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Journal of Bacteriology and Virology 2007. Vol. 37, No. 2 p.79 89 임상가검물에서분리한 Stenotrophomonas maltophilia 의유전적다양성 경북대학교의과대학미생물학교실 장경수 오재영 강희영 진종숙 설성용 김정민 이제철 조동택 이유철 * Genetic Diversity of Stenotrophomonas maltophilia Isolated from Clinical Specimens Kyoung Soo Jang, Jae Young Oh, Hee Young Kang, Jong Sook Jin, Sung Yong Seol, Jungmin Kim, Je Chul Lee, Dong Taek Cho and Yoo Chul Lee * Department of Microbiology, Kyungpook National University School of Medicine, 700-422, Korea Received : February 26, 2007 Accepted : March 30, 2007 Stenotrophomonas maltophilia is a multi-drug resistant pathogen that has been isolated with increasing frequency from the hospitalized patients. A total of 202 S. maltophilia was isolated from three university hospitals and analysed by molecular typing for an epidemiologic investigation. All isolates were tested by antimicrobial susceptibility, random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis, and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RAPD and PFGE patterns were recorded and analysed by the unweighted-pair group method with arithmetic average method. Two or more isolates were considered to be clonally related if their PFGE pattern exhibited 80% similarity. Trimethoprim/ sulfamethoxazole and ciprofloxacin were the most active antimicrobial agents tested. The majority of the isolates found to be genetically unrelated by PFGE. The genetically related isolates were recovered from the same patient. The result demonstrates a high genetic diversity of S. maltophilia isolates from clinical specimens. The clonal diversity of S. maltophilia from the hospitalized patients is partly due to the strains originated from the hospital environments, but not horizontal transfer between the patients. Key Words: Genetic diversity, PFGE, Stenotrophomonas maltophilia 서 Xanthomonadaceae 과에속하는 Stenotrophomonas maltophilia (S. maltophilia) 균종은녹농균과세균학적특징이유사하다. 이균종은토양, 우물이나강물, 하수등의자연계에널리서식하고있다. 근래에 S. maltophilia는높은치명률을보이는병원감염의원인균으로분리빈도가증가하여병원감염의흔한원인균종의하나로주목받고있으며, 주로분리되 * 교신저자 : 이유철. 700-422, 대구광역시중구동인동 2 가 101 번지, 경북대학교의과대학미생물학교실 Phone: +82-53-420-4843, Fax: +82-53-427-5664, e-mail: yclee@knu.ac.kr ** 이논문은 년도한국학술진흥재단의지원에의하여연구되었음 (KRF--002-E00049). 론 는병원환경으로는수도꼭지, 배수구, 인공호흡기및소독용액과같은습한환경이다 (12,20). S. maltophilia는외상이나수술후창상감염, 심내막염, 균혈증, 수막염, 요로감염이나호흡기감염에서분리된다. 숙주의면역능력이저하되거나광범위항균제의장기치료시에이균에감염될위험성이높아지는데, 감염의위험인자는항생제투여, 삽관및호흡보조장치의사용, 장기간의입원, 중환자실입원등이다 (9,25). 그러나이균의독성은높지않으므로건강인으로구성된지역사회에서발생하는감염은병원감염에비하여드물다. 이균의감염이문제가되는이유는최근사용되는광범위항생제에대한자연내성으로치료약제선택의폭이아주제한된다는것이다. S. maltophilia는세균감염에가장효과적인항생제로널리사용되는 beta-lactam 항균제에높은내성 79

