Journal of Radiation Industry 5 (1) : 81~86 (2011) Review Paper 감마선조사된채취미역의유전독성학적안전성평가 최종일 김재훈 송범석 김재경 이주운 * 전병수 1 안동현 1 변명우 2 박경숙 3 한국원자력연구원정읍방사선과학연구소, 1 부경대학교식품생명공학부 2 우송대학교식품생물과학과, 3 장안대학교식품영양학과 Genotoxicological Safety of Undaria pinnatifida Gamma-irradiated after Harvest Jong-il Choi, Jae-Hun Kim, Beom-Seok Song, Jaekyung Kim, Ju-Woon Lee*, Byung-Soo Chun 1, Dong-Hyun Ahn 1, Myung-Woo Byun 2 and Kyung-Sook Park 3 Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, Jeongeup 580-185, Korea 1 Faculty of Food Science and Biotechnology, Pukyong National University, Busan 608-737, Korea 2 School of Food Science and Biotechnology, Woosong University, Daejeon 300-718, Korea 3 Department of Food and Nutrition, Jangan University, Hwaseong 445-756, Korea Abstract - This study was conducted to evaluate the genotoxcity of gamma-irradiated Undaria pinnadifida after harvest for enhancing the storage and microbial safety during drying process. The harvested seaweed was irradiated with the doses of 1 and 10 kgy. The genotoxicity was evaluated by Ames test (Salmonella typhimurium reversion assay) and SOS chromotest. The results from all samples were negative in the bacterial reversion assay with S. typhimurium TA98 and TA100. No mutagenicity was detected in the assay, at both with and without metabolic activation. The SOS chromotest also indicated that the gamma-irradiated U. pinnadifida did not show any mutagenicity. Therefore, this study indicated that gamma irradiation could be used for extending the shelf-life of U. pinnadifida. Key words : Ames test, Gamma irradiation, Genotoxicity, SOS chromotest, Undaria pinnadifida 서 오늘날국가간식량교역은세계경제의균형을유지시켜주며그시장은날로확대되고있다. 각국은국제식량교역에있어서안전을극대화하기위하여공중보건법과검역관리를엄격히다루고있다. 그러므로식량교역에있어서가장어려운점은수출입식품의안전성, 즉 론 * Corresponding author: Ju-Woon Lee, Tel. +82-63-570-3204, Fax. +82-63-570-3207, E-mail. sjwlee@kaeri.re.kr 생물학적, 화학적측면에서의안전성을확보하는데있다 (Robert and Unnevehr 1994). 최근세계각국에서식품에사용되는보존제나 ethylene dibromide, ethylene oxide, methyl bromide 등의훈증처리가유해성분의생성및잔류로발암성등건강장해와환경공해를일으킬수있기때문에. 그사용이금지되거나제한되고있다. 이에대한대체방안으로국제기구및선진여러나라에서는건전성과경제성이공인된방사선조사기술의사용을적극검토하고있다 (FAO/IAEA/WHO Study group 1999). 국내도 1987, 1988, 1991 및 1995년에 4차례에걸쳐총 18 81
82 최종일 김재훈 송범석 김재경 이주운 전병수 안동현 변명우 박경숙 개품목의식품조사가허가되었으며기존품목을확대하여복합조미식품류를비롯한 7개품목이 2004년 5월추가로허가되었다 (KFDA 2004). 최근식생활수준의향상에따라수산가공품의소비가증가되고있다. 이중에서미역 (Undaria pinnatifida) 은다시마목 (Order Laminariales) 미역과 (Family Alariaceae) 에속하는일년생해조류로서한국, 일본및중국북부지방을중심으로양식되고있으며, 채취된후생물형태및건조된형태로많이소비되고있다. 이를이용한미역국은한국의고유한음식으로서일상의식사와출산후산모의회복및유즙분비촉진을위하여주로섭취되고있다. 미역은 Ca, Fe 및 I 등과같은무기질이풍부할뿐만아니라미역의세포막구성성분으로다량존재하는알긴산은콜레스테롤배출작용, 중금속 (Cd) 과방사능물질 (Sr) 의체내흡수억제및배출작용과정장작용등에효과가있는것으로보고되고있다 (Suzuki et al. 1993). 