 (2002년 6월 ), 식육가공품중양념육류 분쇄가공육제품, 유가공품중저지방우유류 아이스크림류 (2002년 9월 ) 에대한 HACCP 관리기준을고시하였으며도축장의경우 HACCP의적용을의무화하고있다. 또한위해도가높은어육가공품중어묵류, 냉동수산식품중어류, 연체류, 조미가공품, 냉동식품중피자류, 만두류, 면류, 빙과류, 비가열음료, 레토르트식품의경우도시행시기는아직확정되지않았으나 HACCP을의무적용토록하고한다. 연도별 HACCP 적용업소지정및품목현황을보면약간의증가는있었지만크게증가하지는못하고있으며전체지정업소의수도 2004년 10월말현재 152개에불과 - 19 -
한실정이다. < 연도별 HACCP 적용업소지정및품목현황 > 연도 지정업소 지정품목 1997 3 6 1998 28(2) 30(4) 1999 6 7 2000 16(1) 16(1) 2001 9 13 2002 34(1) 61(1) 2003 35(6) 50(6) 2004 21(9) 36(10) 계 152(19) 219(22) ( ) : 지정취소업소수 이중어묵류등의무적용대상이되는 6개식품의 HACCP 적용업소지정현황을 보면현재 36개업소만이지정을받아서의무적용대상업소로상하고있는업소수 인 760개의 4.7% 만이 HACCP 적용업소지정을받고있는실정이다. < 의무적용대상품목의 HACCP 적용업소지정현황 > 품목 HACCP 지정업소 어육가공품 5 냉동수산식품 12 냉동식품 10 빙과류 3 비가열음료 3 레토르트식품 3 계 36 HACCP 시스템이식품산업과식품위생관련행정당국에대해서식중독을포함식품 에의해발생할수있는오염문제에대항할수있는가장강력한도구를제공하는것 - 20 -
에대해서는의심의여지가없으나문서화에시간이많이소요되며 HACCP 계획이너무복잡하고, 너무많은 CCP를설정하여수행이어렵다거나, 위해요소분석, 모니터링, 개선조치의설정등이어려운등의이유로인하여식품제조 가공업체에서는쉽게적용하기가어려운실정이다. 따라서위해도가높은일부품목의 HACCP 적용을의무화하고있는미국의경우해당제품의위해요소및이의관리방법에대한지침서를개발하여식품업체에제공하고있으며, 특히소규모업체를위한지원을하고있다. 우리나라식품산업체는매출액이 1억원미만인업체가 59.1% 를점하고있는반면, 1000억원이상인업체는 0.31% 에불과하지만매출액점유율로는 52% 를차지하고있어대부분이영세한기업구조를가지고있는것으로분석되어자체능력만으로 HACCP 시스템을적용하기는어려울것으로판단된다. < 매출액규모별업체현황 > 구 분 업체수 점유율 (%) 매출액 ( 십억원 ) 점유율 (%) 계 15,179 100.00 24,128 100.00 1 억원미만 8,964 59.06 232 0.96 1~5 억원 3,416 22.50 790 3.27 5~10 억원 1,018 6.71 715 2.97 10~20 억원 700 4.61 980 4.06 20~50 억원 601 3.96 1,875 7.77 50~100 억원 239 1.57 1,659 6.88 100~300 억원 133 0.88 2,297 9.52 300~500 억원 36 0.24 1,349 5.59 500~1000 억원 25 0.16 1,668 6.92 1000~2000 억원 30 0.20 4,495 18.63 2000~5000 억원 12 0.08 3,618 15.00 5000~1 조원 3 0.02 2,107 8.74 1 조원이상 2 0.01 2,335 9.68 * 법인업체수로집계하였으며, 축산물가공품은제외 우리나라의경우도식품의위생안전성확보에중요한역할을담당하는 HACCP 시 - 21 -
스템의적용활성화를위해서는정부차원의재정적, 법적지원과더불어식품업체가보다쉽게 HACCP시스템을도입할수있게하는방안의강구가꾸준히필요한실정이며, 특히 HACCP의적용이의무화되어있는어묵류등 6개품목의경우는중소업체에서도 HACCP의적용이가능하도록여러가지기술적인지원방안도마련되어야할것으로생각되어진다. 따라서본연구에서는 HACCP 의무적용대상업체에서보다쉽게 HACCP 시스템의구축및운영을할수있도록하기위하여각식품별로발생가능성이있는위해요소에대한목록을작성하고이들위해요소에대한관리방법을제시하며 HACCP 계획을수립하고적용하는데활용할수있는위해관리지침서를개발하고자한다. - 22 -
제 2 장 국내 외기술개발현황 HACCP란식품의안전성을확보하기위해특정위해를확인하고그위해에대한방적인관리방법을확립하는것으로공정자체를관리하므로최종제품의관리, 검사에의존하는기존의위생관리방법에비하여문제가발생하기전에조치가가능한경제적인안전성확보방법이다. HACCP 시스템은 1960년대초안전한우주식량을제조하기위하여 Pillsbury사에서최초로개발하였고, 1993년 7월제 20차 Codex( 국제식품규격위원회 ) 위생분과위원회회의에서 HACCP 방식을식품위생의일반원칙으로채택하여각국에대하여 HACCP 개념을근거로한위생규격기준을권고하였으며미국, 일본, 캐나다, 유럽등세계각국에서이제도를도입하고있다. 우리나라에서도 1996년에식품위해요소중점관리기준을마련하여 HACCP 제도를도입하였다. 미국 FDA는 1995년 12월수산식품의가공에 HACCP의적용을의무화하는규정인 어류및수산식품의안전하고위생적인가공및수입절차 (21 CFR Part 123) 를공포하고이를 1997년 12월부터국내 외수산식품에강제적용토록하였으며 2001년 1월에는 HACCP; 주스의안전하고위생적인가공및수입절차 (21 CFR Part 120) 를공포하고규모에따라 2002년 1월부터 2004년 1월까지단계적으로강제적용하고있다. 농무부식품안전검사국 (USDA Food Safety and Inspection Service : USDA/ FSIS) 에서도도축장, 식육처리장, 도계처리장및식육식품제조시설에 HACCP 규정을강제적으로도입하는규정을 1996년 7월최종고시하고 1998년 1월부터 2000년 1월까지단계적으로적용하였다. 이를위하여 HACCP 계획의개발을위한가이드북및도축장, 분쇄육등의육가공품등에대한약 13종의일반모델을개발하여제시하고있다. 일본에서는 1995년 5월 24일 HACCP 개념에따른 총합위생관리제조과정 의승인제도를도입하여유 유제품및식육제품 (1996년 5월 ), 어육연제품 (1997년 3월 ), 용기포장후가압가열살균식품 (1997년 11월 ), 청량음료수 (1999년 7월 ) 에적용하고있으며 2003년 6월까지 545개시설에서 861건에대하여승인이이루어졌다. 1998년 7월부터는 식품제조과정관리고도화에관한임시조치법 (HACCP 수법지원법 ) 을제정하여 - 23 -
시행하고있으며식품의제조또는가공을하는자가 HACCP 수법을도입하기위하여시설의정비를하기위한계획즉고도화계획을작성하여지정인정기관의인정을받으면금융, 세제상의지원조치를받을수있다. 2003년 3월까지 150건의지원이이루어졌으며이를위하여일본식육가공협회등 20개의기관이지정인정기관으로인정을받았으며각품목에대한 HACCP 매뉴얼이개발되어있다. 식품산업센터와전국제면협동조합연합회에서는면류에대한 HACCP 일반모델을개발하여제시하고있다. 캐나다의경우는 1991년부터농무성 (Agriculture Canada : AC) 의식품안전강화계획 (Food Safety Enhancement Program : FSEP) 에의해 HACCP 제도를도입하였으며수산해양성 (Fisheries and Oceans Canada : DFO) 에서는 1992년 2월부터수산식품에대하여 HACCP에기초한품질관리프로그램 (Quality Management Program : QMP) 을시행하였다. 1997년 4월에는식품안전강화계획의효과적수행을위해농무성산하에캐나다식품감시청 (Canadian Food Inspection Agency : CFIA) 을창설하여품질관리프로그램과식품안전강화계획을통합관리하고있으며축산물가공품, 저산성통조림등의가공식품, 유제품등에대한 HACCP 일반모델을개발하여제공하고있다. 유럽연합 (EU) 에서는지령 (Council Directive) 에의하여 HACCP에기초한 식품위생에관한지침 (93/43/EEC) 을제정하여 1995년 12월까지 EU 회원국에서법제화할것을규정하였으며수산식품, 식육및식육제품, 유 유제품등에대하여는개별적으로위생규제에관한 EU지령이제시됨으로써 HACCP 제도의실시를요구하고있다. 그리고 EU 지역내만이아니라 EU 지역내로수출하는식품을제조하고있는역외의식품제조시설에대해서도같은지령을적용하도록요구하고있다. 우리나라의경우는 1995년 12월식품위생법제32조의 2( 식품위해요소중점관리기준 ) 을신설하여법적근거를마련하고 1996년 12월 식품위해요소중점관리기준 을제정하였다. 1998년 6월축산물위생관리업무가농림부로이관됨에따라 1998년 8월에는 축산물위해요소중점관리기준 을제정하였다. 식육가공품중햄류 소시지류 (1996년 12월 ), 어육가공품중어묵류 (1997년 10월 ), 냉동수산식품중어류, 연체류, 패류, 갑각류, 조미가공품 (1998년 2월 ), 유가공품중우유, 발효유, 가공치즈, 자연치즈 (1998년 5월 ), 냉동식품중기타빵및떡류, 면류, 일반가공식품의기타가공품및빙과류 (1999년 6월 ), 유가공품중우유류, 발효유류, 가공유류, 버터류 (2000. 2) 집단급식소와식품접객업소의조리식품, 도시락류 (2000. 10), 식육가공품중포장육 (2001년 6 월 ), 비가열음료및레토르트식품 (2002년 6월 ), 식육가공품중양념육류, 분쇄가공육 - 24 -
제품, 유가공품중저지방우유류, 아이스크림류 (2002년 9월 ) 에대한 HACCP 관리기준을고시하였으며도축장의경우 HACCP의적용을의무화하고있다. 또한어육가공품중어묵류, 냉동수산식품중어류 연체류 조미가공품, 냉동식품중피자류, 만두류, 면류, 빙과류, 비가열음료, 레토르트식품의경우도 HACCP을의무적용을시행하고있다. 식품의약품안전청및농림부, 국립수의과학검역원에서는이들품목에대하여품 목별 HACCP 일반모델또는매뉴얼을개발하였으며식품의약품안전청에서는 김치절 임식품, 특수영양식품, 두부및묵류, 저산성통조림, 빵류, 건포류, 조미식품에대한일 반모델도개발 제시하고있다. - 25 -
제 3 장 연구개발수행내용및결과 제 1 절 6 개의무적용품목제조업체의 위생관리현황