80 장경수, 오재영, 강희영, 진종숙, 설성용, 김정민, 이제철, 조동택, 이유철 을나타내며, 아미노배당체에도고도의다약제내성을나타낸다고알려져있다. 현재이균에의한감염의치료약제로권장되고있는항균제는 trimethoprim/sulfamethoxazole (Tp/ Su), quinolone, moxalactam 그리고 ticarcillin과 clavulanic acid 병합제등이다 (15). S. maltophilia 균의다약제내성은근래까지비전달성인자연내성으로알려져왔으나, 최근병원에서분리된일부균주에서는혼합배양에의해 3세대 cephalosporin과 monobactam 등새로운광범위 β-lactam 항균제와아미노배당체항균제에대한내성이 Escherichia coli, Proteus, Pseudomonas 등에전달될수있음이확인되어병원내감염병원균으로서역학적으로중요한위치를차지하게되었다 (2). S. maltophilia에의한병원감염의경로를추적하기위한조사에사용되는분자역학조사방법으로는 pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), random amplified polymorphic DNA (RAPD) 분석, enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)-PCR과 ribotyping 등이사용되어왔다 (4,6,12,18,27). PFGE법은가장정확한방법으로알려져있으나, 시행에소요되는시간과방법의어려움으로일상적으로시행하기는어려운점이있다. 반면에 RAPD-PCR법은신속한방법으로쉽게시행할수있는장점이있으나, 결과의일관성에문제가있다고알려져있다. 따라서이번연구에서는두가지방법을모두시행한다음, 결과를분석하여감염의감시체계수립에적합한방법을제시하고자하였다. 이번연구에서는같은지역에있는 2개의 3차의료기관과지역적으로떨어져있는 3차의료기관에입원한환자의검체에서분리된 S. maltophilia를대상으로균종을동정하고, 항생제내성양상을조사한다음, 유전형검사인 PFGE와 RAPD-PCR을시행하였다. 이결과를임상자료와비교분석하여집단또는산발감염의여부를파악하고, 유전형을비교하였다. 재료및방법 1. 임상검체분리균주 1994년에서 년그리고 2001년에서 년사이에대구광역시에소재하는 3차의료기관 2개소와천안지역 3차의료기관 1개소의환자검체에서분리된균주를사용하였다 (Table 1). 각의료기관의진단검사의학과미생물검사실에서 S. maltophilia로동정이된균주 202주를사용하였다. 수집된모든균주는순수배양한후 API (biomerieux SA, France) 20NE kit를이용하여생화학적성상을확인하였고, Whitby 등 (28) 이 23S rrna의염기서열을근거로고안한 S. maltophilia 균종특이적 PCR을시행하여유전적성상을확인하였다. Table 1. S. maltophilia isolates from clinical specimens used in this study Area Hospital 2. 항생제감수성검사 No. of isolates 1994~ 2001~ Total KY 61 109 170 DS 6-6 Cheonan DA - 26 26 실험에사용한항생제는 antifolate 계열의 sulfamethoxazole (Su, ICN Biomedicals, Irvine, CA, USA), trimethoprim (Tp, ICN Biomedicals) 및 aminoglycoside 계열의 streptomycin (Sm, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), kanamycin (Km, DUCHEFA, Haarlem, Netherland), gentamicin (Gm, DUCHEFA), tobramycin (Tb, Amresco, Solon, OH, USA), amikacin (Ak, ICN Biomedicals), β-lactams 계열의 ampicillin (Ap, USB, Cleveland, OH, USA), ampicillin/sulbactam (Ap/sul, 한국유니온제약, 서울, 대한민국 ), piperacillin (Pi, ICN Biomedicals), cefoxitin (Cx, Sigma Chemical Co.), cefotaxime (Ct, DUCHEFA), ceftazidime (Cd, Sigma Chemical Co.), aztreonam (Az, ICN Biomedicals), imipenem (Ip, 한국 MSD, 서울, 대한민국 ), quinolone 계열의 ciprofloxacin (Cip, Fluka, Buchs, Switzerland) 이며, chloramphenicol (Cm) 과 tetracycline (Tc, Sigma Chemical Co.) 을포함하여총 18종의항생제를실험에사용하였다. 항균제감수성검사는 Mueller-Hinton agar (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) 를사용한평판희석법에의하였다. 항생제감수성과내성의판정의기준이되는 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 과거 National Committee for Clinical Laboratory Standards) (21) 의기준에따라항생제가첨가된우무배지에접종한다음 37 에서 20시간배양후접종부위의균발육유무를보아내성여부를결정하였다. 3. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) 분석 균을 trypticase soy agar (Becton, Dickinson and Company) 에하룻밤배양한후, 식염수로세척하고증류수에부유시켜 100 에서 10분간가열한다음 4 에보관하였다. 반응물의조성은 PCR buffer (100 mm Tris-HCl, ph 8.5, 50 mm KCl, 4 mm MgCl 2 ), 1 µl 당 0.025 U의 Taq polymerase (TaKaRa Shuzo Co. Ltd., Tokyo, Japan), 각 200 mm의 datp, dgtp, dttp, dctp와 1 µm의 primer A (5'-AATCGGGCTG-3') 가 25 µl의 reaction mixture에포함되도록하였다. PCR 반응조건은초기 denaturation step을 94 에서 2분동안반응시킨다음, DNA denaturation 반응을 94 에서 30초, primer annealing 반

