(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2009-0004706 (43) 공개일자 2009년01월12일 (51) Int. Cl. A61K 31/70 (2006.01) A61P 9/10 (2006.01) (21) 출원번호 10-2008-0064291 (22) 출원일자 2008 년 07 월 03 일 심사청구일자 (30) 우선권주장 2008 년 07 월 03 일 1020070066887 2007 년 07 월 04 일대한민국 (KR) 전체청구항수 : 총 15 항 (71) 출원인 주식회사하이폭시 대구광역시남구대명 4 동 3056-6 대구카톨릭대학교의과대학루가관 320 호 학교법인선목학원 대구중구남산 3 동 225-1 (72) 발명자 이종원 대구수성구범어 4 동 305-3 서한두레맨션 102 동 505 호 김예실 대구광역시수성구범어 4 동두레맨션 102 동 505 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 신동인 (54) 벼과식물로부터수득되는전분또는식이섬유를포함하는허혈성질환및퇴행성뇌질환의예방및치료를위한조성물 (57) 요약 본발명은세포생존능개선활성을갖는전분 (starch) 또는식이섬유 (dietary fiber) 를주성분으로하는조성물에관한것으로, 상세하게는본발명의벼과식물로부터분리된전분및식이섬유는저산소조건배양세포, 베타 - 아밀로이드배양세포및하이드록시도파민존재하배양세포에대한생존능개선활성, 심근경색치료활성, 뇌경색치유효과, 치매동물모델에서기억력감소억제효과및혈관성치매치유효과가탁월하므로, 상기조성물은허혈성질환및퇴행성뇌질환의예방및치료용약학조성물및건강기능식품으로유용하게이용될수있다. 대표도 - 도 3a - 1 -
(72) 발명자 송경식 대구수성구신매동시지천마타운 229 동 1106 호 한형수 대구수성구범어 1 동 671 범어우방 APT 6-305 장정희 대구광역시남구봉덕 3 동 2 차대덕맨션 202 동 809 호 양재하대구남구봉덕동 715-6 임선하대구달서구월성2동월성주공아파트 211-1508 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 PF06221-00 부처명 교육과학기술부 연구사업명 자생식물이용기술개발사업 연구과제명 세포자살을억제하는자생식물추출물로부터노인성질환용식품의약의개발 주관기관 대구가톨릭대학교 ( 선목학원 ) 연구기간 2008년 04월 01일 ~ 2009년 03월 31일 - 2 -
특허청구의범위청구항 1 전분또는식이섬유를유효성분으로함유하는허혈성질환또는퇴행성뇌질환의예방및치료용약학조성물. 청구항 2 아라비노자일란 (arabinoxylan), 베타-글루칸 (β-glucan), 아라비노스 (arabinose) 및자일로스 (xylose) 로구성된군으로부터선택된하나이상의성분을유효성분으로함유하는허혈성질환및퇴행성뇌질환의예방및치료용약학조성물. 청구항 3 제 1항또는제 2항에있어서, 상기허혈성질환은심근경색, 뇌경색, 허혈성급성신부전증, 허혈성급성간부전증, 당뇨성족부궤양, 당뇨성신증, 외과수술부작용에기인한허혈성질환또는기관조직손상인약학조성물. 청구항 4 제 3항에있어서, 상기외과수술부작용에기인한허혈성질환은허혈성심부전, 허혈성신부전, 허혈성간부전또는허혈성뇌졸중인약학조성물. 청구항 5 제 3항에있어서, 기관조직손상은허혈후재관류를동반하는장기수술또는이식, 외상성절단사지재접합으로이루어지는군으로부터선택된의료과정중유발됨을특징으로하는기관조직손상인약학조성물. 청구항 6 제 5항에있어서, 상기장기는신장, 간장, 췌장, 폐또는심장등의내부장기인약학조성물. 청구항 7 제 1 항또는제 2항에있어서, 퇴행성뇌질환은알츠하이머형치매, 뇌혈관성치매, 파킨슨병, 근위축성측상경화증, 헌팅턴병, 피크 (Pick) 병, 크로이츠펠트-야콥 (Creutzfeldt-Jakob) 병또는척수손상인약학조성물. 청구항 8 제 1항에있어서, 상기전분또는식이섬유는소맥 (Triticum aestivum L.), 부소맥, 호밀 (Secale cereale L.), 쌀, 보리 (Horden vulgare var. hexastichon ASCH.), 맥아, 귀리 (Avena sativa), 옥수수 (Zea mays L.), 수수 (Sorghum bicolor MOENCH), 율무 (Coix lacryma-jobi var. mayuen STAPF), 기장 (Panicum miliaceum L.), 조 (Setaria italica Beauv.) 