KJMB fm

Korean J. Microbiol. Biotechnol. (2014), 42(3), 211 218 pissn 1598-642X eissn 2234-7305 Korean Journal of Microbiology and Biotechnology 장내유해세균을억제하는양돈용프로바이오틱스개발을위한비피도박테리아탐색 이재연, 신영오, 김근 * 수원대학교바이오산업연구소 Received: June 9, 2014 / Revised: July 17, 2014 / Accepted: August 6, 2014 Screening of Bifidobacteria for the Development of Probiotics Inhibiting Intestinal Pathogenic Bacteria Jaeyeon Lee, Yungoh Shin, and Keun Kim* Institute of Bioindustry, The University of Suwon, Hwaseong 445-743, Republic of Korea In order to isolate probiotic lactic acid bacteria possessing high inhibitory activities against porcine and zoonotic pathogens, such as enterotoxigenic E. coli, Salmonella Typhimurium, and Clostridium perfringens, a total of 65 anaerobic strains were initially isolated from a variety of sources including cattle rumen fluids, chicken intestines and swine feces. Four Bifidobacterium strains were selected for their high anti-pathogenic bacterial activities. By using the 16S rdna sequencing method, three B. boum strains and one B. thermophilum were identified. B. thermophilum demonstrated the best adhesive ability to epithelial cells of swine intestine among the isolates. Indeed, B. thermophilum was seen to have superior characteristics as a probiotic for swine, as judged by their high growth inhibitory activities against various pathogens, and high acid- and bile-tolerance. Keywords: Lactic acid bacteria, probiotics, swine, intestinal pathogenic bacteria 서 론 양돈산업이대규모로산업화되면서세균에의한설사방지를위하여항생제의사용으로질병감소및가축생산성이증대되는효과를가져왔으나항생제의과다사용으로인한항생제내성균의출현및축산물잔류독성의문제가야기되면서국내에서항생제의사료첨가사용을금지하기시작하였다. 항생제대체제로서프로바이오틱스는소화, 미생물경쟁, 면역방어등의기능을통하여증체및생존율을향상시킬수있다. 특히자돈은이유후모체항체의고갈, 잘소화되지않은물질의섭취로인한병원균성장의기회제공, 높은온도및습도로인한면역세포분비의억제 [8], 섭취스트레스 [15], 집단스트레스 [7] 등으로설사빈도가높아짐으로써이유후 20% 이상의높은치사율을나타낸다 [4]. *Corresponding author Tel: +82-31-220-2344, Fax: +82-31-220-2344 E-mail: kkim@suwon.ac.kr 2014, The Korean Society for Microbiology and Biotechnology 장독소성대장균 (enterotoxigenic E. coli, ETEC) 은특히이유후스트레스로인하여 1주일경에작은창자에주로감염되어대장균증을일으키며증상은장관에부착하여독소를생산하며설사, 탈수, 부종등을일으킨다 [2, 5, 6]. 이유후 ETEC로인한질병발병률이평균 25% 이상이며최고 80% 에달한다 [15]. Salmonella Typhimurium는생후 8 12주에살모넬라증을일으키며작은창자및큰창자에감염되어설사를일으킨다 [36]. Clostridium perfringens는유포자성그람양성혐기성바실러스형태로써 type A, C가있으며 [38], 1주가안된면역성이약한돼지의작은창자에서증식하여치명적인괴사성장염, 출혈성설사를일으키며급성의경우빠르게치사하기도한다. 돼지소화관내본래의유산균 (indigenous lactic acid bacteria) 은위장과작은창자에 10 7 10 8 cfu/g 비율로다량존재하고있으며 [23], 유산균은 lactic acid를생성하여위내 ph 를더욱낮춤으로써미생물균총조절및하부소화기관의미생물오염을줄이는역할을한다 [37]. 프로바이오틱스는 적당량을섭취하였을때숙주동물에게건강상이익을주는살아있는미생물 로정의 (FAO/WHO, September 2014 Vol. 42 No. 3