최근식품의위생화증진과저장성을연장할수있는방사선조사기술을이용한미역의저장성에관한연구가보고되었다 (Kim et al. 2009). 채취한미역의감마선조사로건조기간동안의미생물제어가확인되어, 양식업체나가공업체에저장성연장과함께소비자까지의식품안정성을증진시킬수있었다. 그러나, 감마선조사기술을이용해서만든식품, 의약품및화장품의안전성에대한소비자들의부정적인선입견이여전히남아있기때문에이를해결하기위한꾸준한노력도필요하다 (Yook et al. 2004). Ames test는 Salmonella typhimurium LT2 strain에서유래한히스티딘요구성돌연변이주를이용하여간단히복귀돌연변이를검출할수있는시험법으로 TA100은 base pair substitution mutaion을 TA98은 frameshift mutation을검출하기위해만든균주이다 (Ames et al. 1975). 이시험법은발암성물질에대해높은감수성을나타내어일본의경우, 노동성의노동안전위생법또는후생성 통산성의화심법등에도채택되고있다 (Han et al. 2006). 따라서본연구에서는미역의저장성증진을위해사용된감마선조사기술의이용을실용화하기위하여채취한미역의감마선조사의유전독성학적안전성평가를 Ames test와 SOS chromotest를이용하여실시하였다. 재료및방법 1. 실험재료및감마선조사본연구에서사용한미역은전라남도완도에서채취 한다음흐르는물로세정하여실험에사용하기전까지 4 C 에보관하였다. 모든실험은 3일이내보관된미역만을사용하였다. 감마선조사는한국원자력연구원방사선과학연구소 (Jeongeup, Republic of Korea) 내선원11.1 PBq, 60 Co 감마선조사시설 (point source AECL, IR-79, MDS Nordion International Co. Ltd, Ottawa, Canada) 을이용하였다. 준비된시료인수확된미역을실온에서시간당 10 kgy의선량율로 0, 1 및 10 kgy의흡수선량을얻도록하였다. 흡수선량확인은 alanine dosimeter (5 mm, Bruker Instruments, Rheinstetten, Germany) 를사용하였다. Dosimetry 시스템은국제원자력기구 (IAEA) 의규격에준용하여표준화한후사용하였으며, 총흡수선량의오차는 2% 이내였다. 2. Salmonella typhimurium을이용한복귀돌연변이시험 (Ames test) 복귀돌연변이시험은 Ames test (Ames et al. 1975; Maron and Ames 1983) 를이용하여측정하였다. 시험에사용된균주는 Salmonella typhimurium LT2를친주로하는 S. typhimurium TA98과 TA100이었고, 이들균주는사용에앞서필요시균주의유전자형확인을위해 histidine 요구성여부, UV에대한민감도 (uvrb 돌연변이 ), rfa 돌연변이의유지여부및 R-factor에의한ampicillin 또는 tetracycline 내성등의유전형질을확인한후시험에사용하였다. 본실험에사용된균주는 Molecular Toxicology Inc. (Boone, NC, USA) 에서구입하여형질을확인한후한국화학연구소안전성센터에서계대배양중인것을시험에사용하였다. 유전형질이확인된균주는 nutrient broth No. 2 (Oxoid Ltd., Hampshire, England, UK) 에접종하여 37 C 에서 200 rpm으로약 10시간진탕배양 (Vision Scientific Co., Korea) 한후시험에사용하였다. 대사활성을위한간균질액 (S9 fraction) 은 Sprague- Dawley rat의간으로부터분리한것으로 Oriental Yeast Co. (Tokyo, Japan) 에서구입하였으며, 5% (v/v) 의 S9 mixture를제조하여사용하였다. S9 mixture는 0.5 ml plate -1 로처리했으며, 그의활성은 2-aminoanthracene (2-AA) 의돌연변이유발로확인하였다. 음성대조물질로는시험물질의조제에사용한증류수를사용하였으며, 양성대조물질로는 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), sodium azide (SA) 및 2-AA를 Sigma사 (St Louis MO, USA) 로부터구입하여이용하였다. 복귀돌연변이시험은미역의열수추출물을멸균식염수에 10진희석법으로 10배희석하여용해한후각각 1,250~5,000 μg의농도로시험구당 2개
감마선조사된채취미역의안전성평가 83 의 plate를사용하여 direct plate incorporation 방법으로실시하였다 (Maron and Ames, 1983). 시험물질의처리는대사활성계적용 (+S) 및미적용 (-S) 하여 direct plate incorporation 방법으로하였으며, 각농도군당 2개 plate를사용하였다. 시험물질 0.1 ml과 S9 mixture ( 또는멸균증류수 ) 0.5 ml에배양액 0.1 ml을 top agar에혼합하여 minimal glucose agar plate에부어고화시킨다음, 37 C 에서 48시간배양한후복귀돌연변이집락수를계수하였다. 시험결과는복귀돌연변이집락수의평균과표준편차로나타내었으며, 돌연변이유발성의판정은복귀변이집락수가용매대조군의 2배이상이면서용량의존성을갖는경우를양성으로하였다. 3. SOS chromotest 1) 실험균주및균주의형질확인실험에사용된균주는 Escherichia coli GC4436으로부터유래된 E. coli PQ37로써균주는 30% glycerol과 LB broth에서하룻밤배양한균액을 1:1로혼합하여 -20 C 에보관하였다. 