제 1 장제 1 장 콜레라 콜레라는인도지역에서수세기에걸쳐오랫동안상재했던질환으로 1917년이후 7차례의세계적유행을, 제7차세계적유행은 1960~1961년사이에마카오및홍콩지역에서시작하여아시아, 아프리카, 유럽, 남미등지로확산, 유행되었으며 2000년대에들어서도아프리카및동남아시아를비롯한여러국가에서유행적발생을보이고있다. 이 7차유행기간동안우리나라에서는 1963년, 1964년, 1969년, 1970년, 1980년, 1991년, 1995년, 1996년, 1997년, 1999년및 2001년에콜레라의유행적발생이있었다. 콜레라의병원체는 R. Koch에의하여 1883년최초로밝혀졌다. 1905년 El Tor 검역소에서발견된 El Tor 생물형이발견되기까지는주로 classical형에의한유행을보였으나 El Tor형이발견되면서점차 classical형보다가 El Tor형의유행이증가하였다 [2]. 신형콜레라균 (V. cholerae O139 또는 V. cholerae Bengal) 이밝혀지기전까지는 V. cholerae O1혈청군균이검역대상균으로지정되어국가방역상국제적으로중시되어왔으나 1992년신형콜레라균이밝혀짐에따라세계보건기구 (WHO) 에서는신형콜레라균도 V. cholerae O1 균주와같이국제보건규약에따라신형콜레라균이확인될경우 24시간이내에 WHO에보고하도록규정하였다. 제 1 장콜레라 3
병원체 V. cholerae균은그람음성단알균으로 1.5~3.0 0.4~0.6 μm정도의크기로현미경하에서는단일균또는짧은연쇄형태의배열을보이고한개의편모를가지고있어활발한운동성을보이며균주에따라서는혈액배지상에서용혈을나타낸다. 혐기성조건에서도성장가능한호기성균으로최적발육온도는 37 이고, ph 7.8~8.0 범위에서배양성이좋아진다. 콜레라균은 bile salt, bismuth sulfite, tellurite등억제제에내성을갖고있고 55 에서 10분동안처리할경우사멸될수있고건조에특히민감하며 Hydrogen Sulfide와 indole을생성하며 Nitrate를 Nitrite로환원시킨다. 당분해는일정하지않는데, dextrose, levulose, galactose, maltose, sucrose, 및 mannitol 등탄수화물에대해산을생성, 분해하는경우가있으나가스생성능은없다 [5]. V. cholerae O1균, V. cholerae O139균과기타 V. cholerae non-o1균의생화학적성상은유의한차이를보이지않지만대부분의환자유행은 V. cholerae O1균과 V. cholerae O139균에의해서발생한다. 콜레라균은호염균과에속하는균으로장내세균과와따로분류되고있지만배양성, 형태, 질병형등으로볼때장내세균과유사성이있다. V. cholerae O1균의생물형은 classical형과 El Tor형이있다 [9]. 콜레라균의형특이항원은균체항원으로 V. cholerae El Tor형과 V. cholerae classical형은모두혈청군 O1에속한다. 콜레라균은항원형성분을갖고있는형태에따라콜레라균의혈청형을 Inaba형, Ogawa형및 Hikojima형으로분류하며, 콜레라의혈청형은변이가가능한데, 주로 Ogawa형에서 Inaba형태로일어나는경우가유행말기에나타날수있다 [3]. 임상증상 콜레라균에감염을받을경우, 잠복기, 임상증세등은개체에따라현격히다를수가있다. 임상소견에있어서이러한개체의차이는콜레라균의장점막부착력, 장점막에침입한균의수, 침입부위에서의균의증식력, 콜레라균장독소생성력등에따른차이뿐아니라개체의위산분비력, 방어력등에도영향을받기때문이다. 잠복기는통상 3~5일로알려져있으나경우에따라서는감염수시간내에도발병할수있다 [9]. 4 감염병실험실진단제 1 부세균질환