Genetic Diversity in S. maltophilia Isolates 81 응을 35 에서 30초, 그리고 extension 반응을 72 에서 1분동안시행하였고, 총 35회반복하였다. 마지막 extension 반응을 72 에서 4분간시행하였다. 결과의재현성을확인하기위하여 PCR 반응을두번반복하였다. 4. Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) 검사고형배지에서한개의집락을취해서 trypticase soy broth (Becton, Dickinson and Company) 에하룻밤배양한배양액을원침한다음 OD 600 값이 0.8이되도록 TE buffer (100 mm Tris, 100 mm EDTA, ph 8.0) 에현탁하였다. 균액에 lysozyme (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 과 proteinase K (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 를각각 1 mg/ml이되도록첨가하여 37 에서 15분간반응시킨후, 동량의 2% InCert agarose (FMC, Rockland, ME, USA) 를균부유액과혼합하여 agarose의최종농도가 1% 가되게한후, plug mold 에분주하여 plug를만들었다. Lysis buffer (50 mm Tris, ph 8.0, 50 mm EDTA, ph 8.0, 1% sarcosine, 1 mg/ml proteinase K) 에 plug를넣고, 55 에서 2시간동안반응시켰다. 증류수로세척한 plug를 5 mm 폭으로자른후, 제한효소 buffer H (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 에넣고반응시킨다음, 제한효소 XbaI 또는 SpeI (Roche Diagnostics GmbH) 를첨가하여 24시간처리하였다. CHEF-DR III system (Bio-Rad Co, Hercules, CA, USA) 에서 initial pulse 5초, final pulse 40초, 6 V/cm, angle 120 조건으로 12 에서 20시간전기영동하였다. 5. 유전형자료의처리및분석디지털화된사진자료는 Applied Maths사 (Sint-Martens- Latem, Belgium) 의 GelCompar II 프로그램을이용하여분석하고 database화하였다. 분석및비교대상은 48~500 kb 크기의절편으로한정하였으며, lambda 48.5 kb ladder DNA (Roche Diagnostics GmbH) 의전기영동양상을종합하여 reference point를결정하였다. 밴드를비교하는 Dice 방법을사용하여유사성계수를산출하여 unweighted-pair group method with arithmetic average (UPGMA) 에따라 dendrogram 을작성하였다. 결과 1. 균주의임상적특성 S. maltophilia가주로분리된검체는객담과호흡기관련검체가전체의 1/3 이상을차지하여가장많았으며, 소변이 2번째로흔한검체였고, 고름, 혈액등의순이었다 (Table 2). 결과는제시하지않았지만, ~2005년사이에분리된 59주 Table 2. Prevalence of S. maltophilia isolates according to clinical specimens Specimen Sputum & respiratory tract 의월별분리현황을살펴보면, 균주가가장많이분리된달은매년 7월이었으며, 41주 (69%) 가여름철인 6~8월사이에분리되었다. 병동에따른균의분포는중환자실 ( 내과, 외과및신생아중환자실포함 ) 에서분리된것이 20주, 일반병실에서분리된것이 25주, 응급실에서분리된것이 6주였으며, 병실을확인하지못한것이 8주있었다. 2. 항균제내성양상 No. of isolates 1994~ 2001~ Total (%) 21 55 76 ( 37.6) Urine 9 10 19 ( 9.4) Pus 2 7 9 ( 4.5) Blood - 7 7 ( 3.5) Ascitic fluid 4 2 6 ( 3.0) Pleural fluid 4 2 6 ( 3.0) Wound 5-5 ( 2.5) Others 12 12 24 ( 11.9) Unknown 10 40 50 ( 24.8) Total 67 135 202 (100.0) 실험한균주들의항생제별내성빈도를분리연도와병원으로나누어 61주의 1990년대 KY 병원분리주 (KY1990), 109 주의 2000년대 KY 병원분리주 (KY2000), 26주의 년 DA 병원분리주 (DA) 의 3개의군으로정리하였다 (Fig. 1). 대부분의균주가감수성을나타낸항균제는 Tp/Su 및 Cip, 최근에는일반적으로사용되지않는 Cm과 Tc이었다. 대부분의균주가 β-lactam 항균제인 Ap, Cx, Az, Ip 등에는내성을나타내었으며, 절반이상의균주가 Cd에내성이었고, 약 70% 의균주가 Pi에내성이었다. 아미노배당체항균제에대한내성빈도를살펴보면 Ak에대한내성빈도가약 30% 로가장낮았으며, Km, Gm, Tb에대한내성빈도는 50~70% 였다. 현재이균의치료제로권장되는 Tp/Su 병합제에대하여내성인균주는 20주 (10%) 였으며, ~년도에분리된 99주중에서는 8주 (8%) 였다. KY1990, KY2000 및 DA 의 3개군별내성빈도의전체적인차이는없었으며, DA 균주들이 KY1990 및 KY2000 보다 Ak, Cd에대한내성빈도가더높은것으로보이지만통계학적으로유의하지않았다 (p>0.05, by Chi square test).