또는감자로부터분리정제됨을특징으로하는약학조성물. 청구항 9 제 8항에있어서, 상기전분은소맥 (Triticum aestivum L.), 호밀 (Secale cereale L.), 보리 (Horden vulgare var. hexastichon ASCH.), 귀리 (Avena sativa), 옥수수 (Zea mays L.), 쌀또는감자로부터분리정제된전분임을특징으로하는약학조성물. 청구항 10 제 8항에있어서, 상기식이섬유는소맥 (Triticum aestivum L.), 호밀 (Secale cereale L.), 보리 (Horden vulgare var. hexastichon ASCH.), 귀리 (Avena sativa), 옥수수 (Zea mays L.) 또는현미로부터분리정제된총식이섬유임을특징으로하는약학조성물. 청구항 11-3 -
전분또는식이섬유를유효성분으로함유하는허혈성질환또는퇴행성뇌질환의예방및개선용건강기능식품. 청구항 12 아라비노자일란 (arabinoxylan), 베타-글루칸 (β-glucan), 아라비노스 (arabinose) 및자일로스 (xylose) 로구성된군으로부터선택된하나이상의성분을유효성분으로함유하는허혈성질환및퇴행성뇌질환의예방및치료용건강기능식품. 청구항 13 제 11항또는제 12항에있어서, 정제, 환제, 캡슐제또는액제인건강기능식품. 청구항 14 건조후, 잘게부순벼과식물의열매를잘게부순후, 열매중량의 10 내지 100% 의물로반죽을만든후, 이반죽을망사체에넣어흐르는물로반죽하면서전분이흘러나오도록하고, 흘러나온전분을원심분리하여가라앉은침전물을수득하고, 이침전물을물에부유시켜 1 내지 7회원심분리하여침전물을얻는단계를포함하는제 1항의전분을수득하는제조방법. 청구항 15 건조후, 잘게부순벼과식물의열매각각을잘게부순후, 각중량의약 1 내지 15배의부피분량의물, 에탄올, 메탄올등과같은 C 1 내지 C 4 의저급알콜또는이들의혼합용매을가하고 20 내지 100 의추출온도에서약 0.5시간내지 2일동안냉침추출, 열수추출, 초음파추출, 환류냉각추출, 약탕기추출등의추출방법으로, 1 회내지 12회반복하여추출한후여과하고, 여과한추출물을진공회전농축기로 20 내지 100 에서감압농축한후추출된잔사를진공동결건조기로건조하여벼과식물조추출물을수득하는단계, 상기조추출물에대해우선건조후, 당함량이 50% 이상이면에탄올을사용하여당을제거하고침전시킨물질을건조하고시료에대해 10 내지 70배의비율로완충용액에잘녹이고, 50 내지 120 에서 10 내지 60분알파-아밀라아제를처리하고, 30 내지 90 서프로테아제 (protease) 를처리함으로단백질을제거하고아세트산을이용하여 ph 4.1 내지 4.5 로조절하고 20 내지 100 에서아밀로글루코시다제 (amyloglucosidase) 를처리한후, 전체용액부피의약 1 내지 7배의에탄올로침전시키고건조시키는단계를포함하는제 1항의식이섬유를제조하는제조방법. 명세서 발명의상세한설명 <1> 기술분야 본발명은전분또는식이섬유를유효성분으로함유하는허혈성질환및퇴행성뇌질환의예방및치료용조성 물에관한것이다. <2> <3> <4> <5> <6> <7> <8> <9> 배경기술 [ 문헌 1] Crow MT et al., Circ. Res., 95(10), pp957-970, 2004 [ 문헌 2] Friedlander RM, N. Engl. J. Med., 348(14), pp1365-1375, 2003 [ 문헌 3] Daemen MA et al., Transplantation, 73(11), pp1693-1700, 2002 [ 문헌 4] Gastman BR et al., P;ast. Reconstr. Surg., 111, pp1481-1496, 2003 [ 문헌 5] Kang TC et al., J. Neurocytol., 30(12), pp945-955, 2001 [ 문헌 6] Won MH et al., Brain Res., 836(1-2), pp70-78, 1999 [ 문헌 7] Yrjanheikki J et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(23), pp13496-13500, 1999 [ 문헌 8] Scarabelli TM et al., J. Am. Coll. Cardiol., 43(5), pp865-874, 2004-4 -
