Clinical Article The Korean Journal of Sports Medicine 2011;29(2):112-117 http://dx.doi.org/10.5763/kjsm.2011.29.2.112 8 주간의저항성운동이쥐골격근에서 Mustn1 mrna 발현에미치는영향 한양대학교체육과학연구소운동생리학교실 오승렬 Effect of Resistance Exercise Training on Mustn1 mrna Expression in Rat Skeletal Muscle Seung Lyul Oh, PhD Research Institute for Sports Science, Hanyang University, Seoul, Korea The aim of this investigation was to determine if resistance exercise improved musculoskeletal embryonic nuclear protein 1 (Mustn1) mrna expression in skeletal muscle of rat. Thirty-two male Sprague-Dawley rats were separated into sedentary (control group, CON; n=16) and exercise-trained groups (resistance exercise group, REG; n=16). CON and REG subsequently were separated into 4 weeks group (4 weeks CON, 4 weeks REG) and 8 weeks group (8 weeks CON, 8 weeks REG). The rats in the resistance exercise group were trained to climb a 1-m vertical (85 degree incline) ladder with weights secured to their tail, and they climbed the ladder 10 times 3 days per week for 8 weeks progressively. After weeks of exercise, skeletal muscle was taken from the flexor halucis longus. After separating the total ribonucleic acid (RNA) of each group, quantitative polymerase chain reaction was used to analyze RNA quantitatively. After 4 weeks of resistance exercise, Mustn1 mrna expression increased significantly in REG compared to CON (p<0.001). Additionally, there was a significant increase of Mustn1 mrna expression in 8 weeks REG compared to 8 weeks CON (p<0.01). Interestingly, there was a significant difference in Mustn1 mrna between 4 weeks REG and 8 weeks REG (p<0.01). In the REG, Mustn1 mrna increased by 3.7-fold and 2.1-fold relative to CON, respectively. In conclusion, the resistance training increased Mustn1 mrna expression in skeletal muscle of rat. This shows that the Mustn1 mrna expression gives positive effect on myogenesis and muscle regeneration in skeletal muscle of rat results from resistance ladder exercise. Key Words: Resistance training, Mustn1 서 론 접수 : 2011-9-2 수정 : 2011-11-1 승인 : 2011-11-14 책임저자 : 오승렬 133-791, 서울시성동구행당동한양대학교체육과학연구소운동생리학교실 Tel: 02-2220-1502 E-mail: hyriss@hanyang.ac.kr 저항성운동은근골격계발달을위한가장효과적인운동방법으로알려져있으며, 신경과근육사이의상호작용을증진시킬수있도록신체를자극시킨다. 저항성운동으로인한근육의커짐현상을근비대 (muscle hypertrophy) 라부르며, 이는주로근섬유의횡단면적증가를의미한다. 근비대의진행은 112 대한스포츠의학회지
