사업구분 : 기본연구 Code 구분 : LS0212 버섯 ( 전반기 ) 연구과제및세부과제명연구기간연구책임자및참여연구원 ( ) 버섯균주활력검정방법개발연구 버섯균오염진단방법개발 색인용어 `03~`06 `04~`06 경기도원버섯연구소이윤혜 (229-6125) 경기도원버섯연구소장명준 (229-6123) ( 참여연구원 ) 이윤혜, 주영철 종균, 오염진단, 세균성갈반병, 푸른곰팡이, 느타리버섯, YPLP, Phenol red ABSTRACT For the detection of contaminated spawn, we selected suitable medium, indicator and developed method of diagnosis. The growth of pathogenic bacteria, Psedomonas sp., and fungi, Trichoderma sp., in YPL media was better than in PDA and NA. In addition, the changes of color and absorbance of media were obviously showed when contaminated spawn by pathogenic bacteria and fungi was incubated on YPL including phenol red for 48 hour at 25. After incubating of infected sawdust spawn by Psedomonas sp. and Trichoderma sp. the color of YPLP, YPL media including phenol red, were changed from orange to scarlet and to red, respectively. And the color of YPLP after incubating of infected liquid spawn by Psedomonas sp. and Trichoderma sp. were changed from orange to red and to scarlet, respectively. Whereas, the color of YPLP after incubation of only Pleurotus ostreatus was showed yellow at sawdust and liquid spawn. Therefore, it is possible to easily distinguish contaminated spawn by color of change in YPLP. Key words : Spawn, Detection of contamination, Pseudomonas sp., Trichoderma sp., Pleurotus ostreatus, YPLP, Phenol red 1. 연구목표 버섯종균은버섯균을곡립이나톱밥배지또는액체배지에서순수배양한증식체로작물에서의종자와같은역할을한다. 느타리버섯의톱밥종균은톱밥과첨가제를부피비로 8 : 2로혼합하여사용하고있으며, 액체종균의경우대두박에첨가제를넣어조제한후산소를공급하여종균을배양한다. 우리나라에서종균을배양하여체계적으로공급한것은대한산련의표고버섯종균으로 Ⅴ. 버섯연구 597
기록되었으며, 1957년 11,910kg(23,820병 ) 을공급하면서버섯종균이공급되기시작하였고, 이후버섯종균을비롯한종자의중요성이대두되어 1972년종묘관리법령이만들어지면서 11개배양소에서 146만파운드 ( 병 ) 의양송이종균에대한육안및실내검사를실시하였다.( 강등. 2004) 그이후지속적으로종균의공급이증가하였고, 현재병이나봉지를이용하여재배하는전업농가는자체적으로버섯종균을배양하여사용하고있는단계에까지이르렀다. 버섯재배전종균의오염여부를확인하는것은반드시필요한과정이며, 현재농가에서세균이나곰팡이의혼입에따른종균의오염을육안및냄새로판단하고있으나배양중기나배양후기로갈수록구별하기어려운실정이다. 버섯에전반적으로문제를일으키는병원균으로는세균성갈반병균과푸른곰팡이가있다. 이중세균성갈반병을일으키는 Pseudomonas tolaasii와 P. agarici는보통한천배지상에서원형으로구상 (rasied) 의백색, 습광 (glistening) 을띤반투명 (translucent) 의 Colony 를형성하고있으며, Dextrose, L-Arabinose, Levulose, D-xylose, D-mannose, Galactose, D-trehalose, Cellobiose, M-mannitol, Glycerine, Inositol, Solbitol, L-rhamnose를분해하여산을형성하는균이다 (Noel R. Krieg 등 1984). 