82 장경수, 오재영, 강희영, 진종숙, 설성용, 김정민, 이제철, 조동택, 이유철 100% Resistance (%) 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% KY 1990 KY 2000 DA 20% 10% 0% Tp/Su Km Gm Tb Sm Ak Ap Ap/sul Pi Cx Ct Cd Az Ip Cip Cm Tc Antibiotics Figure 1. Resistance of S. maltophilia isolates against 18 antimicrobial agents. The lowest resistance rate of S. maltophilia isolates were for Cip, Cm, and Tp/Su, however, more than 90 % of isolates were resistant to Ap, Cx, Az, and Ip. Abbreviations: Tp: trimethoprim, Su: sulfamethoxazole, Km: kanamycin, Gm: gentamicin, Tb: tobramycin, Sm: streptomycin, Ak: amikacin, Ap: ampicillin, Ap/sul: ampicillin/ sulbactam, Pi: piperacillin. Cx: cefoxitin, Ct: cefotaxime, Cd: ceftazidime, Az: aztreonam, Ip: imipenem, Cip: ciprofloxacin, Cm: chloramphenicol, Tc: tetracycline. 3. S. maltophilia 균주의유전형분석 제한효소 XbaI 처리한 S. maltophilia 균주의 PFGE 결과를보면, XbaI으로처리한경우절편의수는 10~19개였으며, 평균은 14.8이었다 (Fig. 2). 반면 SpeI으로처리한경우절편의수는 6~16개였으며, 평균은 10.8로나타나서 (data not shown) XbaI으로처리한경우가분석에더적합한것으로나타났다. 따라서제한효소 XbaI으로처리한 PFGE profiles 를사용하여균주간의유사성을분석하였다. Dendrogram 작성을위해서 Dice similarity indices (optimization, 3%; position tolerance, 3%) 를사용하였으며, 80% 이상의유사성을나타내는균주들을동일한클론으로판정하였다 (Fig. 3). 같은환자에서중복하여분리된균주는제외하면, 전체적으로 80% 이상유사성을나타내는균주가없이다양한유전적인성상을나타내었다. 따라서조사한기간동안동일한균주에의한집단발생이없었음을알수있었다. 예외적으로분리된시기와장소가다름에도불구하고유전적유사성이높은경우도있었으며 (03DXM34와 06K4, 03DXM12와 06K50), 같은시기에동일한병원에서분리된균주들사이에유전적유사성이있는 1990년대의균주와 DA 병원분리균주 Figure 2. PFGE XbaI profiles of S. maltophilia isolates. Lanes M: lambda ladder DNA, lane 1: S. maltophilia ATCC 13637, lane 2: 05KST01 (), lane 3: 05KST03 (), lane 4: 05KST11, lane 5: 05KST12, lane 6: 05KST19 (III), lane 7: 05KST23 (EEE), lane 8: 05KST25 (FFF), lane 9: 05KST27 (), lane 10: 05KST28 (), lane 11: 05KST32 (), lane 12: 05KST33 (), lane 13: 05KST36. Parenthesis next to the isolates number means the patient. 에서일부있었으나, 대부분의균주는분리된시기나장소와무관하게유전적유사성이아주낮은것으로나타났다.

Genetic Diversity in S. maltophilia Isolates 83 Dice(fuzzy) (Opt:3.00%) (Tol 3.0%-3.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] Stenotrophomonas Stenotrophomonas 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 03DXM31 06K30 96DST05 03DXM27 96DST04 03DXM26 03DXM18 03DXM40 03DXM24 06K51 06K2 96DST06 06K26 03DXM30 03DXM09 04KST21 98K 1055 03DXM32 06K10 03DXM21 03DXM34 06K4 04KST25 05KST27. 2005 96DST07 05KST35 2005 06K11 05KST36 2005 04KST27 03DXM38 03DXM12 06K50 04KST19 03DXM20 06K1 06K25 06K37 03DXM39 03DXM25 03DXM35 03DXM36 06K17 98K 481 98K 501 94K 175 1994 94K 178 1994 94K 136 1994 94K 144 1994 04KST26 05KST03. 2005 04KST14 98K 722 04KST20. 96DST08 04KST02. 98K 597 05KST26 2005 03DXM28 05KST12 2005 03DXM37 06K19 06K35 96DST03 96DST03 05KST11 2005 06K45 95K 249 1995 94K 145 1994 06K12 03DXM17 06K34 03DXM22 06K5 98K 838 03DXM19 Figure 3. Dendrogram of PFGE XbaI profiles of S. maltophilia isolates from clinical specimens. Profiles for similarity were performed with Gel Compar II software with Dice similarity indices (optimization, 3%). Dendrograms were generated by using the unweighted pair group method with arithmetic averages (UPGMA).

