대한진단검사의학회지제 26 권제 3 호 2006 Korean J Lab Med 2006;26: 원저 임상미생물학 16S Ribosomal RNA, Heat-shock Protein 65 및 RNA Polymerase -Subunit 유전자염기서열분석을통한비결

대한진단검사의학회지제 26 권제 3 호 2006 Korean J Lab Med 2006;26:153-60 원저 임상미생물학 16S Ribosomal RNA, Heat-shock Protein 65 및 RNA Polymerase -Subunit 유전자염기서열분석을통한비결핵마이코박테리아의동정 신수 1,3 김의종 2,3 윤종현 1,3 보라매병원진단검사의학과 1, 서울대학교병원진단검사의학과 2, 서울대학교의과대학검사의학교실 3 Identification of Nontuberculous Mycobacteria by Sequence Analysis of the 16S Ribosomal RNA, the Heat-shock Protein 65 and the RNA Polymerase -Subunit Genes Sue Shin, M.D. 1,3, Eui Chong Kim, M.D. 2,3, and Jong-Hyun Yoon, M.D. 1,3 Departments of Laboratory Medicine, Boramae Hospital 1 ; Seoul National University Hospital 2 ; Seoul National University College of Medicine 3, Seoul, Korea Background : The diagnosis of diseases caused by nontuberculous mycobacteria (NTM) is difficult, because NTM are prevalent in the environment such as soil and water, and because they have fastidious properties. In this study we investigated clinical isolates of NTM for their distribution pattern and accurate species identification. Methods : We selected presumptive NTM isolates negative for probe hybridization for M. tuberculosis complex, cultured in a third referral hospital from 21 January 2003 to 20 January 2004. Ninety seven-isolates were identified to the species level by direct sequencing of fragments of 16S rrna, hsp65 and rpob genes. A total of 120 isolates were studied for the distribution analysis. Results : Frequently identified NTM species were M. avium (30.8%), M. intracellulare (23.3%) and M. abscessus (18.3%). Others were M. gordonae, M. senegalense, M. fortuitum, M. peregrinum, M. kansasii, M. terrae complex, M. lentiflavum, M. chelonae, and M. szulgai. Three M. tuberculosis complex (2.5%) were also identified among the presumptive NTM isolates. The identification rate by sequencing of 16S rrna, rpob, and hsp65 were 65%, 82% and 87%, respectively. The hsp65 or rpob gene was more efficient than 16S rrna for the identification of NTM by sequencing. Conclusions : Some NTM are increasingly considered to be the causative organisms in clinical diseases. Thus, direct sequencing could be adapted to routine work of clinical laboratories for accurate identification of NTM to the species level. (Korean J Lab Med 2006;26:153-60) Key Words : Sequence analysis, Atypical mycobacteria, rpob, 16S rrna, Heat-shock protein 서 론 비결핵마이코박테리아 (nontuberculous mycobacteria, NTM; 접수 : 2005년 9월 23일접수번호 : KJLM1887 게재승인일 : 2005년 12월 12일교신저자 : 윤종현우 156-707 서울시동작구신대방동 425 서울대학교보라매병원진단검사의학과전화 : 02-840-2280, Fax: 02-840-2742 E-mail : slice@paran.com * 본연구는 2004 년도서울대학교보라매병원임상공동연구비 (03-2004-04) 의지원에의해이루어진것임. atypical mycobacteria) 는토양이나물등생활환경에널리존재하는비병원성균으로인식되어왔다. 그러나 1980년대후천성면역결핍증이유행하면서이와관련한 NTM 유발질환이증가하였고 [1, 2], 임상적중요성에대한인식과배양법의발달에따라 HIV sero-negative 환자에서도폐질환, 궤양성질환, 염증성장질환등을유발함이보고되었다 [3-5]. 결핵의유병률이높은우리나라의경우, NTM이임상검체에서분리될때결핵으로오인되거나단순오염균으로인식되어, 결핵과거력이라는 NTM 폐질환의위험요인이많음에도불구하고정확한균동정을요구하지않는경우가많다. 153