212 Lee et al. 2001) 되고있다. 프로바이오틱스의알려진잇점들은여러감염증, 알러지병, 염증성질병을막아주는것들이다 [28]. 또한세균들에의한장내불균형의위험을감소시키며 [14], 설사를막아준다 [18]. 프로바이오틱스로사용가능한미생물은위산및담즙산에대한저항성 [10], 숙주소장표피세포의정착능력및증식능력 [11, 22], 안전성등의특징을갖추어야한다 [21]. 양돈용프로바이틱스유산균 (lactic acid bacteria, LAB) 은현재까지대부분 Lactobacillus spp. 를중심으로연구되어왔다 [9, 24, 25, 33]. 본연구의목적은동물유래시료로부터양돈사료첨가용유산균을개발하기위하여 ETEC, Salmonella spp., C. perfringens 등양돈산업에서심각한문제를일으키는병원성세균을강하게저해하는 Bifidobacterium 유산균을분리하고자하였다. 또한분리유산균의내산성, 내담즙성, 돼지소장상피세포에대한부착능력등을조사하여양돈사료첨가용프로바이오틱스로써적합한균주를선발하고자하였다. 실험재료및방법 균주본연구에서사용된여러유산균들과이들의 source를 Table 1에나타내었다. L. pentosus K34는본실험실의 stock culture로서, S. Gallinarum, S. aureus, E. coli에항균력이높은균주이다 [26, 27]. 병원성살모넬라균으로는 Salmonella Gallinarum [ 대상 ( 주 ) 으로부터분양 ], 수의과학검역원으로부터분양받은돼지가검물로부터분리된 S. Enteritidis 및 S. enterica serovar. Typhimurium( 또는 S. Typhimurium) 을사용하였다. 그리고인수공통전염병균으로그람양성균인 Staphylococcus aureus ATCC 29213, Listeria monocytogenes ATCC 19118, Clostridium perfringens (type C) ( 수의과학검역원, 돼지가검물로부터분리 ) 를사용하였고, 그람음성균인 Enterotoxigenic E. coli (O15:H11, LT+, Statens Serum Institute, Denmark), Table 1. The bacterial strains used in this study and their sources. Strain Scientific name Source K34 L. pentosus Chicken small intestine JS B. longum Adult intestine (KCCM 11953T) SF7 B. thermophilum Swine feces R5, R6, R9 B. boum Rumen of cattle R1, R2, R4, R7, RA1 ND a Rumen of cattle a Not determined. Campylobacter jejuni ATCC 43430 을사용하였다. 배지및배양유산균배양배지로는 MRS, cmrs (0.05% cysteine이첨가된 MRS), 또는 Raffinose-Bifidobacterium (RB) 배지를사용하였다 [20]. 병원성세균배양배지는 Salmonella spp., S. aureus, L. monocytogenes 등은 tryptic soy broth (TSB; BD, USA; 1.7% pancreatic digest of casein, 0.3% enzymatic digest of soybean meal, 0.25% dextrose, 0.5% sodium chloride, 0.25% dipotassium phosphate), Brain heart infusion broth (BHI; BD, USA; 20% infusion from calf brains, 25% infusion from beef heart, 1% proteose peptone, 0.2% dextrose, 0.5% sodium chloride, 0.25% disodium phosphate) 를사용하였다. ETEC는 Luria- Bertani broth (LB; 0.5% yeast extract. 1% tryptone, 1% NaCl) 를사용하여 37 o C에서 1일동안배양하였다. C. jejuni 의경우는 BHI agar에 10% (v/v) calf serum (Gibco BRL, USA) 을첨가하여 10% CO 2 incubator에서 37 o C로배양하였다. C. perfringens는 Reinforced Clostridial Medium (0.3% yeast extract, 1% beef extract, 1% peptone, 0.1% soluble starch, 0.5% dextrose, 0.3% sodium acetate) 을제조하여사용하였으며, anaerobic jar에서 37 o C로혐기적으로배양하였다. 유산균분리및 1차선별 Bifidobacterium을분리하기위하여젖소제1위내용물, 돼지분변, 토종닭소장내용물들의시료 1 g을 9 ml 혐기희석액 (0.2% yeast extract, 0.05% cysteine-hcl, 0.05% sodium thioglycollate, 0.2% K 2 HPO 4 ) 을사용하여연속희석한후 RB agar plate에도말하여 37 o C 혐기적으로배양하였다. RB agar plate에서성장한분리된콜로니중에서 raffinose를이용할수있는 Bifidobacterium의성장으로인하여 ph가저하됨으로써 bromocresol purple 지시약색깔이노랗게변하여콜로니주위가노랗고, 동시에콜로니주위에 sodium caseinate의침전이형성된콜로니를분리하여 RB agar plate streaking하여 37 o C 2일간혐기적으로배양하였다. 분리된균주를 cmrs broth에접종하여 3일간배양후대조균주 L. pentosus K34보다저해환 (inhibitory clear zone) 의지름이크게형성된균주를항균력이우수한균주로선별하여 1차로분리하였다. 항균력측정각장내병원성세균의항균력을측정하기위하여 agar diffusion method를사용하였다. Penicylinder( 용량 300 µl, ID 6 mm, OD 8 mm, H 10 mm) 를 95% ethanol로적신후