84 장경수, 오재영, 강희영, 진종숙, 설성용, 김정민, 이제철, 조동택, 이유철 4. 동일한환자에서분리된균주에의한 RAPD 분석과 PFGE 의비교 Figure 4. DNA fingerprinting profiles of RAPD of S. maltophilia with 10 mer primer. Lanes M: DNA size marker (GeneRuler DNA Ladder Mix, MBI fermentas, Canada), lane 1: 05KST23 (EEE), lane 2: 05KST24 (EEE), lane 3: 05KST25 (FFF), lane 4: 05KST26, lane 5: 05KST27 (), lane 6: 05KST28 (), lane 7: 05KST29 (), lane 8: 05KST30 (FFF), lane 9: 05KST31, lane 10: 05KST32 (), lane 11: 05KST33 (), lane 12: 05KST36. Parenthesis next to the isolates number means the patient. S. maltophilia 균주는 RAPD 분석에서다양한유형들을나타내었다. 증폭된 DNA 절편의수는균주별로다양하였는데범위는 1~10개였으며, 영동하여분석한크기는 400~2,000 bp 사이였다 (Fig. 4). 년부터 2005년사이에같은환자로부터 2회이상분리된 S. maltophilia 균주들의 RAPD 결과를 dendrogram으로표시하였으며 (Fig. 5A), 같은균주들의 PFGE 결과 dendrogram을표시하였다 (Fig. 5B). Fig. 2와 4에서나타낸균주들을환자별로분류하여검체의종류, 채취날짜, 항균제내성유형과함께유전형을표로정리하였다 (Table 3). 환자 AAA로부터분리한 04KST30, 04KST31 균주는분리된시점은달랐지만, PFGE와 RAPD에의한유전형이동일하였고, 표현형인항균제내성유형도일치하였다. 환자 GGG 로부터분리한 04KST20, 04KST24 및환자 III로부터분리 Table 3. Characteristics of S. maltophilia multiply isolated from the same patient from to 2005 Isolates No. Patient Date Specimen Same genotype a Resistance patternb 04KST30 AAA Jul-04 Sputum Y / Y Sm Ap/sul Km Ct Cx Az Cd Pi 04KST31 AAA Aug-04 Bronchial aspirates Y / Y Sm Ap/sul Km Ct Cx Az Cd Pi 04KST01 Apr-04 Pus Y / Y Sm Ap/sul Ct Cx Az Pi 04KST08 May-04 Pus Y / N Sm Ap/sul Gm Cx Az Cd Pi 04KST10 May-04 Pus Y / Y Ap/sul Az Pi 04KST02 CCC Apr-04 Urine N / N Sm Ap/sul Tp/Su Km Gm Ct Az Pi 04KST04 CCC Apr-04 Urine N / N Sm Ap/sul Gm Ct Cx Az Pi 05KST27 Jul-05 Blood Y / Y Sm Ap/sul Ct Az Cd Pi 05KST28 Jul-05 Blood Y / Y Ap/sul Ct Az Cd Pi 05KST29 Jul-05 Blood Y / Y Sm Ap/sul Ct Cx Az Cd Pi 05KST32 Jul-05 Blood Y / N Ap/sul Ct Cx Az Cd Pi 05KST33 Jul-05 Blood Y / N Ap/sul Ct Az Pi 05KST23 EEE Jun-05 Sputum Y / Y Sm Ap/sul Km Ct Cx Az Cd Pi 05KST24 EEE Jun-05 Sputum Y / Y Sm Ap/sul Km Ct Cx Az Pi 04KST20 GGG Jul-04 Pleural fluid Y / Y Sm Km 04KST24 GGG Jul-04 Pleural fluid Y / Y Sm Km 05KST01 Jan-05 Pus Y / Y Sm Ap/sul Km Ct Az Pi 05KST03 Jan-05 Pus Y / Y Sm Ap/sul Km Gm Ct Az 05KST13 Mar-05 Sputum N / N Ap/sul Tp/Su Ct Cx Az Pi 05KST19 III Jun-05 Bile Y / Y Sm Ap/sul Km Ct Cx Az Cd Pi 05KST20 III Jun-05 Blood Y / Y Sm Ap/sul Km Ct Cx Az Cd Pi a Same genotype by PFGE / RAPD, Y: yes, N: no. b Abbreviations: Sm: streptomycin, Ap/sul: ampicillin/sulbactam, Tp/Su: trimethoprim /sulfamethoxazole, Km: kanamycin, Gm: gentamicin, Ct: cefotaxime, Cx: cefoxitin, Az: aztreonam, Cd: ceftazidime, Pi: piperacillin

