14.fm

pissn 1229-1153 J. Fd Hyg. Safety Vol. 30, No. 1, pp. 103~108 (2015) http://dx.doi.org/10.13103/jfhs.2015.30.1.103 Journal of Food Hygiene and Safety Available online at http://www.foodhygiene.or.kr 실시간정량 PCR 을통한김치유래 Weissella spp. 에의한 Listeria monocytogenes 생육억제 이영덕 1 김대용 2 박종현 3 1 서원대학교식품공학과, 2 서원대학교제약공학과, 3 가천대학교식품생물공학과 Growth Inhibition of Listeria monocytogenes by Weissella spp. from Kimchi Through Real-time PCR Young-Duck Lee 1, Dae-Yong Kim 2, and Jong-Hyun Park 3 1 Department of Food Science and Engineering, Seowon University, Chungju 362-742, Korea 2 Department of Pharmaceutical Science and Engineering, Seowon University, Chungju 362-742, Korea 3 Department of Food Science and Biotechnology, Gachon University, Seongnam 461-701, Korea (Received November 4, 2014/Revised November 15, 2014/Accepted November 19, 2014) ABSTRACT - Weissella spp. from traditional Korean foods of Kimchi were isolated and characterized against food-borne pathogenic Listeria monocytogens. The isolates were identified as W. cibaria 0D17 and W. confusa 0D23 from Kimchi by the biochemical characteristics and 16S DNA sequencing. The culture solutions of the isolates adjusted to ph 7.0 showed L. monocytogens inhibition. To analyze the quantitative detection of L. monocytogenes, real-time PCR was performed according to the SYBR Green I method. The isolates grew well and L. monocytogens did not grow during the co-culture with those strains at 37 o C. Therefore, W. cibaria 0D17 and W. confusa 0D23 might be the candidates as the functional lactic acid bacteria for improving food safety. Key words : Weissella spp., L. monocytogenes, Kimchi, Real-time PCR, Inhibition 유산균은과거부터현재까지오랜시간동안식품발효에사용되어왔으며, 발효동안생산되는다양한영양물질, 향기성분, 항균물질등식품의풍미와제품수명에영향을주는것으로알려져있다. 그리고 probiotics로서사람의장내에서식하면서장내균총개선, 면역조절작용, 콜레스테롤저하, 병원성세균들의생육억제, 유당불내증개선등의다양한역할을하는것으로알려져있다 1,2). 또한, 최근다양한임상결과를통해 probiotics와이것들이생산하는 bacteriocin 등의물질들이다양한질환들에대해예방적효과와치료적효과가있는것으로알려져있다 3,4). Collins 등은최근다양한유산균들중 Weissella spp. 를 Leuconostoc spp. 로부터 Leuconostoc paramesenteroides으로분류하였다. Weissella spp. 는약 14종이알려져있고김치등다양한발효식품으로부터분리되고있다 5,6). 특히, 김치의발효에중요한역할을하는것으로알려져있다. 이 *Correspondence to: Jong-Hyun Park, Department of Food Science and Biotechnology, Gachon University, Seongnam 461-701, Korea Tel: 82-31-750-5523, Fax: 82-31-750-5501 E-mail: p5062@gachon.ac.kr 러한 Weissella spp. 는 catalase 음성으로포자를형성하지않는 Gram 양성세균으로상대적으로적은양의유산을생성하고, 포도당을발효하여젖산과이산화탄소를생성하는이상발효를하는것으로알려져있다. Weissella spp. 는다른유산균과마찬가지로젖산등의다양한유기산이외에 bacteriocin을생성하여다른세균에대한항균활성이있는것으로보고되어있다 7). 