제 3 장 연구개발수행내용및결과 제 1 절 6 개의무적용품목제조업체의위생관리현황 1. 조사방법 6개의무적용생산업체의현황및위생관리실태, HACCP에대한인식을파악하기위하여어묵류등 6개의무적용품목생산업체 18개에대한설문조사를실시하였다. 조사내용은공장규모, 종사자수등의제조업체현황과실험 분석실유무및실험 분석실의담당직원과시험장비보유현황, 위생관리방법으로교육형태및위생교육주기, 운용중인품질인증시스템등을포함한다. 2. 6 개의무적용품목제조업체현황 가. 규모및종사자 대지는 3 개업체가 200~1000 평미만, 8 개업체가 1,000~5,000 평미만, 2 개업 체가 5,000~10,000 평미만, 3 개업체가 100,000~300,000 평미만이었으며, 2 개업 체가응답하지않았다. 건평은 6개업체가 100~600평미만, 5개업체가 600~ 3,000평미만, 3개업체가 3,000~5,000평미만, 4개업체가 5,000~8,300평이내의규모를가지고있었다. 종사자수는 4개업체가 5명~50명미만, 6개업체가 50~ 100명미만, 6개업체가 100명~200명미만, 2개의업체가 200~320명가량의종사자를두고있는것으로조사되었다. - 29 -
대지 ( 평 ) 업체수통계 (%) 3 개업체 2 개업체 3 개업체 200~1000 미만 3 개 16.6 1,000~5,000 미만 8 개 44.4 5,000~10,000 미만 2 개 11.1 100,000~300,000 미만 3 개 16.6 무응답 2 개 11.1 2 개업체 8 개업체 200~1000 미만 1,000~5,000 미만 5,000~10,000 미만 100,000~300,000 미만 무응답 건평 ( 평 ) 업체수 통계 (%) 4개업체 6개업체 100~600 미만 6개 33.3 600~3,000 미만 5개 27.7 3,000~5,000 미만 3 개 16.6 3 개업체 5 개업체 5,000~8,300 4 개 22.2 100~600 미만 600~3,000 미만 3,000~5,000 미만 5,000~8,300 종사자수 ( 명 ) 업체수통계 (%) 5~50 미만 4 개 22.2 2 개업체 4 개업체 50~100 미만 6 개 33.3 100~200 미만 6 개 33.3 200~320 2 개 11.1 6 개업체 6 개업체 5~50 미만 50~100 미만 100~200 미만 200~320 나. 시험 분석실 시험 분석실이있는경우는 16개업체이고, 없는경우는 2개업체로나타났다. 시험 분석실이있는경우담당직원의수는 11개의업체 (61.1%) 가 1~5명을두고있는것으로가장많았고, 시험 분석실은있지만담당직원이없어실질적으로운영되지않는경우도 3개 (16.6%) 업체로높은비중을차지했다. 그밖에 5~10명미만, 10~15명이내의담당직원을두고있는업체가각 2개업체로조사되었다. - 30 -
분석실업체수통계 (%) 2 개업체 있다 16 개 88.8 16 개업체 없다 2 개 11.1 있다 없다 담당직원수업체수통계 (%) 2 개업체 2 개업체 3 개업체 0 3 개 16.6 1~5 미만 11 개 61.1 5~10 미만 2 개 11.1 11 개업체 10~15 2 개 11.1 0 1~5 미만 5~10 미만 10~15 미만 보유장비업체수통계 (%) 2 개업체 1 개업체 4 개업체 10 개미만 4 개 22.2 10~20 개 8 개 44.4 20~30 개 3 개 16.6 30~50 개 2 개 11.1 3 개업체 8 개업체 기타 1 개 5.5 10 개미만 10~20 개 20~30 개 30~50 개기타 다. 위생관리 종사자의위생교육의교육주기및교육형태에대해서질문한결과교육주기는 11 개업체가 1 개월로응답하여가장많았으며, 교육형태는업체내의자체교육이 주를이루는것으로조사되었다. 그결과는다음과같다. - 31 -
위생교육주기 업체수 통계 (%) 1주일 2개 11.1 3 개업체 1 개업체 1 개업체 2 개업체 1 달 11 개 61.1 3 달 3 개 16.5 6 달 1 개 5.5 11 개업체 기타 1 개 5.5 1 주일 1 달 3 달 6 달기타 교육형태업체수통계 (%) 3 개업체 자체교육 15 개 83.3 자체교육 + 국내위탁교육 3 개 16.6 자체교육 15 개업체 자체교육 + 국내위탁교육 라. 인증의종류와현황 업체내운용하고있는품질인증시스템에대한질문의결과, ISO가가장많은 33.3% 의비중을차지하였고, 민간업체에서 HACCP을인증받은곳은 2개업체로조사되었으며, 업체별로 HACCP, ISO, KS 중하나라도획득하거나, 정인곳은모두 8개업소로나타났다. 그결과는다음과같다. 품질인증업체수통계 (%) 8 개업체 6 개업체 ISO 6개 33.3 KS 1개 5.5 HACCP 2개 11.1 기타 1개 5.5 1 개업체 2 개업체 1 개업체 무응답 8 개 44.4 ISO KS HACCP 기타무응답 - 32 -
도입단계업체수통계 (%) 10 개업체 6 개업체 획득 6 개 33.3 정 2 개 11.1 2 개업체 무응답 10 개 55.5 획득정무응답
제 3 장 연구개발수행내용및결과 제 2 절 어묵류등 6 개의무적용품목의 제조공정별위해요소분석시험
제 2 절어묵류등 6 개의무적용품목의제조공정별위해요소분석시험 1. 실험방법 가. 시료채취 각시료는해당업체인비가열음료, 레토르트식품, 냉동만두, 냉동수산식품, 어묵류, 빙과류각각의업체에서샘플을수집하였다. 그리고 2차오염을방지하기위하여무균적으로멸균시료병이나멸균비닐백에채취한후아이스박스로운반하여신속히실험에사용하였다. 나. 시료의전처리 미생물분석을위한시료는 clean bench에서무균적으로처리되었으며, 모든검체는멸균한시약스푼이나멸균한가위를이용하였다. 무균적으로채취된시료 25g에각시험항목별 225 ml 증균배지를가한후균질기 (Stomacher) 를이용하여균질화하여사용하였다. 액상검체인경우에는강하게진탕하여균질화하고고형및반고형인검체는균질기를이용하여적당량의희석액과혼합하여균질화한것을검체로하였다. 기구, 용기, 종사자및주위환경에대한검체를채취할때에는 Pro-media ST-25 ( 일, Elmax사 ) 제품을이용하여, 검체채취장소에서일정면적을닦아내고세게진탕하여부착균의현탁액을조제하여이를시험용액으로하였다. 다. 미생물분석방법 (1) 일반세균 멸균된가위와칼등으로무균적으로채취된검체 25 g에 225 ml 멸균생리식염수를가한후스토마커를이용하여균질화하였다. 이중 1 ml를취하여 9 ml 멸균생리식염수를접종하여단계별로희석하였다. 각단계희석액 1 ml씩을멸균페트리접시 2매에무균적으로취하여약 43~45 로유지한 PCA(Plate Count Agar) 배지약 15 ml를무균적으로분주하고페트리접시뚜껑에부착되 - 35 -
지않도록주의하면서회전한후냉각응고시켜분주한페트리접시를거꾸로하 여 35±1 의배양기에서배양하였다. 24~48 시간배양한후생성된집락수를계 산하였다. (2) 대장균군수 대장균군의측정은식품공전중건조필름법에의한정량법에따라실험하였다. 검체에대한희석액은일반세균수와동일한방법으로조제한후, 각단계희석액 1 ml씩을대장균군건조필름배지에접종한후잘흡수시키고 35±1 에서 24±2 시간배양한후생성된붉은집락중주위에기포를형성하고있는집락수를계산하였다. (3) 대장균 ( 가 ) FDA 또는 AOAC 법 무균적으로채취된검체 25 g에 225 ml 멸균인산완충액을가한후스토마커를이용하여균질화하였다. 이중 1 ml를취하여 3개의 LST-MUG 발효관에접종하여 35 에서 24~48시간배양하였다. 이때에가스발생이인정되고암실에서자외선램프 (366nm, 6와트 ) 를사용하여 MUG에의한형광이관찰되면대장균양성으로판정하고해당 LST-MUG 발효관으로부터 1백금이를 EMB 평판배지에획선접종하여 35 에서 24시간배양하였다. 이후전형적녹색금속광택의집락을취하여 Nutrient agar에 35 에서 24시간배양하고, 배양된집락을취하여그 람음성, 무아포성간균을확인한후 VITEK GNI + card 를이용하여동정한후대 장균양성으로판정하였다. ( 나 ) 먹는물관리법에의한시험방법 3배농후의 Lactose배지가 25mL씩들어있는대 ( 大 ) 발효관 5개에검수 50mL 씩을접종하여 35±0.5 에서 24±2시간배양하였다. 이때에가스가발생되면대장균양성추정을하고해당시험관으로부터 1백금이를취하여 EC-MUG배지가든시험관에이식하여 44.5±0.2 의항온수조에서 24±2시간배양하였다. 배양후암실에서자외선램프 (366nm, 6와트 ) 를사용하여 MUG에의한형광이나타나면 1-36 -
백금이를취하여 EMB 배지에접종하고 35 에서 24 시간배양후전형적녹색 금속광택의집락을취하여 Nutrient agar 에 35 에서 24 시간배양하였다. 배양된 집락을취하여그람음성, 무아포성간균을확인한후 VITEK GNI + card 를이용 하여동정하고그결과에따라대장균양성으로판정하였다. (4) 내열성세균수시험원액 20 ml를멸균중형시험관 (18 170 mm) 에넣고끓는물속에 10분간넣어가열한후위의표준평판법에준하여시험하였고배양은 35±1 에서 48±3시간배양하여발육한집락의수를측정하여계산하였다. (5) 진균수 세균수 ( 일반세균수 ) 측정방법에준하며배지는 Potato Dextrose 한천배지를사 용하여 25 에서 5~7 일간배양한후발생한집락수를계산하고그평균집락수 에희석배수를곱하여계산하였다. (6) 대장균군 ( 가 ) 식품공전법 검체 25 g에 225 ml 멸균생리식염수를가한후스토마커를이용하여균질화하였다. 이중 1 ml를취하여 2개의 BGLB 발효관에접종하여 35 에서 24~48 시간배양하고, 가스발생이확인된시험관에서 1백금이를취하여 EMB 배지에접종하여 35, 24시간배양하였다. EMB 배지에서녹색의금속광택의집락을취하여 Nutrient agar에접종하여 35 에서 24시간배양하고, 배양된집락을취하여 그람음성, 무아포성간균을확인한후 VITEK GNI + card 를이용하여동정하고 그결과에따라대장균군양성으로판정하였다. ( 나 ) 먹는물관리법에의한시험방법 3배농후의 Lactose배지가 25ml씩들어있는대 ( 大 ) 발효관 5개에검수 50ml 씩을접종하여 35 에서 24시간배양한다음가스발생이관찰되면가스가발생한시험관으로부터배양액을 1 백금이취하여 BGLB 발효관에접종시켜 35 에서 48-37 -