<10> <11> <12> <13> <14> <15> <16> <17> <18> <19> <20> <21> <22> <23> <24> <25> <26> <27> <28> <29> <30> <31> <32> <33> <34> <35> <36> <37> <38> <39> <40> <41> <42> <43> [ 문헌 9] Wang J et al., J. Biol. Chem., 279(19), pp19948-19954, 2004 [ 문헌 10] Hunter CL, Eur. J. Neurosci., 19(12), pp3305-3316, 2004 [ 문헌 11] Wu DC et al., J. Neurosci., 22(5), pp1763-1771, 2002 [ 문헌 12] Zhu S et al., Nature, 417(6884), pp74-78, 2002 [ 문헌 13] Chen M et al., Nat. Med., 6(7), pp797-801, 2000 [ 문헌 14] Teng YD et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(9), pp3071-3076, 2004 [ 문헌 15] KR 10-0404134호 [ 문헌 16] US 특허등록번호 6716822호 [ 문헌 17] US 특허등록번호 6818625호 [ 문헌 18] KR 특허등록제10-0723950호 [ 문헌 19] PCT/KR2006/000027 [ 문헌 20] Ranhotra GS et al., Cereal Chem., 68(5), pp556-558, 1991 [ 문헌 21] Grausgruber H et al., In Genetic variation for plant breeding (Vollmann J et al. (Eds.)) pp23-26, Eucarpia & Boku, Vienna, 2004 [ 문헌 22] Izydorczyk MS et al., Carbohydrate Polymers, 28, pp33-48, 1995 [ 문헌 23] Zekovic DB et al., Crit. Rev. Biotech., 25, pp205-230, 2005 [ 문헌 24] Philippe S et al., Planta, 224(2), pp449-461, 2006 [ 문헌 25] Vinkx CJA et al., J. Cereal Sci., 24, pp1-14, 1996 [ 문헌 26] Miller SS et al., Cereal Chem., 72(5), pp421-427, 1995 [ 문헌 27] Kanauchi M et al., Cereal Chem., 78(2), pp121-124, 2001 [ 문헌 28] Adams EL et al., Carbohydr. Res., 340, pp1841-1845, 2005 [ 문헌 29] Zhou K et al., J. Agric. Food Chem., 52, pp6108-6114, 2004 [ 문헌 30] Clifford MN, J. Sci. Food Agric., 79, pp362-372, 1999 [ 문헌 31] Yoo et al., Carbohydr. Polymers, 49, pp297-305, 2002 [ 문헌 32] Lee SC et al., J. Assoc. Off. Anal. Chem., 75, pp395-416, 1992 [ 문헌 33] Prosky L et al., J. Assoc. Off. Anal. Chem., 71, pp1017-1023 [ 문헌 34] Houben R et al., J. Cereal Sci., 26, pp37-46, 1997 [ 문헌 35] Virkki L et al, Carbohydr. Res., 343, pp521-529, 2008 [ 문헌 36] Ordaz-Ortiz JJ, et al., J. Ceral Sci., 42, pp119-125, 2005 [ 문헌 37] Van Der Borght et al., J. Cereal Sci., 41, pp221-237, 2005 [ 문헌 38] Hoffman RM, In Cell Biology (Celis JE (Ed.), Academic Press, New York, Vol. 1, pp369-370, 1994 [ 문헌 39] Guo S et al., Free Radic. Biol. Med., 39(5), pp682-695, 2005 [ 문헌 40] Haisong J et al., Circulation, 97, pp892-899, 1998 [ 문헌 41] Han HS et al., J. Neurosci., 22, pp3921-3928, 2002 [ 문헌 42] Lindner MD et al., Psychopharmacol. 188, pp629-640, 2006-5 -