사용균주는 6개월마다새로준비하였으며그때마다 uvra mutation, rfa mutation과 PHO c gene 의 constitutivity 및 sfta::lacz fusion의 inducibility를검사하였다. 2) 돌연변이원실험 Frame shift mutation과 point mutation을동시에측정할수있는이실험에서 Quillardet와 Hofnung의방법 (1985) 을변형시킨 Baik과 Ham의방법 (1990) 을이용하였다. 냉동보관된 PQ37균액 50 μl를 12 ml LB medium (peptone 4 g, yeast extract 2 g 및 sodium chloride 4 g을증류수 400 ml에용해 ) 에접종하고 37 C 에서 A 600 측정치가 1.0에이를때까지 2시간정도진탕배양하였다. 얻어진균액을 LB medium에 1/4로희석하여각농도별로준비된시료 20 μl와돌연변이원인 Mitomycin C (Sigma 사 ) 를 30 μl 혼합하여 90분간 37 C 에서배양하여 SOS 반응을유도한후한쪽에는 β-galactosidase의활성측정을위하여 B-buffer 1.8 ml을첨가하여 37 C 에서 5분간배양한다음 o-nitrophynyl-β-d-galactopyranoside (ONPG) 400 μl을첨가하였고, 다른쪽에는 alkaline phosphate의활성측정을위해 P-buffer 1.8 ml을첨가하여 37 C 에서 5분간배양한후 P-nitrophenyl phosphate disodium (PNPP) 400 μl를첨가하였다. 그다음37 C 에서 30분간발색시킨후β-galactosidase는 1.5 M Na 2CO 3 1.6 ml로 alkaline phosphate는 2.5 N HCl 0.8 ml 및 2 M Tris 0.8 ml로효소에의한발색반응을정지시킨다음분광광도계 (UV 1600 PC, Shimadzu, Tokyo, Japan) 를이용하여 420 nm에서측정하였다. 측정된수치를이용하여 enzyme unit으로나타낸후 R-factor로환산하여최종적으로유도지수 (IF= Induction Factor) 로나타냈다. 측정식은다음과같다. 1000 O.D. at 420 nm Enzyme unit = mmmmmmmmmmmmmmmmmmmm Reaction time (30 min) β-galactosidase unit R-factor = mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm alkalinephosphatase unit 실험군의 R-factor Induction Factor = mmmmmmmmmmmmmmmmm 대조군의 R-factor 4. 통계분석 모든실험은 3회반복실시하였으며, 얻어진결과들은 SPSS software (version 10, 1970) 에서프로그램된 general linear model procedure을수행하고유의적인차이가보일때평균값간의차이를 Duncan의 multiple range test 법을사용하여평가하였다 (p 0.05). 1. Ames test 결과및고찰 감마선조사한미역추출물을첨가하였을때 S. typhimurium TA98와 TA100에대한복귀돌연변이집락수를조사한결과를 Table 1에제시하였다. 실험에사용된두균주의생균수는 1.8 10 9 ml -1 수준이었으며, 예비시험결과에따라모든시료는 5,000 μg plate -1 를최고농도로설정하여복귀돌연변이시험을수행하였다. 우선대사활성부재시의경우, 모든시험균주에서시험적용농도인 1,250~5,000 μg plate -1 의범위에서복귀돌연변이집락수가용매대조군과비교하였을때유의적인차이가없는것으로나타났다. 또한대사활성계 (S-9 mixture) 를도입하였을때시험물질에대해 S. typhimurium을이용한복귀돌연변이시험결과에서시험한모든검체는적용농도에서복귀돌연변이집락수간의유의적인차이가없었다. 일반적으로돌연변이원성의판정은음성대조군복귀변이집락수의 2배경우를양성으로하므로감마선조사된미역에대한시험적용농도에서복귀변이를유발하지않는것으로보아감마선조사에의한돌연변이원성은없는것으로나타났다. 이와같은결과는유전독성학적변이원성시험에서감귤정유 (Kim et al. 2005) 및비파메탄올추출물 (Kim et al. 2006) 에대한감마선조사는돌연변이를유발하지않았다는결과와감마선조
84 최종일 김재훈 송범석 김재경 이주운 전병수 안동현 변명우 박경숙 Table 1. Revertant colonies in the Salmonella typhimurium reversion assay of the gamma irradiated Undaria pinnatifida Number of revertant colonies (His+) per plate Sample Irradiation dose Dose (kgy) (μg plate -1 ) TA98 TA98 TA100 TA100 (-S9) (+S9) (-S9) (+S9) 1,250 32±5 a 28±4 215±18 217±27 0 2,500 31±1 31±8 222±11 224±44 5,000 30±1 26±3 211±9 218±12 1,250 26±3 26±6 151±10 162±23 Undaria 1 2,500 33±4 31±4 129±16 206±16 pinnatifida 5,000 23±1 32±4 171±11 211±12 1,250 31±5 36±4 160±24 162±21 10 2,500 32±2 34±4 178±25 191±11 5,000 29±1 31±1 153±11 