그리고푸른곰팡이는버섯재배과정의모든시기에감염되어초기에는백색이나불완전세대의분생포자가형성되면서푸른색을띠는병으로 Green mold, Trichoderma disease 등으로불리고있다 (Felegg, at al 1985., 차등 1989). 식품이나의료용으로는미생물들의생리적특성을파악하여 ph지시약을이용한미생물검출방법이일부개발되어있고, Yumi 등 (2005) 은 BTB지시약을이용한버섯의균사활력을검사하는방법을제시하였고, 이 (1998) 등은느타리버섯에발생하는 Pseudomonas tolaasii의검출방법으로효소면역검출법을제시하였으며, 또한정 (2003) 등은 Pseudomonas tolaasii의검출방법으로 PCR로검출하는방법을제시하기도하였다. 그러나버섯균의오염여부를농가현장에서간편하게진단할수있는기술은개발되어있지못하다. 따라서느타리버섯톱밥및액체종균의오염여부를간이진단할수있는기술을개발하여종균오염에따른피해를예방함과동시에건전한종균의보급체계를확립코자본실험을수행하였다. 2. 재료및방법 < 시험 1> 원균오염진단방법개발가. 시험균주본시험에사용된버섯균주는경기도농업기술원버섯연구소에서보유하고있는느타리버섯균중춘추2호를 Potato dextrose agar(pda, Difco Co.) 평판배지에 7일간배양하여시험용으로사용하였다. 그리고오염균으로세균성갈반병 Pseudomonas tolaasii, P. agarici 2종, 푸른곰팡이 Trichoderma koningii, T. harzianum, T. atroviride, T. virens 4종을사용하였으며, 세균은 Nutrient agar(na, Difco Co.) 에서푸른곰팡이는 PDA배지에서배양하였다. 598 2006 년도시험연구보고서
나. 균주별접종량및접종방법 PDA배지상의춘추2호와푸른곰팡이, NA배지상의세균을각각 0.05g씩액체및고체진단배지에접종하였다. 미생물들을단용으로진단배지에각각접종하였으며, 혼용으로접종할경우액체진단배지는춘추2호를먼저접종하고후에오염균을접종하였으며, 고체진단배지는춘추2호와오염균을대치배양하였다. 다. 진단배지제조및진단배지선발 YPL(Yeast extract, Peptone, Lactose), PDA, NA배지별로춘추2호와오염균을단용과혼용으로접종하여 25 에서 7일간배양한후기본배지를선발하였다. 또한기본배지로선발된진단배지에 ph지시약을종류별로첨가하였으며, 이때첨가한 ph지시약은 Bromocresol green(bg), Methyl red(mr), Bromocresol purple(bp), Bromothymol blue(btb), Phenol red(pr) 이었고, 첨가농도는 10ppm이었다. 진단배지는액체진단배지와 agar를첨가한고체진단배지로사용하였으며, 발색반응이뚜렷하게관찰된 ph첨가배지를진단배지로선발하였다. 라. 발색반응확인과 ph측정각각의배지에 ph지시약을첨가하여고체진단배지의균주별발색반응은육안으로조사하였다. 그리고액체진단배지의균주별발색반응은분광광도계 (tecan) 로 BG첨가배지는 612nm, MR첨가배지는 230nm, BP첨가배지는 599nm, BTB첨가배지는 610nm, PR첨가배지는 560nm에서흡광도를측정하여반응전후의값을흡광도변화율 %,( O.D반응전- O.D반응후 )/ O.D반응전 100) 로나타내었다. 육안으로색상의변화를조사하였으며, ph는 ph meter(radiometer사 ) 를이용하여측정하였다. < 시험 2> 톱밥종균오염진단방법개발가. 시험균주본시험에사용된버섯균주는 < 시험1> 과동일한균주를사용하였고오염균으로서세균성갈반병은 Pseudomonas tolaasii, P. agarici 2종을 NB배지 (NB, Difco Co.) 에서 25 로 6 일배양하였고, 푸른곰팡이는 Trichoderma koningii, T. harzianum, T. atroviride 3종을 PDA배지에서 25 로 6일배양하였다. 나. 톱밥종균의제조및균주별접종량톱밥종균은톱밥과미강이 80 : 20(v/v) 비율로혼합된배지를사용하였으며, 수분함량은 65% 내외로조절하여 850cc P.P병에입병한후 121 에서 90분간살균하였다. 톱밥종균에춘추2호를 10g정도접종한후세균및푸른곰팡이현탄액을제조하여 Pseudomonas tolaasii Ⅴ. 버섯연구 599