<44> <45> [ 문헌 43] Fan et al., Neurosci. Lett. 374, pp222-226, 2005 [ 문헌 44] Cho KO et al., J. Neurosci. Res., 83, pp285-291, 2006 발명의내용 <46> <47> <48> <49> <50> <51> <52> 해결하고자하는과제대표적인허혈성질환인뇌경색과심근경색은고혈압, 고지혈증, 당뇨, 흡연등에의해혈관이좁아지는동맥경화증에빠진상태에서혈전등에의해뇌에혈액을공급하는뇌동맥또는심장에혈액을공급하는관상동맥이막혀주위조직이괴사됨으로써발생한다. 심혈관질환은세계적으로전체사망원인의 30 % 를차지하고있어사망원인 1위를차지하고있으며, 이중의 75 % 는심근경색과뇌경색과같은허혈성질환이다. 심근경색과뇌경색각각은암과더불어사망률최고를차지하고있다. 이러한심근경색과뇌경색에의한사망률을줄이는방법에는고혈압과고지혈증을치료하여혈관의폐색을방지하는방법과혈관폐색시주위조직의괴사를감소시키는방법이있다. 이중, 괴사부위를감소시키는최선의방법은빠른시간내에막힌혈관을혈전용해제등으로뚫어혈관을재관류시키는것이나, 호흡에의해에너지를얻는심장과뇌는혈관이막히는폐색 3~ 6 시간이내에조직들이괴사되어이후에는재관류를시키더라도그치료효과를기대할수없다. 그러나, 치료효과를높이는데필요한시간인폐색 3~ 6 시간이내에병원에도착하여치료를받아재관류시키는것이어려운현실이며, 또한심장과뇌는일단손상을입으면재생이잘되지않는다. 따라서병원에서재관류시킬때까지허혈상태에서의세포생존능을개선할수있다면치료효과를높일수있다. 이때, 조직괴사원인중하나는세포자살이며 (Crow MT et al., Circ. Res., 95(10), pp957-970, 2004; Friedlander RM, N. Engl. J. Med., 348(14), pp1365-1375, 2003), 이를억제함으로써세포생존능을개선할수있다. 또한, 신장이식 (Daemen MA et al., Transplantation, 73(11), pp1693-1700, 2002) 이나성형외과적인수술 (Gastman BR et al., P;ast. Reconstr. Surg., 111, pp1481-1496, 2003) 등에서이식된조직의손상도허혈에이은재관류에따른세포자살에의해발생한다. 또한, 심장을정지시키고시행하는수술의경우, 심폐기에의해공급되는산소량보다요구되는산소량이많게되면심근손상또는저혈압에의한뇌손상이발생할수있다. 예를들어, 관상동맥폐색시에실시하는우회로이식 (bypass graft) 수술, 뇌동맥이나대동맥에발생한동맥류 (aneurysm) 수술등, 혈액을일부차단하는수술시에허혈로인한심근손상및뇌손상으로심부전및반신불수등의부작용이발생할수있다. 실제로대동맥류의수술적또는중재적치료시, 3-16 % 의환자에게서심근허혈, 신부전, 하지마비등의부작용이나타난다. 따라서허혈조건에서세포자살을억제하는약물을전처치에이용한다면, 상기부작용을감소시킬수있다. 신경세포자살의원인은아직명확하게밝혀지지않았지만대뇌에일시적인뇌허혈이유발되는경우, 산소와포도당의공급이차단되어신경세포에서는아데노신삼인산 (ATP) 이감소하고부종 (edema) 이발생되면서신경세포자살이유발되는것으로알려져있다. 뇌허혈에의한신경세포자살기전으로는허혈에의해서세포밖에과도한글루탐산 (glutamate) 이축적되게되고이글루탐산이세포내로유입되어결국과도한세포내칼슘의축적으로신경세포자살이유발된다는흥분성신경세포자살기전 (Kang TC et al., J. Neurocytol., 30(12), pp945-955, 2001) 과허혈-재관류시에갑작스러운산소공급으로인한생체내라디칼의증가가 DNA 및세포질에손상을입혀신경세포사가유발된다는산화성신경세포자살기전 (Won MH et al., Brain Res., 836(1-2), pp70-78, 1999) 이있다. 