190±13 Negative control distilled water 31±2 33±3 265±35 300±28 4-NQO 0.5 734±4 Positive control 2-AA 2 1051±6 SA 0.5 692±61 2-AA 2 1477±398 Abbreviations: 4-NQO, 4-Nitroquinoline-1-oxide; SA, Sodium azide; 2-AA, 2-Aminoanthracene. a Values are the mean±s.d. (P 0.05). Induction factor 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 Mitomycin C* 0 kgy 10 kgy 사한육제품이유전독성학적으로안전하다는 Jo et al. (2005) 의결과, 그리고수산자숙액의유전독성학적안정성을평가한 Kim et al. (2008) 의결과와도일치하였다. 2. SOS chromotest 1250 2500 5000 Concentration (mg assay -1 ) Fig. 1. Genotoxicity of the gamma irradiated Undaria pinnatifida in Escherichia coli PQ37. The mitomycin C concentration is 0.01 mg ml -1. SOS chromotest에사용되는 E. coli PQ37은 uvra 돌연변이와 rfa 돌연변이로되어있어돌연변이원이균주내로용이하게침투할수있어 SOS 반응이증폭되어 sifa 의발현이일어나면 β-galactosidase의활성으로발색이일어나게되는데이때발색수준을흡광도로측정하여 유도지수로환산하여돌연변이유발능을알아볼수있다 (Ohta et al. 1984; Rueff et al. 1986). SOS chromotest는비록식품내일부당함량에의해영향을받을수도있지만, 흡광도를측정하여판정하므로객관성이유지되며, DNA 손상을주는유전독성물질의검색에편리하게이용되고있다. 또한 Ames test에서밝혀진돌연변이물질의약 90% 가 SOS 유발물질이었으며이두방법간에정량적인상관관계가있다고보고되었다 (Quillardet et al. 1982; Quillardet et al. 1985). 본실험에서도 Ames test 와 SOS chromotest의상관관계가확인되어졌다. 감마선조사한미역을첨가하였을때 E. coli PQ37에대한돌연변이원성을조사한결과를 Fig. 1에제시하였다. 시험적용농도는예비실험을통하여 5,000 mg assay -1 를최고농도로설정하여수행하였다. 실험결과모든시험적용농도에서감마선조사된미역에대한유도지수수치는 1.30 ~1.58로나타났다. 또한방사선조사에따른유도지수의증가는나타나지않았다. 본시험에서사용한돌연변이원인 mitomycin C (0.01 mg ml -1 ) 의유도지수가 4.48 나타난것을볼때감마선조사에의한돌연변이원성은없는것으로판단되었다. 이는감마선조사한쇠고기 (Ha et al. 1994), 장류 (Yook et al. 2001) 그리고수산자숙액 (Kim et al. 2008) 등이 SOS chromotest에의한유전독성학적안전성평가에서안전성이입증되었다는결과와일치하였다. 이상의결과를종합하여볼때, in vitro 상에서 Ames test 및 SOS chromotest를이용한안전성평가결과저장성증진을위해수확된상태에서감마선을조사한미역
감마선조사된채취미역의안전성평가 85 에서는돌연변이원성이관찰되지않는것으로나타나감마선조사기술을미역등의해조류에유용하게쓰일수있을것으로사료된다. 결 미역의수확후미생물오염에대한제어방안으로수확된미역의감마선조사에대한유전독성학적안전성평가를하였다. 감마선조사한미역추출물의 S. typhimurium TA98 및 TA100에대한복귀돌연변이집락수를조사한결과대사활성계도입및부재시모두시험적용농도인 1,250~5,000 μg plate -1 의범위에서돌연변이가일어나지않았으며, E. coli PQ37에대한돌연변이원성을알아본결과 1,250~5,000 mg assay -1 의범위안에서감마선조사에의한돌연변이원이관찰되지않았다. 따라서시험에이용된선량의감마선이조사된미역은독성을일으키지않고, 식품및공중보건산업의소재로서유용하게사용할수있다고판단된다. 사 본연구는한국원자력연구원기본연구사업연구비지원에의해수행되었습니다. 론 사 참고문헌 Ames BN, McCann J and Yamasaki E. 1975. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test. Mutat. Res. 31:347-364. Baik CW and Ham SS. 1990. Antimutagenic effects of browning products reated with polyphenol oxidase extracted from apple by using SOS chromotest. Korean J. Food Sci. Technol. 22:618-624. FAO/IAEA/WHO Study group. 