대표적인 Weissella spp. 의 bacteriocin에대한연구는다른유산균이생성하는 bacteriocin에비해상대적으로많이진행되지않고있으나, 최근 weissellicin 110 등이보고되어있다 8,9). 또한, 최근 Weissella spp. 의 Listeria monocytogenes 등의식중독세균에대한항균활성에대한연구가보고되고있다. L. monocytogene는식중독세균으로우유, 쇠고기, 돼지고기, 닭고기같은다양한식품으로부터분리되었으며이에감염된식품또는식품원료물질을섭취하면수막염, 심내막염및파종성육아종을유발하고임산부의경우유산, 사산, 조산등을일으킬수있는리스테리아증 (listeriosis) 이유발될수있다 10,11). 특히, 저온에서도생육이가능하여미국과유럽등의식품제조업체에서매우중요한식중독 103

104 Young-Duck Lee, Dae-Yong Kim, and Jong-Hyun Park 세균으로인식되고있다. 국내에서도 L. monocytogenes에대한관리를위해농산물, 축산물, 수산물및식품에오염현황에대한연구와함께 L. monocytogenes의제어를위해고압이나가열처리, 수분활성도조절, 방사선조사등의물리적인방법이외에도여러가지유기산과각종유산균을활용한연구가진행되고있다 12,13). 특히몇몇유산균들은 L. monocytogenes에대한항균활성이탁월한것으로알려져있다. 하지만, 국내에서는 Weissella spp. 를활용해 L. monocytogenes의제어에적용한연구는상대적으로미흡하다. 따라서, 본연구에서는김치로부터 Weissella spp. 를분리및동정하고정량 PCR을통해 L. monocytogenes의생육억제효과를확인하고자하였다. 재료및방법 사용균주및유산균분리본실험에사용된 L. monocytogenes KCTC3710을미생물자원센터에서분양받았으며, Listeria selective agar (Oxoid, UK) 에서배양한후 BHI agar 또는 broth로옮겨 37 o C, 호기적으로 24 시간배양하였다. 유산균의배양은 0.05% L-cystein을첨가하여만든 Lactobacilli MRS broth 또는 MRS agar (Difco Laboratory, Detroit, MI, US) 에서 37 o C, 24 시간혐기적으로배양하였다. 김치로부터 Weissella spp. 를분리하기위해김치제조회사로부터김치를수집하였다. 이들시료 25 g을 225 ml의 0.1% peptone water 에혼합하고, stomacher를이용하여균질화한후 10진희석을하여 MRS agar에도말후 37 o C에서 48~72 시간배양하였다. 그리고배양된집락들중형태학적으로상이한것을선택하여 MRS agar에평판획선하여배양하여순수분리하였다. 그후분리된유산균들을대상으로현미경을통한형태학적특성확인, Gram test, catalase test를수행후 API kit 50CHL (Biomerieux Co., France) 을이용하여당자화성등의생화학적특성분석을통해 Weissella spp. 를분리하였다. 16s rrna 염기서열분석을통한동정분리된 Weissella spp. 을 API kit 50CHL을이용해당자화성특성및 1차적으로동정하고최종적인동정을위해 16s rrna 서열분석을수행하였다. 서열분석을위해분리된젖산균을 MRS broth에배양하고배양액 1mL을취해원심분리한후 0.8% 멸균생리식염수로수세하였다. 그리고 genomic DNA kit를사용하여 DNA를추출하여 PCR을위한 template DNA로이용하였으며, 세균의 16s rrna에대한 universal primer인 F-341 (CCTACGGGAG- GCAGCAG) 와 786-R (GACTACCAGGGTATCTAATC) 을사용하였다. PCR 수행후전기영동을통해 450 bp의증폭산물을확인하고 QIAquick PCR purification kit (QIAGEN, Hilden, Germany) 를사용하여정제하였다. 염기서열은 Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Biosystems, CA, USA) 와 ABI 3700 sequencer (Biosystems, CA, USA) 에의해수행하였으며, primer는위와동일하게사용하였다. 16S rrna sequence의 homologous의분석은 National Center for Biotechnology Information (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/) 의 BLAST search program을이용하여 DNA database와비교하였다. 그리고계통학적분석은 Clustal X, BioEdit, MEGA 4 (www.megasoftware.net/) 를이용하여염기서열간의유전적거리와 phylogenic tree를확인하였다. 김치유래 Weissella spp. 의 L. monocytogenes에대한항균효과분리된 Weissella spp. 가 L. monocytogens에대한항균작용을하는지의활성유무를확인하였다. Weissella spp. 