이러한기전적인연구를바탕으로뇌허혈로인한신경세포자살을효과적으로억제하는물질을탐색하거나물질에대한기전을밝히는연구가많이수행되고있지만아직까지신경세포자살을효과적으로억제하는물질은거의발견되지않았다. 다만, 허혈조건에서세포자살을억제하는테트라사이클린계열의항생제인미노사이클린의경우, 뇌경색 (Yrjanheikki J et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(23), pp13496-13500, 1999), 심근경색 (Scarabelli TM et al., J. Am. Coll. Cardiol., 43(5), pp865-874, 2004) 및허혈성급성신부전증 (Wang J et al., J. Biol. Chem., 279(19), pp19948-19954, 2004) 등의허혈성질환뿐만아니라알츠하이머병 (Hunter CL, Eur. J. Neurosci., 19(12), pp3305-3316, 2004), 파킨슨병 (Wu DC et al., J. Neurosci., 22(5), pp1763-1771, 2002), 근위축성측상경화증 (amyotrophic lateral sclerosis; Zhu S et al., Nature, 417(6884), pp74-78, 2002), 헌팅턴병 (Chen M et al., Nat. Med., 6(7), pp797-801, 2000) 및척수손상 (Teng YD et al., Proc. - 6 -
Natl. Acad. Sci. USA, 101(9), pp3071-3076, 2004) 등의신경세포자살에의해발생하는퇴행성뇌질환의치료에도효과가있다는것이알려져있다. 또한, 본발명자들은이러한테트라사이클린계열의항생제가본연구와유사한허혈조건에서세포의생존을개선시키는것을확인하였다 ( 대한민국특허등록번호 0404134호 ; 미국특허등록번호 6716822, 6818625호 ). 더군다나미노사이클린뿐만아니라아미노글리코사이드계열, 퀴놀론계열의항생제들도미노사이클린과마찬가지로허혈조건에서세포의생존을개선시켰으며, 이중에서특히아미노글리코사이드계열의 G418 ( 제네티신 ) 은심근경색치료효과가관찰되었다 ( 미국특허등록번호 6716822). 이후의실험에서 G418은허혈조건에서세포자살을억제하며심근경색뿐만아니라뇌경색에도치료효과를나타내는것을확인하였다. 상기의결과로, 허혈조건에서 G418과동일한세포생존개선효과를나타내는시료들이궁극적으로심근경색등의허혈성질환의치료에효과를나타내고아울러퇴행성뇌질환등세포자살에의해발생하는질환의예방및치료에도효과를나타낼것으로예상되어탐색을한결과소맥을포함한벼과식물추출물이세포생존을개선효과를나타내는것을확인하였으며, 이를근거로소맥추출물을허혈성질환및퇴행성뇌질환동물모델에적용하여실험을실시한결과뇌경색및심근경색등의허혈성질환과알츠하이머병등의퇴행성뇌질환에대한치료에도효과를나타내는것을확인한바있다. ( 대한민국특허등록번호제10-0723950호및국제출원번호 PCT/KR2006/000027). <53> <54> <55> <56> <57> 대표적인벼과식물인소맥, 호밀, 보리및귀리의알곡전체의조성은, 란호트라등의보고에의하면 10% 정도의수분, 50-60% ( 보리는 25%) 의전분을포함한탄수화물, 10-20% 의단백질, 2-8% 의지방, 10-20% ( 보리는 40%) 의전체식이섬유 [1-3% ( 보리는 9%) 의수용성식이섬유 ] 로구성되어있으며 (Ranhotra GS et al., Cereal Chem., 68(5), pp556-558, 1991), 그라우스그루버등의보고에의하면 50-60% 의전분, 10-20% 의단백질, 1-5% 의지방, 10-20% 의전체식이섬유로구성되어있어상기두보고는유사하다 (Grausgruber H et al., In Genetic variation for plant breeding (Vollmann J et al. (Eds.)) pp23-26, Eucarpia & Boku, Vienna, 2004). 이중에서식이섬유를이루는구성요소중의하나로배유세포 (endosperm cell) 의세포벽을이루는아라비노자일란 (arabinoxylan) 과베타-글루칸 (β-glucan) 이있다 (Izydorczyk MS et al., Carbohydrate Polymers, 28, pp33-48, 1995; Zekovic DB et al., Crit. Rev. Biotech., 25, pp205-230, 2005). 