The Korean Journal of Microbiology (2011) Vol. 47, No. 2, pp. 158-162 Copyright c 2011, The Microbiological Society of Korea 단보 Proteus mirabilis 전사조절단백질의 DNA 결합특성 강종백 * 경원대학교화학과 DNA Binding Specificity of Proteus mirabilis Transcription Regulator JongBack Gang Department of Chemistry, Kyungwon University, Sungnam, Kyunggido 461-701, Republic of Korea (Received April 8, 2011 / Accepted May 26, 2011) Amino acid sequence alignment shows that Proteus mirabilis transcription regulator (PMTR) has cystein sequence homology at metal binding domain to CueR (copper resistance) protein, which conserves two cysteins (Cys 112 and Cys 120 in PMTR). Gel shift assay revealed that PMTR protein bound to promoter region of Escherichia coli copa (copper-translocating P-type ATPase) and Proteus mirabilis atpase (putative copper-translocating P-type ATPase) genes except that of E. coli znta (zinc-translocating P-type ATPase) gene. DNase I protection experiment indicated that PMTR protein protected the region over -35 box and close to -10 box. DNase I hypersensitive bases were shown at C and A bases of labeled template strand and at G and C bases of labeled non-template strand of DNA. These hypersensitive bases were appeared in other metalloregulatory proteins of MerR family, which suggests protein-induced DNA bending. Keywords: MerR family, metalloregulatory protein, protein-dna interaction 철, 아연, 구리, 망간그리고코발트등의금속이온들은산화-환원반응, 삼투압조절, 그리고효소의성분을구성하는필수적인요소들이다 (17). 그러나높은농도의금속이온들은 DNA, 세포막, 그리고효소의작용에유해하다. 그래서박테리아는세포내 외의격리 (intra- and extracellular sequestration), 배출펌프 (efflux pumps), 효소에의한비독성화 (enzymatic detoxification), 혹은환원 (reduction) 등의다양한저항성 ( 항상성 ) 시스템을이용한다 (11, 15). 세포내중금속저항성은중금속조절 (metalloregulatory) 단백질의중금속특이적결합과이들복합체에의한중금속저항시스템유전자의발현으로이루어진다. MerR ( 수은저항성, mercuric resistance) 패밀리는널리연구된중금속조절단백질패밀리이다. MerR 패밀리에 MerR ( 수은저항성 )(2, 7), ZntR ( 아연저항성 )(5, 16), 그리고 CueR ( 구리저항성 )(5, 14) 등의단백질이속한다. MerR 패밀리단백질은아미노말단의 DNA 결합부위에서아미노산서열의유사성이높으나, 카르복실도메인의중금속결합부위는아미노산서열의유사성이낮으며이는중금속의선택적결합에관여한다. 그리고두도메인을연결하는링커 (linker helix) 로 * For correspondence. E-mail: jbgang@kyungwon.ac.kr; Tel: +82-31- 750-5409; Fax: +82-31-750-5389 이루어진다. 중금속결합부위에중금속의결합으로인한단백질의구조적인변화가링커를통하여 DNA 결합부위에전달되는방식으로해당유전자의발현을조절한다. 또한링커는단백질의이중체 (dimer) 형성에필수적이다 (3). Noll 등 (12) 에의하면 pmtr 유전자를포함한 DNA 조각이클로닝된재조합플라즈미드 (plasmid) 로형질전환된 Escherichia coli에서 12-kDa 단백질이세포내축적되었으며, 두개의아연이온결합부위를보유한이단백질로인해서세포는아연저항성을보였다. 그러나 MerR 패밀리단백질들의아미노산서열분석 (Fig. 1) 에의하면 PMTR 단백질은 CueR 단백질과같이중금속결합부위에두개의시스테인 (C112와 C120) 만이존재한다. 