Screening of Bifidobacteria Inhibiting Pathogenic Bacteria 213 화염살균하여중층된 agar plate 상에일정간격으로놓은후각분리유산균의배양액 30 또는 100 µl 를 loading 하여 ETEC 는 37 o C 에서 6 시간배양하여형성된저해환의지름을비교하였으며나머지다른종류의병원성세균은 37 o C 에서 12 시간이상배양한후생성된저해환의지름 (mm) 을측정하였다. 배양기간에따른배양상등액의항균력변화측정분리된유산균중여러종류의인수공통전염병세균에대한항균력이공통적으로우수한유산균을 2 차로선발하여각균주를 10 ml cmrs broth 에서 37 o C 로혐기적으로배양하여 1, 2, 3 일째배양액을각각원심분리하고상등액 30 µl 씩을 S. Enteritidis 가중층된 YM agar plate 상에 penicyliner 에 loading 하여 37 o C 배양기에서 12 시간배양한후저해환의지름을측정하였다. 균주동정균주동정을위한 16S rdna 염기서열분석을위해선발된균주를 RB agar plate에서배양한후생성된단일 colony 를취하여 AccuPrep Genomic DNA Extraction kit (BIONEER Co., Ltd, Korea) 를사용하여 genomic DNA를분리하였다. 분리된 genomic DNA를전기영동을통하여확인한후, PCR (GeneAmp PCR System 2700, USA) 을 denaturation 95 o C/ 30 sec, annealing 55 o C/1 min, extension 72 o C/1 min의조건으로 primer 27F (5 AGAGTTTGATCMTGGCTCAG>) 와 1492R (5 TACGGYTACCTTGTTACGACTT>) 을사용하여총 35 cycle 수행한후전기영동을통하여약 1,500 bp 크기의 16S rdna를확인하였다. 증폭된 16S rdna를 AccuPrep PCR Purification kit를사용하여이 PCR product 를정제하였다. Automated DNA Sequencer (ABI 3100, Applied Biosystem Inc., USA) 를이용하여염기서열을분석하였고, primer를위와같은 27F, 1492R 외에 530F (5 GTGCCAGCMGCCGCGG>) 와 1100R (5 GGGTTGCGCTCGTTG>) 의 4가지를사용하였다. 이후 Clustal X software를사용하여염기서열을조합하여 NCBI (The National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih) 에서제공하는 Advanced Blast search [3] 를이용하여 GenBank의염기서열과비교하여동정하였다. 유산균의내산성과내담즙성각유산균의배양액 1 ml 를 Eppendorf tube 에넣고원심분리하여상등액을버리고모은 pellet 에 modified MRS 배지 (ph 7.0) (sodium acetate, ammonium citrate 불포함 ) 를 1 ml 씩처리하여균체를 2 회세척한후에다시원심분리후남은 cell pellet 에 0.3% HCl 을함유한 MRS (ph 2.2) 또는 0.3% (w/v) bile salt (Difco, USA) 를 1.2 ml 씩넣고잘섞은후세포현탁액을준비하였다. 37 o C 에서 6 시간동안방치한후 RB agar plate 에도말하여혐기적으로배양한후생균수를측정하였고, 다음식에의해내산성또는내담즙성을나타내기위한생존율 (%) 을계산하였다. 생존율 (%) = (cell number in MRS containing 0.3% HCl or bile salt cell number in MRS) 100 유산균의돼지소장상피세포부착성돼지소장상부의중간부를절개하고절개된부위에압력을가해내용물을제거하였다. 점액질표면을 0.01 M PBS (potassium buffered saline, ph 7.4) 로세척하고조심스럽게긁어서 mucus 부분을제거하고 HEPES-Hank's (HH) buffer (25 mm HEPES, 0.137 M NaCl, 5.4 mm KCl, 0.25 mm Na 2 HPO 4, 0.44 mm KH 2 PO 4, 1.3 mm CaCl 2, 1.0 mm MgSO 4, 4.2 mm NaHCO 3 ) 로세척하였다. 분리된표피세포와장관막을 mucus로부터분리하기위하여 4 o C, 12,000 g에서 15분간 2번원심분리하고, 다시 4 o C, 27,000 g에서 15분간원심분리하였다. Mucus를제거한후에 20 ml hyaluronidase (Sigma No. H-3506; 1 mg/ml HH buffer) 로 37 o C에서 30분간반응시키고표피세포를멸균된스푼으로조심스럽게긁어서분리하였고, 이분리된표피세포용액에서거즈로덩어리와부스러기들을여과하여제거시켰다. 표피세포현탁액을 1 분간 100 g 로 2 번원심분리하였고 pellet 을 5 ml HH buffer 로 120 g 10 분간 2 번세척하고 15 ml HH buffer 로한번원심분리하여세척하였다. 표피세포와유산균을최종 1 ml 로섞고 4 o C 에서 40 분간반응시켰다. 현탁액을 200 g 에서 15 분간원심분리하고 HH buffer 로 3 번세척하였다. 침전물을초기부피의반부피로현탁하고 slide glass 에도말하였다. 