시간배양하였다. 이후가스발생이확인된시험관에서 1 백금이를취하여 EMB 배 지에접종하여 35, 24 시간배양하였다. EMB 배지에서전형적인녹색의금속광 택의집락을취하여 Nutrient agar 에접종하여 35 에서 24 시간배양하고, 배양된 집락을취하여그람음성, 무아포성간균을확인한후 VITEK GNI + card 를이용 하여동정하고그결과에따라대장균군양성으로판정하였다. (7) 분원성대장균군대장균군의먹는물관리법에의한시험방법중 Lactose배지에서양성의반응을보이는시험관에대하여백금이를사용, EC-MUG배지가든시험관에이식하여 44.5±0.2 의항온수조에서 24시간배양하였다. 배양후암실에서자외선램프 (366 nm, 6와트 ) 를사용하여 MUG에의한형광이나타나면 1백금이를취하여 EMB 배지에접종하여 35 에서 24시간배양후전형적녹색금속광택의집락을취하여 Nutrient agar에 35 에서 24시간배양하고, 배양된집락을취하여그람음성, 무아포성간균을확인한후 VITEK GNI + card를이용하여동정하고그결과에따라분원성대장균군양성으로판정하였다. (8) 분원성연쇄상구균검수 50mL 씩을 5개의 3배농후아자이드포도당배지가 25mL씩들어있는대 ( 大 ) 시험관에접종시킨다음 35 에서 24시간배양하여혼탁이관찰되지않을경우 48시간까지연장하여배양하였다. 배양후배지가혼탁해진것을확인할수있는것은해당시험관으로부터 1백금이씩을취하여각각파이자장구균선택한천배지에접종하여 35 에서 24시간배양하였다. 배양후갈색의테두리가있는흑갈색의집락이형성되었을경우확정시험양성즉분원성연쇄상구균양성으로판정하였다. (9) 녹농균검수 50mL씩을 3배농후 Asparagine 배지가 25mL씩들어있는대 ( 大 ) 시험관 5개에각각접종하고 35 에서 24시간배양후암실에서자외선램프로자외선 (366nm, 6와트 ) 을조사해서형광이발생한경우추정시험양성으로하였다. 명확한형광이확인되지않는경우는배양을더지속해서 48±3시간까지관찰하였다. 녹색을띠는 - 38 -
형광을확인한모든시험관에서 1 백금이를취하여각각의아세트아미드한천사면 배지의사면에골고루이식하여 35 로 24~36 시간배양하였다. 배양후아세트 아마이드한천사면배지에서 적자색을나타내는것은양성집락을순수분리한후 Tryptic Soya 배지에서 41.5±0.5 로 48 시간배양하여성장여부를관찰하였다. 성장 한집락은그람음성간균임이확인되면 API 20NE 또는 VITEK kit 를사용하여 동정하고결과에따라양성판정한다. (10) 아황산환원혐기성포자균검수 10mL 씩을 5개의시험관에무균적으로넣은후수온을 75±1.0 로유지한항온수욕조에 10분간정치한후즉시 20 전후로냉각한다음미리준비한 2배농후 DRCM 배지를각각 10mL씩넣었다. 기포가생기지않도록검수와배지를혼합한후미리멸균한액체파라핀을 2~3mL 씩무균적으로배지표면에넣고마개를단단히닫고 35 로 48±3시간배양하였다. 배양후배지가검게변하게되면아황산이환원된것으로아황산환원혐기성포자형성균양성으로판정하며 5개의시험관중 1개라도양성인경우검출되었다고판정하였다. (11) 공중낙하균 ( 가 ) 일반세균수미리제조해둔 PCA(Plate Count Agar) 배지를공정각위치에덮개를연상태로 10분간정치시킨후덮개를닫고 35 에서 48시간배양하였다. ( 나 ) 진균수 미리제조해둔 PCA(Plate Count Agar) 배지를공정각위치에덮개를연상 태로 10 분간정치시킨후덮개를닫고 25 에서 5 일간배양한다. (12) Staphylococcus aureus( 황색포도상구균 ) ( 가 ) 증균배양 검체 25 g 또는 25 ml 를취하여 225 ml 의 10% NaCl 을첨가한 Tryptic Soy 배지에가한후균질화하여 35~37 에서 16 시간증균배양하였다. - 39 -
( 나 ) 분리배양 증균배양액을난황첨가 Mannitol 식염한천배지에접종하여 37 에서 16~24시간배양하였다. 배양결과난황첨가 Mannitol 식염한천배지에황색불투명집락 (Mannitol 분해 ) 을나타내고주변에혼탁한백색환 ( 난황반응양성 ) 이있는집락은확인시험을실시하였다. ( 다 ) 확인시험 분리배양된평판배지상의집락을보통한천배지에옮겨 37 에서 18~24시간배양한후그람염색을실시하고, 포도상의배열을갖는그람양성구균을확인하였다. 포도상의배열을갖는그람양성구균이확인된것은 coagulase 시험을실시하였다. 토끼혈청 ( 신선혈청은 5%, 건조혈청의용액은 10%) 을가한생리식염수를멸균한시험관에 0.5~1 ml씩무균적으로분주하였다. 여기에분리배지상의집락에서직접또는 Nutrient Agar에서순수배양시킨균 1 백금이를접종하여 37 에배양하였다. 배양후 3, 6, 24시간의각시간에응고의유무를판정하여어느시간후에도응고또는섬유소 (fibrin) 가석출된것은모두 coagulase 양성으로하였으며 VITEK GPI card를사용하여기기를이용한동정을수행하였다. (13) Bacillus cereus( 바실러스세레우스 ) ( 가 ) 분리배양 검체 25 g 또는 25 ml를취하여 225 ml의인산완충희석액에가하여균질화한검액을 MYP 한천배지에접종하여 30 에서 24시간배양하였다. 배양후혼탁한환을갖는분홍색집락을선별하였다. 이때명확하지않을경우 24시간더배양하여관찰하였다. ( 나 ) 확인시험 MYP 한천배지에서전형적인집락을선별하여 Nutrient Agar 에접종하고 30 에서 24 시간배양후그람염색을실시하여포자를갖는그람양성, 간균으로확인 된균은 API CHB kit 을이용하여동정시험을실시하였다. - 40 -
(14) Clostridium perfringens( 클로스트리디움퍼프린젠스 ) ( 가 ) 증균배양 검체 25 g 에 225 ml 멸균생리식염수를가한후스토마커를이용하여균질화 한검액 1 ml 를 Cooked Meat Medium 의배지아랫부분에접종하여 37 에서 18~24 시간혐기배양하였다. ( 나 ) 분리배양 카나마이신을 200 μg/ml 의농도로가한난황첨가 CW 한천평판배지에증균 배양액을접종하여 35 에서 18~24 시간혐기배양한결과분리배지상에서유황 색으로주변에혼탁한백색환이있는집락을확인시험을실시하였다. ( 다 ) 확인시험 분리배양된평판배지상의집락을보통한천배지에옮겨 37 에서 18~24시간혐기배양한후그람염색을실시하고동시에보통한천배지를 37 에서 18~24시간호기배양하여균의비발육을확인하였다. 포자형성그람양성간균으로호기조건에서비발육으로확인된집락은 API 20A kit을이용하여동정을수행하였다. (15) Listeria monocytogenes( 리스테리아모노사이토제네스 ) ( 가 ) 증균배양 무균적으로채취한검체 25 g을 Listeria enrichment broth 225 ml에가하고스토마커로균질화하여 30 에서 24시간증균배양하였다. 증균액 1 ml를취하여 Fraser listeria broth 10 ml에접종하고 30 에서 24시간 2차증균배양하였다. ( 나 ) 분리배양 2 차증균액에서 1 백금이를취하여 Chrom Listeria agar 에접종하여 30 에서 24 시간배양한후연한푸른색의환을가진의심집락이확인되면이를 0.6% - 41 -
yeast extract 가포함된 Tryptic Soy 한천배지에접종하여 30 에서 24~38 시간 배양하였다. ( 다 ) 확인시험 그람염색후그람양성간균이확인되면 CAMP test 를실시한결과 Staphylococcus aureus 에서용혈양성, Rhodococcus equi 에서용혈음성을나타내 고 catalase 양성의결과를보일경우 API Listeria kit 을이용하여동정하였다. (16) E.coli O157:H7( 대장균 O157:H7) ( 가 ) 증균배양 무균적으로채취된검체 25 g 에증균용액체배지인 modified EC 배지에가한 후균질화하여 35 에서 24 시간증균배양하였다. ( 나 ) 분리배양 증균배양액을 MacConkey Sorbitol 한천배지에접종하여 35 에서 18시간배양하였다. Sorbitol을분해하지않는무색집락을취하여 EMB 한천배지에접종하여 35 에서 24시간배양하고, 녹색의금속성광택이확인된집락은확인시험을실시하였다. ( 다 ) 확인시험 EMB 한천배지에서녹색의금속성광택을보이는집락을 Nutrient Agar 에옮 겨 35 에서 24 시간배양한후그람음성간균임을확인하고 VITEK GNI + card 를 이용하여동정하였다. ( 라 ) 혈청형시험및 PCR 시험 의심균주로확인동정된균은 BAX system( 미, Dupont 사 ) 의 O157:H7 검출 kit 을이용하여혈청형확인시험을하였다. 또한상용화된 One Shot PCR kit( 일본 - 42 -
TAKARA 사 ) 를이용하여 O157:H7 의분자생물학적시험을통해 cross-checking 을실시하였다. (17) Vibrio parahaemolyticus( 장염비브리오 ) ( 가 ) 증균배양 검체 25 g 에 225 ml 멸균 Alkaline Peptone Water 를가한후스토마커를이용 하여균질화하여 37 에서 18~24 시간배양하였다. ( 나 ) 분리배양 TCBS 배지에증균배양액을접종하여 35 에서 18~24 시간배양한결과분리 배지상에서투명한청록색집락은확인시험을실시하였다. ( 다 ) 확인시험 분리용배지에서의심되는집락을선택하여 TSI 사면배지에천자이식하고 3 5 에서 24시간배양하여생물학적성상을검사하였다. 즉사면부는적색을띠고천자부는황색으로변하며유화수소와가스를비발생한것을양성으로하였고, Nutrient Agar에이식하여 35 에서 24시간배양한후분리된균이그람음성간균이며 oxidase 양성을확인하고 VITEK GNI + card를사용하여동정을수행하였다. (18) Yersinia enterocolitica( 여시니아엔테로콜리티카 ) ( 가 ) 증균배양 검체 25 g 또는 25 ml 를취하여 225 ml 의 PSBB 배지에가한후 10 에서 10 일간배양하였다. ( 나 ) 분리배양 증균배양액 0.1 ml 를 0.5% KOH 가함유된 0.5% 식염수 1 ml 에가하여수초 간섞는다. 이용액을 MacConkey 한천배지와 CIN 한천배지에각각접종하여 3-43 -