오승렬. 8 주간의저항성운동이쥐골격근에서 Mustn1 mrna 발현에미치는영향 단순히섬유의횡단면적만을증가시키는것이아니라근원섬유내의수축단백질인액틴 (actin) 과마이오신세사 (myosin filament) 의합성증가, 근섬유내의근원섬유숫자의증가와관련되며, 결국근비대는근력의향상을유도하게된다 1). 즉, 규칙적인저항성운동으로인한운동단위동원의증가와근비대현상이일어나게되면근세포의성장및근력의발달을효과적으로촉진시키게되고, 특히저항성운동은성장호르몬의분비를유발하여세포막을통한아미노산의수송을촉진하고핵내전사 (transcription) 작용에영향을주어 messenger RNA (mrna) 의양을증가시킴으로써단백질의합성을촉진시키게된다 2,3). 한편 musculoskeletal embryonic nuclear protein 1 (Mustn1) 은골격근, 뼈, 건을제외한대부분의성인조직에서는비활성화되지만, 정상성인골격근과건에서압도적으로높은발현을보이기때문에 musculoskeletal-specific gene으로제시되어왔다 4). 특히골재형성기간과배아발생 (embryogenesis) 시골, 연골, 골격근계통 (i.e., preosteoblast, proliferation condrocyte, myoblast and mesenchymal cell) 에서 Mustn1의활성도는크게증가하는것으로나타났다 5,6). Lombardo 등 7) 은생쥐를골절시킨후 callus에서골재형성과정에관여하는유전자를조사하였는데, Mustn1이골절 3일째 22배, 5일째 54배의높은증가를보인것으로보고하였으며, Hadjiargyrou 등 8) 도 transcriptional profiling 연구에서 Mustn1을골재형성관여하는후보유전자로보고하였다. 이렇듯 Mustn1는골과연골에서재형성에관여를하며, 골격근에서발현의증가를보이지만그기능에대해서는아직알려져있지않다 5). 그러나최근 Liu 6) 는 in vitro myogenesis model (C2C12 cells myogenic differentiation) 에서 Mustn1 발현을확인하고, Mustn1을골격근계연구에대한새로운 marker로제시하였다. 이와같이골재형성과배아발생및연골재생등과같은골관절계에높은관여를보이는 Mustn1 유전자는단백질합성과골격근형성과같은기능에대해명확하게밝혀진바는없으나저항성운동시단백질의합성을높이고근육형성을유도하는등골격근에긍정적인효과를보인다는연구보고 5) 가발표된바있다. 그럼에도불구하고규칙적인저항성운동에따른 Mustn1 발현에대한연구가여전히부족한실정이다. 따라서본연구는흰쥐를대상으로 8주간의사다리를이용한점증적저항성운동을통한근비대의유발후골격근에서의 Mustn1 mrna의발현을분석하고자하였다. 연구방법 1. 연구대상본연구대상은 10주령의 Sprague-Dawley계수컷흰쥐 (Semtako Inc., Osan, Korea) 로최초 32두를분양받은후통제집단 (control group, CON; n=16) 과저항성운동집단 (resistance exercise group, REG; n=16) 으로구분하였다. 그리고이들집단은다시 4주차와 8주차집단으로구분하여총 4집단으로구성하였다 : 1) 4주차통제집단 (4 weeks CON; n=8), 2) 8주차통제집단 (8 weeks CON; n=8), 3) 4주차운동집단 (4 weeks REG; n=8), 4) 8주차운동집단 (8 weeks REG; n=8). 모든동물에게일주일간의식이및실험실환경적응기간을부여한후, 일주일간의추가운동적응기간을동일한시간대에제공하였다. 2. 실험동물처치 1) 실험동물사육실험동물은 S시소재 H대학교의과대학동물실험실에서스틸게이지 (steel cage) 를이용하여 3마리씩사육하였다. 사육실의온도는 22 o C±1 o C, 습도는상대습도의 50%±2% 로일정하도록조절하였으며, 12시간 (08:00-20:00) 을주기로명암을조절하였다. 또한실험동물에게는실험기간동안시판되는고형생각 ( 단백질 22.5%, 지방 3.5%, 저섬유 7.0%, 회분 9.0%, 칼슘 0.7%, 인 0.5%; Samyangfeed, Seoul, Korea) 와고압증기로멸균한물을충분히공급하였다. 2) 체중및골격근의무게측정주차별체중의변화는전자저울 (mettler instrument AG CH-8606, Greifensee, Switzerland) 을이용하여측정하였으며, 골격근의무게는최대한기시점과부착점에가깝게절단하여적출하고, 지방조직과결체조직을제거한후정밀계량기 (Sartorius, Goettingen, Germany) 를이용하여계량하였다. 골격근의무게는절대적인무게 (mg) 와함께근육적출직전체중에대한골격근의상대적인무게비율 (mg/g) 을산출하였다 9). 3) 시료채취분석을위한시료채취는운동 4주와 8주후, 총 2회에걸쳐실시하였고, 저항성운동은조직채취 24시간전에, 고형생각은조직채취당일아침에중단하여 4시간의공복을유지 제 29 권제 2 호 2011 113