세포와균을 methanol 로고정시키고 Gram staining 을한후광학현미경으로관찰하면서균수를측정하였다. 약 10 개의표피세포에부착한유산균수를계수하여평균을내어결과를나타내었다. 저해물질의단백질성여부확인분리된유산균이생산하는물질이그람양성균을주로저해하는단백질성항균물질인가의여부를조사하기위하여그람양성균인 S. aureus, L. monocytogenes 에대한 natural ph 와 ph 6.5 에서의유산균배양상등액의항균력을조사하였다. 10 ml cmrs 에서 37 o C, 3 일간배양된각균주의배양액을 10 분간원심분리한후 5 N NaOH 로 ph 를 6.5 로조절하였다. ph 를조절하지않은배양상등액 (natural ph) 과 ph 를 6.5 로조절한배양상등액을 0.45 µm syringe filter (celluolose acetate, Advantec MFS Inc., Japan) 로각각여 September 2014 Vol. 42 No. 3

214 Lee et al. 과하였다. 그리고그여과액을그람양성균인 S. aureus, L. monocytogenes 가중층된 agar plate 에 100 µl 씩 loading 하여형성된저해환의지름을측정하였다. 또한본연구에사용된 Bifidobacterium 균이생산하는배양상등액내의항균물질의단백질성항균물질의여부를조 Table 2. Growth inhibition of different species of Salmonella by the culture broths of various selected LAB a. Diameter (mm) of inhibitory clear zone Strain S. Gallinarum S. Enteritidis S. Typhimurium Control (cmrs) 0.0 0.0 0.0 L. pentosus K34 24.0 19.0 17.0 B. longum JS 28.0 22.0 16.0 SF7 24.0 19.0 14.0 R1 27.0 17.0 17.0 R2 24.0 18.0 13.0 R4 25.0 20.0 18.0 R5 28.0 20.0 22.0 R6 27.0 17.0 16.0 R7 25.0 17.0 14.0 R9 28.0 23.0 21.0 a Thirty microliter supernatant of culture broth of each strain grown at 37 o C for 3 days in cmrs was loaded into a penicylinder on the agar plate to examine the diameter of inhibitory clear zone. 사하기위하여열처리또는단백질분해효소처리를하였다. cmrs에서 3일간배양된유산균배양액을열처리경우유산균배양액의여과액을 100 o C 1시간동안 boiling하였고, 단백질분해효소처리경우 pepsin과 trypsin (Sigma, USA) 을유산균배양상등액의여과액에 1 mg/ml가되도록처리하여 37 o C에서 3시간동안반응시킨후 S. Typhimurium이중층된 YM agar plate상의 penicylinder에 50 µl씩 loading하여 37 o C로 12시간배양한후저해환의지름을측정하였다. 결과및고찰 인수공통전염병세균들에대한항균효과여러가축시료로부터 65 주의혐기성유산균후보균을분리하였고, S. Gallinarum 에대한항균력이우수한 21 주를선별하였다. 이들균주들을 S. Enteritidis, S. Typhimurium 등에대한항균력도조사하여항균활성이우수한 8 균주를선별하였는데이들의 S. Gallinarum, S. Enteritidis, S. Typhimurium에대한항균활성을 Table 2에나타내었다. S. Gallinarum에대한항균력이있는유산균들은다소간의차이는있었지만모두 S. Enteritidis와 S. Typhimurium에도항균력을나타내었다. 한편이들 3가지 Salmonella 균에대한항균력이 L. pentosus K34보다공통적으로우수한균주는 R4, R5, R9, 3균주로나타났는데이들은모두젖소제1위에서분리된 Bifidobacterium으로간주되는균주들이었다. Salmonella에대한항균력이우수한 8균주를 ETEC, S. Table 3. Growth inhibition of different kinds of enteropathogenic bacteria by the culture broths of various isolated LAB a. Strain Diameter (mm) of inhibitory clear zone ETEC b S. aureus L. monocytogenes C. jejuni C. perfringens Control c 0 0 0 0 0 L. pentosus K34 17 20 10 21 16.0 B. longum JS 18 21 12 23 17.5 SF7 16 19 9 21 18.0 R1 17 16 9 24 16.0 R2 16 19 11 24 18.0 R4 15 21 13 18 16.0 R5 20 21 12 25 17.0 R6 16 17 11 21 16.0 R7 18 19 12 21 18.0 R9 20 21 12 25 18.0 a The 100 µl supernatant of culture broth of each strain grown at 37 o C for 3 days in cmrs was loaded into a penicylinder on the agar plate to examine the diameter of inhibitory clear zone. b ETEC, enterotoxigenic E. coli. c Control, cmrs.