0 에서 24 시간배양하였다. ( 다 ) 확인시험 MacConkey 한천배지에서유당을비분해하는집락이나 CIN배지에서중심부가짙은적색을보이는집락을골라각각 TSI 사면배지의사면과고층부에접종하여, 35 에서 24시간배양후고층부와사면이노랗고가스와황화수소가발생하지않은균주를선택하여 Nutrient Agar에이식하여 35 에서 24시간배양한후그람음성간균이확인되면 VITEK GNI + card로동정을수행하였다. (19) Salmonella spp.( 살모넬라균 ) ( 가 ) 식품공전법 1 증균배양 검체 25 g 또는 25 ml 를취하여 225 ml 의 Buffered Peptone Water 에가하여 균질화한검액을 35 에서 24 시간증균배양하였다. 2 분리배양 증균된균액 1mL을취하여 10mL의 RV 배지에접종하여 42 에서 24시간배양한후배지의색이무색투명하게변하면 1백금이를취하여 Rambach나 XLD 배지에접종하고 35 에서 24시간배양하여각각붉은색과검은색의집락의생성여부를확인하였다. 3 확인시험 분리용배지에서의심되는집락을선택하여 TSI 사면배지에천자이식하고 3 5 에서 24시간배양하여생물학적성상을검사하였다. 즉유당은분해되지않으며, 포도당은분해하여배지면이황색으로변하고, 가스를발생하여배지천자부는갈라지며, 유화수소를발생하여천자한자리근처가검은색으로변한것을양성으로하였고, Nutrient Agar에이식하여 35 에서 24시간배양한후분리된균을그람염색법에따라염색하여검경한결과그람음성간균을확인하고배양된균 - 44 -
을 VITEK GNI + card 를사용하여동정을수행하였다. ( 나 ) 먹는물관리법에의한시험방법검수 50mL씩을 3배농후 Selenite 배지가 25mL씩들어있는대 ( 大 ) 시험관 5개에접종하였다. 검수를접종한 Selenite 배지는 37 에서 18~24시간배양하였다. 백금이를이용하여 5개의모든시험관에서증균배양액을취하여 Bismuth agar 에획선접종하였다. 35 에서 24시간배양후집락을관찰하고다시배양하여 48시간후재관찰하여가장자리에하얀테를두른검고반짝이는집락을살모넬라양성으로추정하였다. 양성으로판정된집락을순수분리하여 Nutrient Agar로옮겨접종하여 35 에서 24시간배양후그람염색및현미경으로그람음성간균임을확인하고 VITEK GNI + card를사용하여동정하였다. (20) Shigella( 쉬겔라 ) 증균과정은먹는물관리법에의한시험방법의살모넬라분석법과동일하다. 배양된증균배지를백금이로취하여 XLD Agar에획선접종한후 35 에서 24시간배양하였다. 붉은색집락이형성되는양성으로판정된집락을순수분리하여 Nutrient Agar로옮겨접종하여 35 에서 24시간배양후, 그람염색및현미경으로그람음성간균임을확인하고 VITEK GNI + card를사용하여동정하였다. (21) Clostridium botulinum( 클로스트리디움보툴리눔 ) ( 가 ) 증균배양검체 25 g또는 25 ml를취하여동량의젤라틴-인산완충액를가하고균질화한검액 2mL를 Cooked Meat Medium의배지아래부분에접종하여 35 에서 18~ 24시간혐기배양한후 2mL을취하여 TPGY 배지에접종하고 25 에서 7일간혐기배양하였다. ( 나 ) 분리배양 TPGY 증균액 2mL 과동량의제균에탄올을섞은후실온에 1 시간동안방치한 후, 1 백금이를취하여난황을가한 Liver-veal Agar 에접종하고 35 에서 48 시간 - 45 -
동안혐기배양하였다. 환을형성한, 퍼져있거나불규칙한집락이검출되면확인 시험단계로진행하였다. ( 다 ) 확인시험 양성으로판정된집락을순수분리하여 Nutrient Agar로옮겨접종하여 35 에서 24시간혐기배양후, 그람염색및현미경으로포자형성그람양성간균임을확인하고 API 20A kit를사용하여동정하였다. 동정결과보툴리눔으로판정되면 Takara사의신경독소타입별유전자검출 PCR kit을이용하여독소형을구분하였다. 라. 이화학적분석 (1) 잔류농약 ( 가 ) 추출 추출시료 [ 곡류및콩류는약 1kg을잘혼합하여표준체 20 mesh를통과하도록분쇄한 50g. 채소류, 과실류, 종실류및견과류는약 1kg을대형분쇄기 (Cutter mixer) 에넣고분쇄한 50g. 차는 10g] 를정밀히달아혼합추출분쇄기 (Omni mixer) 병에넣고 ( 곡류및콩류의경우물 30mL를넣어 2시간방치, 차의경우물 40mL를넣어 2시간방치 ) 아세토니트릴 100mL를넣은후혼합추출분쇄기로 2~3분간균질화하였다. 이를여지가깔려있는부크너깔때기로감압여과하였다. 여액을염화나트륨 10~15g이들어있는 150mL의분리병에담고마개 (Teflon-lined) 를막은후 1분간세게흔들어섞었다. 이를약 1시간정치하여아세토니트릴층과물층을분리시켰다. 주. 당근과같이크고단단한것들은먼저칼로대강썬후분쇄함. 주. 용매추출액을저온에서정치하면층분리가빨라질수있음. ( 나 ) 농축 ( 가 ) 의상등액 ( 아세토니트릴층 ) 을 250mL 의비이커에취하여 40 이하의수욕조 중에서 vacuum evaporator 로공기또는질소가스를통과시키면서용매가소량 - 46 -
남을때까지날려보냈다. 다시 20% 아세톤함유헥산 2mL 를넣고시험관교반 기 (Vortex mixer) 로벽면의잔류물을완전히녹였다. ( 다 ) 정제미리후로리실카트리지에헥산 5mL를초당 2~3방울정도의속도로유출하여버린후, 이카트리지에 20% 아세톤함유헥산 5mL를위와같은방법으로유출하여버렸다. 이어서 ( 나 ) 농축의녹인액을카트리지상단에넣고초당 1~2방울정도의속도로용출시켜시험관에받았다. 다시카트리지가용매에젖어있는상태에서 20% 아세톤함유헥산 5mL를용출하여동일시험관에모으고내부표준물질을첨가하였다. 용출액은 40 이하의수욕조중에서질소또는공기를낮은유속으로통과시키면서용매를날려보낸후 20% 아세톤함유헥산에녹여서일정량으로하여시험용액으로하였다 ( 정제과정중에는모든카트리지의충전제가마르지않도록주의한다 ). ( 라 ) 시험조작 1 가스크로마토그래피의측정조건 - GC-ECD 칼럼 :DB-5 캐필러리칼럼 (30m 0.25mm i.d., 0.25μmdf) 및 DB-17 캐필러리칼럼 (30m 0.25mm i.d., 0.25μmdf) 또는이와동등한것 캐리어가스및유량 : 질소, 1.0mL/ 분 오븐온도 :80 에서시료를주입하고 2분간유지한후 10 / 분의비율로 280 (DB-17의경우 270 ) 까지온도를상승시켜 10분이상 (DB-17의경우 15분이상 ) 유지한다. 주입부 :split mode(50:1), 260 검출기온도 :280 - GC-NPD 칼럼 :DB-5 캐필러리칼럼 (30m 0.25mm i.d., 0.25μmdf) 및 DB-17 캐필러리칼럼 (30m 0.25mm i.d., 0.25μmdf) - 47 -
또는이와동등한것 캐리어가스및유량 : 질소, 1.0mL/ 분 오븐온도 :80 에서시료를주입하고 2분간유지한후 10 / 분의비율로 280 (DB-17의경우 270 ) 까지온도를상승시켜 10분이상 (DB-17의경우 15분이상 ) 유지한다. 주입부 :splitless mode, 260 검출기온도 :280 - GC-MSD 칼럼 :DB-5MS 캐필러리칼럼 (30m 0.25mm i.d., 0.25μmdf) 또는이와동등한것 캐리어가스및유량 : 헬륨, 0.9mL/ 분 오븐온도 :100 에서시료를주입하고 2분간유지한후 10 / 분의비율로 280 까지온도를상승시켜 15분이상유지한다. 주입부 :split mode(10:1), 260 Interface 온도 :280 Solvent delay time:7분 2 정성시험 위조건으로얻어진크로마토그램상의피이크는어느측정조건에서도표준용액 피이크의머무름시간과일치하여야한다. 3 정량시험 정성시험에서얻어진결과를근거로적절한칼럼충전제를써서가스크로마토그 래피를하여피이크높이법또는피이크면적법에따라서정량하였다. (2) 아플라톡신 NEOGEN 사의 Veratox(Quantitative Aflatoxin Test) Kit 를사용하여 650 nm filter 를이용 microwell reader 에서측정된결과를읽었다. - 48 -
(3) 중금속 ( 가 ) 카드뮴 (Cd) 검체 ( 건조물로서 5~20g에상당하는양 ) 를분해플라스크에취해물 50~70mL, 질산 10~40mL를넣고혼합하여방치하였다. 다음에조용히가열하여격렬한반응이그치면식힌다음황산 5~20mL를넣고다시조용히가열하였다. 내용물이암색이되기시작하면질산 2~3mL씩을추가하면서가열을계속하여내용물이미황색~무색이되었을때분해가끝난것으로하였다. 분해액을식힌후물 30~50mL, 포화수산암모늄용액 10~25mL를가해서황산의흰연기가발생할때까지가열하고식힌다음물로일정량으로하여시험용액으로하였다. 공시험용액에대해서도같은조작을하여시험용액을보정하였다. 시험용액및공시험용액각일정량에대하여식품공전 6. 유해중금속시험법 2) 측정 (2) ICP법에따라시험하였다. 사용기기는 ICP-AES(JOBIN YVON 38S) 를이용하여파장 214.438nm에서분석하였다. ( 나 ) 납 (Pb) 검체 ( 건조물로서 5~20g 에상당하는양 ) 를분해플라스크에취해물 50~70mL, 질산 10~40mL 를넣고 혼합하여방치하였다. 다음에조용히가열하여격렬한 반응이그치면식힌다음황산 5~20mL를넣고다시조용히가열하였다. 내용물이암색이되기시작하면질산 2~3mL씩을추가하면서가열을계속하여내용물이미황색 ~ 무색이되었을때분해가끝난것으로하였다. 분해액을식힌후물 30~50mL, 포화수산암모늄용액 10~25mL를가해서황산의흰연기가발생할때까지가열하고식힌다음물로일정량으로하여시험용액으로하였다. 공시험용액에대해서도같은조작을하여시험용액을보정하였다. 시험용액및공시험용액각일정량에대하여식품공전 6. 유해중금속시험법 2) 측정 (2) ICP법에따라시험하였다. 사용기기는 ICP-AES(JOBIN YVON 38S) 를이용하여파장 220.353nm에서분석하였다. ( 다 ) 주석검체 ( 건조물로서 5~20g에상당하는양 ) 를분해플라스크에취해물 50~70mL, 질산 10~40mL를넣고혼합하여방치하였다. 다음에조용히가열하여격렬한반응이그치면식힌다음황산 5~20mL를넣고다시조용히가열하였다. 내용물이암색이되기시작하면질산 2~3mL씩을추가하면서가열을계속하여내용물이 - 49 -