Genetic Diversity in S. maltophilia Isolates 85 A Dice(fuzzy) (Opt:3.00%) (Tol 3.0%-3.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] RAPD RAPD 30 40 50 60 60 70 80 90 100 Isolates Patients 04KST30 AAA 04KST31 AAA 05KST13 05KST23 EEE 05KST24 EEE 05KST28 05KST29 05KST27 05KST19 III 05KST20 III 04KST02 CCC 04KST20 GGG 04KST24 GGG 04KST01 04KST10 04KST04 CCC 04KST08 05KST01 05KST03 05KST32 05KST33 B Dice(fuzzy) (Opt:3.00%) (Tol 3.0%-3.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] Stenotrophomonas Stenotrophomonas 50 60 70 80 90 100 Isolates Patients 04KST30 AAA 04KST31 AAA 04KST20 GGG 04KST24 GGG 05KST19 III 05KST20 III 05KST23 EEE 05KST24 EEE 04KST01 04KST04 CCC 04KST10 04KST08 05KST01 05KST03 05KST27 05KST33 05KST28 05KST32 05KST29 04KST02 CCC 05KST13 Figure 5. Dendrogram of S. maltophilia isolates from the same patients by RAPD (A) and PFGE (B). Fragments were analyzed using Dice similarity indices (optimization, 3%) and a dendrogram was drawn using unweighted-pair group method with arithmetic average (UPGMA).

86 장경수, 오재영, 강희영, 진종숙, 설성용, 김정민, 이제철, 조동택, 이유철 한 05KST19, 05KST20도같은경우였다. 그러나환자 에서분리된균주인 04KST01, 04KST08, 04KST10의경우는항생제내성유형에서조금차이가있었으며, 04KST08은 RAPD 분석에서대부분의절편이같았지만, 절편의수가적어서다른그룹으로분류되었다. 가장많은균주가분리된환자 유래 S. maltophilia 5주는항생제내성유형은조금씩달랐지만, PFGE 유전형은같은그룹이었다. 환자 유래의 05KST32와 05KST33은 RAPD 분석에서는하나의절편만나타나서다른군으로분류되었다. RAPD의결과는대부분 PFGE의결과와일치하여동일한환자에서분리된균주들이유전적으로같은것으로나타났지만, 두방법의결과가완벽하게일치하지않는경우도있었다. PFGE와 RAPD 분석의두실험모두에서차이가있는것으로나타난환자 CCC 유래의 04KST02와환자 유래의 05KST13은같은환자에서분리된균주들과달리 Tp/Su 에내성이었다. 따라서이경우에는다른 S. maltophilia 균주에의한재감염이일어난것으로추측된다. 고찰 S. maltophilia는물이있는환경에서잘자라는호기성세균으로강이나하수와같은자연계뿐만아니라, 소변, 호흡기분비물등과같은병원환경에서도자주분리된다 (9). 이균의감염과관련된국내의연구는심판막염, 복막투석관련감염, 안과영역의감염등넓은범위에서다루어졌다 (1,17). 이균의 colonization 및 infection의위험인자는광범위항생제의투여, 장기간의입원, 중환자실입원, 인공호흡기및혈관내삽관, 혈액종양, 호중성백혈구감소증등이며, 다른균에대한광범위항생제치료로인하여이균의 colonization 및 infection이유도된다고알려져있다 (25). 이균의직접전파경로가명확하게밝혀진것은없으나, 이균이자연계에널리분포되어있기때문에우연하게숙주에감염될가능성이있으며, 숙주의면역능력이떨어질경우질병으로연결될가능성이제시되고있다 (10,24). 이번연구에서수집된 S. maltophilia가분리된검체는객담과호흡기관련검체가전체의 1/3 이상을차지하여가장많았으며, 소변이 2번째로흔한검체였고, 고름또는혈액에서분리된경우가많았다. 