는 1.4 10 10, P. agarici는 1.2 10 10 (cfu/ml), Trichoderma koningii는 2.0 10 7, T. harzianum 은 8.0 10 7, T. atroviride는 7.2 10 7 (spore/ml) 로밀도를조절하여각각 2ml씩접종하였다. 다. 톱밥종균의육안조사배양초기의오염균혼입에따른오염균의생장정도를육안으로조사하여강 (+++), 중 (++), 약 (+), 없음 (-) 으로나타내었으며, 종균의배양온도는 21 로배양하였다. 라. 발색반응조사오염균접종후 7일배양한다음진단배지에접종하였으며, 진단배지의배양온도는 25 로 48시간후에발색반응을조사하였다. 진단배지는 YPL(Yeast extract 4.5g, Peptone 7.5g, Lactose 5.0g) 에 PR(Phenol red) 10ml를첨가 (YPLP) 하여액체진단배지를조제하였고, 액체진단배지에 agar를첨가하여고체진단배지를제조하였다. 액체진단배지의균주별발색반응은분광광도계 (tecan) 로 560nm에서측정하여반응전후의흡광도변화율 (%) 을 < 시험 1> 의 라 에준하여조사하였다. 색상의변화는육안으로조사하였으며, 색변화를객관적으로검정하기위해색차계 (Minolta-720) 를이용하여 L(lightness, 명도 ), a값 (redness, 적색도 ), b값 (yellowness, 황색도 ) 와 E값 (color difference, 색차 ) 를측정하였다. 그리고 ph는 ph meter(radiometer사 ) 를이용하여측정하였다. 고체진단배지의경우육안으로발색반응을확인하였다. < 시험 3> 액체종균오염진단방법개발가. 시험균주 < 시험 2> 와동일하게사용하였다. 나. 액체종균의제조및균주별접종량대두박 3g, 황설탕 30g, KH 2PO 4 0.5g, MgSO 4 7H 2 0.5g, 식물성식용유 3ml를증류수 1l 에혼합하여사용하였으며, 삼각플라스크에각각 200ml을분주하여 121 에서 20분간살균한후냉각하여춘추2 호는평판배지 ( 87mm) 에서배양된원균을 1/2분량을접종하였고, 세균은 Pseudomonas tolaasii와 P. agarici 모두 1.0 10 8 (cfu/ml) 밀도의현탄액을제조하여각각 2ml씩춘추2호가접종되어있는액체종균에접종하였으며, 푸른곰팡이는평판배지 ( 87mm) 에배양하여평판배지의 1/4분량을춘추2호가접종되어있는액체종균에접종하였다. 다. 발색반응조사오염균접종후 5일배양한다음진단배지에접종하였으며, 진단배지의배양온도는 25 로 600 2006 년도시험연구보고서
48시간후에발색반응을조사하였다. 이때진단배지의배양온도는 25 로 48시간후에발색반응을조사하였다. 진단배지는 < 시험 2> 와같이동일하게제조하였으며, 균주별발색반응은 < 시험 2> 의 라 에준하여측정하였다. 3. 결과및고찰 < 시험 1> 원균오염진단방법개발가. 오염진단기본배지선발오염균들의균사생장조건이양호한배지를선발하기위하여배지별미생물의생장형태및생장정도를조사한결과그림 1과표1과같다. 일반적으로 PDA배지는담자균의증식및배양에사용되는데본시험에사용한오염균은 P. tolaasii를제외하고모두 강 으로나타났으며, 푸른곰팡이중 T. harzianum, T. virens 는배지상에서분생포자를형성하였다. YPL배지에서는춘추2호의균사생장정도는 약 이었고, 반면에세균성갈반병 2종과푸른곰팡이 4종모두 강 으로나타났다. NA배지에서는춘추2호의균사생장정도는 중, P. tolaasii 와 T. virens 는 강, P. agarici, T. koningii, T. harzianum와 T. atroviride는 중 으로나타났으며, 이중 T. atroviride만분생포자를형성하였다. 따라서 YPL배지에서춘추2호의생육에비해세균과푸른곰팡이모두생장이왕성하였으므로본실험을수행하기위한기본배지로사용하였다. PDA 춘추2 호 A B 춘추2 호 PDA C D E F YPL YPL NA NA 그림 1. 배지별미생물의생장형태 A : P. tolaasii, B : P. agarici, C : T. koningii, D : T. harzianum, E : T. atroviride, F : T. virens Ⅴ. 버섯연구 601
표 1. 배지별오염균의균사생장정도 배지종류춘추 2 호 P. tolaasii P. agarici T. koningii T. harzianum T. atroviride T. virens PDA +++ + +++ +++ +++ ( 포자형성 ) +++ +++ ( 포자형성 ) YPL + +++ +++ +++ +++ +++ +++ NA ++ +++ ++ ++ ++ ++ ( 포자형성 ) +++ 균사생장정도 : 육안조사 (- 없음, + 약, ++ 중, +++ 강 ) 나. 접종방법별발색반응및오염진단배지선발 YPL배지에버섯균및오염균별로 ph지시약 5종을각각첨가하여액체진단배지에서측정한결과는그림 2와같다. BP(Bromocresol purple), BTB(Bromothymol blue), PR(Phenol red) 을첨가한배지에서무접종대비오염균접종시발색반응을보였다. < 춘추 2 호 > <P. tolaasii> <P. agarici> 무접종 접종 <T. koningii> <T. harzianum> <T. atroviride> <T. virens> 그림 2. ph 지시시약별오염균접종시발색반응 ( 액체진단배지 ) 흡광도의변화율 (%) 은반응전흡광도값을반응후흡광도값으로뺀후반응전흡광도값으로나누어이에 100을곱한것으로그림 3과같다. BTB와 PR을첨가한배지가그외의 ph지시약첨가배지에비해홉광도의변화율이컸으며, 오염균들의경우푸른곰팡이보다는세균에서흡광도변화율 (%) 이큰것으로나타났다. 오염균들의경우주로음 (-) 의흡광도변화율 (%) 을나타내는것이많았으며, 춘추2호의경우양 (+) 의흡광도변화율 (%) 로나타 602 2006 년도시험연구보고서