미황색~무색이되었을때분해가끝난것으로하였다. 분해액을식힌후물 3 0~50mL, 포화수산암모늄용액 10~25mL를가해서황산의흰연기가발생할때까지가열하고식힌다음물로일정량으로하여시험용액으로하였다. 공시험용액에대해서도같은조작을하여시험용액을보정하였다. 시험용액및공시험용액각일정량에대하여식품공전 6. 유해중금속시험법 2) 측정 (2) ICP법에따라시험하였다. 사용기기는 ICP-AES(JOBIN YVON 38S) 를이용하여파장 189.926nm에서분석하였다. (4) 보존료 (Dehydroxyacetic acid, Sorbic acid, Benzoic acid, para- Hydroxybenzoic acid-isopropyl, para-hydroxybenzoic acid-buthyl, para-hydroxybenzoic acid-propyl, para-hydroxybenzoic acid-ethyl, para-hydroxybenzoic acid-methyl, para-hydroxybenzoic acid-isobuthyl) ( 가 ) 시험용액의조제 1 간장 (solid-phase extraction; SPE) 검체 5g 또는 5mL를취하여물로 25mL로희석하였다. 메탄올 10mL, 물 10mL, 4mL CTA 용액 0.5mL 를차례로흘려씻어준 Sep-Pak C 18 카트리지에 실험용액을서서히가했다. 이어서물 10mL로카트리지를씻고메탄올 10mL로 1초당한방울정도의속도로서서히용출시켜전량을메탄올로 10mL가되게하였다. 이액을필요에따라 0.45μm의멤브레인여과지로여과하여시험용액으로하였다. 2 이외의기타식품 (Carrez 침전법 ) 고체검체 : 잘게분쇄하고고르게섞은검체 2g 을 정확히칭량하여 10~ 20mL의초산암모늄 (ammonium acetate): 메탄올 (methanol)(60 : 40, v/v, ph 4.5, 이하추출용매 ) 을가하고초음파로잘섞어준후혼합액을 100mL 용량플라스크에옮기고추출용매로약 80mL가될정도로채웠다. 침전용시약인 Carrez clearing reagent Ⅰ 용액을 1.0mL 넣고섞은후, Carrez clearing reagent Ⅱ 용액을 1.0mL을첨가하여 100mL로정용하고필요에따라멤브레인여과지로여과한후시험용액으로하였다. 액체검체 : 5~mL를 100mL 용량플라스크에직접주입하고 80mL 정도추 - 50 -
출용매를채운후 20분간초음파로섞어주었다. 침전용시약인 Carrez clearing reagent Ⅰ 용액을 1.0mL 넣고섞은후, 다시 Carrez clearing reagent Ⅱ 용액을 1.0mL 첨가하여혼합한다음, 100mL로정용하고필요에따라멤브레인여과지로여과한후시험용액으로하였다. ( 나 ) 표준용액의조제각각의표준물질을 0.1g으로정밀하게칭량하여 100mL의메탄올에녹여 1,000μg/mL 농도로조제하여표준용액을제조하였다. 표준용액을최종농도가 100μg/mL이되도록물로희석하여사용하였다. ( 다 ) 측정법 1 HPLC 측정조건 검출기 : 자외선검출기 (UV) 칼럼 : RP-C 18 column 칼럼온도 : 40 이동상 A액 ; 25mM 초산암모늄 : 아세토니트릴 (75 : 25) B액 ; 아세토니트릴 A:B = 100 : 0 /5분 80 : 20 /40분, curve #6 유속 : 1.0mL / 분 측정파장 : 235nm 2 검량선작성 표준용액 10uL 를상기의조건에따라고속액체크로마토그래피에주입하여얻어진 피이크의높이와면적으로부터검량선을작성하였다. 3 정량 시험용액 10μL 를상기의조건에따라고속액체크로마토그래피에주입하였다. 얻 - 51 -
어진피이크의머무름시간 (retention time) 을비교해서정성을하고얻어진검량 선과비교하여시험용액중의보존료농도 (μg/ml) 를구하고다음식에따라검체 중의보존료의양을산출하였다. 보존료 (g/kg) 각표준용액의농도 (mg/kg) PS : 표준용액의높이또는면적 PA : 시험용액의높이또는면적 SA : 검체의무게 (g) ( 라 ) 시액및시약 1 추출용매 : 초산암모늄 (ammonium acetate) 과메탄올 (methanol) 을 60 : 40 비율로혼합하여 ph 4.5로조정하여조제하였다. 2 침전용시약 Carrez clearing reagent Ⅰ: 페로시안화칼륨 (potassium ferrocyanide 3H 2O) 을물 1L을 150g을용해하여조제하였다. Carrez clearing reagent Ⅱ: 황산아연 (Zinc sulfate 7H 2O) 을물 1L 에 300g을용해하여조제하였다. 3 주석산 (tartaric acid) 4 초산 (acetic acid) 5 염화나트륨 (sodium chloride) 6 수산화나트륨 (sodium hydroxide) 7 Cetyltrimethylammonium chloride(cta) 8 카트리지 : Sep-pak plus 400mg (5) 사카린 (Saccharin) ( 가 ) 시험용액의조제 - 52 -
다음과같이식품공전에방법으로수행하였으며, 주로당류와관련된원료, 제품등은 2번방법으로수행하였으며, 1~6의시험용액의조제방법을비교한결과거의차이가나지않았다. 1 과실 채소류음료, 주류및탄산음료류탄산가스가있는경우에는 10분간초음파처리하여탄산가스를제거하고알코올을함유한검체의경우는 70 의수욕상에서 15분간가온하여알코올을증발시키며고형물이있는경우에는혼합기로균질화를한후약 5g을취해검체로하였다. 검체에물을가해 50mL로하고잘혼합한다음실온, 5,000rpm에서 10분간원심분리하고상등액을취하여 0.45μm 멤브레인필터로여과한액을시험용액으로하였다. 2 사탕류, 껌류, 꿀및쨈류사탕류는잘게부수어약 2~5g을취한다음온수 10~20mL의물을가한후 10~20 분간흔들어완전히용해시키고껌은적당한크기로자른다음검체약 2~5g을취하여온수 10~20mL의물을가한후 10~20분간잘저어주며꿀과쨈은약 2~5g에물 10~20mL를넣고 20분간가온초음파처리하여검체를물에녹였다. 이액을물로희석하여 50mL로하고실온, 5,000rpm에서 10분간원심분리한다음상등액을취하여 0.45μm 멤브레인필터로여과한액을시험용액으로하였다. 3 두유류, 발효음료류및특수영양식품검체약 5g을취하여물약 10~20mL에녹이고두유및발효음료는잘섞은후검체약 5g을취한다. 이액을메스플라스크로옮기고물 10mL를첨가한후강하게흔든다음 Carrez clearing reagent Ⅰ 시약을 2mL 넣어섞고 Carrez clearing reagent Ⅱ 시약 2mL 을넣어 2 분간흔들어섞었다. 발생한거품을초음파처리하여제거한후 물로 50mL를채우고실온, 5,000rpm에서 10분간원심분리한다음여기서얻은상등을취하여 0.45μm 멤브레인필터로여과한액을시험용액으로하였다. 4 건과류, 아이스크림류, 초콜릿류검체약 2~5g을취하여약 10~20mL의물을넣고 10분간초음파처리한후물로희석하여 50mL로하고이액을실온, 5,000rpm에서 10분간원심분리하였다. 상등액을분액깔때기로옮기고 50mL 디에틸에테르를가한다음물층을취하였다이조작을 2회반복하여모든추출액을합하고증발농축하여디에틸에테르를제거한다음 0.45μm 멤브레인필터로여과한액을시험용액으로하였다. - 53 -
5 김치, 절임식품류, 어육가공품혼합기로분쇄한검체약 2~5g을취하여 10~20mL의물을넣고 10분간초음파처리한다음물로희석하여 50mL로하고실온, 5,000rpm에서 10분간원심분리하였다. 상등액을취하여 0.45μm 멤브레인필터로여과한액을시험용액으로하였다. 6 혼합제제식품첨가물검체 0.1g을물로희석하여 100mL로한다음이액을 0.45μm 멤브레인필터로여과하여시험용액으로하였다. ( 나 ) 표준용액의조제 1mL 당각인공감미료가 1,000μg/mL(1,000ppm) 를함유하도록용액을조제하 고이를물로희석하여각각 0, 5, 10, 20, 50μg/mL 의검량선용표준용액으로하였다. ( 다 ) 측정법 1 HPLC 측정조건 검출기 : 자외선검출기 (UV) 칼럼 : Symmetry C 18 (3.9mm i.d. 150mm, 5μm) 또는이와동등한것 칼럼온도 : 40 이동상 : 0.005M 인산이수소칼륨 (0.01M TBA-OH 포함 ): 아세토니트릴 (90 : 10, ph 3.5) 유속 : 10mL/ 분 측정파장 : 210nm 2 검량선의작성표준용액 20μL를상기의조건에따라고속액체크로마토그래피에주입하여얻어진피이크의높이와면적으로부터검량선을작성하였다. 3 정량시험용액 20μL를상기의조건에따라고속액체크로마토그래피에주입하였다. 얻어진피이크의머무름시간 (retention time) 을비교해서정성을하고얻어진검량선과 - 54 -
비교하여검체중의사카린나트륨의함량을산출하였다. ( 라 ) 시약및시액 1 사카린나트륨표준품 2 메탄올 (methanol) 3 아세토니트릴 (acetonitrile) 4 10% tetrapropylammonium hydroxide solution(tpa-oh) 5 황산아연 (zinc sulfate) 6 인산이수소칼륨 (potassium dihydrogenphosphate) 7 제일인산나트륨 (sodium phosphate, monobasic) 8 디에틸에테르 (diethyl ether) 9 Carrez clearing reagentⅠ : 페로시안화칼륨 (potassium ferrocyanide 3H 2O)=150g/L Carrez clearing reagentⅡ : 황산아연 (zinc sulfate, 7H 2 O)=300g/L (6) 산화방지제 (PG, TBHQ, BHA, BHT) ( 가 ) 시험용액의조제 1 유지 ( 액상식물유 ) 균질화한검체 5g을비이커에달아, 5mL 헥산이들어있는 125mL 분액깔때기에옮기고, 헥산 15mL로여러번나누어서비이커를씻어분액깔때기에합쳤다. 여기에헥산포화아세토니트릴 50mL씩으로 3회추출하고 ( 만약유탁형태가일어나면뜨거운물에분액깔때기를 5~10초동안담구어서분리한다 ), 추출액을 250mL 분액깔때기에합했다. 이액을농축수기에서서히옮겨 40 이하의수욕상에서회전농축기를사용하여 3~4mL로농축하여눈금이있는용기에옮기고씻어전량을 5mL 로한후, 이소프로판올 5mL로수기를씻어전량을 10mL로하여시험용액으로하였다. 2 버터, 마가린등검체를 60 에서가온하여녹인후, 그 2.5g을비이커에달아 5mL 헥산이들어있는 125mL 분액깔때기를옮기고, 헥산 17.5mL로여러번나누어비이커를씻어분 - 55 -