를 20 ml의 MRS broth에접종한후 37 o C에서 OD560에서약 1.0까지배양하고, 원심분리 (10,000 g, 5 min) 후상등액을 1 N NaOH를이용하여 ph 7.0으로조정하고 0.22 µm Syringe filter (Millipore, Billerica, MA) 를이용하여제균하였다. 그리고, 제균액을 L. monocytogenes가도말된배지위에 spot on the lawn 방법으로 10 ul 분주하고배양한뒤억제환을확인하여생육저해효과를확인하였다. L. monocytogenes의실시간정량 PCR L. monocytogenes의정량분석은 LightCycler 2.01 (Roche, Mannheim, Germany) 를사용하였으며, 이를위해 BHI broth 에서 18~24 시간동안배양한 L. monocytogenes를 Listeria selective agar에단계희석하여도말한후 37 o C에서 18~24 시간동안다시배양하였다. 배양된균수를바탕으로 standard plate count법을이용하여 colony forming unit (CFU) 값을구하였다. 구해진 CFU값을기준으로앞서추출한 genomic DNA를 10진희석하여 real-time PCR assay을실행한후, 각희석단계의 CFU값과 crossing point (Cp) 값으로표준곡선을작성하여정량분석하였다. 사용한 primer는 L. monocytogenes의 16s rrna를목적으로하는 16s forward (GGCTAATACCGAATGATGAA) 와 16s reverse (AAGCAGTTACTCTTATCCT) 를사용하였다. Capillary PCR tube에 1uL의 DNA와 10 pmol의 primer, 100 mm KCl, 40 mm Tris-HCl (ph 8.4), 0.4 mm each dntp, 50 U/mL of itaq DNA polymerase, 6 mm MgCl2 and 20 nm SYBR Green I을혼합한후실시간정량 PCR 을수행하였다. 반응조건은 95 o C 5분간진행후, 95 o C 1 분, 55 o C 1분, 72 o C 1분세단계를 45회반복하여목적유전자를증폭하였다. 그리고, temperature transition rate는 20 o C/s였고증폭된 DNA는 SYBR Green I의결합으로특유의형광을발하게되어이형광의발생정도를분석하

Inhibition of L. monocytogenes by Weissella spp 105 였다. Melting peak 분석은 16s rrna 유전자증폭후 95 o C 0초, 65 o C 15초, 95 o C 0초로하였으며온도변화율은 20 o C/ s이었고마지막 3번째단계만 0.1 o C/s로수행하였다. 김치유래 Weissella spp. 의 L. monocytogenes와동시배양에따른생육억제분리된 Weissella spp. 와 L. monocytogenes를각각 OD560 이약 1.0 수준이되도록배양한후 10 ml의 MRS broth 에약 3logCFU/mL 수준으로동시에접종하고 37 o C와 4 o C 에서배양하였다. 그리고, 시간에따른생육억제를확인하기위해 24 시간후에배양액 1mL을취해 DNA를추출하여실시간정량 PCR을수행하여 L. monocytogenes의생육정도를확인하였다. 결과및고찰 김치로부터 Weissella spp. 를분리하기위해 MRS agar 에서배양된집락의형태학적인특성에따라분리한후 Gram test, catalase test, 현미경관찰을통한형태학적특성확인등을통해유산균으로의심되는균을분리하였다. 그리고 API 50 CHL kit를이용하여당발효특성등의생화학적특성을확인하고, 그결과를동정프로그램을통해확인하였으며, 동정결과 (%) 가 90% 이상인균주 Weissella spp. 를분리하였다. 또한, 확인된 Weissella spp. 를 16s rrna 염기서열분석한결과 W. cibaria 0D17와 W. confusa 0D23으로최종동정되었다 (Fig. 1). 최근 DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis), ARDRA법 (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), T-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism), metagenomics 분석등의다양한분자생물학적연구를통해김치의유산균총에대한연구가활발하게진행되고있다 14~16). 보통김치 발효초기와중기에는이상유산발효유산균인 L. mesenteroides 등이우점종으로생육하여김치의적숙을유도하다가, 발효후기에들어서면내산성이약한 L. mesenteroides 가감소하게된다. 반면에내산성이우수한 L. plantarum 이나 L. brevis 등이급격히증가하고그결과더많은산이생성되어김치산패를일으킨다고알려져왔다. 하지만, 최근보고되는연구결과들은 Weissella spp. 가김치발효에있어서매우중요한역할을할것으로예측하고있다 6). 하지만, Weisella spp. 의생육과김치품질에미치는영향에관한연구는아직미흡한실정으로김치유래 Weissella spp. 