반면에 ZntR 단백질은 PMTR에서언급된두개의시스테인에추가로두개의시스테인 (Cys 79와 Cys 115) 과히스티딘 (His 119) 이아연결합에참여한다 (5, 17). 그래서 PMTR 단백질은아연과결합하는 ZntR 단백질과달리 CueR 단백질과같은중금속의결합이예상된다. 본연구는겔시프트법 (gel shift assay) 을이용하여 E. coli 의 copa (copper-translocating P-type ATPase gene) (14) 와 znta (zinc-translocating P-type ATPase gene) (13) 프로모터그리고 Proteus mirabilis (P. mirabilis) 의 atpase (8) 프로모터 (copper-translocating P-type ATPase gene) 와 PMTR 단백
P. mirabilis 전사조절단백질의 DNA 결합특성 159 Fig. 1. Amino acids sequence alignment of MerR family proteins. HTH means helix-turn-helix for DNA binding motif. Asterisks (*) denote the conserved cysteins in all proteins listed here. In addition, dot ( ) symbols indicate the additional cysteins or histidine required for the binding of metal in MerR or ZntR. Invariant and similar residues are shaded black and grey, respectively. 질사이의결합을관찰하였다. 그리고 DNase I protection 실험으로 P. mirabilis의 atpase 프로모터에서 PMTR 단백질의결합부위와단백질결합에따른 DNA 구조적변화를관찰하였다. pmtr 유전자는 P. mirabilis 유전체일부가포함된 PROT1 플라즈미드 (12) 로부터 PCR 증폭과벡터와동일한제한효소에의한절단으로발현벡터 pet15b (Novagen) 에클로닝하였다 (8). 이렇게구축된재조합벡터에서생성되는 PMTR 단백질은 6개의히스티딘태그 (tag) 와짧은펩티드가추가로붙는다. 37 C에서배양액의흡광도가 0.5-0.6에도달된후, PMTR 단백질은 isopropyl β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) 를부가하여 25 C에서 4시간동안유도되었다. 단백질분리는 Ni-NTA 아가로스 (agarose) 수지 (Qiagen) 와이미다졸 (imidazole) 농도기울기를이용하여단백질을분리하였다. 순수하게분리된 PMTR 단백질은 15% SDS-PAGE (sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis) 에의하여확인하였으며, 95% 이상의순도를갖는다 ( 자료미제시 ). 단백질의농도는계산에의한몰흡광계수값 (6) 과 BSA단백질을이용한 Lowry 방법으로결정된농도를비교하여결정되었다. CopA, znta, 그리고 P. mirabilis의 atpase 올리고디옥시뉴클레오티드 (oligodeoxynucleotide, 바이오니아 ) 의염기서열은 Fig. 6의프로모터양끝에약간의염기들이추가되었다 ( 각올리고뉴클레오티드의 5 끝에형광물질인 fluorescein 부착, 바이오니아 ): 5 -CTTGACCTTCCCCTTGCTGGAAGGTTTT AACCTT-3 (E. coli copa), 5 -TAAAACTTGACTCTGGAG TCGACTCCAGAGTGTATCCTTCGG-3 (E. coli znta), 5 -ATAATCCTTGACCTTCCCCTAATGGTAAAGCTTAAGC TTTGT-3 (P. mirabilis atpase). 위의각가닥과상보적인가닥을동일한몰수로취하여 10 mm sodium cacodylate (ph 6.5) 용액에서 80 C에서 10분동안중탕한후서서히실온으로냉각시킴으로써, 겔시프트법에필요한 duplex DNA를준비하였다. 겔시프트법실험에서 0.1 μm duplex DNA와 PMTR 단백질그리고중금속이온이포함된결합용액 [20 mm Tris; ph 7.5, 50 mm NaCl, 10 μg/ml poly d(ic)] 에서 20분간실온 (~15 C) 에서중탕하였다. 이렇게준비된반응용액을 TAE 완충용액 (Tris-Acetate EDTA) 에서 12% 폴리아크릴아미드겔에전기영동하였다. 전기영동이끝난겔은건조하여 470 nm 들뜬 (excitation) 파장과 535 nm 방출 (emission) 파장에서코닥이미지스캐너 (Kodak image scanner) 로자료를얻었다. 겔시프트법 (Fig. 2) 에서 PMTR 단백질은중금속이없거나낮은농도 (10 μm) 에서 E coli copa와 P. mirabilis atpase 프로모터에복합체를잘형성하지만중금속농도가 100 μm에서 PMTR 단백질의결합력이급격히감소하였다. 