Screening of Bifidobacteria Inhibiting Pathogenic Bacteria 215 aureus, L. monocytogenes, C. jejuni, C. perfringens 등 5 종류의다른인수공통전염병원균에대한항균력을조사하였고그결과를 Table 3 에나타내었다. 여기에서도마찬가지로 Salmonella 에항균력을나타낸균주들은다소간의차이는있었지만모두 Salmonella 가아닌다른인수공통장내병원성세균들에도항균성을나타내었다. 시험한병원균모두에대해공통적으로 L. pentosus K34 보다우수한 Bifidobacterium 으로간주되는균주로는 JS, R5, R9 이었다. 조사한균주중에서 5 가지인수공통전염병균모두에가장높은항균력을나타낸균주는 R5 와 R9 이었는데이들 2 균주는 3 종류의 Salmonella 에도역시매우높은항균력을나타내었다 (Table 2). 유산균이생산하는항균효과를나타내는요소로는낮은 ph, 유기산들, bacteriocin, 이산화탄소, 에탄올, diacetyl, 저분자항균물질, 낮은환원전위, 영양소고갈, 우점등에의하여항균력을나타낸다 [1, 34]. 프로바이오틱스균주의항균력시험은액체배양이나 agar plate 를사용한 in vitro 에서많이이루어져왔다. 이외에쥐나다른동물모델을사용하여 in vivo 에서프로바이오틱스의항균작용을연구하는것도바람직하다. 왜냐면대부분의항균작용은숙주의면역조절과프로바이오틱스의항균및감염억제력의혼합작용이기때문이다 [17]. 돼지에서발견되는 ETEC, Salmonella spp., S. aureus, L. monocytogenesis 등은돼지뿐만아니라사람에게도병을일으키는인수공통전염병의원인체인데, 최근에는항생제 methicillin 내성 S. aureus 가돼지로부터돼지사육자들에게옮긴다는논문이발표되어큰문제가되고있다 [31, 32]. 따라서인수공통병원균을억제하는유산균을프로바이오틱스로하여가축에투여한다면가축의질병예방뿐아니라사람으로의전염원을차단한다는점에서그의의가크다. 유산균배양시간이항균능에미치는영향분리된유산균중인수공통전염병균에대한항균력이공통적으로우수한 4 주의 Bifidobacterium 균을선발하여이들유산균들의배양시간에따른 Salmonella 에대한저해능의변화를알아보기위하여 1, 2, 3 일동안각각배양된시료를비교한결과 R9 균주는배양 2 일째에최대항균력을나타내었고, 나머지 4 균주는 2 일째보다 3 일째가증가된항균력을나타내었다 (Table 4). 따라서일반적으로 Bifidobacterium 으로부터최대한많은항균물질을얻기위해서는 3 일이상배양하여야할것으로생각된다. 한편가장빠른시일내에가장높은항균력을나타낸것은 SF7 으로서 1 일배양후 17 mm 의저해환의지름을나타내었고, 최대치의항균력을나타낸균주는 R5 로서 3 일배양후 24 mm 의가장큰저해환의지름을나타내었다. Table 4. Growth inhibition of S. Enteritidis by various selected LAB after different culture time. Diameter (mm) of inhibitory clear zone a Strain after 1 day 2 3 Control b 0.0 0.0 0.0 L. pentosus K34 15.0 18.0 19.0 B. longum JS 14.0 18.0 21.0 SF7 17.0 19.0 21.0 R5 14.0 22.0 24.0 R9 13.0 22.0 22.0 a The loading volume of the culture supernatant onto a paper disc was 30 µl. b Control, cmrs broth. Fig. 1. Acid and bile tolerance of various selected LAB. 균주동정분리된우수유산균들의균주동정을위하여이들유산균들의 16S rdna 서열을분석한결과, 젖소제 1 위에서분리한유산균인 R5, R6, R9 는모두 Bifidobacterium boum 으로동정되었다. 돼지분변에서분리한 SF7 유산균은 B. thermophilum 으로동정되었다. R5, R6, R9 은같은소위에서분리되었고, 같은학명으로동정이되었으나, 항균력에있어서는차이를보였다 (Table 2, Table 3). 내산성과내담즙성분리균주의내산성내담즙성을조사한결과를 Fig. 1 에나타내었다. HCl 내성에서는 L. pentosus K34 가생존율 34.6% 로가장우수하였는데, Bifidobacterium spp. 중에서는 B. thermophilum SF7 이생존율 28.8% 로가장우수하였다. 담즙내성의경우, L. pentosus K34 와 B. boum R9 이생 September 2014 Vol. 42 No. 3

216 Lee et al. 존율각각 67.6% 와 62.1% 로가장우수하였다. 전체적으로보면내산성과내담즙성은직접관련되지않은것으로보인다. 예를들면 R5 의경우 18.5% 로내산성이가장낮았으나, 내담즙성은 58.4% 로높은편이었고, SF7 경우내산성은 28.8% 로높았으나, 내담즙성은 38.6% 로낮은편이었다. 한편내산성측정에사용한균주들은모두항균활성이높은균주들이었는데내산성과내담즙성에는균주간에차이가있는것으로보아, 항균활성과내산성그리고내담즙성에는직접적인관련이없어보인다. Lahteinen 등 [24] 은항균활성과내산성에는오히려 negative 관계가있어보인다고보고하였다. 프로바이오틱스균이장내에서효과를발휘하려면위장관을통과하면서생존할수있어야한다. 따라서위산과담즙에내성은프로바이오틱스를선별하는데있어서중요한기준이되는데 [10, 17], 이들에대한내성은미생물의 species 에따라다르며, 같은 species 라도 strain 에따라다르게나타난다 [17]. 본연구에서도 R5 와 R6 는같은 species 지만위산과담즙내성의차이를보였다 (Fig. 1). 돼지소장상피세포부착성분리한유산균세포들의돼지소장상피세포에대한부착성을조사한결과를 Fig. 2 에나타내었다. 여기에서보면돼지분변에서분리한 B. thermophilum SF7 가가장우수하게부착됨으로써높은돼지장내정착가능성을나타내었다. 따라서돼지의분변에서분리된유산균이사람, 닭, 젖소로부터분리한유산균들보다돼지소장상피세포에대하여예상했던바와같이 [21] 우수한정착가능성을가지는것으로나타났다. 한편 B. boum R5 와 B. boum R9 을비교해볼때부착성이각각 7.0% 와 12.6% 로크게차이가났는데, 이는같은종의균주라도부착성에있어차이가있음을보여주는것이다. 일반적으로장부착성실험에는오랫동안 Caco-2 cell line 이사용되어왔는데 [13], 이는사람의대장상피선암세포로서양돈용유산균의장부착실험에는부적절하다. 따라서본실험에서와같이양돈용유산균의장부착실험은돼지의장표피세포를돼지의창자에서직접분리한창자상피세포로사용하는것이필요하다 [24]. 