1999. High dose irradiation: Wholesomeness of food irradiated with doses above 10 kgy. pp. 1-9. In: WHO Technical Report Series 890. World Health Organization, Geneva. Ha KW, Jung HK, Oh HY, Heo OS, Sohn SJ, Han ES, Jung SC, Choi BY, Kim YM, Kim PS and Moon HH. 1994. Studies on the genotoxicity of the gamma-irradiated Panax Ginseng Radix in vitro and in vivo. J. Food Hyg. Safety 9: 67-74. Ha SM, Kim HM, Jeung SK, Lee JW, Byun MW and Kanf IJ. 2006. Genotoxicological safety of high-dose gama-irradiated cereal powders. Korean J. Food Preserv. 13(4):524-529. Jo C, Lee NY, Kang HJ, Hong SP, Kim YH, Kim HJ and Byun MW. 2005. Radio-sensitivity of pathogens in inoculated prepared foods of animal origin. Food Microbiol. 22:329-336. KFDA. 2004. Food Code. Munyoungsa, Seoul, Korea. Kim HJ, Jo C, Lee NY, Son JH, An BJ, Yook HS and Byun MW. 2005. Effect of gamma irradiation on physiological activity of citrus essential oil. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 34(6): 797-804. Kim HJ, Jo C, Kim TH, Kim DS, Park MY and Byun MW. 2006. Biological evaluation of the methanolic extract of Eriobotrya japonica and its irradiation effect. Korean J. Food Sci. Technol. 38(5):684-690. Kim HJ, Choi J, Lee HS, Kim JH, Byun MW, Chun BS, Ahn DH, Yook HS, Kim KH and Lee JW. 2008. Genotoxicological safety of the ethanol extract from seafood cooking drips by gamma irradiation. J. Radiat Ind. 2:21-26. Kim HJ, Choi J, Kim JH, Chun BS, Ahn DH, Kim GH, Byun MW and Lee JW. 2009. Improvements in storage stability of Undaria pinnatifida after gamma irradiation. Korean J. Food Preserv. 16:1-4. Maron DM and Ames BN. 1983. Revised methods for Salmonella mutagenicity test. Mutat. Res. 113:1013-1030. Ohta T, Nakamura N, Moriya M, Shirai T and Kada T. 1984. The SOS-function-inducing activity of chemical mutagens in Escherichia coli. Mutat. Res. 131:101-109. Quillardet P, Bellecomide CD and Hofnung M. 1985. The SOS chromotest, a colorimetric bacterial assay for genotoxins: validation study with 83 compounds. Mutat. Res. 147:79-95. Quillardet P and Hofnung M. 1985. The SOS chromotest, a colorimetric bacterial assay for genotoxins. Mutat. Res. 147:65-78. Quillardet P, Huisman OD, Ari R and Hofnung M. 1982. SOS chromotest, a direct assay of induction of an SOS function in Escherichia coli K-12 to measure genotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5971-5975. Roberts T and Unnevehr L. 1994. New approaches to regulating food safety. Food Rev. 17:2-8. Rueff JA, Borba LH, Chaveca T, Gomes MI and Halpern M. 1986. Genetic toxicology of flavonoids: The role of metabolic conditions in the induction of reverse mutation. SOS function and sister-chromatid exchanges. Mutagenesis 1: 179-183. SPSS. 1970. Statistical Package for the Social Csiences, Norman. Suzuki T. 1993. Effect of sodium alginates rich in gulurocin acid and mannuronic acids on cholesterol levels and diges-
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