그러나이균에의한감염과함께 colonization의경우도포함되어있기때문에이에대한정확한연구를위하여환자의병력에대한상세한검토가있어야할것이다. ~2005년에는 7월에가장많이분리되었으며, 여름에분리된균주가대부분을차지하는것으로보아계절의변화에의한환경의영향이감염과관련되어있음을시사한다. S. maltophilia가분리된환자들의병실을살펴보면내 과, 외과및신생아중환자실을포함한중환자실에서분리된것이 20주, 일반병실에서분리된것이 25주로이균감염의위험인자인중환자실입원을확인할수있었다. 1970년대부터 S. maltophilia 균의분리에대해보고된이후, 1980년대부터 1990년대까지는 S. maltophilia가자연내성을가지고있는 carbapenem 항생제사용의증가와함께이균의감염이폭발적으로증가한것으로보고되었다 (9). 2002년부터 년사이에영국, 웨일즈, 북아일랜드지역에서발생한 S. maltophilia에의한균혈증의빈도가 8% 증가하였다고보고하였으나 (13), Meyer 등 (19) 이 2001년부터 년까지독일에있는 34개중환자실을조사한결과 1,000환자일당분리빈도는평균 2.2였으며, 2001년 2.7에서 년 2.1로큰변화가없었으며, S. maltophilia 병원감염의빈도역시평균 0.134로 (2001년 0.173에서 년 0.191) 크게변화가없다고보고하였다. 국내병원에서분리된그람음성균의균종별분리빈도의추이를보면 S. maltophilia의분리빈도는 1993년에 3.1% 에서 년에는 4.7% 로다른균종에비하여분리빈도가급격하게증가하였다 (16). 이번연구에서도 1990 년대후반보다 2000년이후에분리된균주의수가많았지만, 병원에서분리되는모든균들이조사되었는지에대한의문이있다. 따라서 colonization과감염의구별과함께이균의분리빈도에대한정확한결과를얻기위해서는집중적이고구체적인계획과협조하에서상세한병원환자기록의분석이필요할것으로생각된다. S. maltophilia에의한감염의치료에일차선택약으로추천되는것은 Tp/Su이다. Tp/Su에대한내성빈도는아시아 -태평양지역은약 8%, 미주지역은약 5%, 유럽은 10% 로보고되었으나, 보고에따라빈도의차이가있다 (11,14). 이번연구에서는나타난 Tp/Su에대한내성빈도는 10% 였다. S. maltophilia는자연적으로 extended-spectrum penicillin, 3세대 cephalosporin 및 carbapenem을포함한대부분의 β-lactam 항생제와아미노배당체항균제에내성을나타내며, fluoroquinolone 항생제에대해서도다양한감수성을보인다고보고되었다 (9,22,25). S. maltophilia가보유한 efflux 기전중에서 Sme- ABC는 Cip의배출에, SmeDEF는 meropenem 항생제의배출에관여한다고알려져있다 (5). 이번연구에서수집된균주의 Cip에대한내성빈도는 10% 정도로낮았다. 그러나 quinoline의내성판정기준이되는표준 breakpoint가확실하지않고 S. maltophilia의경우에 Cip와 ofloxacin 같은 quinolone 에대한감수성균의 MIC가흔히 breakpoint 주변에몰려있기때문에현재의이러한결과는조심스럽게해석되어야할것으로보인다 (1,22,23). 이균의대부분은 Ip에자연내성을나타내며, 3세대 cephalosporin을포함한대부분의 β-lactam 항균제와아미노배당체항균제에내성을나타낸다. 따라서

Genetic Diversity in S. maltophilia Isolates 87 Ip와 3세대 cephalosporin의사용은이균감염의가능성을높이게되므로이러한항균제를자주사용하는병원에서는더높은비율로원내감염의원인균으로분리되어임상적으로문제가된다 (2,8). 이번연구에서분리된균주들은거의모두가 Ip과 3세대 cephalosporin을포함한대부분의 β-lactam 항균제에내성이었다. S. maltophilia 균주에의한원내감염의역학조사를위한형별검사방법중에서 PFGE 방법은시행이다소까다롭고시간이많이걸린다는단점은있으나, 처리및실험조건에대한표준화를통하여실험실내에서나실험실간에재현성이높다는장점이있어균주의형별검사방법으로현재까지는가장좋은것으로알려져있다 (29). PCR을이용한형별검사방법으로신속하고간단하면서비용도적게드는 RAPD 검사법은 PCR의높은감수성으로인하여재현성에문제가있는것으로알려져있다 (7,18,27). 이번연구에서나타난결과를보면, 대부분의균주는 RAPD 형별과같은 PFGE 형별로분류가되었으나, 일부균주가다른것으로나타났다. 따라서 RAPD 방법은간단하게시행할수있다는점에서 1 차검색목적으로시행하고, 정확한유전형의판별을위해서는반드시 PFGE로확인하여야할것으로생각된다. 