154 신수 김의종 윤종현 우리나라에서는 1981년 Mycobacterium avium complex (MAC) 에의한폐항산균증이처음으로보고되었으며 [6], 이후 NTM 폐질환에대한국내보고의빈도는늘고있지만, 대상환자군및시기, 동정방법등이달라직접적인비교가힘들뿐아니라, 정확한균동정을기초로한분리율및분포등에대한연구는부족한실정이다 [7-12]. NTM은전통적으로성장속도, 균집락의모양, 색등의미생물학적특징에따라구별된다. 그러나생화학적동정으로는균종구분이힘들고, 방법상시간과숙련도가필요하며새롭게발견되는종에있어서는충분한기초자료가정립되어있지않다는단점이있다 [13, 14]. 그러므로신속하고정확한동정을위하여 mycolic acid의분석이나, 핵산소식자, 핵산증폭, 염기서열분석등의핵산을이용한방법을이용하고있다. 일반적으로검사실에서는임상적으로중요한 M. tuberculosis (MTB) 와 NTM의구별에신속감별법중하나를도입하고있다. PCR-based sequencing방법은마이코박테리아동정의최종적인방법이되며, 이때이용되는유전자는 16S rrna, 16S-23S rrna ITS (internally transcribed spacer), 65 kda heat-shock protein gene (hsp65), RNA polymerase -subunit gene (rpob) 등이연구되고있다 [15-18]. 16S rrna 유전자는모든박테리아에존재하며, 보존부위및변이부위를가지고있어미생물계통분류에이상적인유전자로마이코박테리아동정에도많이연구되었다. 특히 16S rrna 유전자의 5 쪽 500 bp를이용한 RIDOM (Ribosomal differentiation of medical microorganisms system: ridom-rdna.de) database는사용자의접근이용이하고, 고찰을거친비교적정확한자료로써서열비교에많이이용된다 [19]. hsp65 유전자역시모든마이코박테리아에존재하고, 종간변이가 16S rdna 보다커서 M. tuberculosis 염기서열 396부터 836 사이의염기서열을분석하는경우 16S rrna로구별할수없는 M. abscessus와 M. chelonae를정확히구분할수있다. 종내변이는 2% 이내이다 [18, 20, 21]. rpob 유전자를 NTM 동정에이용하는경우 rifampin 내성을갖는분절 (306 bp) 의 NTM 균종간차이는 0.7-15%, 균종내변이는 1% (3 bp) 이내이다 [22]. 전체 rpob 유전자를분석시신속성장균에서는균종간상동성은 84.3-96.6% 이며, 균종내상동성은 98.2-99.9% 로동정에이용할경우 reference strain과의차이는 3% 를넘지않으면서균종간의구별을확실히할수있다 [23]. 본연구에서는염기서열분석을통한 NTM의동정에서 16S rdna, hsp65 및 rpob 유전자분절의효용을비교하고자하였다. 대상및방법 1. 대상 2003년 1월 21일부터 2004년 1월 20일까지서울대병원결핵균 검사실에서 Ogawa 배지 ( 신양화학, 한국 ) 에배양된균주중 AccuProbe Mycobacterium tuberculosis complex culture identification test kit (Gen-Probe, San Diego, California, USA) 검사상음성인균주를대상으로하였다. 가능한단순오염을제외하기위하여집락수 10개이상인검체와, 집락수가 10개미만이라도같은환자에서두번이상배양된경우는포함하였다. 2. 방법 1) 중합효소연쇄반응배양균주에서의핵산추출은 resin이포함된 DNA extraction buffer (Bioseum, Seoul, Korea) 를이용하였다. 중합효소연쇄반응은총 50 L의반응액에 3 L의추출된균핵산액과 0.2 M 의각시발체 (Bioneer, Daejon, Korea), 200 M의 dntp (Roche, Penzberg, Germany), 1.5 unit의 Taq polymerase (Roche), 1 PCR buffer (1.5 mm MgCl 2 포함 ) 를첨가하였다. PCR은 94 5분간의 denaturation 단계후, 94, 각시발체에해당하는붙임온도 (annealing temperature, Ta), 72 각 1분씩 35회시행후최종 extension을 72 10분간시행하여 4 에보관하고 (Table 1), 5 L의 PCR 산물을 ethidium bromide가첨가된 1% 아가로오스에서 100 V, 25분간전기영동하여확인하였다. 2) 염기서열분석및동정 PCR 산물은 AMPure (Agencourt, Beverly, MA, USA) purification kit를이용하였다. 정제된 PCR산물을 50 ng/ L의농도로희석한후총 10 L의반응량에 150 ng의 PCR 산물과 3.2 pmol의각 reverse (16S rdna) 혹은 forward 시발체 (rpob, hsp65) 를넣고 Big Dye Terminator Sequencing kit (Applied Biosystems, CA, USA) 를이용하여반응시키고, Applied Biosystems automatic sequencer를이용하여염기서열을분석하고 Chromas 2 program을이용하여정렬하였다. 정렬된염기서열은 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 혹은 RIDOM database와비교하였다. Table 1. Primers for amplification of 16S rrna, rpob and hsp65 genes Genes Primers (5 3 ) Amplicon *Ta, annealing temperature. Ta* Reference ( ) 16S rrna F:AGT TTG ATC CTG GCT CAG 17 527 bp 53 R:GTA TTG CCG CGG CTG CTG 19 rpob F:CGA CCA CTT CGG CAA CCG 351 bp 60 16 R:TCG ATC GGG CAC ATC CGG hsp65 F:ACC AAC GAT GGT GTG TCC AT 441 bp 53 20 R:CTT GTC GAA CCG CAT ACC CT