여기서중금속농도에따른 PMTR 단백질과프로모터사이의결합의존성을 Fig. 2. Gel shift assay of E. coli copa and P. mirabilis atpase. 0.1 μm DNA and 1.2 μm PMTR were used in each reaction. F copa and F atpase denote free duplex DNA of E. coli copa and P. mirabilis atpase, respectively. C 1 and C 2 indicate PMTR:DNA complexes. Lanes 1 and 5 contain no PMTR and metal. Lanes 2 and 6 contain PMTR only. Lanes 3 and 7 contain PMTR with 10 μm Cu(I). Lanes 4 and 8 have PMTR with 100 μm Cu(II). Cu(I) stock solution was freshly prepared in 0.1 M HCl and 4% NaCl in a glove box under N 2 atmosphere.
160 JongBack Gang Fig. 3. Gel shift assay of E. coli copa and P. mirabilis atpase with various concentration of Cu(II). 0.1 μm DNA and 0.6 μm PMTR were used in each reaction. F copa and F atpase denote free duplex DNA of E. coli copa and P. mirabilis atpase, respectively. C 1 and C 2 indicate PMTR:DNA complexes. Lanes 1 and 5 have PMTR with no metal. Lanes 2 and 6 include PMTR with 10 μm Cu(II). Lanes 3 and 7 have PMTR with 20 μm Cu(II). Lanes 4 and 8 retain PMTR with 50 μm Cu(II). 관찰하기위하여 Fig. 3과 Fig. 4의실험을수행하였다. 이실험들은 PMTR 단백질의결합력이중금속 Cu(I) 혹은 Cu(II) 의농도가증가함에따라억제되는경향을보여준다. 존재하는 PMTR 단백질의농도에따라서중금속에대한영향이다르게나타나지만, 0.6 μm PMTR 농도와 50 μm 이상의중금속농도에서 PMTR:DNA 복합체가관찰되지않았다 (Fig. 3의 lane 4와 8), 1.2 μm PMTR을사용한경우는 100 μm Cu(II) 에서 PMTR:DNA 복합체가거의관찰되지않았다 (Fig. 2의 lane 4와 8). 이와동일한실험결과 (14) 가 CueR 단백질에도관찰되었으며, CueR 단백질만존재할때보다 Cu(II) 와 Cu(I) 이온이존재할때 DNA 결합에필요한단백질의농도가증가함을보였다. 이런 PMTR 단백질의 DNA 결합력이높은중금속농도에서중금속과의결합으로인한단백질의구조적인변화가능성을 CD (circular dichroism) 스펙트럼으로관찰하였다 ( 미발표자료 ). CD 스펙트럼에의하면 100 μm 중금속이존재할때먼 UV 파장범위 (far UV region) 에서 PMTR 단백질의알파나선이 59.8%( 단백질만존재 ) 에서 62.9%( 단백질과중금속 ) 로크게변화하지않았다. 그러므로이실험에서사용된단백질과중금속의농도비율에서차이가있기는하지만, 중금속에의한단백질의급격한구조적인변화는없는것으로여겨진다. 그리고아연이온은 PMTR 단백질이 DNA에결합할때억제하는경향을보이지않았다 ( 미발표자료 ). 이것은아마도아연이온이 PMTR 단백질에결합하지않거나혹은구리이온이단백질에결합하는것과다른형태로아연이온이결합할지도모른다. PMTR 단백질은 atpase와 copa 프로모터에결합하지만 (Figs. 2-4), 그러나 PMTR 농도의증가및아연의존재와상관없이 PMTR 단백질과 znta 프로모터사이에복합체형성이거의관찰되지않았다 ( 자료미제시 ). 그리고 Fig. 6에서 -35와 -10 사이의프로모터염기서열 (3) 을비교하면, E. coli znta와 Fig. 4. Gel shift assay of E. coli copa with Cu(I). 0.1 μm DNA was used in each reaction. F copa denotes free duplex DNA of E. coli copa. C 1 and C 2 indicate PMTR:DNA complexes. Lane 1 has copa DNA only. Lanes 2 through 5 contain 0.06, 0.12, 0.24, 0.6 μm PMTR, respectively. Lanes 2 through 9 include the same concentration of PMTR as lanes 2 through 5 with 10 μm Cu(I). P. mirabilis atpase 사이는 45% 그리고 E. coli copa와 P. mirabilis atpase 사이는 74% 의염기서열이일치하였다. 