SL Oh. Effect of Resistance Exercise Training on Mustn1 mrna Expression in Rat Skeletal Muscle Table 1. Resistance exercise program Condition Reps Set Load Rest (min) Duration (min) Frequency (day/wk) Period (wk) Adaptation period Max. 3 1 Weight bearing 1 10 4 1 Exercise period Max. 10 1 50%/body weight, every trial+15% 2 30 3 8 한채물만공급하였다. 조직채취는동물용마취제인 Zoletil (50 mg/kg; Virbac, Carros, France) 과 Rompun (5-10 mg/kg; Bayer, Seoul, Korea) 을 5:1의비율로혼합하여복강내주입시켜마취시킨후사다리운동에서주동근 10-14) 으로작용하는장무지굴근 (flexor hallucis longus) 의양측동일한부위를적출하였다. 3. 저항성운동방법일주일간의환경적응기간과일주일간의추가운동적응기간을가진운동집단의 12주령동물은자체제작한쥐전용사다리 (100 12 cm, 2 cm grid, 85 o incline) 를이용하여 8주간의저항성운동을실시하였다. 저항성운동프로그램은 Table 1과같다. 저항성운동방법은중량을달고사다리를오르는저항성사다리운동방법을사용하였다 14). 첫일주일은운동적응기간으로동일시간대에부하없이사다리를오르는훈련에적응시킨다음, 부하를달고높이 100 cm와경사도 85% 의자체제작된사다리를오르는운동을주당 3일, 1일 10회씩점진적인과부하하에서실시하였으며, 모든운동은최대 12회를넘기지않도록통제하였다. 저항성운동부하는최대중량의 50% ( 최초체중의 50%) 부터시작하여매회마다처음지정된무게에서 15% 씩부하를증가시켰고, 반복간 2분간의휴식시간을가졌다. 세트가끝나는시점인 10번째중량을최대중량으로기록하였다. 그러나세트가끝나기전에운동수행이불가능하게되면바로전시점의중량으로세트를완료하였으며, 더이상운동을할수없게되기전시점의중량을최대중량으로기록하였다. 4. 분자생화학적분석방법 1) Total RNA 분리적출한골격근을최대한빠른시간에액화질소 (liquid nitrogen) 로동결시킨후 BioPulverizer (Biospec 59013N, Bartlesville, OK, USA) 를이용하여최대한분쇄시켰다. 조직 50-100 mg당 1 ml의 Tri Reagent (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA) 를첨가하여균질화시켰다. Chloroform (Sigma, St. Louis, MO, USA) 과 isopropanol (Sigma), 75% ethanol을이용한 RNA 추출, 침전, 세척과정을거친후건조된 pellet에 nuclease-free water 30μL 를첨가하여 total RNA를분리한후 Spectrophotometer (NanoDrop, Wilmington, DE, USA) 를이용하여흡광도 (absorbance) 와정제도 (purity) 를측정하였다. 또한 2% agarose gel를이용해서전기영동을실시하고, UV transilluminator (Bio Rad, USA) 를통해서 total RNA의 quality를측정하였다. 2) Real-time quantitative polymerase chain reaction (qpcr) RNA를정량분석하기위하여 SYBR Green을이용한 qpcr 을실시하였다. 유전자의최적의 primer set는하버드대학의 primerbank에서탐색하여합성하였으며, 합성한 primer set와 cdna 샘플을 SYBR Geen supermix와혼합하여 icycler를이용한 qpcr을실시하고정량분석하였다. qpcr data는 housekeeping gene인 Gapdh와비교한상대적인수치 (dct=gene Gapdh) 를이용하여 normalization한 Gapdh 대비상대적인유전자발현의비율 (2n-dCt) 을의미한다. 구체적인 qpcr 방법은 iq SYBR Green Supermix (Bio Rad) 를이용하여 total volume이 50μL (iq SYBR Green Supermix, Primer 1, Primer 2, Sterile water, DNA template) 가되게만들고, qpcr 반응조건을 denaturation (95 o C, 40s), annealing (58 o C, 40s), extension (70 o C, 40s) 으로설정하여실시하였다. 유전자의 primer sequence는 Gapdh sense; F 5'-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3', antisense; R 5'-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3' (146 bp), Mustn1 sense; F 5'-GGGAGTCTGTCCAAGAACCA-3', antisense; R 5'-TTG- GGCTTCTCGAAGACTGT-3' (137 bp) 이다. 5. 자료처리모든측정치에대한평균 (mean) 과표준편차 (standard deviation) 를산출하였으며, 운동집단과통제집단의체중, 골격근무게의변화, Mustn1 mrna 발현의변화를분석하기위해서대응표본 T-검정 (paired samples t-test) 을적용하였다. 이상결과자료에대한통계치검증은 SPSS ver. 18.0 (SPSS Inc., 114 대한스포츠의학회지