프로바이오틱스세포가동물장표피세포에부착함으로써동물숙주와프로바이오틱스미생물과밀접한접촉이이루어지기때문에 [19], 또한병원균을경쟁적으로배제하기때문에 [30], 동물의장상피세포부착능력은일반적으로프로바이틱스선정에있어서중요한기준으로여겨져왔다. 유산균항균물질의특성조사 SF7과 R9균주가생산하는물질이그람양성균을주로저해하는단백질성항균물질인 bacteriocin인지의가능성을알아보기균배양액을 ph를조절하지않은 natural ph의배양액과 ph를 6.5로조절한배양액의 S. aureus와 L. monocytogenesis에대한항균력을조사한결과, 두균주모두 natural ph에서는 S. aureus에대한저해환지름이 22.0 mm과 L. monocytogenesis에대한저해환지름이 12.5-13.0 mm로항균력을나타냈으나, ph 6.5로조정한후에는저해환이없어항균력이나타나지않았다. 일반적으로저해물질이 bacteriocin이라면산에의한항균효과가배제된 ph 6.5에서도항균력을나타내야하는데 [35] ph 6.5에서항균력이나타내지않았기때문에 SF7과 R9이생산하는물질이그람양성균을저해하는단백질성항균물질인 bacteriocin일가능성이적어보이고, 그항균력은배양액내의생산된 lactic, acetic, phenyllactic acids 등의유기산일가능성이높다 [24, 27]. SF과 R9 균주들이생산하는항균물질의단백질성여부를알기위하여그배양액을 100 o C에서 1시간동안 boiling한후와단백질분해효소인 pepsin과 trypsin을처리한후에항균력을비교하였지만모두항균력의변화가없었다 (data not shown). 즉배양액내의항균물질은열이나단백질분해효소에의해파괴되지않았기때문에두균주가생산하는항균물질은단백질성항균물질이아닌것으로판단되었다. 결 론 Fig. 2. Adherence of various selected LAB to porcine intestinal epithelial cell. 본연구에서분리된 Bifridobacterium 유산균들은 S. Typhimurium, ETEC, S. Enteritidis, C. perfringens, S. aureus 등국내돼지에서많이발생되는인수공통장내병원성세균들에게높은항균력을보였다. 이들분리유산균들중내산성과답즙내성이상대적으로가장우수한균주는각각 B. theromophilum SF7과 B. boum R9이었다. 돼지소장

Screening of Bifidobacteria Inhibiting Pathogenic Bacteria 217 표피세포부착능이우수한균주는 SF9 과 R9 이었는데이중에서돼지로부터분리된 B. thermophilum SF7 이가장우수한부착능을나타내돼지의장내병원세균을억제해주는프로바이오틱스로의가능성이있는가장적합한균주로판단된다. 앞으로이선발된균주들이프로바이오틱스로사용되기위해서는돼지의창자세포모델연구 [29] 와실제돼지사육을통한그효능을입증하는연구 [39] 들이필요하다. 요 약 본연구에서는동물유래시료들로부터양돈사료첨가용유산균을개발하기위하여 enterotoxigenic E. coli, Salmonella Typhimurium, Clostridium perfringens 등양돈산업에서심각한문제를일으키는인수공통병원성세균들과 Clostridium jejuni, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus와같은식중독균을강하게저해하는 Bifidobacterium 유산균을분리하고자하였다. 이를위하여소의반추위내용물, 닭창자내용물, 돼지분변등의시료들로부터총 65주의혐기성미생물을분리하였다. 이중에서항병원세균활성이가장높은 4주를선별하였는데, 이들은 16S rdna 염기서열분석방법에의하여 3주의 B. boum과 1주의 B. thermophilum으로동정되었다. 특히 B. thermophilum는분리주들중에서가장높은돼지장상피세포에대한부착성을보였고, 여러인수공통병원세균들과식중독균들에대한높은항균력, 산과담즙내성을보여양돈용생균제후보균주로서우수한특성을나타내었다. Acknowledgments This work was supported by the Royalty Program (10046405, Development of microbial strain inhibiting harmful microorganisms and its fermentative production technique) funded by the Ministry of Trade, Industry & Energy (MOTIE, Korea). References 1. Adams MR, Nicholaides L. 1997. Reviews of the sensitivity of different foodborne pathogens to fermentation. Food Control. 8: 227-239. 2. Alexander TJL. 1994. Neonatal diarrhea in pigs, pp. 151-170. In Gyles CL (ed.), Escherichia coli in Domestic Animals and Humans, CAB international, Wallingford. U.K. 3. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, et al. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. 4. Bäckström, L. 1973. Environment and health in piglet production. A field study of incidences and litter number on behaviour and physiological responses related to welfare status of individual and group housed pigs. Appl. Anim. Behaviour Sci. 17: 229-243. 5. Bertschinger HU, Fairbrother JM. 1999. Escherchia coli infections, Sec. 3, Bacterial diseases, pp. 431-468. In Taylor DJ (ed.), Diseases of swine, 8th Ed. Iowa State University Press, Ames, Iowa. 6. Beutin L, Geiser D, Steinruck H, Zimmermann S, Scheutz F. 1998. Prevalence and some properties of verotoxin (shiga-like toxin)-producing E. coli in seven different species of healthy domestic animals. J. Clin. Microbiol. 