액깔때기에합쳤다. 이하유지 ( 액상식물유 ) 에따라조작하였다. 3 어패건제품, 어패염장품, 어패냉동품등잘게썰은검체 5~20g을달아브랜더캡 (Blender Cap) 에옮기고무수황산나트륨약 15g, 헥산 100mL를가하여약 2분간균일하게섞은다음여과하였다. 잔사에헥산 100mL를가하여추출을되풀이하고, 여액을합쳤다. 여액을농축하여약 20mL 로하였다. 이하유지 ( 액상식물유 ) 항에따라실험을수행하였다. ( 나 ) 표준용액의조제디부틸히드록시톨루엔 100mg을이소프로판올및아세토니트릴혼액 (1 : 1) 에녹여 50mL로하였다. 사용시이액 10mL를취하여위의혼액으로희석하여 100mL로하였다. ( 다 ) 측정법 1 HPLC 측정조건 검출기 : 자외선검출기 (UV) 칼럼 : u-bondapak C 18 또는 Lichrosorb RP-18 용매여과기 : Solvent Clarification Kit 또는이와동등한것. 이동상 : 물 : 아세토니트릴 : 초산 (35 : 60 : 5) 유속 : 1.0~1.5mL/ 분 감도 : 0.05AUFS 측정파장 : 280nm 2 검량선의작성표준용액 10~20μL를상기의조건에따라고속액체크로마토그래피에주입하여얻어진피이크의높이와면적으로부터검량선을작성하였다. 3 정량시험용액 10~20μL를상기의조건에따라고속액체크로마토그래피에주입하였다. 얻어진피이크의머무름시간 (retention time) 을비교해서정성을하고얻어진검량선과비교하여검체중의산화방지제의함량을다음식에따라산출하였다. - 56 -
산화방지제 (mg/kg) 각표준용액의농도 (mg/kg) PS : 표준용액의높이또는면적 PA : 시험용액의높이또는면적 SA : 시료의무게 (g) ( 라 ) 시액및시약 1 아세토니트릴 (acetonirile) 2 이소프로파올 (isopropanol) 3 헥산 (hexane) 4 무수황산나트륨 (sodium sulfate, anhydrous) 5 초산 (acetic acid) (7) 타르색소 (B1, B2, R2, R3, R40, Y4, Y5, G3) ( 가 ) 시험용액의조제다음과같이식품공전방법으로수행하였으며, 당류와관련된원료및제품은사탕, 젤리추출법을, 빙과류는아이스크림류추출법을사용하였고, 청량음료추출법을많이사용하였다. 각추출법을비교한결과거의차이가나지않았다. 1 추출 청량음료검체약 10g( 착색의정도에따라 2~10g) 을취하여필요한경우 2배량의물로희석하고원심분리 (3,500rpm, 15분 ) 하여불용물을제거한후 1% 암모니아수또는 1% 초산으로 ph를 5~6으로조정한다음정제하고물을가해일정량으로하여시험용액으로하였다. 사탕, 젤리검체 5~10g을취하여 2~10배량의물또는 50~80% 에탄올용액을가한후때때 - 57 -
로흔들어혼합하면서 2~3시간실온에방치하거나수욕상에서 10~30분간가온한다음그액을원심분리하여고형물을제거하고물층을취한다. 잔유물이여전히착색되어있을경우는 1N 염산 10mL를가해상기조작방법을반복하고모든물층을합했다. 에탄올을함유한경우는증발농축시키고 1% 암모니아수또는 1% 초산으로 ph 5~6으로조정한다음정제하고물을가해일정량으로하여시험용액으로하였다. 츄잉껌검체 5~10g을취하고잘게썰어물또는 1% 암모니아수를가한후때때로흔들어혼합하면서 2~3시간실온에방치하거나수욕상에서 10~30분간가온한다음사탕또는젤리실험과동일하게조작하였다. 아이스크림류검체약 5~10g을취하고균질화하고 5~10배량의물을가한후가끔흔들어혼합하면서 2~3시간실온에방치하거나수욕상에서 10~30분간가온한다음사탕또는젤리실험과동일하게조작하였다. 다만, 키산틴계색소가함유된경우는따로 ph를 11~12로조정하였다. 2 정제 0.1% 염산-메탄올및 1% 암모니아성메탄올의혼합액을용출액으로사용하였으며용출된액은물 2mL를첨가하여증발농축하고 1% 암모니아수 1mL와물을가하여정확하게 10mL로정용한후시험용액으로하였다. ( 나 ) 표준용액의조제 1mL당각식용색소 100μg(100ppm) 을함유하도록조제하고이표준용액 0, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0mL를각각정확하게취해물을가하여 100mL로정용하여표준용액으로한다.( 이액의 1mL는각색소 0, 2, 5, 10, 20, 50μg을함유 ) ( 다 ) 측정법 1 HPLC 측정조건 - 검출기 : 자외선검출기 (UV) - 칼럼 : va-pak C 18(3.9mm i.d. 300mm, 4μm) 또는이와동등한것 - 58 -
- 이동상 : A액 0.025M 초산암모늄 (0.01M TBA-Br) : 아세토니트릴 : 메탄올 (62 : 28 : 10) B액 0.025M 초산암모늄 (0.01M TBA-Br) : 아세토니트릴 : 메탄올 (50 : 40 : 10) gradient program : 100 : 0 0 : 100 /10분, curve #10 isocratic program : 0 : 100 /25분 - 유속 : 1.0mL/ 분 - 측정파장 : 254nm( 단일분석시는 600nm) 2 검량선의작성표준용액 20μL를상기의조건에따라고속액체크로마토그래피에주입하여얻어진피이크의높이와면적으로부터검량선을작성하였다. 3 정량시험용액 20μL를상기의조건에따라고속액체크로마토그래피에주입하였다. 얻어진피이크의머무름시간 (retention time) 을비교해서정성을하고얻어진검량선과비교하여검체중의식용색소녹색제3호의함량을산출하였다. ( 라 ) 시액및시약 1 메탄올 (methanol) 2 아세토니트릴 (acetonitrile) 3 초산암모늄 (ammonium acetate) 4 에탄올 (ethanol) 5 1% 암모니아수 6 초산 (acetic acid) 7 헥산 (hexane) 8 석유에티르 (Pet. ether) 9 Tetrabutylammonium bromide ꊉꊒ Cartridge : Sep-pak C 18-59 -
2. 재료별분석항목 어묵류등 6 개품목의원료, 제조공정, 완제품, 그리고제조환경에대해법적규 격, 식중독발생사례, 오염가능성등을고려하여샘플및분석항목을결정하였다 ( 표 1). 표 1 어묵류등 6 개품목에대한위해요소분석개요 품목 구분 샘플수 분석항목수 미생물화학미생물화학 비가열음료 빙과류 냉동수산식품 냉동과자류 어묵류 레토르트식품 원료 6 4 42 10 제조공정 24-168 - 완제품 1 1 7 5 제조환경 31-83 - 원료 9 14 44 35 제조공정 6-24 - 완제품 2 1 8 3 제조환경 14-33 - 원료 6 8 29 16 제조공정 7-35 - 완제품 2 1 14 2 제조환경 27-68 - 원료 8 19 38 40 제조공정 6-36 - 완제품 2 1 16 3 제조환경 23-55 - 원료 9 15 43 31 제조공정 7-28 - 완제품 2 1 14 3 제조환경 21-51 - 원료 8 20 53 44 제조공정 3-21 - 완제품 2 1 10 3 제조환경 20-70 - 주 ) 분석항목수는각품목당샘플수와샘플당분석항목을곱한것을모두더한 합계임 - 60 -
가. 비가열음료비가열음료의법적규격에의해일반세균수및 E. coli O157:H7에대한항목을설정하였고, 미국등에서비가열사과주스및혼합주스섭취로인해 E. coli O157:H7 및 Salmonella typhimurium등에의한식중독사고가보고된바, Salmonella spp. 에대한위해분석을실시하였다. 또한, 토양유래의원료농산물이차지하는비중을고려하여미생물학적으로는토양유래포자형성식중독균인 B. cereus를, 화학적위해요소로는잔류농약을분석항목으로설정하였다. 가공용수의적합성을평가하기위해먹는물관리법에근거하여살모넬라, 분원성연쇄상구균, 분원성대장균군, 대장균군, 아황산환원혐기성포자균, 녹농균, 쉬겔라등을위해평가항목으로설정하였고, 가공과정중교차오염및적합성여부에대해서는 L. monocytogenes 및 S. aureus등의식중독균과화학적위해요소로중금속, 보존료및타르색소에대한평가를진행하였다 ( 표 2). 표 2 비가열음료의제품에서상되는위해요소 (Potential s of non-pasteurized beverages) 구분위해요소근거 미생물학적 화학적 E. coli O157:H7 법적규격 S. aureus 교차오염 Salmonella spp 발생보고 B. cereus 원료오염 L. monocytogenes 환경오염 분원성연쇄상구균 가공용수의적합성 분원성대장균군 가공용수의적합성 아황산환원혐기성포자균 가공용수의적합성 녹농균 가공용수의적합성 쉬겔라 가공용수의적합성 일반세균수 법적규격 진균수 환경오염 대장균 분변오염 대장균군 가공용수의적합성 잔류농약 원료오염 납 가공과정의적합성 중금속 카드뮴 가공과정의적합성 주석 가공과정의적합성 보존료 가공과정의적합성 타르색소 가공과정의적합성 - 61 -
(1) 원료비가열음료에대한분석항목은다음과같다. 케일, 사과, 양배추, 신선초에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균군수, E. coli O157:H7, S. aureus, Salmonella spp., B. cereus, L. monocytogenes, 화학적위해요소로보존료, 타르색소, 농약을분석하였다. 용수에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균, 대장균군, 분원성대장균군, 분원성연쇄상구균, 녹농균, 아황산환원혐기성포자균, 쉬겔라를분석하였다. (2) 제조공정비가열음료의제조공정에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균군수, E. coli O157:H7, S. aureus, Salmonella spp., B. cereus, L. monocytogenes를분석하였다. (3) 완제품 비가열 음료의 제품에 대해 미생물학적 위해요소로 일반세균수, 대장균군 수, E. coli O157:H7, S. aureus, Salmonella spp., B. cereus, L. monocytogenes, 화학적 위해요소로 보존료, 타르색소, 중금속 ( 납, 카드뮴, 주 석 ) 을분석하였다. (4) 제조환경 비가열음료제조시일반위생관리에대한평가를위해제조기기및설비, 작 업자에대해일반세균수, 대장균군수, 진균수에대한오염도를측정하였다. - 62 -
나. 빙과류 빙과류의법적규격에의해일반세균수및대장균군에대한항목을설정하였고, 또한제품의특성상저온에서생육이가능한 Y. enterocolitica와 L. monocytogenes를미생물위해요소항목에추가하였다. 원료에서는포자형성식중독균인 B. cereus를, 화학적위해요소로는중금속및곰팡이독소 M1을분석항목으로설정하였다. 가공용수의적합성을평가하기위해먹는물관리법에근거하여살모넬라, 분원성연쇄상구균, 분원성대장균군, 대장균군, 아황산환원혐기성포자균, 녹농균, 쉬겔라등을위해평가항목으로설정하였으며, 가공과정중교차 오염및적합성여부에대해서는 L. monocytogenes 및 S. aureus 등에대해, 화 학적위해요소로사카린나트륨, 산화방지제, 보존료및타르색소에대한평가 를실시하였다 ( 표 3). 표 3 빙과류의제품에서상되는위해요소 (Potential s of ices) 구분위해요소근거 Y. enterocolitica 발생보고 S. aureus 교차오염 Salmonella spp 가공용수의적합성 B. cereus 원료오염 L. monocytogenes 환경오염 미생물학적 화학적 분원성연쇄상구균분원성대장균군아황산환원혐기성포자균녹농균쉬겔라일반세균수진균수대장균대장균군사카린나트륨중금속산화방지제곰팡이독소 M1 보존료타르색소 가공용수의적합성가공용수의적합성가공용수의적합성가공용수의적합성가공용수의적합성법적규격환경오염분변오염법적규격가공과정의적합성원료오염가공과정의적합성원료오염가공과정의적합성가공과정의적합성 - 63 -