났다. 흡광도변화율 (%) 의경우음 (-) 의값이높을수록반응후액체진단배지색깔의진한정도가강한것을나타내는데오염균접종구가춘추2호보다진한정도가강함을알수있다. 150 100 흡광도변화율 (%) 50 0-50 -100 춘추 2 호 C D E F -150-200 -250 A B 그림 3. 액체진단배지에서의오염균별흡광도변화율 (%) A : P. tolaasii, B : P. agarici, C : T. koningii, D : T. harzianum, E : T. atroviride, F : T. virens 흡광도변화율 (%)= ( O.D 반응전 - O.D 반응후 )/ O.D 반응전 100 ph지시약을첨가한액체진단배지에서의 ph변화를보기위해느타리버섯균과오염균을각각단용으로접종하여 25 에서 7일배양한후의 ph를표2로나타내었다. BTB와 PR첨가배지에서흡광도변화율 (%) 은크게나타났으나반면에 ph의변화는 5종의지시약모두비슷한경향이었다. 춘추2호의 ph는 6.6~6.7이었으며, 오염균들의 ph는춘추2호보다최저 0.1에서최대 1.4정도높았다. 그리고반응후 ph는접종전 ph 7.0과큰차이가없었다. 표 2. ph지시약을첨가한액체진단배지에서의오염균 ph변화 ph지시약접종원 춘추2호 6.7 6.7 6.6 6.7 6.6 P.tolasii 7.8 8.1 8.0 8.1 7.9 P.agarici 7.5 7.4 7.3 7.5 7.2 T.koningii 7.3 6.9 6.9 7.1 7.1 T.harzianum 7.3 7.2 7.2 7.3 7.3 T.atroviride 6.9 6.8 6.8 6.9 6.7 T.virens 7.3 7.3 7.3 7.4 7.2 배양일수 : 7일, 배양온도 25, 접종전 ph 7.0 Ⅴ. 버섯연구 603
이와같이액체진단배지에서발색반응은 ph 요인이기보다는버섯균의세포외분비효소중리그닌분해효소등의활력에따라색깔이변화된것으로판단된다. 이는 BTB와 PR의화학구조가방향족탄화수소를가지고있고, 이것이리그닌의구조와비슷한구조이기때문에각각의오염균별로분비하는효소의분해정도에따라발색반응이나타나는것으로판단되었다. 각각의오염균별고체진단배지에서의발색반응을살펴보면그림 4와같다. BTB와 PR 첨가배지에서춘추2호는발색반응이나타나지않는반면, 세균및푸른곰팡이에서 BTB 첨가배지는녹색 청색, PR 첨가배지는주황색 적색으로변하였다. 이상의액체진단배지및고체진단배지시험결과오염진단배지는 YPL배지, 지시약은 BTB와 PR을선발하였다. BG MR BP BTB PR BG MR BP BTB PR 무접종 접종 춘추 2 호 P. tolaasii P. agarici T. koningii T. harzianum T. atroviride T. virens 그림 4. ph 지시시약별오염균접종시발색반응 ( 고체진단배지 ) 다. 버섯균과오염균혼합접종에따른발색반응전시험에서선발한 YPL배지에지시약 BTB와 PR을첨가한액체진단배지에서의춘추 2호 + 오염균혼합접종에따른발색반응은그림 5와같다. BTB를첨가한액체진단배지에서춘추2호는녹색 황색으로변하였고, 춘추2호 + 오염균의혼합접종은녹색 청록색으로변하였다. 또한 PR을첨가한액체진단배지에서춘추2호는주황색으로색상의변화가없었고, 춘추2호 + 오염균의혼합접종은주황색 적색으로변하여, 각각의오염균단용접종의액체진단배지변화와유사한경향으로나타났다. 604 2006 년도시험연구보고서
<BTB> <PR> 무접종춘추 2 호 A B C D E F 무접종춘추 2 호 A B C D E F 그림 5. 액체진단배지발색반응 검정배양 7일, 배양온도 25 A : 춘추2호 +P. tolaasii, B : 춘추2호 +P. agarici, C : 춘추2호 +T. koningii, D : 춘추2호 +T. harzianum, E : 춘추2호 +T. atroviride, F : 춘추2호 +T. virens 혼합접종시액체진단배지에서의흡광도변화율 (%) 은그림 6과같다. BTB보다 PR을첨가한배지에서홉광도의변화율 (%) 이크게나타났다. 단용접종시와유사한경향을나타내었으나푸른곰팡이중 T. harzianum 은양 (+) 의흡광도변화율 (%) 로나타났다. 