31: 2483-2488. 7. Björk AKK, Christensson E, Olsson NG, Martinsson KB. 1984. The clinical effect of amperozide in pig production. I. Effect of amperozide on aggression and performance in weaners. XV. p. 335. Proc. Int. Vet. Soc. 8th Congress, Ghent. Belgium, 27-31 August, 1984. 8. Carghill CF 1982. Control of E. coli infections in pigs. Austral. Adv. Vet. Sci. pp. 206-207. 9. Chang YH, Kim JK, Kim HJ, Kim WY, Kim YB, Park YH. 2001. Selection of a potential probiotic Lactobacillus strain and subsequent in vivo studies. Antonie van Leeuwenhoek 80: 193-199. 10. Chou LS, Weimer B. 1999. Isolation and characterization of acid- and bile-tolerant isolates from strains of Lactobacillus acidophilus. J. Dairy Sci. 82: 23-31. 11. Coconnier M, Lievin HV, Lorrot M, Servin AL. 2000. Antagonistic activity of Lactobacillus acidophilus LB against intracellular Salmonella enterica serovar Typhimurium infecting human enterocyte-like Caco-2/TC-7 cells. Appl. Environ. Microbiol. 66: 1152-1157. 12. De Angelis M, Siragusa S, Berioco M, Caputo L, Settanni L, Alfonsi G. 2006. Selection of potential probiotic lactobacilli from pig feces to be used as additives in pelleted feeding. Res. Microbiol. 157: 792-801. 13. Dicks LM, Botes M. 2010. Probiotic lactic acid bacteria in the gastro-intestinal tract: health benefits, safety, and mode of action. Benef. Microbes 1: 11-19. 14. Dunne C. 2011. Adaptation of bacteria to the intestinal niche: Probiotics and gut disorder. Inflam. Bowel Dis. 7: 136-145. 15. Fahy VA, Connaughton D, Driesen SJ, Spicer EM. 1987. Post-weaning colibacillosis, pp. 189-201. In APSA Committee (eds.), Manipulating Pig Production, Australian Pig Science Association, Werribee, Victoria, Australia. 16. FAO/WHO. 2001. Health and nutritional properties of probiotics in food, including powder milk with live lactic acid bacteria. Report of a joint FAO/WHO expert consulation on evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food, including powder milk with live lactic acid bacteria. FAO, Cordoba, Argentina. 17. Fontana L, Bermudez-Brito M, Plaza-Diaz J, Munoz-Quezada S, Gil A. 2013. Sources, isolation, characterization and evaluation of probiotics. British J. Nutrition. 109: S35-S50. 18. Fuller R, Gibson GR. 1997. Modification of the intestinal September 2014 Vol. 42 No. 3

218 Lee et al. microflora using probiotics and prebiotics. Scand. J. Gastroenterol. 222: 28-31. 19. Gueimonde M, Salminen S. 2006. New methods for selecting and evaluating probiotics. Dig. Liver Dis. 38: S242-247. 20. Hartemink, R, Kok BJ, Weenk GH, Rombouts FM. 1996. Raffinose-Bifidobacterium (RB) agar, a new selective medium for bifidobacteria. J. Microbiol. Methods. 27: 33-43. 21. Havenaar R, Brink BT, Veid JHJI. 1992. Selection of strains for probiotic use, pp. 209-224. In Fuller R (ed.), Probiotics : The scientific basis. Chapmann & Hall, London. 22. Hudault, S, Lievin V, Bernet-Camard MF, Servin AL. 1997. Antagonistic activity exerted in vitro and in vivo by Lactobacillus casei (strain GG) against Salmonella Typhimurium C5 infection. Appl. Environ. Microbiol. 63: 513-518. 23. Jonsson E, Conway P. 1992. Probiotic for pigs, pp. 209-224. In Fuller R. (ed.), Probiotics : The scientific basis. Chapmann & Hall, London. 