16S rrna, hsp65 및 rpob 를이용한 NTM 동정 155 결 1. 임상검체에서의 NTM 빈도 1년간서울대학교병원결핵검사실에서 Ogawa 배지 ( 신양화학 ) 에배양된검체수는총 1,851검체였으며이중 46검체에대해서는검체오염을이유로 Accuprobe MTBC culture identification (Gen-Probe) 선별검사가시행되지않았다. 선별검사된 1,805 배양균주중 MTBC probe 음성인검체는 388검체 (21.5%) 였으며총 228명의환자에서배출되었다. 그러나 228명중 6명의환자에서는같은시기에배출된다른균주로반복시 MTBC probe 양성을보였으므로, 순수 NTM으로생각되는환자는 222명이었다. 약제감수성검사등을위하여결핵연구원에의뢰된것을제외하고 97환자의균주만을얻을수있어, 이에대하여염기서열을분석하였다. 과 2. 염기서열분석을통한임상분리균주의동정 1) 16S rdna 총 97개의검체모두가증폭되었고구강내오염균 2개를제외한 95개의균주중 62개 (65%) 에서성공적으로동정되었다 (Table 2). 16S rdna 5 쪽 490번째이하부위의 399-434개의염기를분석하였을때기존서열과 99% 이상일치되었고, RIDOM 데이터와비교시에도 99% 이상일치하였다. 증폭된 5 쪽서열이동일하여 Table 2. Similarity search results using 16S rrna gene sequence First rank N Overlap Identity (%) Second rank Interspecies difference Identified: 62 isolates M. avium 26 415-434 99.0-100 M. lepraemurium 1 M. fortuitum 3 352-404 99.4-100 M. mucogenicum 1 M. gordonae 3 419-424 100 M. kansasii 15 M. intracellulare 24 417-431 99.3-100 M. avium 2-9 M. lentiflavum 1 411 100 M. simiae 5 M. szulgai 1 420 100 M. malmoense 5 M. terrae complex 2 399-423 99.3-99.7 M. hiberniae 5-7 MTBC 2 Unidentified: 33 isolates M. abscessus* 14 401-420 99.0-100 M. fortuitum 8-11 M. kansasii 2 416-420 99.8-100 M. malmoense 10 M. peregrinum 3 407-423 99.8-100 M. alvei 2 M. senegalense 3 404-406 100 M. mucogenicum 1 Bacillus sp. 3 Signal unsatisfied 8 *M. abscessus and M. chelonae share an identical sequence in the 5-16S rdna sequence; M. kansasii and M. gastri share an identical 16S rdna; M. peregrinum and M. septicum showed an identical 5-16S rdna sequence; M. senegalense and M. farcinogenes and M. fortuitum third biovar (sorbitol +) share an identical 5-16S rdna sequence. 동정할수없었던균종들은 M. kansasii와 M. gastri; M. senegalense와 M. farcinogenes와 M. fortuitum 3rd biovar (sorbitol positive); M. abscessus와 M. chelonae; M. septicum과 M. peregrinum이었다. Bacillus 속 3개와주형의혼재혹은불분명양상을보인 8개균주는동정이불가능하였는데 Bacillus sp. 와유사했던균주는 M. avium 혹은 M. abscessus이었고, 서열자체가불명확하였던균주는 M. abscessus, M. gordonae, M. avium, M. peregrinum 및 M. fortuitum으로판명되었다 (Table 3). 2) rpob M. tuberculosis rpob 유전자 2,174-2,524번째염기를증폭하였을때구강내오염균 2균주를제외한 95개의균주중 83개 (87%) 만증폭되었다. 증폭된 rpob 유전자분절 241-300 개염기를비교하였을때 98.2-100% 일치율을보이고같은균종내차이는 5염기이내로 78균주가성공적으로동정되었다 (82%). 12개의균주는증폭산물을보이지않았는데여기에는 M. abscessus, M. gordonae, M. intracellulare, M. kansasii가포함되었다 (Table 3). 기존보고된서열과 98% 이하의상동성을보인 5개의균주는 rpob 유전자로는동정할수없었다. 여기에는 M. avium (92%), M. intracellulare (95.8%), M. gordonae (96.7%) 및두개의 M. nonchromogenicum (96.5%) 유사균주가포함되었다 (Table 4). Table 3. Final identification of the isolates difficult to identify with a single gene fragment Final Genes identification 16S rdna rpob hsp65 M. avium Bacillus sp M. avium NA M. abscessus Bacillus sp M. abscessus M. abscessus M. avium Bacillus sp M. avium M. avium M. abscessus MS* NA M. abscessus unidentifiable MS* M. gordonae NA M. gordonae MS* M. gordonae M. gordonae M. avium MS* M. avium M. avium M. avium MS* M. avium M. avium M. fortuitum MS* M. fortuitum M. fortuitum M. fortuitum MS* M. fortuitum M. fortuitum M. peregrinum MS* M. peregrinum M. peregrinum M. gordonae M. gordonae NA M. gordonae M. gordonae M. gordonae NA M. gordonae M. intracellulare M. intracellulare NA MS* M. kansasii M. kansasii NA NA M. avium M. avium M. avium NA M. avium M. avium M. avium MS* *MS, mixed sequence; NA, no amplicon; M. gordonae like organism with 96.7% similarity.