특성, 발효조건, 스타터로서의가능성, 김치발효와 Weissella spp. 의대사산물과의연관성등에대한연구결과가보다많이필요할것으로판단된다. 본연구를통해분리된김치유래 W. cibaria 0D17와 W. confusa 0D23이식중독세균인 L. monocytogenes에대한항균활성유무를확인하고자하였다. W. cibaria 0D17와 W. confusa 0D23의배양상등액을 ph 7.0으로조정했을때와그렇지않을경우모두 L. monocytogenes에대해억제환을나타내어항균효과가있음을확인하였다 (data not shown). 이러한결과는 ph를조정하지않았을경우는 Weissella spp. 가생성하는다양한유기산과항균물질등에의한것으로보이며, ph를중성으로조정하였을때는 Weissella spp. 가형성하는 bacteriocin 등의항균물질에의한것으로사료된다. 하지만, L. monocytogenes를생육을저해하는유기산과 bacteriocin 등의항균물질과의상호작용에대한추후연구가진행되어야할것으로판단된다. 안등은김치에서분리한 W. cibaria JW15의배양상등액이 L. monocytogenes에대한항균활성이있다는보고와유사하였다 17). 그리고, 분리된 W. cibaria 0D17와 W. confusa 0D23가각각 L. monocytogenes와공동배양시온도에따른생육억제효과를 SYBR Green I을이용해 Fig. 1. Phylogenetic relation between Weissells spp. and other LAB based on 16s rrna sequence.

106 Young-Duck Lee, Dae-Yong Kim, and Jong-Hyun Park Fig. 2. Specificity of real-time PCR for amplification of 16s rrna as determined by melting peak analysis. : L. monocytogenes, X: W. cibaria 0D17, : W. confusa 0D23. 실시간정량 PCR을통해확인하였다. 실시간정량 PCR 은다양한형광색소를활용해형광의강도를측정해목적유전자의증폭을확인하는방법으로, 이중 SYBR Green I은 DNA 이중나선사이로결합되어나타나는형광을측정함으로써 Cp 값과 Tm값을알수있고이를통해시료의농도, 증폭여부및종을확인할수있다 18). Cp 값은증폭물이나타나면서형광이증가하기시작하는점으로주형의농도가많을수록빠른시간내에나타난다. Tm 값은반응이끝난후 60~95 o C까지온도를올려주게되면 DNA의이중나선이단일가닥으로떨어지면서 SYBR Green I이방출되는데염기서열의길이및구성에따라방출되는온도가다르다. 이특정온도를이용하여목적유전자가맞는지확인할수있다 18). 본연구에서도 L. monocytogenes의정량분석을위해 melting peak를확인한결과 L. monocytogenes의경우 Tm값이약 87 o C로고유의 melting peak가나타나는반면에 W. cibaria 0D17와 W. confuse 0D23는확인되지않았다. 이를통해 W. cibaria 0D17와 W. confuse 0D23와공동배양시에 L. monocytogene 만을정량적으로분석이가능한것을확인하였다 (Fig. 2). 그리고, 정량분석을위한표준곡선은배양된 L. monocytogenes를약 2~6 log CFU/mL로 10진희석하여실시간정량 PCR을통해유전자를증폭하여 Cp 값과농도와의선형분석결과, 상관계수 0.994, 기울기는 3.006 으로나타났다 (Fig. 3). 표준곡선에위생처리를 3반복실험한 Cp값의평균을대입하여 L. monocytogenes의농도를산출하였다. 이를통해 W. cibaria 0D17와 W. confusa 0D23 가 L. monocytogenes와공동배양시생육억제효과를확인한결과는 Table 1과같다. 37 o C의경우, W. cibaria 0D17와 W. confusa 0D23는 L. monocytogenes에대한생육억제효과가공동배양하지않은때와비교해약 4log CFU/mL 수준으로확인되었다. 또한, 4 o C에서는 W. cibaria 0D17와 W. confusa 0D23 모두 L. monocytogenes의생육억제에는효과가크게나타나지않는것으로나타났다. 이러한결과는 Weissella spp. 가 4 o C에서는생육이거의되지않으나, 37 o C에서는왕성하게생육하면서유기산, Fig. 3. Real-time PCR for quantitative detection of L. monocytogenes. A) Amplification profiles of 10 fold serial dilution of L. monocytogenes. : 6 log CFU/mL, : 5 log CFU/mL, : 4 log CFU/ ml, : 3 log CFU/mL, : 2 log CFU/mL. B) Standard curve showing correlation between Cp and log concentration. Table 1. Quantitative analysis of L. monocytogenes co-cultured with W. cibaria 0D17 and W. confusa 0D23 after 24 h 37 o C (CFU/mL) 4 o C (CFU/mL) L. monocytogenes 8.71 4.08 L. monocytogenes cocultured with W. cibaria 0D17 3.85 3.90 L. monocytogenes cocultured with W. confusa 0D23 4.61 4.20 bacteriocin 등의다양한항균물질을생산할수있기때문으로보인다. 