150 100 BTB PR 흡광도변화율 (%) 50 0-50 -100 춘추 2 호 C D E B -150-200 A B 그림 6. 액체진단배지에서의혼합접종시흡광도변화율 (%) A : P. tolaasii, B : P. agarici, C : T. koningii, D : T. harzianum, E : T. atroviride, F : T. virens 흡광도변화율 (%)= ( O.D 반응전 - O.D 반응후 )/ O.D 반응전 100 표 3은혼합접종시액체진단배지의 ph변화이며, BTB와 PR을첨가한액체진단배지모두비슷한변화가나타났다. 푸른곰팡이중 T. atroviride를제외한모든오염균접종에서춘추2호보다다소높은 ph의변화가나타났다. Ⅴ. 버섯연구 605
표 3. 혼합접종시액체진단배지의 ph변화처리내용 BTB PR 춘추2호 6.8 6.8 춘추2호 + P. tolaasii 8.1 8.0 춘추2호 + P. agarici 8.0 7.9 춘추2호 + T. koningii 7.6 7.4 춘추2호 + T. harzianum 7.6 7.5 춘추2호 + T. atroviride 6.9 6.9 춘추2호 + T. virens 7.4 7.5 배양일수 : 7일, 배양온도 25, 접종전 ph 7.0 이와같이혼합접종한액체진단배지에서의발색반응은단용접종시와유사하였으며, 세 균및푸른곰팡이의접종에의해 ph변화보다는버섯균의효소활력이저하되어지시약의 색깔이변화된것으로판단된다. YPL배지에 BTB, PR을각각첨가하여제조한고체진단배지의발색반응은그림7과같 다. BTB를첨가한배지에서춘추2호는녹색 연두색으로변하였고, 춘추2호 + 오염균혼합 접종에서는녹색 청록색으로변하였다. 그리고 PR을첨가한배지에서춘추2호는주황색 으로색상의변화가없었고, 춘추2호 + 오염균혼합접종에서는주황색 적색으로변하였으 며, 액체진단배지와유사한결과를나타냈다. BTB A C E PR A C E 춘추 2 호 B D F 춘추 2 호 B D F 그림 7. 고체진단배지발색반응 검정배양 7일, 배양온도 25 A : 춘추2호 +P. tolaasii, B : 춘추2호 +P. agarici, C : 춘추2호 +T. koningii, D : 춘추2호 +T. harzianum, E : 춘추2호 +T. atroviride, F : 춘추2호 +T. virens 이상의결과로 BTB 와 PR 첨가배지모두색변화의관찰이용이하였으나 BTB 보다 PR 을첨가한액체진단배지에서는흡광도변화율 (%) 이크고, 고체진단배지에서는춘추2호가접종되어있는부분까지색변화가관찰되어육안검정이더양호하였다. 따라서 PR을원균 606 2006 년도시험연구보고서
오염여부를진단할수있는지시약으로선발하였다. < 시험 2> 톱밥종균오염진단가. 톱밥종균육안검정춘추2호를톱밥종균용배지에접종한후오염균을균주별로각각접종하여 7일배양후의균사생장형태및생장정도를그림 8로나타내었다. 세균성갈반병접종은상단부분에느타리버섯균의균사밀도가춘추2호단용접종에비해다소낮은것으로나타났으며, 푸른곰팡이접종은상단부분은푸른곰팡이균사가우점하고있었으며, 측면은푸른곰팡이의균사가진행되는것을육안으로관찰할수있었다. 처리내용 춘추 2 호 세균성갈반병 (Pseudomonas sp.) P. tolaasii P. agarici T. koningii 푸른곰팡이 (Trichoderma sp.) T. harzianum T. atroviride 상단 측면 오염균생장정도 - - - ++ ++ ++ : 육안조사 (- 없음, + 약, ++ 중, +++ 강 ) 종균배양배지 : 미송톱밥 + 미강 (80 : 20) 그림 8. 오염된톱밥종균의형태및생장정도 이 (1996) 등은세균성갈반병이팽이버섯과애느타리버섯의균사생장에미치는영향을보고하였는데, P. tolaasii와 P. agarici의경우애느타리와팽이의균사생장을현저하게억제한다고하였다. 그리고푸른곰팡이의전염은공기, 토양, 물, 유기물중에다양하게분포 Ⅴ. 버섯연구 607
되는가장일반적인균으로서 green mold는퇴비에의해전파된다고보고하였고 (Staunton. 1987, Seaby, 1987), Seaby(1996) 는양송이에서푸른곰팡이병의주전염은공기중의먼지이며, 그외에차량, 기계, 작업복, 트레일러, 전파자로버섯파리, 응애, 쥐등이있다고보고하였다. 최등 (1998) 은자동화시설내에서재배되는팽이버섯에발생하는푸른곰팡이의발생상황을시기에따라조사하였는데배양기에가장높은 7.7% 로나타났다고하였다. 이와같이현재종균을배양하는장소는크린룸시스템을이용하고있으나세균성갈반병및푸른곰팡이는재배과정뿐만아니라종균에서도많이발생되고있다. 본실험에서이 (1996) 와최 (1998) 등의보고와도일치하였으며, 이에따라오염균들이우점하는것으로판단되었다. 