156 신수 김의종 윤종현 Table 4. Similarity search results using rpob sequence First rank N Overlap 3) hsp65 Identity (%) Second rank Interspecies difference Identified: 78 isolates M. abscessus 7 277-300 98.3-100 M. immunogen 3-7 M. avium 30 232-294 99.0-100 M. scrofulaceum 3-15 M. chelonae 1 277 100 M. abscessus 7 M. fortuitum 5 279-296 98.9-100 M. farcinogenes 5 M. gordonae 2 285 98.6-99.5 M. asiaticum 12 M. intracellulare 22 277-289 98.2-100 M. asiaticum 9-18 M. kansasii 1 277 100 M. haemophilum 8 M. peregrinum 4 277-296 99.3-100 M. porcinum 7 M. senegalense 3 274-277 99.6 M. porcinum 3 M. szulgai 1 279 98.9 M. gordonae 13 MTB complex 2 Unidentified: 17 isolates M. avium 1 313 92.0 M. intracellulare 1 283 95.8 M. avium 9-18 M. gordonae 1 210 96.7 M. asiaticum 8 M. nonchromo- 2 282 96.5 M. terrae complex 1 genicum No amplicon 12 Table 6. Distribution of MTBC probe negative, presumptive NTM isolates Organism No. case Percent (%) M. avium 37 30.8 M. intracellulare 28 23.3 M. abscessus 22 18.3 M. fortuitum 8 6.7 M. peregrinum 4 3.3 M. gordonae 3 2.5 M. senegalense 3 2.5 M. kansasii 2 1.7 M. terrae complex 3 1.7 M. chelonae 1 0.8 M. celatum 1 0.8 M. lentiflavum 1 0.8 M. szulgai 1 0.8 MTB complex 3 2.5 Oral contaminant 2 1.7 unidentifiable* 1 0.8 Total 120 100 *M. gordonae like organism (similarity 96.7%). Abbreviations: MTBC, Mycobacteriun tuberculosis complex; NTM, nontuberculous mycobacteria. 증폭된 441염기중 352-406개의염기를비교분석하였는데, 98.2-100% 일치하여동정할수있었다 (Table 5). 오염균을제외한 95개의검체중에서 91개 (96%) 가증폭되었고 67개 (71%) 가성공적으로동정되었다. M. senegalense와 M. farcinogenes는분절서열이일치하였으며, M. abscessus, M. chelonae 중16균주 Table 5. Similarity search results using hsp65 sequence First rank N Overlap 또한 BLAST 검색으로는동정이어려웠다. Ringuet 등 [18] 의분석서열과비교하였을때 M. abscessus와 M. chelonae 두균종간염기서열의큰차이로 (30 bp) 정확히동정할수있었고, 이에따라동정성공률을 87% (83/95) 로높일수있었다 (Fig. 1). 증폭되지않았던네균주및서열이불분명했던두균주는 M. avium, M. intracellulare, M. kansasii였다 (Table 3). 4) 균주분포두번이상혹은집락이 10개이상배양된 120환자에서균종별빈도는대한결핵협회결핵연구원에서의동정결과를포함할때, M. avium 30.8 %, M. intracellulare 23.3%, M. abscessus 18.3%, M. fortuitum 6.7%, M. peregrinum 3.3%, M. gordonae 2.5%, M. senegalense 2.5%, M. kansasii 2.5%, M. terrae complex 1.7%, M. lentiflavum 0.8%, M. chelonae 0.8%, M. szulgai 0.8% 였다. MTB complex로동정된경우도 2.5% 나되었고, 오염균은 1.7%, 동정할수없었던경우는 1예 (0.8%) 가있었으며이는 M. gordonae-like organism이었다 (Table 6). 고 Identity (%) 임상검체에서배양된항산균은우선 AccuProbe (Gen-Probe) 등으로 Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) 와비결핵성마이코박테리아 (NTM) 를구별하는데, 본연구에서는 95개의 AccuProbe 음성인마이코박테리아균주중 2균주 (2.1%) 에서, 결 찰 Second rank *M. senegalense and M. farcinogenes showed an identical hsp65 sequence. Interspecies difference Identified: 83 isolates M. abscessus 15 374-396 99.2-100 M. chelonae 25-28 M. avium 27 352-406 99.7-100 M. intracellulare 3-10 M. chelonae 1 396 99.7 M. abscessus 28 M. fortuitum 5 381-392 100 M. senegalense 3 M. gordonae 4 389-403 97.5-99.5 M. asiaticum 8-16 M. intracellulare 22 380-406 99.2-100 M. avium 7-16 M. kansasii 1 386 100 M. gastri 8 M. lentiflavum 1 382 100 M. triplex 9 M. peregrinum 4 374-381 100 M. septicum 3 M. szulgai 1 383 100 M. lentiflavum 14 MTB complex 2 Unidentified: 12 isolates M. senegalense* 3 374-396 98.2-98.5 M. fortuitum 1 M. avium 1 396 98.0 M. intracellulare 3 M. terrae complex 2 398 97.0 M. abscessus 8-16 No amplicon 4 Signal unsatisfied 2