초기임상증세는갑작스런설사증을보이며설사의빈도가잦아지고설사초기에는복통을느끼지못하며설사양태는심한물설사로쌀뜨물과같은설사를보이는것이특징적이다. 병증이진전되면서구토감, 전신쇠약, 근육경련, 어지러움증, 속이불편해지고복통과미열이수반될수있다. 발병초기단계에는다수의콜레라균이위산의장벽을통과한후소장내에감염이이루어지면서장독소에의한설사가일어나급격한수분및전해질의손실을초래된다. 쌀뜨물과같은설사는점액및탈락된상피세포를함유하고있다. 계속적인수분과 Bicarbonate 의손상으로인해현저한탈수및산독증 (acidosis) 현상이나타나다결국심한탈수현상이수반된다 [8]. 콜레라균에감염이되었어도임상적증세를보이지않는경우가흔히있다. 일반적으로불현성감염의경우, 감염자의분변검체 1 g당 10 2 ~10 3 정도의콜레라균이, 쌀뜨물과같은심한설사를보이는현성환자의경우, 1 g에 10 8 이상의콜레라균이검출되는것으로알려져있다. 환자에대한처치를적시에적절하게실시할경우, 치사율을 10~20% 또는 1% 이하로낮출수있다 [2]. 역학 콜레라환자의전파, 확산은대부분오염된물의섭취에의한수인성감염과가열처리되지않은오염된식품의섭취에의한감염으로전파, 확산된다. 콜레라의유행적확산은인도의 Bengal지방과같은콜레라상재지역에서통상적으로매년 2월경시작되어 Monsoon시기가시작되기직전인 4~5월경유행의절정에달하는것으로알려져있다. Bengal지역에서의보다소규모의 2차유행은통상 12월경에나타난다. 콜레라는이러한국지적유행에서부터수차례에걸쳐유럽을비롯한세계적대유행을보였다. 구미국가로의전통적확산전파경로는아프가니스탄을경유하여중동국가와동부유럽을통해전파되었다고본다. 현재의제7차세계적유행은 El Tor 생물형콜레라균에의하여이루어졌는데 El Tor 형은 1960년홍콩에서유행을보이기까지는인도네시아지역에서만소규모발병양상을보였었다. 1960년홍콩에서유행을보인후 1961년필리핀, 인도차이나, 서남태평양국가로확산되었으며 1963년에는우리나라에까지확산되었다. 이유행은 1964~1965년에이란, 이라크에까지, 1970~1971년에는러시아, 케냐, 북아프리카, 대서양연안국가, 나이제리아, 카메룬, 스페인, 포르투갈까지확산유행되었다 [2]. 제 7차콜레라의세계적유행은 2000년대에도계속되고있으며 제 1 장콜레라 5
다수국가에서콜레라의유행적발생이보고되고있다. 우리나라에서는제7차세계적콜레라유행기간동안 1963년, 1964년, 1969년, 1970년, 1980년, 1991년, 1995년, 1996년, 1997년, 1999년및 2001년에집단적이거나유행적발생을보였으며, 매년해외여행을통한유입이지속적으로확인되고있다. 표 1. 1963 년이후국내콜레라발생현황 연도유행기간환자수사망자수 1963 1964 1969 1970 1980 1991 1995 1996 1997 1998 1999 2001 36 31 59 77 47 32 16 2 17 - - 414 20 1,538 206 145 113 68 2 12-3 142 36 2 137 12 4 4 0 0 0-0 0 1992년 10월경 India에서 Bengal 지역에서부터유행하여 1993년초까지방글라데시에까지대유행을보였던기존의 O1 혈청군과다른새로운콜레라의원인병원체는 V. cholerae O139 혈청군또는 V. cholerae Bengal로칭하고있으며 WHO에서는 V. cholerae O1과같이 V. cholerae O139 균을확인했을경우세계보건규약에따라 WHO에보고하도록요구하고있다. V. cholerae O139 혈청군은 1994년우리나라에처음유입이된후, 한동안유입되지않다가 2000년이후거의매년유입사례가보고되고있다. 아직국내발생사례는없지만발생에대비한철저한감시가요구된다. 예방및관리 1. 예방 콜레라균의오염방지에는음식물조리나취급시에세심한청결이필요하며생식으 6 감염병실험실진단제 1 부세균질환