또한 znta, copa, 그리고 atpase 프로모터에서역반복염기서열 (inverted repeat sequences) 은 -ACTCTGGAGTC-, -ACCTTC-, 그리고 -ACCTT- 이다 (3). 이반복염기서열중에서 P. mirabilis atpase 반복염기가 znta보다 copa 염기서열과상당히유사성을보인다. 이런이유로왜 PMTR 단백질이 znta 프로모터대신에 copa와 atpase 프로모터와복합체를잘형성하는지알수있다. 또한 Figs. 2-4에서낮은 PMTR 농도에서 C 1 복합체만이관찰되지만높은단백질농도에서 C 1 복합체와 C 2 복합체가관찰되었다. 이것은 PMTR:DNA (C 1 복합체 ) 복합체에또하나의 PMTR 단백질이추가로결합되었다는것을의미한다. 그러나높은단백질농도에서어떻게 C 2 복합체가형성되었는지는명확하지않다. 예로서 SmtB (cyanobacterial metallothionein repressor) 단백질은역반복염기서열의반쪽부위에단백질이약하게먼저결합하고, 다음에나머지반쪽부위에다른 SmtB 이중체결합으로다중단백질 (multi-protein) 복합체를형성하는것으로보고되었다 (9). 또한, CzrA (zinc sensing protein) 단백질도마찬가지로다중단백질복합체를형성하는것으로확인되었다 (4). C 2 복합체를형성하는또다른가능성은 Fig. 6의 P. mirabilis atpase 프로모터에서 -35부근과중간부근에유사한역반복염기서열인 -ACCT-가반복하여위치하고있다. 그래서두개의역반복염기서열중에서선호하는부위에첫 PMTR 단백질이결합한이후에, 두번째 PMTR단백질이이미결합된단백질 :DNA 복합체에결합하여 C 2 복합체가형성되는지등의추가적인확인이필요하다. 단백질결합부위와단백질결합에따른 DNA의구조변화를관찰하기위하여 DNase I protection 실험을수행하였다. 먼저증폭에필요한한가닥의프라이머를 γ- 32 P ATP가존재하는상태에서폴리뉴클레오티드키나제 (polynucleotide kinase) 를처리한이후에 PROT1 플라즈미드 (12) 로부터 atpase 프로
P. mirabilis 전사조절단백질의 DNA 결합특성 161 (A) (B) Fig. 6. DNase I hypersensitive bases by ZntR, CueR, and PMTR proteins. Arrows indicate inverted repeat sequences. Dotted arrows show the possible inverted repeated sequences. Base sequences of -35 and -10 boxes are indicated with bold letters. Asterisks (*) indicate DNase I hypersensitive sites. DNase I hypersensitive data by ZntR and CueR were obtained from Ref. 16 and 13, respectively. Fig. 5. DNase I protection with labeled template (A) and non-template (B) strands. Reaction condition was mentioned in the content. 0.6 μm PMTR was used in reaction. Dot lines (----) shown above DNA sequences indicate the protected region by PMTR protein. G and A sequencing reactions were conducted by Maxam and Gilbert sequencing methods. + and - symbols denote either in the presence or absence of PMTR, respectively. 모터를 PCR로증폭하였다. DNase I 실험의반응조건은겔시프트법과동일한조건을사용하였다. 전기영동이끝난겔은건조하여포스포이미지스캐너 (phosphoimager scanner, Kodak) 를사용하여자료를얻었다. 그리고 DNA 염기서열결정반응은 Maxam과 Gilbert 방법 (10) 을사용하였다. Fig. 6 에서보듯이, PMTR 단백질의결합으로 -35 부위에서 -10 부위부근까지 DNase I에보호되었으며, 과민성염기는주형가닥 (template strand, Fig. 5A) 에서 C (-35 부근 ) 와 A (-10 부근 ) 염기들과비주형가닥 (non-template strand, Fig. 5B) 에서 G (-35 부근 ) 와 C (-10 부근 ) 염기들이다. Figure 6에서 ZntR 단백질과 znta 사이의과민성염기들은주형가닥에서 A (-10 부근 ) 와비주형가닥에서 A (-35 부근 ) 염기이지만, CueR 단백질과 copa 사이는주형가닥에서 C (-35 부근 ) 와 A (-10 부근 ) 염기들이며비주형가닥에서 A (-35 부근 ) 와 C (-10 부근 ) 염기들이다. 