오승렬. 8 주간의저항성운동이쥐골격근에서 Mustn1 mrna 발현에미치는영향 Chicago, IL, USA) 프로그램을이용하였고, 모든통계치의유의수준은 α=0.05로설정하였다. 결과 1. 체중과골격근무게의변화주차별체중의변화를살펴보면, Fig. 1과같이최초집단별체중의유의한차이는보이지않았고 (4 weeks CON, 393.5±14.0 g; 4 weeks REG, 394.7±17.3 g; 8 weeks CON, 397.3 g; 8 weeks REG, 388.0±9.7 g; p>0.05), 4주차집단군과 8주차집단군의통제집단과저항성운동집단은서로비슷한양상을보이며증가하였다. 그리고 4주차집단 (CON, 484.2±22.6 g; REG, 458.9±17.9 g) 에서는운동집단에비하여통제집단에서더높은체중의증가를보였으나, 집단간통계적으로유의한차이를보이지는않았다. 그러나 8주차집단 (CON, 532.8±17.2 g; REG, 462.7±15.0 g; p<0.01) 에서는운동집단이통제집단에비해유의한체중의감소가나타난것으로나타났다 (Fig. 1). 주차별골격근무게의변화를살펴보면전체적으로증가하는양상을보이고있다 (Figs. 2, 3). 절대적인골격근의무게는저항성운동에따라증가하는양상을보였고, 4주차집단군에서유의한차이가나타났다 (CON, 660±58.3 mg<reg, 760± 47.0 mg; p<0.05). 반면에상대적인골격근의무게 (mg/g) 는 4주차집단군 (CON, 1.33±0.1<REG, 1.7±0.1; p<0.01) 과 8주차집단군 (CON, 1.4±0.1<REG, 1.7±0.1; p<0.01) 모두에서유의한차이를보였다. 따라서 8주간의저항성사다리운동은골격근무게를증가시키는것으로나타났다. 2. Mustn1 mrna 발현의변화 Fig. 1. Changes of the body weight. **Significant difference between control group (CON) and resistance exercise group (REG). Significant at **p<0.01. 쥐전용사다리를이용한저항성사다리운동은쥐골격근에서 Mustn1 mrna 발현을유의하게증가시키는것으로나타났다 (Fig. 4). 4주차운동집단 (CON, 0.088±0.006; REG, 0.330± 0.029; p<0.001) 과 8주차운동집단 (CON, 0.109±0.027; REG, 0.234±.0033; p<0.01) 모두통제집단에비해 Mustn1 mrna 발현의유의한증가를보였고, 4주차운동집단 (4 weeks REG) 이 8주차운동집단 (8 weeks REG) 보다 Mustn1 mrna 발현의유의한증가가나타났다 (p<0.01). 또한 Fig. 5는통제집단의대한 Mustn1 mrna 발현의비율을의미하는데, 4주차운동집단은 4주차통제집단에비해약 3.7 배, 8주차운동집단은 8주차통제집단에비해약 2.1배의 Mustn1 mrna 발현이증가한것으로나타났다. 즉, 저항성 Fig. 2. Absolute flexor halucis longus (FHL) weight. *Significant difference between control group (CON) and resistance exercise group (REG). Significant at *p<0.05. Fig. 3. Relative flexor halucis longus (FHL) weight. **Significant difference between control groups (CON) and resistance exercise groups (REG). Significant at **p<0.01. 제 29 권제 2 호 2011 115
SL Oh. Effect of Resistance Exercise Training on Mustn1 mrna Expression in Rat Skeletal Muscle Fig. 4. Musculoskeletal embryonic nuclear protein 1 (Mustn1) messenger ribonucleic acid (mrna) expression. GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. **Significant difference between control group (CON) and resistance exercise group (REG). ## Significant difference between 4 weeks REG and 8 weeks REG. Significant at **p<0.01, ## p<0.01. 운동은 Mustn1 mrna 발현을유의하게증가시키는데, 4주간의운동이 8주간의운동보다더높은발현의증가를보이는것으로나타났다. 고 찰 Mustn1은골성장과재생 6) 뿐만아니라연골형성 15) 과관련된 musculoskeletal-specific gene이다. 특히 Mustn1 유전자는골격근과건, 연골에서높은발현을보임에도불구하고대부분의 Mustn1 연구들은골재형성의효과만을보고하고있다. 