로섭취되는야채나과일의위생적취급과청결이요구된다. 만약위생상태가의심될때에는가열처리를통해섭취하는것이안전하다. 외출후, 식사전손씻기등개인위생관리도예방및전파확산방지에중요하다. 특히, 동남아시아, 아프리카등콜레라상재국가나저개발국가를여행할때에는위생적으로잘처리된물또는끓인물을섭취하여야하며, 익히지않은음식을먹는것은위험하므로주의하여야한다. 콜레라유행시예방접종은권장되지않는다. 2. 환자, 접촉자및위험환경에대한관리 해당지역보건당국에콜레라환자신고를해야한다. 법정전염병제1군에준한방역조치가시행되어야하며환자는의사의처치및지시를따라야하고환자접촉자에대하여최종폭로일로부터최소 5일동안을추적조사및검사가필요하다. 전염원과접촉자에대한역학적조사가필요하며, 이때오염된음용수나오염된식품으로부터의전염가능성등을조사해야한다. 또감염자관리를위하여환자접촉자에대한보균조사가필요하다. 환자에대한처치는전문의의처치및지시를따르는것이좋다. 통상저칼륨증 (hypokalemia) 상태를교정해주기위하여신속히처치해주는것이필요하다. 항생제투여로설사기간을단축시킬수있고설사로인한수분손실을줄임과동시에병원체의배설기간을단축시킬수있다. 3. 백신 현재개발되어있는백신의면역접종은유행관리나환자의접촉자관리에유용하지않다. 이백신은콜레라상재지역에서의임상보고에따르면짧은기간 ( 약 3~6개월 ) 동안에부분적방어 ( 약 50%) 효과만을보여주고있기때문에감염을예방하기어렵다. 따라서예방접종은통상적으로권장되고있지않다. 경구백신의경우도개발이상당히진행되어일부국가에서는시판되고있기도하나 O139에대해서는아직까지효과적인백신이존재하지않는다. 제 1 장콜레라 7
대변해 하수어패류뻘 1) rectal swab 또는 2) 채변통 1) 여과법 (0.45 μm ) 또는 2) APW 10 배농축액을 1:9 로첨가 1) 아가미내장부위 2) 패류는잘게썰음 3) 5 배량 APW 첨가 1) 아가미내장부위 2) 패류는잘게썰음 3) 5 배량 APW 첨가 선택감별배양 / TCBS 1) 37, 18~24hr 2) 플레이트는검체당 2개이상 3) 냉동어패류는 24~48hr배양 37, 6~8 시간배양배양시간초과시에는새로운 APW(5.5 부, 10 ml ) 에배양액을 1 ml넣어새로 6~8 시간배양 순수배양 / TSA 1) 37, 18~24hr 2) 검체당 5~10개집락선별 O-Ag 응집반응시험 1) O1, O139 항혈청시험 2) O1양성 ; Og, In 혈청형시험 생화학적동정시험 1) API, VITEK, ATB 등 2) V. cholerae 일경우 O-Ag 응집반응재시험 추가확인시험 1) 생물형 ; El Tor, Classical 2) 독소생산 ; PCR, RPLA 3) 분자역학시험 :PFGE 등 그림 1. 콜레라균분리, 동정, 확인을위한실험과정 8 감염병실험실진단제 1 부세균질환
실험실진단 1. 검사방법 콜레라환자관련검체는주로대변및직장채변검체, 오염음료, 오염식품등이며, 환경검체는해 하수, 갯벌흙, 어패류등이해당될수있으며, 각검체별체취방법은감염병실험실진단일반시험법 ( 검체채취및보존 ) 을참조한다 [1, 5, 6]. 1) 검체채취및수송검체는병원성미생물취급요령에대한교육을받은사람이채취하여야한다. 또검체채취즉시일련번호및관련사항을기록하도록한다. 1 대변및직장채변검체발병후 24시간이내항균제를사용하기전에채취하는것이좋다. 냉장상태로수송하며얼리지않도록한다. 자연변을얻을수없을때는직장채변도검체로서유효하다. 채취된대변이장시간운송이필요할때는 Cary & Blair 수송용배지에접종하여실온에서수송하고, 수시간내에실험실에서배양할수있을때에는 Alkaline peptone 수 (ph 8.4) 10 ml에 1/10 (v/w) 의대변을넣어수송한다. 2 물, 음료수또는해수멸균된용기에 1l이상채취하여냉장수송한다. 해수나하수는깊이 1m 이내의표층수만채취하도록하며채취양이적고수시간내에실험실에서배양할수있을때에는동량의 2배농축 Alkaline peptone수에넣어수송한다. 3 오염식품, 갯벌흙멸균된도구를사용, 무균적조작으로채취하여보존액에넣어운반하거나 peptone water에넣어수송한다. 2) 증균배양검체의증균은 Alkaline peptone수 (ph 8.4) 에접종하여 37 에서 6~8시간정치배양하는것을원칙으로한다. Vibrio속이아닌균들이높은 ph에서발육이억제되는특성을이용하는것이므로배양시간을잘지켜야한다. 만일 6~8시간의배양시간을지킬수없다면밤새배양한다음배양액의표층에서일부를덜어내어 10배의새로운 제 1 장콜레라 9