16S rrna, hsp65 및 rpob 를이용한 NTM 동정 157 Fig. 1. Nucleotide sequences of the partial hsp65 gene from 15 M. abscessus (HSP2-HSP107) and one M. chelonae (HSP74) strains aligned with reference sequences from Genebank (AF071128 and AF071139, M. abscessus strains; AF071130, AF071141 and AF 071142, M. chelonae strains). 핵연구원에서동정된결과를포함할경우 2.5% (3/120) 에서 MT- BC가확인되었다. 일년간의검체를분류하는과정에서도 MTBC probe 음성인환자 228명중 6명 (2.6%) 은그환자가배출한다른검체에서 MTBC probe 양성으로써 probe 음성결과를전적으로신뢰할수는없었다. 그러므로결과를접하는임상의는 MTBC probe 음성이라도결핵을완전히배제할수없음에유의해야하며, 검사실에서도보다정확한검사를위한노력및검체처리과정에주의를기울여야할것이다. 즉마이코박테리아가배양되는경우, 결핵과의감별을위하여가능하면최종동정과약제감수성을확인하는것이권장된다. 본검사실에서마이코박테리아배양후에 probe 교잡반응을이용하여선별검사를시행하였을때일년간 NTM이분리된환자는 228 명이고검체수로는 388개로환자당평균 1.7번의배양양성인데비하여, 결핵균은 409명의환자에서 1,417개의검체가분리되어환자당평균 3.5번의배양양성횟수를보였다. 이는 NTM이실제로오염균으로써추적검사상배양되지않았거나, NTM 으로보고된경우임상에서오염균으로간과하여추적검사의뢰가적었을가능성이있다. 마이코박테리아가배양되는경우결핵균과비결핵균의빈도는각 78.5% 및 21.5% 였는데, 1999년의아산병원결과 78.1:21.9% 와는비슷하였으나, 삼성서울병원의 2001까지 4년여간의분리비율은 89.7:10.3% 으로환자혹은연구시기등에따라차이가있음을알수있었다 [11, 24]. 미국의 1980년조사에의하면 NTM은검체에서분리된마이코박테리아중 35% 를차지하며, 이중 M. avium complex (MAC) 61%, M. fortuitum complex를포함한신속성장균 19%, M. kansasii 10% 의빈도로분리되었고, 1981-83년까지 2년간의조사에서는 M. avium complex는 62%, M. kansasii가 24%, M. fortuitum 5% 로보고되었으며, 1992년을기점으로결핵균보다 NTM 의분리율이더높아졌다 [25-27]. 우리나라에서는 1980년부터 1994년까지대한결핵협회결핵연구원에서균이확인된환자를대상으로하여균종분포를조사하였을때 M. avium complex 65.2 %, M. fortuitum 2.7%, M. chelonae 9.5%, M. gordonae 4.4%, M. terrae 3.2%, M. scrofulaceum 1.9%, M. kansasii 1.3%, M. szulgai 1.3%, MAC & M. terrae complex 0.6% 를차지하여빈도순으로가장많이분리된세균종은본연구와동일하였다 [28]. 특히 1990년대이후의 NTM이전체 158예중 96예로 84.2% 를차지하였는데이러한증가추세는유병률자체의변화뿐아니라진단방법의발전및임상의들의관심도변화에따른것으로생각된다. 16S rdna, rpob 및 hsp65 유전자의균종구별력은본연구에포함된임상분리균주의증폭상태와비교서열부재등의문제로

158 신수 김의종 윤종현 Table 7. Comparison of the three gene segments used in identification of presumptive NTM isolates Genes Cases* Presence of amplicon (%) Identification of NTM (%) 16S rrna 95 100 65 rpob 95 87 82 hsp65 95 96 71 87 *Of the studied 97 isolates, two oral contaminants were excluded because they were not mycobacteria; The percent was lowered to 70% when the two MTBC isolates were also excluded. But other values were not changed; We could get the percentage when the sequences were compared with those in reference 18. Abbreviation: NTM, nontuberculous mycobacteria. 인하여동정성공률은각 65%, 82%, 87% 였다 (Table 7). 본연구에서어느한가지유전자만을가지고동정이불가능하였던원인을유전자별로분석하면, 16S rdna 유전자는이미알려진바와같이몇균종에서 5 쪽비교서열이동일하였고모든미생물에존재하는 16S rdna가같이증폭이되어서열이혼재되어있는형태로나타나는경우도있었다. 