이에본연구자는흰쥐를대상으로 8주간의저항성사다리운동을실시하여근비대를유도한후 10), 골격근에서 4주차와 8주차별 Mustn1 mrna 발현을분석하여골격근에서 Mustn1 유전자의동화작용효과를제안하고자하였다. 그결과본연구의주요변인인 Mustn1 유전자의발현은저항성운동에따라유의하게증가하는것으로나타났으며, 특히통제집단과비교하였을때, 저항성 4주차집단 (3.7배) 이 8주차집단 (2.1배) 보다더높은발현의증가를보였고, 두집단간 Mustn1 유전자의유의한발현의차이가나타났다. 그리고주차별체중의변화를살펴보면모든집단에서주차별로체중이증가하는양상을보이고있다. 그러나 4주차운동집단과 8주차운동집단모두통제집단에비하여체중의증가의폭이더낮은양상을보였으며, 특히 8주간의저항성운동은통제집단에비하여체중의증가폭이유의하게낮은것으로나타났다. 이러한결과로체중에대한골격근무게의비율인상대적인골격근의 Fig. 5. Musculoskeletal embryonic nuclear protein 1 (Mustn1) mrna expression in contrasts with 4 weeks control groups (CON) and 8 weeks CON. 무게는저항성운동집단에서유의하게높게나타난것으로생각된다. 그러나저항성운동을실시한결과절대적인골격근의무게는모든운동집단에서증가하는경향을나타내었으며, 특히 4주간의저항성운동은골격근의무게를유의하게증가시키는것으로나타났다. 이는적절한과부하의저항성운동으로 4주차까지는근비대가이루어졌으나, 이에비하여 4주차이후에는적절한과부하가이루어지지않은것으로생각된다. Mustn1은배아발생 (embryogenesis) 동안높은발현을나타내지만골격근과건을제외한정상성인의대부분의조직에서는비활성화된다. Postfracture (PF) 연구에서 Mustn1은뼈의재생과정에서신속하게발현이증가하는것으로나타났다 7). 치유가골 (healing callus) 에서 Mustn1 mrna 발현은 PF 3일째 22배, 5일째 54배의현저한증가를나타내었다 7). 이러한결과는 Mustn1이조골세포 (osteoblast) 와연골세포 (chondrocyte) 에작용할뿐만아니라, 근골격계성장과재생에주요한역할을하는후보유전자임을뒷받침한다 5). 실제로저항성운동후근육과건에서근원섬유와콜라겐단백질은비슷한양상을보이며증가하기때문에 5), Mustn1은골에서뿐만아니라골격근에서도동화작용의역할을할것으로생각된다. 한편상자 (height=0.55 cm) 를이용한단발성 stepping up & down 운동 ( 체중의 25% 중량옮기기 ) 은대퇴사두근에서 Mustn1 유전자발현의증가를유도하였고, 특히회복 24시간에원심성수축이구심성수축보다 4.1배의 Mustn1 유전자의발현증가를제시하였다 5). 이는 Mustn1 유전자가근육성장뿐만아니라원심성수축시근손상에대한치료과정에서발현이증가되는것으로보여진다. 최근연구를살펴보면 Mustn1 유전자가근원세포분화과정에서발현이증가될뿐만아니라근육형성전구세포 (myogenic progenitor cell) 기능에중요한 116 대한스포츠의학회지
오승렬. 8 주간의저항성운동이쥐골격근에서 Mustn1 mrna 발현에미치는영향 역할을하며, 골격근의성장과비대, 그리고재생을위한필수적인작용을하는것으로보고되었다 16). 또한 Liu 등 16) 은 Mustn1 유전자의결핍은근육발생의결합 (fusion) 과분화를저해시켜그결과근육발생 (myogenesis) 을억제하는것으로보고하였다. Zheng 등 17) 은 Mustn1을골격근성장을위한중요한유전자로제시하였으며, Callipyge 유전자의돌연변이양에서도근비대동안에 Mustn1 유전자가증가하는것으로보고되었다 18). 이러한연구결과들은규칙적인저항성운동으로인한근비대에따른 Mustn1 mrna 발현의증가를보인본연구결과를뒷받침한다. 즉골격근의성장을유도하는저항성운동은 Mustn1 유전자의발현을증가시키는것으로생각된다. 결론적으로규칙적인저항성운동에따른근비대는쥐골격근에서 Mustn1 mrna 발현을증가시켰으며, 이는근원세포분화과정에서뿐만아니라실제운동으로유도된근비대과정에서도 Mustn1 유전자가근골격계의발생과재생에관여함을시사한다. 참고문헌 1. Baechle TR, Earle RW. Essentials of strength training and conditioning. 2nd ed. Champaign (IL): Human Kinetics; 2000. 2. Fry AC, Allemeier CA, Staron RS. Correlation between percentage fiber type area and myosin heavy chain content in human skeletal muscle. Eur J Appl Physiol Occup Physiol 1994;68:246-51. 3. Kraemer WJ. Endocrine responses to resistance exercise. Med Sci Sports Exerc 1988;20:S152-7. 4. Liu C, Hadjiargyrou M. Identification and characterization of the Mustang promoter: regulation by AP-1 during myogenic differentiation. Bone 2006;39:815-24. 