Alkaline peptone수에접종한다음 6시간동안정치배양을한다. 자세한증균방법은검체의종류에따라조금씩다르다 ( 그림 1 참조 ). 1 대변및직장채변검체 Alkaline peptone수 (ph 8.4) 10 ml에 1/10 (v/w) 의대변을넣어배양한다. 직장채변의경우, 채변봉의오염된부위를잘라낸다음 5~10 ml의 Alkaline peptone수에넣어배양한다. 2 물, 음료수또는해수 20 μm nitrocellulose 여과지를사용하여여과한다음, 여과지를잘게찢어 10 ml이상의 Alkaline peptone수에넣어배양한다. 갯벌흙등의부유물이많아바로여과하는것이힘든경우에는유리섬유여지로먼저여과시킨후 nitrocellulose 여과지를이용하여여과시킨다. 불가능한경우, 검체를 2~3시간정치시켜부유물이가라앉은다음, 상청액부분만을덜어내어여과할수도있다. 3 오염식품, 갯벌흙식품이나어패류의경우, 잘게부순다음, 2배농도의 Alkaline peptone수 (ph 8.4) 를같은양을넣어배양한다. 어류의경우아가미와내장부분만을떼어내어배양시키는것이좋으며이때 Alkaline peptone수의 ph는 9.4로맞추어야한다. 3) 선택배양 1 증균된균액을한백금이 ( 약 10 μl ) 떠서 TCBS 배지에집락이잘분리될수있도록접종한후 35~37 에서 18~24시간배양한다음직경 2~4 mm의노란집락을의심되는집락으로판단한다. 2 콜레라균은 TCBS 배지상에서 sucrose를분해하기때문에노란색집락을형성하게되며전형적인집락은윤기를띄고있으나환경검체등에서분리될경우에는노란색이약하거나집락크기가좀크게나타나는등비전형적인집락형태를보이는경우가많으므로집락선택에유의해야한다. 3 TCBS 배지는선택성이강하므로배지에접종할때에는일반적인접종방법처럼중간에백금이를교체할필요가없다. 그러나면봉으로직접접종하는것은독립된집락을얻기가어려우므로피한다. 10 감염병실험실진단제 1 부세균질환
3. 집락선택및콜레라균주분리 콜레라원인병원체를탐색하는방법중가장효과적인방법은슬라이드용항혈청을이용하는방법으로이장에서는항혈청을이용하여의심되는균주를찾아내어분리하는방법을기술하였다 [1, 5, 6]. 1) 항혈청을이용한콜레라균의탐색방법 1 TCBS 배지에서전형적인양상을보이는독립된집락의가운데부분을백금이나백금선으로가볍게떼어내서 NaCl 농도를 1% 로조정한 tryptic soy agar (TSA) 배지에접종한후독립된집락을선택하여 TCBS와 TSA 배지에각각계대배양한다. 2 순수분리된집락을선택하여먼저 O1 다가항혈청으로응집반응을확인한후, 양성이면 Ogawa, Inaba 혈청형을추가로확인한다. O1 다가항혈청에음성일경우에는 O139 항혈청에대한응집여부를확인한다. 3 상품화된콜레라진단용항혈청의다가항혈청은 O1 혈청군에대한항혈청을의미하며, 다가항혈청에응집을보이지않을경우에는반드시 O139 항혈청에대한응집여부를확인한다 (TCBS배지에서자란집락은위양성반응을보이는경우가많으므로혈청형확인실험에사용하지않는다 ). 4 혈청형의판정은다가항혈청에응집이된후, Ogawa 형항혈청에응집이되고, Inaba에응집이안되는경우 Ogawa 형으로, 반대의경우에는 Inaba형으로판정한다. 다가항혈청에응집이안되었으면 O139 로응집시험을실시한다. Ogawa와 Inaba형항혈청에모두응집이되는경우도있는데이럴경우에는생리식염수로응집시험을추가로실시하여자가응집여부를확인한다. 만일생리식염수에응집이되어자가응집으로판단되면비선택배지에계대하여혈청형을재확인하고, 생리식염수에응집이안되면 Hikojima 혈청형으로판정한다. 4 전술하였듯이 Ogawa와 Inaba형은항원형성분을공유하고있어응집정도의차이가나면서모두응집이일어나는경우가있다. 이경우에는 Hikojima 혈청형으로판정하는것이아니고응집정도가더강한쪽으로판정한다 ( 예, 만약 Ogawa형에 4+ 이고 Inaba형항혈청에대한응집결과가 2+ 이면 Ogawa 형으로판정 ). 제 1 장콜레라 11