24. Lahteinen, T, Malinen E, Koort JMK, Mertaniemi-Hannus U, Hankimo T, Karikoski N, et al. 2010. Probiotic properties of Lactobacillus isolates originating from porcine intestine and feces. Anaerobe. 16: 293-300. 25. Lee DY, Seo YS, Rayamajhi N, Kang ML, Lee SI, Yoo HS. 2009. Isolation, characterization, an evaluation of wild isolates of Lactobacillus reuteri from pig feces. J. Microbiol. 47: 663-672. 26. Lee JY, Hwang KY, Kim HS, Kim K. 2002. Isolation and identification of lactic acid bacteria inhibiting gastro-intestinal pathogenic bacteria of domestic animal. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 30: 129-134. 27. Lee JY, Hwang KY, Kim K, Park YS, Paik MJ, Kim KR. 2002. Characteristics of antimicrobial organic acids produced by Lactobacillus pentosus K34 isolated from small intestines of Korean native chickens. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 30: 241-246. 28. Minocha, A. 2009. Probiotics for preventive health. Nutr. Clin. Pract. 24: 227-241. 29. Nissen L, Chingwaru W, Sgorbati B, Biavati B, Cencic A. 2009. Gut health promoting activity of new putative probiotic/ protective Lactobacillus spp.strains: A functional study in the small intestinal cell model. Int. J. Food Microbiol. 135: 288-294. 30. Nousianen J, Javanainen P, Setala J, von Wright A. 2004. Lactic acid bacteria as animal probiotics, pp. 547-580. In Salminen S, von Wright A, Quwehand A. (eds.) Lactic acid bacteria. Microbiological and functional aspects. 3rd Ed. Marcel Dekker. New York. 31. Petinaki E, Spiliopoulou I. 2012. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus among companion and food-chain animals: impact of human contacts. Clin. Microbiol. Infect. 18: 626-634. 32. Pletinckx LJ, Verhegghe M, Crombé F, Dewulf J, De Bleecker Y, Rasschaert G, et al. 2013. Evidence of possible methicillinresistant Staphylococcus aureus ST398 spread between pigs and other animals and people residing on the same farm. Prev. Vet. Med. 109: 293-303. 33. Rodriguez E, Arques JL, Rodriguez R, Nunez M, Medina M. 2003. Reuterin production by lactobacilli isolated from pig faeces and evaluation of probiotic traits. Lett. Appl. Microbiol. 37: 259-263. 34. Sanders ME, Kondo JK, Willrett DL. 1991. Application of lactic acid bacteria, pp. 433-459. In Goldberg I. Williams R (eds.), Biotechnology and Food Ingredient, Van Nostrand Reinhold, New York. 35. Schillinger U, Lücke F. 1989. Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat. Appl. Environ. Microbiol. 55: 1901-1906. 36. Schwartz KJ. 1999. Salmonellosis, Sec. 3, Bacterial diseases, pp.535-551. In Taylor DJ (ed.), Diseases of swine, 8th Ed. Iowa State University Press, Ames, Iowa. 37. Smith HW. 1965. The development of the flora of the alimentary tract in young animals. J. Pathol. Bacteriol. 90: 495-513. 38. Taylor DJ. 1999. Clostridial infections, Sec. 3, Bacterial diseases, pp. 395-412. In Taylor DJ (ed.), Diseases of swine, 8th Ed. Iowa State University Press, Ames, Iowa. 39. Wang JQ, Yin FG, Zhu C, Yu H, Niven SJ, delange CFM, et al. 2012. Evaluation of probiotic bacteria for their effects on the growth performance and intestinal microbiota of newlyweaned pigs fed fermented high-moisture maize. Livestock Sci. 145: 79-86.