5. Kostek MC, Chen YW, Cuthbertson DJ, et al. Gene expression responses over 24 h to lengthening and shortening contractions in human muscle: major changes in CSRP3, MUSTN1, SIX1, and FBXO32. Physiol Genomics 2007;31: 42-52. 6. Liu C. Functional characterization of Mustn1 during skeletal myogenesis [dissertation]. New York (NY): Stony Brook Univ.; 2007. 7. Lombardo F, Komatsu D, Hadjiargyrou M. Molecular cloning and characterization of Mustang, a novel nuclear protein expressed during skeletal development and regeneration. FASEB J 2004;18:52-61. 8. Hadjiargyrou M, Lombardo F, Zhao S, et al. Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair. J Biol Chem 2002;277:30177-82. 9. Kobayashi J, Mackinnon SE, Watanabe O, et al. The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model. Muscle Nerve 1997;20:858-66. 10. Hornberger TA Jr, Farrar RP. Physiological hypertrophy of the FHL muscle following 8 weeks of progressive resistance exercise in the rat. Can J Appl Physiol 2004;29:16-31. 11. Jung DM. Effects of resistance and hgh injection on muscle function and related gene expression of aged SD rats [dissertation]. Seoul: Graduate School, Kyung Hee Univ.; 2006. 12. Kwon YE, Chung DM, Park H. Effects of the chronic application of hgh and climbing to the aged female SD rats on their morphological and enzymological properties especially in FHL. Korean J Exerc Nutr 2004;8:37-42. 13. Lee S, Barton ER, Sweeney HL, Farrar RP. Viral expression of insulin-like growth factor-i enhances muscle hypertrophy in resistance-trained rats. J Appl Physiol 2004;96:1097-104. 14. Oh SL, Hwang IG, Oh SD. Effects of regular resistance exercise on IGF-1 and UCP-3 mrna expression in the rats. J Korea Sports Med 2009;27:192-9. 15. Gersch RP, Hadjiargyrou M. Mustn1 is expressed during chondrogenesis and is necessary for chondrocyte proliferation and differentiation in vitro. Bone 2009;45:330-8. 16. Liu C, Gersch RP, Hawke TJ, Hadjiargyrou M. Silencing of Mustn1 inhibits myogenic fusion and differentiation. Am J Physiol Cell Physiol 2010;298:C1100-8. 17. Zheng Q, Zhang Y, Chen Y, Yang N, Wang XJ, Zhu D. Systematic identification of genes involved in divergent skeletal muscle growth rates of broiler and layer chickens. BMC Genomics 2009;10:87. 18. Vuocolo T, Byrne K, White J, et al. Identification of a gene network contributing to hypertrophy in callipyge skeletal muscle. Physiol Genomics 2007;28:253-72. 제 29 권제 2 호 2011 117