따라서, 저온성식중독세균인 L. monocytogenes의제어를위해서 Weissella spp. 또는다른유산균이생산하는 bacteriocin과의병행처리를통해저온발효에서도효과적인제어가가능할것을판단된다. 최근 L. monocytogenes에대한위해성이높아짐에따라 anti-listeria 활성이있는 E. faecium, L. sake, L. mesenteroides, P. pentosaceus 및 P. acidilactici 등 19~22) 의 bacteriocin 등의항균물질과다양한식품저장조건에대한연구가진행되어왔다 23-25). 하지만, Weissella spp. 에의한 L. monocytogenes 에생육억제에대한연구는상대적으로많이이루어지지않았으나, 근래에 Weissella spp. 가생산하는 weissellicin에

Inhibition of L. monocytogenes by Weissella spp 107 대한분리와항균활성특성에대한연구결과가보고되었으며, L. monocytogene에대한항균효과가있는 bacteriocin과항균효과가없는 bacteriocin도있는것으로알려져있다 8,9). 따라서, 추후에김치유래 Weissella spp. 에대한항균물질과유기산등의특성규명과더불어상호작용에관한연구를통해 L. monocytogenes 이외에다양한식중독세균에제어를위한생균제또는항균제로서사용이가능할것으로판단된다. 본연구에서분리된 W. cibaria 0D17와 W. confusa 0D23가 L. monocytogenes와공동배양시생육억제효과는이들이생산하는유기산등의항균효과를갖는물질과함께 bacteriocin에의해생육억제가있었을것으로판단된다. 따라서, W. cibaria 0D17와 W. confusa 0D23가생성하는 weissellicin 등의 bacteriocin에대한특성규명에대한연구가필요할것이며, 다양한식품내에서 L. monocytogenes와 Weissella spp. 가함께존재하였을때각각의생리특성, 발효식품의특성변화등에대한추가적인연구가수행되어야할것이다. 또한, 공동배양시분자수준에서변화를 metagenomics 분석이나 transcriptomics 분석등을통해규명되어야할것이다. 요약 본연구에서는김치로부터 W. cibaria 0D17와 W. confusa 0D23를생화학적특성분석과 16s rrna 염기서열분석을통해분리, 동정하였으며, W. cibaria 0D17와 W. confusa 0D23 배양상등액이 L. monocytogenes에대한항균효과가있는것으로나타났다. 또한, 실시간정량 PCR을통해 W. cibaria 0D17 및 W. confusa 0D23가 L. monocytogenes 를공동배양했을때의생육억제효과를분석한결과, 37 o C 에서는생육억제효과가있는것으로확인되었다. 따라서, 김치유래 Weissella spp. 가갖는 L. monocytogenes에대한항균활성에대한기초자료로활용가능할것으로판단되며, W. cibaria 0D17 및 W. confusa 0D23가생산하는 bacteriocin 등의항균물질특성에대한연구가추가적으로진행될필요가있을것이다. 감사의말씀 본논문은농촌진흥청연구사업 ( 과제번호 : PJ009799) 의지원에의해이루어진것임. 참고문헌 1. Leroy, F. and De Vuyst, L.: Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry. Trends Food Sci. Technol. 15, 67-78 (2004). 2. Vyas, U. and Ranganathan, N.: Probiotics, prebiotics, and synbiotics: Gut and beyond. Gastroenterol. Res. Pract. 2012, 1-16 (2012). 3. Jeppsson, B., Mangell, P., and Thorlacius, H.: Use of probiotics as prophylaxis for postoperative infections. Nutri. 3, 604-612 (2011). 4. Wallace, T.C., Guarner, F., Madsen, K., Cabana, M.D., Gibson, G., Hentges, E., and Sanders, M.E.: Human gut microbiota and its relationship to health and disease. Nutr. Rev. 69, 392-403 (2011). 5. De Bruyne, K., Camu, N., De Vuyst, L., and Vandamme, P.: Weissella fabaria sp. nov., from a Ghanaian cocoa fermentation. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60,1999-2005 (2010). 6. Collins, M.D., Samelis, J., Metaxopoulos, J., and Wallbanks, S.: Taxonomic studies on some leuconostoc-like organisms from fermented sausages: description of a new genus Weissella for the Leuconostoc paramesenteroides group of species. J. Appl. Bacteriol. 75, 595-603 (1993). 7. Kim, J.H., Lee, K.W., Han, N.S., Park, J.Y., and Chun, J.Y.: Importance of Weissella Species during Kimchi Fermentation and Future Works. J. Microbiol. Biotechnol. 38, 341-348 (2010). 8. Srionnual, S., Yanagida, F., Lin, L.H., Hsiao, K.N., and Chen, Y.S.: Weissellicin 110, a newly discovered bacteriocin from Weissella cibaria 110, isolated from plaa-som, a fermented fish product from Thailand. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2247-50 (2007). 9. Leong, K.H., Chen, Y.S., Lin, Y.H., Pan, S.F., Yu, B., and Wu, H.C., Yanagida, F.: Weissellicin L, a novel bacteriocin from sian-sianzih-isolated Weissella hellenica 4-7. J. Appl. Microbiol. 115, 70-76 (2013). 10. Dieterich, G., Karst, U., Fischer, E. Wehland, J. and Jansch, L.: LEGER: knowledge database and visualization tool for comparative genomics of pathogenic and non-pathogenic Listeria species. Nucleic Acids Res. 34, D402-D406 (2006). 11. Farber, J.M. and Peterkin, P.I.: Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991). 12. Gravesen, A., Z. Diao, J. Voss, B.B. Budde, and S. Knochel.: Differential inactivation of Listeria monocytogenes by D- and L lactic acid. Lett. Appl. Microbiol. 39, 528-532 (2004). 13. Lu, Z., Sebranek, J.G., Dickson, J.S., Mendonca, A.F. and Bailey, T.B.: Application of predictive models to estimate Listeria monocytogenes growth on frankfurters treated with organic acid salts. J. Food Prot. 68, 2326-2332 (2005). 14. Bae, J.W., Rhee, S.K., Park, J.R., Chung, W.H., Nam, Y.D., Lee, I., Kim, H. and Park, Y.H.: Development and evaluation of genome-probing microarray for monitoring lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 71, 8825-8835 (2005). 15. Kim, M.J., and Chun, J.S.: Bacterial community structure in kimchi, a Korean fermented vegetable food, as revealed by 16S rrna gene analysis. Int. J. Food Microbiol. 103, 91-96 (2005). 16. Lee, J.S., Heo, G.Y., Lee, J.W., Oh, Y.J., Park, J.A., Park, Y.H., Pyun,Y.R., and Ahn, J.S.: Analysis of kimchi microflora using denaturing gradient gel electrophoresis. Int. J.

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