이런 DNase I 과민성염기들의유형에서 PMTR 단백질은 ZntR 단백질보다 CueR 단백질에가까운과민성염기유형을보이지만, -35 부근의 G염기에서다르다. 아마도 -35 부근에서 PMTR 단백질이 CueR 단백질과다른결합특성을나타내는것으로여겨진다. CAP:DNA 복합체에서보았듯이, 이런과민성염기들이갖는 DNA 구조적의미는단백질에의한 DNA bending이다 (1). 특히중금속단백질에의해서조절되는유전자들은 -35와 -10 사이의염기들의간격이 lactose 프로모터 (17 bp) 보다긴 18-20 bp 간격으로 RNA polymerase 와 -35와 -10 프로모터지역의염기들과효과적인상호작용을 이루지못한다. 그래서 ZntR 단백질을포함한 MerR 패밀리단백질에의한 DNA의구조적인변화인 DNA 뒤틀림 (DNA distortion) 등이수반된다 (13). 앞에서언급되었듯이, pmtr 유전자를포함한재조합플라즈미드로형질전환된대장균에서 PMTR 단백질이어떤작용을통하여아연이온저항성을증가시켰는지지금은설명할수없다. 하지만이를설명하기위하여, 우선구리이온뿐만아니라아연이온의단백질결합을확인하기위하여 1-5 mm DTT (dithiothreitol) 조건에서하나의 subunit에결합하는이온수를 ICP (Inductively Coupled Plasma) mass spectrometer 로확인중이다. 이결과를토대로세포내 외조건에서구축된재조합유전자를이용한전사실험 (transcription assay) 을통하여중금속에의한유전자의전사과정조절을관찰한다. 이런일련의실험으로충분할지모르지만상당부분지금의의문이설명될것으로기대된다. 적요 Proteus mirabilis 전사조절 (Proteus mirabilis transcription regulator) 단백질의중금속결합부위에대한아미노산서열분석에서 PMTR 단백질은 ZntR ( 아연저항성 ) 단백질이아닌 CueR ( 구리저항성 ) 단백질과동일한환경이다. 그리고겔시프트법 (gel shift assay) 실험에의하면 PMTR 단백질은 Escherichia coli의 znta (zinc-translocating P-type ATPase gene) 프로모터에결합하지않고 copa (copper-translocating P-type ATPase gene) 프로모터와 Proteus mirabilis에서 atpase (copper-translocating P-type ATPase gene) 프로모터에결합하였다. DNase I protection 실험에서 PMTR 단백질결합부위와 DNase I 민감성염기들이관찰되었다. P. mirabilis atpase 프로모터에서민감성염기로주형가닥 (template strand) 에서 C와 A 그리고비주형가닥 (non-template strand) 에서 G 와 C 염기들이다. 이런민감성염기들은다른 MerR 패밀리단백질에서또한관찰되었으며, 이것은단백질에의한 DNA
162 JongBack Gang bending 을의미한다. 감사의말 이논문은 2011년도경원대학교교내연구비지원에의한결과로이에감사를드립니다 (KWU-2011-R149). 특히, pmtr cloned vector의제공과실험에도움을준 Richard G. Brennan 박사 (University of Texas, MD Anderson Cancer Center at Houston), Svetlana Lutsenko 박사, James Lunblad 박사그리고 Joy L. Huffman 박사 (Oregon Health and Sciences University, Portland) 께감사드립니다. 또한 CD 스펙트럼자료를공유한고정호에게도감사를전한다. 참고문헌 1. Ansari, A.Z., J.E. Bradner, and T.V. O'Halloran. 1995. DNA-bend modulation in a repressor-to-activator switching mechanism. Nature 374, 371-375. 2. Barkay, T., S.M. Miller, A.O. Summer. 2003. Bacterial mercury resistance from atoms to ecosystems FEMS Microbiol. Rev. 27, 355-384. 3. Brown, N.L., J.V. Stoyanov, S.P. Kidd, and J.L. Hobman. 2003. The MerR family of transcriptional regulators. FEMS Microbiol. Rev. 27, 145-163. 4. Busenlehner, L.S., T.C. Weng, J.E. Penner-Hahn, and D.P. Giedroc. 