이러한균종의혼재양상은보관되었던고체배지위의배양균주를면봉으로채취하는과정에서한집락만을채취하지못한때문으로생각되며, 순수배양이아닌임상검체에서는항상다른균종의오염문제가항상존재하므로 [21], 검사실에서실제배양되는 NTM를동정하고자할때는 16S rdna 한가지만으로는부족할것으로생각된다. 그러나 16S rdna는많은비교분석자료가존재하여 hsp65나 rpob로는동정할수없었던, 드물게분리되는균동정에는유용하였다. 본연구에서한균주가 rpob와 hsp65로는각 95% M. intracellulare, 98% M. avium 유사균으로생각되었는데, 16S rdna의 RIDOM 데이터와의비교에서 M. intracellulare sqv. Ⅳ와 100% 일치되어동정된예가있었다. rpob 유전자는각균종을효과적으로구분하였으나 M. lentiflavum 등은비교서열이없어동정하지못하였고, M. terrae complex의경우는 96.5% 밖에일치하지않으면서 M. nonchromogenicum과의구별이어려웠다. rpob 분석에서증폭이되지않았던 12개균주는 M. tuberculosis 서열을기준으로한시발체 [16] 로는증폭되지않았지만 rpob 유전자의 5번째변이부위 [23] 780 bp를증폭하였을때 11개균주에서증폭산물을볼수있었다. 그러나이서열을이용할경우 M. abscessus와 M. chelonae는감별가능했으나 M. abscessus와 M. immunogenum 구별은어려웠다. hsp65 유전자의경우는 BLAST 검색을통해서는신속성장균에대한신뢰할수없는자료가많아쉽게동정되지않았고 M. farcinogenes와 M. senegalense가비교서열내에서동일한단점이있지만, 검증된표준균주와비교했을경우 M. abscessus와 M. chelonae를효과적으로구분할수있었다 [18]. 각유전자별로증폭되지않은검체가있었고이때문에검체동정률이차이를보였는데, 핵산추출에사용하였던 resin이나이물질이증폭을방해하였거나, 시발체부위의변이등의영향일수있 다. 다른연구자들도 hsp65를이용한동정에서각 batch 별증폭양성률이 50-80% 정도차이가있음을보고한바있는데 [29], 본연구에서도 hsp65에서증폭되지않은네균주는모두같은작업 batch에서시행되어부적절한검체채취에따른배지오염의문제가있었을것으로생각되었고, 같은검체에서도 hsp65 보다는 rpob 가증폭이안되었던것은방해물질뿐아니라시발체부위의변이를의심할수있으나이는전체 rpob 유전자의서열분석등더연구가필요할것이다. 검사에포함되었던 97개균주중 2균주는서열분석상구강내오염균만을발견할수있었는데, 이는 probe 검사와항산성염색은배양즉시시행하고염기서열분석을위해서는보관후채취한시간상의차이때문으로, 앞서언급한집락채취상오류중하나로생각되며실제검사실에서유전자를이용한동정을실시할경우주의해야할것으로생각된다. 최근에는마이코박테리아핵산을이용한신속진단법이이용되고있는데, 이는배양균주뿐아니라검체에서직접이용할수있는장점이있다. 특히 NTM을동정하기위해서는 probe법, PCR- RFLP법등을이용하는데 probe법은간편하나동정할수있는균종이제한되며비용이비싸다. PCR-RFLP법은특히 rpob 유전자를이용하는경우는약제저항성까지알수있는장점이있지만아직까지 pattern analysis에필요한비교서열이완전하지않아서새롭게발견되는균이나균종내변이가있는경우는동정에어려움이있다. 염기서열분석법은다양한 NTM의동정에가장최종적인방법이되며실제로 PCR-RFLP 법으로 M. szulgai로보고된것이본연구에서 M. lentiflavum으로동정된 1예가있었다. 염기서열분석법을이용하여 NTM의임상분리균주를동정할때는검체혼합, 채취상의문제, 분석대상서열의구별력등을고려하여, hsp65나 rpob 중하나를먼저분석하여검증된 database와비교하되, 균종감별이힘든경우 16S rdna를부가적으로이용하는것이좋을것으로생각된다. 요약배경 : 비결핵마이코박테리아 (NTM) 는환경분포균으로환자검체에서분리되는경우라도질환과관계없는오염균으로생각하기쉽고, 일반적인미생물학적동정방법으로는정확한동정이어렵다. 이에저자들은임상검체에서배양된 NTM에대하여염기서열분석법으로정확하게동정하여균종분포를연구하고자하였다. 방법 : 2003년 1월 21부터 2004년 1월 20일까지일개 3차의료기관의결핵검사실에서배양된균주중에서결핵균소식자에음성인 NTM를대상으로하였다. 이들중집락이 10개이상배양되거나 10집락미만이라도동일환자에서두번이상배양된 97개에서 16S rrna, hsp65 및 rpob 유전자서열을분석하였고, 결핵연구원의결과를포함하여 120 환자에서균종분포를연구하였다. 결과 : 임상검체에서배양된 NTM 균종은 M. avium, M. intracellulare, M. abscessus가각각 30.8%, 23.3%, 18.3% 를차지

16S rrna, hsp65 및 rpob 를이용한 NTM 동정 159 하였다. 이외에 M. gordonae, M. senegalense, M. fortuitum, M. peregrinum, M. kansasii, M. terrae complex, M. lentiflavum, M. chelonae, M. szulgai가분리되었고 MTB complex도 2.5% 에서확인되었다. 유전자별동정성공률은 16S rrna, rpob, hsp65 각 65%, 82%, 87% 로써, NTM을염기서열분석법으로동정할때에는 5-16S rdna보다는 hsp65나 rpob를이용하는것이성공률을높일수있었다. 결론 : 임상검체에서 NTM은더이상오염균으로무시할수있는대상이아니며, 염기서열분석을이용한마이코박테리아의동정법은검사실에서도유용하게쓰일수있을것으로기대한다. 참고문헌 1. Tenholder MF, Moser RJ 3rd, Tellis CJ. Mycobacteria other than tuberculosis. Pulmonary involvement in patients with acquired immunodeficiency syndrome. Arch Intern Med 1988;148:953-5. 2. Falkinham JO 3rd. Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria. Clin Microbiol Rev 1996;9:177-215. 