설등 (1) 은 1990년대에분리한 S. maltophilia 68주중에서 14주의균주를대상으로 PFGE와 enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)-PCR 을시행하여그결과가일치한다고하였으며, 10개의그룹으로분류하였다. 그리고동일한유형에속한창상유래균주는표현형과유전형이일치하여공통의감염원에서유래한것으로보고하였다. 이번연구에서분리된균주들의 PFGE는아주다양한양상으로나타났으며, 같은환자에서분리한균주들만이동일한유전형으로분류되었을뿐지속적으로유행하는균주는발견되지않았다. 과거에비하여병원내감염의관리가강화된사실을반영한결과로추측된다. S. maltophilia의감염원은병원에있는모든액체나기구를포함한병원환경이다. 이균은환자의정상균무리의일부로존재하기도하며, 혈액종양환자의변에서는높은빈도로검출되고, 병원종사자의호흡기, 인두, 및손에서도검출된다 (25). Cystic fibrosis 환자의경우이균은한환자에서 6개월이상지속적으로 colonization되기도하지만, 일반적인병원환경에서는 8.5±6.5일정도로생각보다짧다 (26). Berg 등 (3) 이 4년동안같은병원에서환자유래주, 병원의소독약제에서분리한균주, 물이있는환경에서분리한균주, 식물관련균주와함께표준균주의유전적다양성을조사한결과유래에따른유전적유사성이발견되지않았고, 특정클론이발견되지않았으며, 유전형이다양하다고하였다. 이번연구에서는같은환자에서중복하여분리된균주를제외하면, 80% 이상의유사성을나타내는균주가없이다양한유전적인성상을나타내었으며, 지역이나분리된병원에따른특정클론이발견되지않았다. 즉공통적인감염원에의한집단적인감염이라기보다사람들이다양한환경에서식하는 S. maltophilia를획득하여 colonization 되었다가숙주의면역저하또는위험인자에노출되면서감염된것임을시사한다. 병원감염과일반사회감염의감별및 colonization 과 infection을감별할수있는임상자료의정리가필요하며, 이를근거로더분명한감염이나전파경로의파악이가능하다. 따라서차기연구는반드시정확하고상세한임상자료가제시되는연구로수행되어야할것으로생각된다. 이균에의한감염이앞으로도많이발생할것이예상되므로환자발생할경우에는감염된환자에의한균의전파를차단하기위한즉각적인조치가필요하며, 오염원에대한조사를즉각시행하여병원환경에서가능한원인을신속히제거할수있는감염차단의시스템의수립이병원단위에서이루어져야할것으로생각된다. 참고문헌 1) 설성용, 장경수, 정웅기, 조응래, 김능희, 유학선, 이유철 : 병원재료에서분리한 Stenotrophomonas maltophilia 의항균제내성및분자역학적특성. 대한미생물학회지 35: 239-250, 2000. 2) Babalova M, Blahova J, Lesicka-Hupkova M, Krcmery V. Sr., Kubonova K: Transfer of ceftazydime and aztreonam resistance from nosocomial strains of Xanthomonas (Stenotrophomonas) maltiphilia to a recipient strain of Pseudomonas aeruginosa ML-1008. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 14: 925-926, 1995. 3) Berg G, Roskot N, Smalla K: Genotypic and phenotypic relationships between clinical and environmental isolates of Stenotrophomonas maltophilia. J Clin Microbiol 37: 3594-3600, 1999. 4) Bingen EH, Denamur E, Lambert-Zechovsky NY, Bourdois A, Mariani-Kurkdjian P, Cezard JP, Navarro J, Elion J: DNA restriction fragment lengh polymorphism differentiates crossed from independent infections in nosocomial Xanthomonas maltiphilia bacteremia. J Clin Microbiol 29: 1348-1350, 1991. 5) Chang LL, Chen HF, Chang CY, Lee TM, Wu WJ: Contribution of integrons, and SmeABC and SmeDEF efflux pumps to multidrug resistance in clinical isolates of Stenotrophomonas maltophilia. J Antimicrob Chemother 53: 518-521,.

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