나. YPLP 오염진단배지에서의발색반응 < 시험 1> 에서최종적으로선발된 YPLP액체진단배지에접종구별로접종하여 48시간후의색차 ( E) 를나타낸것으로표 4와같다. 본실험에서 L값은세균접종이춘추2호및푸른곰팡이접종에비해다소낮은값을나타내었고, a값의경우춘추2호및푸른곰팡이는 -값, 세균은 + 값으로세균접종에서적색도가강한것으로나타났다. b값은접종구별로황색도가모두 + 값이었다. 표 4. YPLP 액체진단배지의색차 처리내용 L a b 색차 ( E) 무접종 61.58 0.87 15.30 0 춘추 2 호 62.94-2.01 18.06 14.0 P. tolaasii 57.87 5.83 13.59 39.9 P. agarici 57.72 5.84 13.04 42.1 T. koningii 63.44-4.20 22.56 55.6 T. harzianum 62.53-2.15 17.95 13.5 T. atroviride 62.34-2.89 21.98 37.0 : (L-L ) 2 +(a-a ) 2 +(b-b ) 2, L 백색도, a 적색도, b 황색도 검정시간 : 48 시간, 배양온도 25 톱밥종균배양 7 일후액체진단배지에서검정, 병원균접종시기 : 종균접종시동시접종 오염된톱밥종균의액체진단배지상에서의 ph변화는표 5와같다. 춘추2호와푸른곰팡이의 ph는모두비슷한경향을나타내고있으며, 세균접종은 7.1로접종전 ph 7.0과큰차이가없었다. 608 2006 년도시험연구보고서
표 5. YPLP액체진단배지의 ph변화처리내용 YPLP 액체진단배지춘추2호 6.6 춘추2호 + P. tolaasii 7.1 춘추2호 + P. agarici 7.1 춘추2호 + T. koningii 6.7 춘추2호 + T. harzianum 6.4 춘추2호 + T. atroviride 6.3 배양일수 : 7일, 배양온도 25, 균주접종전 ph 7.0 오염된톱밥종균의흡광도변화율 (%) 은그림 9와같다. 세균접종은춘추2호접종구보다낮은 -값의흡광도변화율 (%) 을나타내고있으며, 푸른곰팡이의경우춘추2호와유사하거다소작은흡광도의변화를나타내고있다. 100.0 50.0 흡광도변화율 (%) 0.0-50.0-100.0 춘추 2 호 A C D E -150.0-200.0 B 그림 9. YPLP 액체진단배지에서의흡광도변화율 (%) A : P. tolaasii, B : P. agarici, C : T. koningii, D : T. harzianum, E : T. atroviride 흡광도변화율 (%)= ( O.D 반응전 - O.D 반응후 )/ O.D 반응전 100 그림 10은오염된톱밥종균의 YPLP액체진단배지에서의 25, 48시간후의발색반응을나타낸것이다. 세균접종은적색, 푸른곰팡이접종은춘추2호와유사한황색의발색반응이나타났다. Ⅴ. 버섯연구 609
처리내용 무접종 춘추 2 호 세균성갈반병 (Pseudomonas sp.) P. tolaasii P. agarici T. koningii 푸른곰팡이 (Trichoderma sp.) T.harzianum T.atroviride 발색반응 그림 10. YPLP 액체진단배지의발색반응 검정배지 : YPLP 배지 (Yeast Extract 4.5g, Peptone 7.5g, Lactose 5.0g)+Phenol red 10 ml 검정시간 : 48 시간, 배양온도 25 이와같이톱밥종균의경우 YPLP액체진단배지에서세균접종은 ph 및흡광도변화율이춘추2호와차이가나는것으로나타났으며, 푸른곰팡이접종은춘추2호와유사한경향을보였다. 따라서톱밥종균의세균성갈반병오염진단배지는 YPLP액체진단배지가적합한것으로판단되었다. 그림 11은배양 7일후오염된톱밥종균을 YPLP 고체진단배지에 48시간배양한후의발색반응및오염균의생장정도를나타낸것이다. 무접종대비춘추2호는색변화가없었고, 세균접종은적색으로, 푸른곰팡이접종은 T. atroviride는미황색으로그외접종구는적색으로변하였다. 처리내용무접종춘추 2 호 세균성갈반병 (Pseudomonas sp.) P. tolaasii P. agarici T. koningii 푸른곰팡이 (Trichoderma sp.) T.harzianum T.atroviride 발색반응 오염균 - - ++ ++ ++ ++ ++ 생장정도 그림 11. YPLP 고체진단배지발색반응및오염균생장정도 : 육안조사 (- 없음, + 약, ++ 중, +++ 강 ) 검정배지 : YPL 배지 (Yeast Extract 4.5g, Peptone 7.5g, Lactose 5.0g)+PR 검정시간 : 48 시간, 배양온도 25 610 2006 년도시험연구보고서