3. Debrunner M, Salfinger M, Brandli O, von Graevenitz A. Epidemiology and clinical significance of nontuberculous mycobacteria in patients negative for human immunodeficiency virus in Switzerland. Clin Infect Dis 1992;15:330-45. 4. Dobos KM, Quinn FD, Ashford DA, Horsburgh CR, King CH. Emergence of a unique group of necrotizing mycobacterial diseases. Emerg Infect Dis 1999;5:367-78. 5. Collins MT, Lisby G, Moser C, Chicks D, Christensen S, Reichelderfer M, et al. Results of multiple diagnostic tests for Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in patients with inflammatory bowel disease and in controls. J Clin Microbiol 2000;38:4373-81. 6. Kim SJ, Hong YP, Kim SC, Bai GH, Jin BW, Park CD. A case of pulmonary disease due to M. avium-intracellulare complex. Tuberc Respir Dis 1981;28:121-4. ( 김상재, 홍영표, 김성진, 배길한, 진병원, 박종달. M. avium-intracellulare complex에의한폐항산균증 1예. 결핵및호흡기질환 1981;28:121-4.) 7. Bai GH, Park KS, Kim SJ. Clinically isolated mycobacteria other than mycobacterium tuberculosis from 1980 to 1990 in Korea. J Korean Soc Microbiol 1993;28:1-6. ( 배길한, 박관숙, 김상재. 1980년부터 1990년까지우리나라의결핵균의마이코박테리아균종별감염양상. 대한미생물학회지 1993;28:1-6.) 8. American Thoracic Society. Diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria. Am J Respir Crit Care Med 1997;156:S1-25. 9. Pae HH, Lee JH, Yoo CG, Lee CT, Chung HS, Kim YW, et al. Study for clinical characteristics of nontuberculous mycobacterial pulmonary disease. Tuberc Respir Dis 1999;47:735-46. ( 배현혜, 이재호, 유철 규, 이춘택, 정희순, 김영환등. 폐비결핵항산균증의임상적특징에관한연구. 결핵및호흡기질환 1999;47:735-746.) 10. Lew WJ, Ahn DI, Yoon YJ, Cho JS, Kwon DW, Kim SJ, et al. Clinical experience on mycobacterial disease other than tuberculosis. Tuberc Respir Dis 1992;39:425-32. ( 류우진, 안동일, 윤영자, 조정섭, 권동원, 김상재등. 비결핵마이코박테리엄증의임상경험. 결핵및호흡기질환 1992; 39:425-32.) 11. Lee HW, Kim MN, Shim TS, Bai GH, Pai CH. Nontuberculous mycobacterial pulmonary infection in immunocompetent patients. Tuberc Respir Dis 2002;53:173-82. ( 이효원, 김미나, 심태선, 배길한, 배직현. 면역적격자에서비결핵마이코박테리아의폐감염. 결핵및호흡기질환 2002; 53:173-82.) 12. Koh WJ, Kwon OJ, Kang EH, Jeon IS, Pyun YJ, Ham HS, et al. Clinical and radiographic characteristics of 12 patients with Mycobacterium abscessus pulmonary disease. Tuberc Respir Dis 2003;54:45-56. ( 고원중, 권오정, 강은해, 전익수, 편유장, 함형석등. Mycobacterium abscessus 폐질환환자 12명의임상적, 방사선학적특징. 결핵및호흡기질환2003;54:45-56.) 13. Springer B, Stockman L, Teschner K, Roberts GD, Bottger EC. Twolaboratory collaborative study on identification of mycobacteria: molecular versus phenotypic methods. J Clin Microbiol 1996;34:296-303. 14. Brown-Elliott BA, Griffith DE, Wallace RJ Jr. Newly described or emerging human species of nontuberculous mycobacteria. Infect Dis Clin North Am 2002;16:187-220. 15. Patel JB, Leonard DG, Pan X, Musser JM, Berman RE, Nachamkin I. Sequence-based identification of Mycobacterium species using the MicroSeq 500 16S rdna bacterial identification system. J Clin Microbiol 2000;38:246-51. 