2) 동정시험 O1이나 O139로판정이되었다고해서콜레라원인병원체로확인된것이아니므로반드시생화학동정을실시한다. 비선택배지에서자란독립된집락을선택하여, 미생물동정용키트등을이용하여생화학적인검사를수행한다. 혈청군이 O1이나 O139이고, 생화학적동정결과가 Vibrio cholerae일경우, 후속실험으로생물형, 독소생산유 무등을확인한다. 4. 콜레라독소의확인 콜레라균의병원성인자는콜레라독소이므로콜레라독소생산여부의확인이필요하다. 생산유무를확인하는방법은중합효소연쇄반응을통하여콜레라독소유전자의유무를확인하거나 [7], 콜레라독소에대한역수동라텍스응집반응키트 (Reverse Passive Latex Agglutination kit) 를이용하는방법이있다. 1) 중합효소연쇄반응 1 콜레라균을비선택영양배지 ( 평판 ) 에접종하여 37 에서하룻밤배양한후, 나타난집락 1~2개를백금이로수거하여멸균증류수 300~500 μl에넣고현탁한다. 2 균현탁액을 5분간끓인후원심분리 (14,000 rpm, 1분 ) 하여그상층액을 PCR 반응용주형으로사용한다. 3 콜레라독소유전자를증폭하기위한 primer 키트는상품화된 primers를사용하는데주문합성을위한 primer의염기서열은표 1과같다. 표 1. 콜레라균의 ctx 유전자에대한 primer Primer 염기서열 (5 3 ) 산물크기 (bp) ctx-1 ctx-2 ACAGAGTGAGTACTTTGACC ATACCATCCATATATTTGGGAG 308 4 PCR 반응조건은 94 에서 5분동안변성하고 94 1분, 55 1분, 72 1분간 30 회반복한후 72 에서 10분간확장하여 4 에정치한다음전기영동으로증폭산물을관찰하여 308 bp의크기에달하는산물이나오면양성대조군과의일치여부를 12 감염병실험실진단제 1 부세균질환
대조한다음, 일치하면양성으로확인한다. 5 중합효소연쇄반응의특성상진단의정확성을기하기위해매실험마다양성대조와음성대조를모두사용하여야한다. 양성대조는콜레라독소를생산하는균주에서분리된유전자를주형으로하며, 음성대조는주형을넣지않고반응시킨다. 2) 역수동라텍스응집반응콜레라균독소생산을확인을위해역수동라텍스키트가상품화 (Oxoid, 생연등 ) 되어있다. 1 콜레라균을 tryptic soy broth에접종하여 37 에서하룻밤배양한후원심분리하여균을수거한다. 2 Round bottom이나 V-bottom 96웰플레이트의 1열과 2열의두번째줄부터여덟번째줄까지희석액을각웰에 25 μl씩넣는다 3 96웰플레이트의 1열과 2열의첫번째와두번째줄웰에원심분리한배양액의상층액을취하여 25 μl씩첨가하여두번째줄의웰로부터시작하여 2배씩희석을실시한다. 감작된라텍스를잘섞은다음 1열의웰에 25 μl씩넣고대조라텍스를잘섞어 2열의웰에 25 μl씩넣은후비어있는웰중하나를선택하여표시한다음키트에들어있는양성대조용독소 25 μl와감작된라텍스 25 μl를넣는다. 4 플레이트를잘흔들어준다음밀폐용기에넣고, 종이나솜에물을묻혀함께넣은후 10~12시간실온에방치한다음응집여부를관찰한다. 5. 생물형의판정 콜레라균의생물형은혈구용혈시험, 닭혈구응집실험, 항균제인폴리믹신 B에대한감수성실험, phage Ⅳ 감수성실험등으로구분할수있는데그검사방법은다음과같다 [1, 5, 6]. 1) 혈구용혈실험 1 영양액체배지 10 ml에분리주를접종시킨다음 37 에서 18~24시간배양시킨액 1 ml을멸균된시험관 (13 100 mm ) 에옮긴다. 2 1% 양혈구세포부유액 ( 생리식염수로 3번세척한후 1% 가되도록만듬 ) 1 ml를 제 1 장콜레라 13