(1) 원료빙과류에대한분석항목은다음과같다. 백설탕, 맥아엿, 액상과당, 탈지유조제품, 유청분말, 혼합제제 ( 안정제 ) 에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균군수, S. aureus, Salmonella spp., B. cereus, L. monocytogenes를분석하였고, 화학적위해요소는상기원료를포함한전체원료에대해보존료, 타르색소, 산화방지제, 사카린나트륨, 곰팡이독소아플라톡신 M1을분석하였다. 용수에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균, 대장균군, 분원성대장균군, 분원성연쇄상구균, 녹농균, 아황산환원혐기성포자균, 쉬겔라를분석하였다. (2) 제조공정 빙과류의제조공정에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균군수, S. aureus, L. monocytogenes 를분석하였다. (3) 완제품빙과류의제품에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균군수, 대장균, 진균수, Y. enterocolitica, S. aureus, B. cereus, L monocytogenes, 화학적위해요소로보존료, 타르색소, 곰팡이독소아플라톡신 M1을분석하였다. (4) 제조환경 빙과류제조시일반위생관리에대한평가를위해제조기기및설비, 작업자 대해일반세균수, 대장균군수, 진균수에대한오염도를측정하였다. - 64 -
다. 냉동수산식품냉동수산식품의경우법적규격에의해미생물학적으로일반세균수및대장균을분석하였고, 화학적위해요소로보존료및타르색소를분석하였다. 또한국내외의굴, 새우, 대합등의해산물에의한 V. parahaemolyticus 식중독보고사례및저온에서생육이가능하고작업장내환경오염을일으키는 L. monocytogenes 의특성을고려하여미생물학적위해항목에반영하였다. 원료로부터오염가능한 B. cereus에대해모니터링을실시하였으며, 가공용수의적합성을평가하기위해먹는물관리법에근거하여살모넬라, 분원성연쇄상구균, 분원성대장균군, 대장균군, 아황산환원혐기성포자균, 녹농균, 쉬겔라등을위해평가항목으로설정하였다. 가공과정중교차오염및적합성여부에대해서는 S. aureus에대한모니터링실시하였고, 화학적위해요소로사카린나트륨, 산화방지제, 보존료및타르색소에대한평가를실시하였다 ( 표 4). 표 4 냉동수산식품에서상되는위해요소 (Potential s of frozen fishery product) 구분위해요소근거 미생물학적 화학적 V. parahaemolyticus 발생보고 S. aureus 교차오염 Salmonella spp 가공용수의적합성 B. cereus 원료오염 L. monocytogenes 발생보고 분원성연쇄상구균 가공용수의적합성 분원성대장균군 가공용수의적합성 아황산환원혐기성포자균 가공용수의적합성 녹농균 가공용수의적합성 쉬겔라 가공용수의적합성 일반세균수 법적규격 진균수 환경오염 대장균 법적규격 대장균군 가공용수의적합성 보존료 법적규격 타르색소 법적규격 - 65 -
(1) 원료냉동수산식품에대한분석항목은다음과같다. 새꼬리민태, 빵가루, 밀가루, 전분에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균군수, V. parahaemolyticus, S. aureus, Salmonella spp., B. cereus를분석하였고, 화학적위해요소는상기원료를포함한전체원료에대해보존료, 타르색소를분석하였다. 용수에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균, 대장균군, 분원성대장균군, 분원성연쇄상구균, 녹농균, 아황산환원혐기성포자균, 쉬겔라를분석하였다. (2) 제조공정 냉동수산식품의제조공정에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균 군수, 대장균, S. aureus, B. cereus 를분석하였다. (3) 완제품냉동수산식품의제품에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균군수, 대장균, V. parahaemolyticus, S. aureus, L. monocytogenes, B. cereus를, 화학적위해요소로보존료, 타르색소를분석하였다. (4) 제조환경 냉동수산식품제조시일반위생관리에대한평가를위해제조기기및설비, 작업자대해일반세균수, 대장균군수, 진균수에대한오염도를측정하였다. - 66 -
라. 냉동만두류냉동만두류에대한법적규제미생물로일반세균수및대장균을분석하였다. 또한돈육및부추등원료로부터유래될수있는 E. coli O157:H7, L. monocytogenes, Salmonella spp. 에대해모니터링을실시하였다. 가공용수의적합성을평가하기위해먹는물관리법에근거하여살모넬라, 분원성연쇄상구균, 분원성대장균군, 대장균군, 아황산환원혐기성포자균, 녹농균, 쉬겔라등을위해평가항목으로설정하였으며, 가공과정중교차오염및적합성여부에대해서는 S. aureus와화학적위해요소로사카린나트륨, 산화방지제, 보존료및타르색소에대한평가를실시하였다 ( 표 5). 표 5 냉동만두류의제품에서의상되는위해요소 (Potential s of frozen dumplings) 구분위해요소근거 미생물학적 화학적 E. coli O157:H7 원료오염 S. aureus 교차오염 Salmonella spp 원료오염 B. cereus 원료오염 L. monocytogenes 환경오염 분원성연쇄상구균 가공용수의적합성 분원성대장균군 가공용수의적합성 아황산환원혐기성포자균 가공용수의적합성 녹농균 가공용수의적합성 쉬겔라 가공용수의적합성 일반세균수 법적규격 진균수 환경오염 대장균 법적규격 대장균군 가공용수의적합성 보존료 가공과정의적합성 산화방지제 가공과정의적합성 타르색소 가공과정의적합성 사카린나트륨 가공과정의적합성 (1) 원료 냉동만두류에대한분석항목은다음과같다. 돼지고기, 부추, 돈지, 당면, 두부, - 67 -
난백에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균군수, S. aureus, Salmonella spp., B. cereus, E. coli O157:H7을분석하였고, 화학적위해요소는상기원료를포함한전체원료에대해보존료, 타르색소, 산화방지제, 사카린나트륨을분석하였다. 용수에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균, 대장균군, 분원성대장균군, 분원성연쇄상구균, 녹농균, 아황산환원혐기성포자균, 쉬겔라를분석하였다. (2) 제조공정 냉동만두류의제조공정에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균, S. aureus, B. cereus, Salmonella spp., L. monocytogenes 를분석하였다. (3) 완제품냉동만두류의제품에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균군수, 대장균, E. coli O157:H7, S. aureus, Salmonella spp., B. cereus, L. monocytogenes, 화학적위해요소로보존료, 타르색소, 사카린나트륨을분석하였다. (4) 제조환경 냉동만두류제조시일반위생관리에대한평가를위해제조기기및설비, 작 업자대해일반세균수, 대장균군수, 진균수에대한오염도를측정하였다. - 68 -
마. 어묵류어묵류의법적규제항목인대장균군, 보존료, 타르색소에대해각각미생물학적, 화학적위해요소로모니터링하였다. 주원료인해산물로인한 V. parahaemolyticus와 L. monocytogenes의오염가능성을고려하여이를위해항목에추가하였다. 원료로부터오염가능성이높은 B. cereus에대해모니터링을실시하였으며, 가공용수의적합성을평가하기위해먹는물관리법에근거하여살모넬라, 분원성연쇄상구균, 분원성대장균군, 대장균군, 아황산환원혐기성포자균, 녹농균, 쉬겔라등을위해평가항목으로설정하였다. 가공과정중교차오염및적합성여부에대해서는 S. aureus에대한모니터링실시하였고, 화학적위해요소로사카린나트륨에대한평가를실시하였다 ( 표 6). 표 6 어묵류의제품에서의상되는위해요소 (Potential s of fish pastes) 구분위해요소근거 미생물학적 S. aureus 교차오염 Salmonella spp 가공용수의적합성 B. cereus 원료오염 L. monocytogenes 발생보고 V. parahaemolyticus 발생보고 C. botulinum 발생보고 분원성연쇄상구균 가공용수의적합성 분원성대장균군 가공용수의적합성 아황산환원혐기성포자균 가공용수의적합성 녹농균 가공용수의적합성 쉬겔라 가공용수의적합성 일반세균수 일반위생 진균수 환경오염 대장균 분변오염 화학적 대장균군보존료타르색소사카린나트륨 법적규격법적규격법적규격가공과정의적합성 - 69 -