2002. Elucidation of primary (α3n) and vestigial (α5) heavy metal binding sites in Staphlococcus aureus pi258 CadC: evolutionary implications for metal ion selectivity of ArsR/SmtB metal sensor proteins. J. Mol. Biol. 319, 685-701. 5. Changela, A., K. Chen, Y. Xue, J. Holschen, C.E. Outten, T.V. O'Halloran, and A. Mondragon. 2003. Molecular basis of metalion selectivity and zeptomolar sensitivity by CueR. Science 301, 1383-1387. 6. Gill, S.C. and P.H. von Hippel. 1989. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182, 319-326. 7. Hobman, J.L. 2007. MerR family transcription activators: similar design, different specificities. Mol. Microbiol. 63, 1275-1278. 8. Huffman, J.L. 2001. DNA and metal specificity of MerR family member PMTR, Proteus mirabilis transcription regulator. Ph. D. thesis. Oregon Health and Sciences University. 9. Kar, S.R., J. Lebowitz, S. Blume, K.B. Taylor, and L.M. Hall. 2001. SmtB-DNA and protein-protein interactions in the formation of the cyanobacterial metallothionein repression complex: Zn 2+ does not dissociate the protein-dna compex in vitro. Biochemistry 40, 13378-13389. 10. Maxm, A. and W. Gilbert. 1977. A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74. 560-564. 11. Nies, D.H. 1999. Microbial heavy-metal resistance. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, 730-750. 12. Noll, M., K. Petrukhin, and S. Lutchenko. 1998. Identification of a novel transcription regulator from Proteus mirabilis, PMTR, revealed a possible role of YJAI protein in balancing zinc in E. coli. J. Biol. Chem. 273, 21393-21401. 13. Outten, C.E., F.W. Outten, and T.V. O Halloran. 1999. DNA distortion mechanism for transcriptional activation by ZntR. J. Biol. Chem. 275, 31024-31029. 14. Outten, F.W., C.E. Outten, J. Hale, and T.V. O Halloran. 2000. Transcription activation of an Escherichia coli copper efflux regulon by the chromosomal MerR homologue, CueR. J. Biol. Chem. 275, 31024-31029. 15. Permina, E.A., A.E. Kazakov, O.V. Kalininia, and M.S. Gelfand. 2006. Comparative genomics of regulation of heavy metal resistance in Eubacteria. BMC Microbiol. 6, 1-11. 16. Singh, V.K., A. Xiong, T.R. Usgaard, S. Chakrabarti, R. Deora, T.K. Misra, and R.K. Jayaswal. 1999. ZntR is an autoregulatory protein and negatively regulates the chromosomal zinc resistance operon znt of Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 33, 200-207. 17. Zhen, M., F.E. Jacobsen, and D.P. Giedroc. 2009. Coordination chemistry of bacterial metal transport and sensing. Chem. Rev. 109, 4644-4681.