취하여넣은다음 37 항온수조에서 2시간, 실온에서 1시간반응시킨다음, 살며시흔들어 4 에서하룻밤정치시킨후관찰한다. 양성인경우는용혈되어시험관전체가붉게되며, 음성인경우시험관밑바닥에혈구가침전되어상층액은맑다. 2) 혈구응집실험 1 Heart infusion 사면배지나 Nutrient 사면배지에실험균주와대조균주를 37 에서 18~24시간순수배양시킨후닭적혈구세포 ( 생리식염수로 3번세척한것 ) 를생리식염수로 2.5% 부유액이되게만든다. 2 슬라이드위에 2.5% 닭적혈구세포부유액을떨어뜨린다음백금이로균주를취하여잘혼합한후 1분내에응집여부를확인한다 ( 이때대조균주와함께병행하여실험한다 ). 1분내에응집을보이면양성으로 El Tor로, 음성이면 Classical로판정한다. 3) Polymyxin B 감수성실험 1 일반실험법의항균제디스크감수성실험법에준하여실험하며, 50units 폴리믹신 B 항생제디스크를사용한다. 4) Phage Ⅳ 감수성실험 1 순수배양된실험균주를 Nutrient broth 에접종하여 37 에서 3시간동안배양시킨다음 Nutrient 한천배지에배양액을일부채취하여평판면에고루퍼지도록접종한다. 2 실온에서 10~20분동안건조시킨다음 Phage Ⅳ액 5~10 μl를접종면의한가운데떨어뜨린후실온에서건조하여 37 에서하룻밤배양시킨다음 phageⅣ액떨어뜨린자리에용균현상을보이면 classical로아니면 El Tor형으로판정한다. 참고문헌 1) 병원미생물검사기준 (1992). pp 143-159. 국립보건원. 콜레라검사. pp 3-40. 보건사회부. 1985. 14 감염병실험실진단제 1 부세균질환
2) 국립보건원보 (1994). pp 3-29. 제31권제 1호. 국립보건원. Control of communicable diseases in man. pp 75-0. 14th edition. American public Health association. 1985. 3) Lee JW. NAG. Vibrio (non-agglutinable) 에대한논문집. pp 3-41, 114. 보건사회부. Lee SY. Laboratory Methods in Clinical Pathology, copyright. pp 417-419, 369-370. Yonsei university press Seoul, Korea. 1982. 4) Difco Manual of Dehydrated Culture Media and reagents for Microbiological and clinical laboratory Procedures. p 32. 9th ed. Difco laboratories incorated detroit I. Michigan, USA. 1953. 5) MacFaddin JF. Biochemical tests for Idenification of Medical Bacteria Copyrightc. pp 35-36, 99-106, 108, 103-141, 187-203, The Williams & wikins Company Baltimore. Md:21202, USA. 1976. 6) Albert Balows. Manual of Clinical Microbiology. 5th ed. pp 384-395. American society for Microbiology. Washington. DC. 1991. 7) Cowan ST. Cowan & Steel s Manual for the Identification of Medical Bacteria 2nd ed. pp 100-102. Cambridge University press London. New York, Melbourne. 1974. 8) Laboratory Methods for the Diagnosis of Epidemic Dysentery and Cholera. pp 41-51. Centers for Disease Comtrol and Prevention Atlanta, Georgin. 1999. 9) Freeman BA. Textbook of Microbiology. pp 552-567. 21st ed., W. B. saunders Co. 1979. 제 1 장콜레라 15