16. Kim BJ, Lee SH, Lyu MA, Kim SJ, Bai GH, Chae GT, et al. Identification of mycobacterial species by comparative sequence analysis of the RNA polymerase gene (rpob). J Clin Microbiol 1999;37:1714-20. 17. Turenne CY, Tschetter L, Wolfe J, Kabani A. Necessity of quality-controlled 16S rrna gene sequence databases: identifying nontuberculous Mycobacterium species. J Clin Microbiol 2001;39:3637-48. 18. Ringuet H, Akoua-Koffi C, Honore S, Varnerot A, Vincent V, Berche P, et al. hsp65 sequencing for identification of rapidly growing mycobacteria. J Clin Microbiol 1999;37:852-7. 19. Harmsen D, Rothganger J, Frosch M, Albert J. RIDOM: Ribosomal Differentiation of Medical Micro-organisms Database. Nucleic Acids Res 2002;30:416-7. 20. Telenti A, Marchesi F, Balz M, Bally F, Bottger EC, Bodmer T. Rapid identification of mycobacteria to the species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis. J Clin Microbiol 1993; 31:175-8. 21. Pai S, Esen N, Pan X, Musser JM. Routine rapid Mycobacterium species assignment based on species-specific allelic variation in the

160 신수 김의종 윤종현 65-kilodalton heat shock protein gene (hsp65). Arch Pathol Lab Med 1997;121:859-64. 22. Kim BJ, Lee KH, Park BN, Kim SJ, Bai GH, Kim SJ, et al. Differentiation of mycobacterial species by PCR-restriction analysis of DNA (342 base pairs) of the RNA polymerase gene (rpob). J Clin Microbiol 2001;39:2102-9. 23. Adekambi T, Colson P, Drancourt M. rpob-based identification of nonpigmented and late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. J Clin Microbiol 2003;41:5699-708. 24. Koh WJ, Kwon OJ, Yu CM, Jeon K, Suh GY, Chung MP, et al. Recovery rate of nontuberculous mycobacteria from acid-fast-bacilli smearpositive sputum specimen. Tuberc Respir Dis 2003;54:22-32. ( 고원중, 권오정, 유창민, 전경만, 서지영, 정만표등. 항산균도말양성객담에서비결핵성마이코박테리아의분리비율. 결핵및호흡기질환 2003;54:22-32.) 25. Good RC and Snider DE Jr. Isolation of nontuberculous mycobacteria in the United States, 1980. J Infect Dis 1982;146:829-33. 26. O Brien RJ, Geiter LJ, Snider DE Jr. The epidemiology of nontuberculous mycobacterial disease in the United States. Results from a national survey. Am Rev Respir Dis 1987;135:1007-14. 27. Ostroff S, Hutwagner L, Collin S. Mycobacterial species and drug resistance patterns reported by state laboratories-1992. 93rd American Society for Microbiology General Meeting, May 16, 1993, Atlanta, GA. Abstract U-9, P.170. 28. Scientific committee in Korean academy of tuberculosis and respiratory disease. National survey of mycobacterial disease other than tuberculosis in Korea. Tuberc Respir Dis 1995;42:277-94. ( 대한결핵및호흡기학회학술위원회. 비결핵항산균증전국실태조사. 결핵및호흡기질환 1995;42:277-94.) 29. Wong DA, Yip PC, Tse DL, Tung VW, Cheung DT, Kam KM. Routine use of a simple low-cost genotypic assay for the identification of mycobacteria in a high throughput laboratory. Diagn Microbiol Infect Dis 2003;47:421-6.