(1) 원료 어묵류에대한분석항목은다음과같다. 연육 ( 명태 ), 연육, 연육 ( 메 퉁이 ), 조 미액, 난백액, 가쓰오엑기스에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균군수, V. parahaemolyticus, S. aureus, Salmonella spp., B. cereus를분석하였고, 화학적위해요소는상기원료를포함한전체원료에대해보존료, 타르색소, 사카린나트륨을분석하였다. 용수에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균, 대장균군, 분원성대장균군, 분원성연쇄상구균, 녹농균, 아황산환원혐기성포자균, 쉬겔라를분석하였다. (2) 제조공정 어묵류의제조공정에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균군, S. aureus, B. cereus 를분석하였다. (3) 완제품어묵류의 제품에 대해 미생물학적 위해요소로 일반세균수, 대장균군, V. parahaemolyticus, S. aureus, L. monocytogenes, B. cereus, C. botulinum 을화학적위해요소로보존료, 타르색소, 사카린나트륨을분석하였다. (4) 제조환경 어묵류제조시일반위생관리에대한평가를위해제조기기및설비, 작업 자대해일반세균수, 대장균군수, 진균수에대한오염도를측정하였다. - 70 -
바. 레토르트식품레토르트식품의법적규격에의해미생물학적으로일반세균수, 내열성세균수, 세균발육시험을, 화학적으로는타르색소에대해위해요소모니터링을실시하였다. 열처리공정의적합성여부를판단하고유통중성장가능성등을고려하여 B. cereus, C. perfringens, C. botulinum 등의내열성포자형성균을미생물학적위해요소로설정하였다. 가공용수의적합성을평가하기위해먹는물관리법에근거하여살모넬라, 분원성연쇄상구균, 분원성대장균군, 대장균군, 아황산환원혐기성포자균, 녹농균, 쉬겔라등을위해평가항목으로설정하였으며, 가공과정중교차오염및적합성여부에대해서는 S. aureus와화학적위해요소로보존료, 타르색소, 사카린나트륨및농약에대한평가를실시하였다 ( 표 7). 표 7 레토르트식품의제품에서의상되는위해요소 (Potential s of retort food) 구분위해요소근거 미생물학적 화학적 C. perfringens 발생보고 S. aureus 교차오염 Salmonella spp 가공용수의적합성 B. cereus 원료오염 C. botulinum 원료오염 세균발육시험 법적규격 내열성세균수 법적규격 분원성연쇄상구균 가공용수의적합성 분원성대장균군 가공용수의적합성 아황산환원혐기성포자균 가공용수의적합성 녹농균 가공용수의적합성 쉬겔라 가공용수의적합성 일반세균수 법적규격 진균수 환경오염 대장균 분변오염 대장균군 가공용수의적합성 보존료 가공과정의적합성 타르색소 법적규격 사카린나트륨 가공과정의적합성 농약 가공과정의적합성 - 71 -
(1) 원료레토르트식품에대한분석항목은다음과같다. 양파, 냉동감자, 쇠고기, 세절당근, 쇠고기육수농축액에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 내열성세균수, C. botulinum, C. perfringens, S. aureus, Salmonella spp., B. cereus를분석하였고, 화학적위해요소는상기원료를포함한전체원료에대해보존료, 타르색소, 농약, 사카린나트륨을분석하였다. 용수에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 대장균, 대장균군, 분원성대장균군, 분원성연쇄상구균, 녹농균, 아황산환원혐기성포자균, 쉬겔라를분석하였다. (2) 제조공정 레토르트식품의제조공정에대해미생물학적위해요소로일반세균수, 내열성 세균수, S. aureus, B. cereus, C. botulinum, C. perfringens 를분석하였다. (3) 완제품레토르트 식품에 대해 미생물학적 위해요소로 세균발육시험, S. aureus, B. cereus, C. botulinum, C. perfringens를, 화학적위해요소로보존료, 타르색소, 농 약을분석하였다. (4) 제조환경 레토르트식품제조시일반위생관리에대한평가를위해제조기기및설비, 작업자대해일반세균수, 대장균군수, 진균수에대한오염도를측정하였다. - 72 -
3. 식품별위해요소분석시험결과 비가열음료, 빙과류, 냉동수산식품, 냉동만두류, 어묵류, 레토르트생산업체 에서원료, 제조공정, 완제품, 그리고제조환경에대한미생물학적, 화학적위해 요소에대한분석을하였다. 가. 비가열음료 (1) 원료의오염현황 ( 가 ) 미생물학적위해요소 1 일반세균수및대장균군류비가열음료의원 부재료에대한일반미생물검사를실시하였다. 표 8에나타난바와같이원료중에서일반세균수및대장균군수가가장높은것은신선초로오염수준은일반세균수가 2.1 10 7 CFU/g, 대장균군수가 2.5 10 6 CFU/g으로나타났고, 사과의경우원료중가장낮은오염도를나타냈다. 또한용수에서대장균군양성결과가나와이에대한적절한관리가필요한것으로나타났다. 대체적으로토양과접하여생육하는원료에서높은오염도가나타났으며, 이들로부터의분변오염가능성도높은것으로나타났다. 표 8 비가열음료의원료에대한일반미생물분석결과 (Microbiological evaluation of raw materials in non-pasteurized beverage) 시료 일반세균수 (CFU/g) 대장균군 (CFU/g) : 정량실험 대장균군 : 정성실험 대장균 분원성대장균군 케일 2.5 10 4 4.4 10 3 - - - 사과 1.6 10 3 1.0 10 1 - - - 양배추 2.1 10 6 1.1 10 3 - - - 신선초 2.1 10 7 2.5 10 6 - - - 용수 1.3 10 1 -* 양성 음성 음성 포장재 <10 <10 - - - 주 ) <10 : 10배희석시평판상에 colony가없음 - * : t tested 2 병원성미생물 - 73 -
비가열음료의원료에대한병원성미생물검사를실시하였다 ( 표 9). 용수는먹는물관리법에의거하여해당관리항목을대상으로실시하였으며, 포장재는접촉에의한오염을고려하여 S. aureus 분석만을수행하였다. 표 2에나타난결과와같이병원성미생물은모든시료에서검출되지않았다. 표 9 비가열음료의원료에대한병원성미생물분석결과 (Detection of pathogens in raw materials of non-pasteurized beverage) 시료 E. coli O157:H7 Salmonella spp. S. aureus B. cereus L. monocytogenes 분원성연쇄상구균 녹농균 아황산환원혐기성포자균 케일음성음성음성음성음성 - - - - 사과음성음성음성음성음성 - - - - 양배추음성음성음성음성음성 - - - - 신선초음성음성음성음성음성 - - - - 쉬겔라 용수 -* 음성 - - - 음성음성음성음성 포장재 - - 음성 - - - - - - - * : t tested ( 나 ) 화학적위해요소 표 10 과같이비가열음료의원료에대한화학적위해요소분석을실시한결 과, 케일, 사과, 양배추, 신선초의보존료, 타르색소분석결과가모두불검출이 었으며, 케일, 신선초에대한농약분석결과는 Bifenthrin 이 0.015~0.037 ppm 으 로검출되어케일과신선초에대해법적기준치는없으나다른유사농산물과비 교한결과우려할만한수치는아닌것으로측정되었다. 원료에대한화학적위 해요소에대한분석을실시한결과우려할만한위해요소는없는것으로결정되 었다. 표 10 비가열음료의원료에대한화학적위해요소분석결과 (Chemical evaluation of raw materialsin non-pasteurized beverage) 시료 보존료 (mg/kg) 타르색소 (mg/kg) 농약 (mg/kg) 케일 불검출 불검출 Bifenthrin 0.015 사과 불검출 불검출 -* 양배추 불검출 불검출 - 신선초 불검출 불검출 Bifenthrin 0.037 - * : t tested - 74 -
(2) 제조공정의오염현황 ( 가 ) 미생물학적위해요소 1 일반세균수및대장균군수비가열음료의원료를대상으로각제조공정에서의일반세균수와대장균군수검사를실시하였다 ( 표 11). 신선초는모든제조공정을거친후의대장균군수가 4.4 10 6 CFU/g으로차아염소산침지전초기단계의수준에비해그수가 100배가량증가하였고, 케일은초기대장균군수가 10 CFU/g 미만이었으나최종저장 후의공정에서는 4.8 10 4 CFU/g 을나타내어공정중오염이심각한것으로나타 났다. 양배추의경우에도차아염소산침지후의일반세균수와대장균군수가감소하지않았고오히려이들원료의혼합과냉각저장후에는오염도가높은신선초와케일때문에전체적인오염도가증가되는것으로나타났다. 또한신선초와케일모두고압세척후일반세균수와대장균군수가이전단계의수준에비해 10 1 ~10 3 배까지급증하는경향을보이는것으로보아, 원료의고압세척단계에서의작업용수관리및세절기나착즙기로부터의 2차오염방지가필요한것으로판단되었다. - 75 -
표 11 비가열음료의제조공정에대한일반미생물분석결과 (Microbiological evaluation on the production of non-pasteurized beverages) 시료 일반세균수 (CFU/g) 대장균군 (CFU/g) 신선초 ( 차아염소산침지전 ) 1.1 10 6 4.5 10 4 신선초 ( 차아염소산침지후 ) 1.0 10 5 5.8 10 4 신선초 ( 밑부분절단후 ) 4.6 10 5 3.9 10 4 신선초 ( 고압세척후 ) 1.4 10 6 5.7 10 5 신선초 ( 스쿠류착즙후 ) 1.9 10 6 3.5 10 5 신선초 ( 저장후 ) 3.8 10 6 4.4 10 6 케일 ( 차아염소산침지전 ) 2.7 10 4 <10 케일 ( 차아염소산침지후 ) 1.1 10 4 9.3 10 2 케일 ( 고압세척후 ) 2.9 10 5 1.5 10 5 케일 ( 유압착즙후 ) 4.5 10 6 4.7 10 5 케일 ( 저장후 ) 2.7 10 5 4.8 10 4 사과 ( 세척전 ) <10 <10 사과 ( 차아염소산침지후 ) <10 <10 사과 ( 젖산침지후 ) <10 <10 사과 ( 헹굼후 ) 2.6 10 4 1.1 10 4 사과 ( 착즙후 ) 6.2 10 4 2.6 10 3 사과 ( 저장후 ) 8.0 10 4 5.7 10 3 양배추 ( 썰기후 ) 2.5 10 4 3.3 10 3 양배추 ( 차아염소산침지후 ) 3.1 10 4 2.0 10 3 양배추 ( 물세척후 ) 1.4 10 4 4.7 10 2 양배추 ( 착즙후 ) 1.8 10 4 1.2 10 2 양배추 ( 저장후 ) 6.5 10 4 1.1 10 3 혼합후 9.9 10 4 2.3 10 4 냉각저장후 1.0 10 5 4.4 10 4 주 ) <10: 10배희석시평판상에 colony가없음 2 병원성미생물비가열음료의원료를대상으로각제조공정에서의병원성미생물검사를실시한결과, 표 12에나타난바와같이모든제조공정에서병원성미생물이검출되지않았다. - 76 -