이상의결과로 YPLP고체진단배지는오염균접종시적색계통의색으로발색반응이현저하였으며, 단, T. atroviride는미황색으로나타났으나푸른곰팡이의균사생장이왕성하여육안으로관찰할수있었다. 따라서톱밥종균의푸른곰팡이오염진단배지는 YPLP고체진단배지가적합한것으로판단되었다. < 시험 3> 액체종균오염진단가. 액체종균육안검정그림 12는춘추2호및오염균혼용접종구의액체종균배양 5일째의배양상태를나타낸것으로오염균생장정도는세균접종구는 중 정도이였고, 푸른곰팡이접종구는 강 으로나타내었다. 처리내용 춘추 2 호 세균성갈반병 (Pseudomonas sp.) P. tolaasii P. agarici T. koningii 푸른곰팡이 (Trichoderma sp.) T.harzianum T.atroviride 형태 오염균생장정도 - ++ ++ +++ +++ +++ : 육안조사 (- 없음, + 약, ++ 중, +++ 강 ) 종균배양배지 : PDB 배지, 배양일 : 5 일 그림 12. 오염된액체종균의형태및생장정도 일반적으로세균의경우영양조건과환경조건이최적상태에서는 20~30분만에 2배씩증식하는데, P. tolaasii와 P. agarici은그람음성세균으로서 Nutkins 등 (1991) 은 P. tolaasii 에서 tolaasin이라불리는독소물질을분비하여버섯균의원형질막을파괴한다고보고하였으며, 이등 (1996) 은 P. agarici 가배양배지내에서팽이버섯균의균사생장을 75% 이상억제한다고보고하였다. 그리고푸른곰팡이의경우 Trichoderma spp. 의대부분은 chitinase, cellulase 등다양한종류의효소와 trichodermin과 peptid계항생물질을생산하여다른균류의생장을억제하는것으로보고되었다 (Dennis and Webster. 1971). 본실험에서도이와같이오염균들이독소물질을분비하여춘추2호균사를가해함으로써춘추2호의균사생육은약해지고, 오염균들의생장이증가하는것으로판단되었다. Ⅴ. 버섯연구 611
나. YPLP 오염진단배지에서의발색반응 < 시험 1> 에서최종적으로선발된 YPLP액체진단배지에접종구별로접종하여 48시간후의색차 ( E) 를나타낸것으로표6과같다. L값은톱밥종균의오염진단시의반응과는달리큰차이가나지않았다. 그리고 a값의경우춘추2호및푸른곰팡이는 -값, 세균은 + 값으로세균접종에서적색도가강한것으로나타났다. b값은접종구별로황색도가모두 + 값으로톱밥종균의오염진단과유사한경향이었다. 표 6. YPLP 액체진단배지의색차 처리내용 L a b 색차 ( E) 무접종 60.13 3.23 15.81 0 춘추 2 호 63.6-2.4 18.4 47.1 P. tolaasii 63.4 11.3 8.1 105.5 P. agarici 61.5 13.2 23.5 130.8 T. koningii 63.2-3.3 13.4 55.0 T. harzianum 64.3-2.5 17.6 51.8 T. atroviride 62.3-1.6 12.7 32.9 : (L-L ) 2 +(a-a ) 2 +(b-b ) 2, L 백색도, a 적색도, b 황색도 검정시간 : 접종후 48 시간, 검정배지배양온도 25, 액체종균배양 5 일후진단배지에서검정오염균접종시기 : 종균접종시동시접종 오염된액체종균의진단배지상에서의 ph 변화는표 7 과같다. 톱밥종균의오염진단시의 ph 변화와비슷하였으며, 세균접종이다소높게나타났다. 표 7. YPLP액체진단배지의 ph변화 처리내용 YPLP 액체진단배지 춘추2호 6.8 춘추2호 + P. tolaasii 7.2 춘추2호 + P. agarici 7.0 춘추2호 + T. koningii 6.8 춘추2호 + T. harzianum 6.6 춘추2호 +T. atroviride 6.7 배양일수 : 7일, 배양온도 25, 균주접종전 ph 7.0 오염된액체종균의흡광도변화율 (%) 은그림 13과같다. 톱밥종균오염진단과는달리 모든처리구에서낮은흡광도의값을나타내었으며, 춘추2호접종구에비해오염균접종구 612 2006 년도시험연구보고서
의흡광도변화율이크게나타났다. 0.0-50.0 흡광도변화율 (%) -100.0-150.0-200.0-250.0-300.0-350.0-400.0-450.0 춘추 2 호 A B C D E 그림 13. YPLP액체진단배지에서의흡광도변화율 (%) A : 춘추2호 +P. tolaasii, B : 춘추2호 +P. agarici, C : 춘추2호 +T. koningii, D : 춘추2호 +T. harzianum, E : 춘추2호 +T. atroviride 흡광도변화율 (%)= ( O.D 반응전 - O.D 반응후 )/ O.D 반응전 100 그림 14는배양 5일후오염된액체종균의 YPLP액체진단배지에서의 25, 48시간후의발색반응을나타낸것이다. 세균접종은적색으로나타났으며, 푸른곰팡이접종은톱밥종균진단시의발색반응과는달리연두색으로나타났다. 구분무접종춘추 2 호 세균성갈반병 (Pseudomonas sp.) P. tolaasii P. agarici T. koningii 푸른곰팡이 (Trichoderma sp.) T.harzianum T.atroviride 발색반응 그림 14. YPLP 액체진단배지의발색반응및오염균생장정도 검정배지 : YPL 배지 (Yeast Extract 4.5g, Peptone 7.5g, Lactose 5.0g)+PR 검정시간 : 48 시간, 배양온도 25 Ⅴ. 버섯연구 613
그림 15는배양 5일후오염된액체종균을 YPLP고체진단배지에 48시간배양한후의발색반응및오염균의생장정도를나타낸것이다. 무접종대비춘추2호는색변화가없었고, 모든오염균접종구에서적색및선홍색의발색반응을나타내었다. 처리내용 무접종 춘추 2 호 세균성갈반병 (Pseudomonas sp.) P. tolaasii P. agarici T. koningii 푸른곰팡이 (Trichoderma sp.) T.harzianum T.atroviride 발색반응 오염균 생장 - ++ ++ ++ ++ + 정도 그림 15. YPLP 고체진단배지발색반응및오염균생장정도 : 육안조사 (- 없음, + 약, ++ 중, +++ 강 ) 이와같은결과로액체종균 YPLP진단배지의발색반응은세균, 푸른곰팡이모두액체진단배지보다는고체진단배지에서색변화의관찰이용이하였으므로 YPLP고체진단배지가적합한것으로판단되었다. 4. 적요 ph지시약을 YPL배지에첨가하여진단배지로사용하였으며, 진단배지의발색반응을기준으로오염균을진단할수있는기술을개발코자수행한결과는다음과같다. < 시험 1> 원균오염진단방법개발 가. 오염진단기본배지로 PDA, NA, YPL배지에서의춘추2호, 세균성갈반병, 푸른곰팡이를접종한결과 YPL배지에서춘추2호의생장보다오염균의생장이왕성하여이배지를실험의기본배지로선발하였다. 나. 춘추2호느타리에대한병원균 Pseudomonas tolaasii, P. agarici, Trichoderma koningii, T. harzianum, T. atroviride, T. virens에대한오염진단을위해 BG, MR, BP, BTB, PR 5종의지시약이각각포함된배지에서의발색반응결과 BTB첨가배지는녹색 청록색, PR첨가배지는주황색 적색으로변하여오염균진단배지로선발하였다. 614 2006 년도시험연구보고서
다. BTB와 PR첨가배지모두유사한발색반응을나타내고있으나 BTB보다 PR 첨가배지의흡광도변화율이크므로 YPL배지에 PR을첨가한액체및고체진단배지를최종적으로선발하였다. < 시험 2> 톱밥종균오염진단가. 종균접종시오염된톱밥종균을 7일동안배양하여 YPLP진단배지에접종하여 48시간후의발색반응은세균 (Pseudomonas sp.) 접종의경우 YPLP 액체진단배지에서모두적색의발색반응이강하게나타났다. 나. 푸른곰팡이 (Trichoderma sp.) 접종의경우 YPLP 액체진단배지에서는모두황색으로나타났고, 고체진단배지에서는 T. koningii, T. harzianum는적색으로발색반응이나타났다. 다. 따라서톱밥종균의오염진단배지는세균은 YPLP액체진단배지, 푸른곰팡이에는 YPLP고체진단배지가적합한것으로판단되었다. < 시험 3> 액체종균오염진단가. 5일간배양된액체종균의진단배지발색반응으로세균 (Pseudomonas sp.) 접종구는액체및고체진단배지모두적색의발색반응이나타났다. 나. 푸른곰팡이 (Trichoderma sp.) 접종구는액체진단배지에서연두색으로나타났으며, 고체진단배지의경우선홍색으로나타났다. 다. 따라서액체종균오염진단은 YPLP고체진단배지에서가장발색반응이뚜렷하여적합한배지로판명되었다. 5. 인용문헌 경기도농업기술원버섯연구소. 2004. 버섯의모든것. pp.22-35. 농림부. 2006. 특용작물생산실적. pp.44-81 농촌진흥청. 2004. 병버섯액체종균이용과느타리버섯배지제조. pp.3-27. 성재모등 2명. 1998. 버섯학. 교학사. pp.100-102 이향범, 전낙범, 손동화, 유승헌. 1998. 느타리버섯세균성갈반병균 Pseudomonas tolaasii의효소면역검출법. Kor.J.Appl.Microbiol. Biotechnol. Vol.26, No.3 pp.238-243 이현욱, 이명환, 조동진, 신원교, 문병주. 1996. 버섯세균성갈반병균 Pseudomonas spp. 가애느타리및팽이의균사생장에미치는영향. 농업논문집. 38(2) : 887-892 정규식, 김우재, 장후봉, 차재순. 2003. PCR을이용한느타리버섯재배사물로부터세균성갈색무늬병병원균 Pseudomonas tolaasii검출. 한국버섯학회. Vol.1, No.1 pp.28-33 Ⅴ. 버섯연구 615
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