소맥 (Philippe S et al., Planta, 224(2), pp449-461, 2006) 및호밀 (Vinkx CJA et al., J. Cereal Sci., 24, pp1-14, 1996) 의경우는상기세포벽에베타-글루칸보다아라비노자일란이많이함유된반면, 귀리 (Miller SS et al., Cereal Chem., 72(5), pp421-427, 1995) 및보리 (Kanauchi M et al., Cereal Chem., 78(2), pp121-124, 2001) 의경우는아라비노자일란보다베타-글루칸이많이함유되어있으며, 일반적으로, 아라비노자일란은아라비노스 (arabinos e) 와자일로스 (xylose) 로구성되어있으며, 베타-글루칸은포도당으로구성되어있다 (Izydorczyk MS et al., Carbohydr. Polym., 28, pp33-48, 1995). 세포벽을구성하는것으로는상기한아라비노자일란및베타-글루칸과같은고분자이외에도항산화효과를가지는화합물로아라비노자일란분자끼리의결합에참여하는페룰린산 (ferulic acid; Adams EL et al., Carbohydr. Res., 340, pp1841-1845, 2005) 을포함하여쿠마릭산 (coumaric acid), 바닐릭산 (vanillic acid), 파라벤조익산 (p-oh benzoic acid) 및시린직산 (syringic acid; Zhou K et al., J. Agric. Food Chem., 52, pp6108-6114, 2004; Clifford MN, J. Sci. Food Agric., 79, pp362-372, 1999) 등이있다. 전분 (starch) 은녹말이라고도불리며, 엽록소를가진식물체에널리존재한다. 녹말은식물의씨, 뿌리, 줄기, 알뿌리, 열매등에함유된중요한저장물질의하나이며, 고등동물에서도탄수화물의영양원으로서중요한물질이다. 전분은무미, 무취의백색분말로물에는녹지않는다. 분자량은 1백만 ~1천만이며, 비중은 1.65 정도이므로물속에서는침전한다. 일반적으로입자의형태로존재하는데, 그크기나형태는식물의종류에따라다르다. 전분은단일물질로이루어진것이아니라아밀로오스 (amylose) 와아밀로펙틴 (amylopectine) 의혼합물이며, 그비율은전분의종류에따라대체로일정하다. 일반적으로아밀로오스 20-30%, 아밀로펙틴 70~80% 가함유되어있다 (Yoo et al., Carbohydr. Polymers, 49, pp297-305, 2002). 그러나찹쌀, 찰옥수수등은아밀로오스가거의없고아밀로펙틴만으로이루어져있다. 소맥을비롯한벼과식물추출물의저산소조건에서세포생존능개선활성및허혈성질환및퇴행성뇌질환동물모델에서의개선및치료효과를확인한바는이미본발명의발명자들에의해발표된바있으나 ( 대한민국특허등록번호제10-0723950호및국제출원번호 PCT/KR2006/000027), 벼과식물로부터분리정제된전분이나식이섬유 ( 이하, 식이섬유뿐만아니라그구성성분인아라비노자일란, 아라비노스, 자일로스및베타-글루칸포함 ) 가허혈성질환및퇴행성뇌질환개선및치료활성에대해서는알려진바없다. - 7 -
<58> 따라서본발명자들은저산소조건, 베타 - 아밀로이드및하이드록시도파민 (6-hydroxydopamine) 처리조건하의 시험관내실험에전분및식이섬유를적용하여세포생존능개선활성을확인함과동시에허혈성질환및퇴 행성뇌질환동물모델에서의개선및치료효과를확인함으로써본발명을완성하였다. <59> <60> <61> <62> <63> <64> <65> <66> <67> <68> <69> <70> 과제해결수단상기목적을수행하기위하여, 본발명은전분또는식이섬유를유효성분으로함유하는허혈성질환및퇴행성뇌질환의예방및치료용약학조성물을제공한다. 또한, 본발명은전분또는식이섬유를유효성분으로함유하는허혈성질환및퇴행성뇌질환의예방및치료용건강기능식품을제공한다. 또한, 본발명은아라비노자일란 (arabinoxylan), 베타-글루칸 (β-glucan), 아라비노스 (arabinose) 및자일로스 (xylose) 로구성된군으로부터선택된하나이상의성분을유효성분으로함유하는허혈성질환및퇴행성뇌질환의예방및치료용약학조성물을제공한다. 또한, 본발명은아라비노자일란 (arabinoxylan), 베타-글루칸 (β-glucan), 아라비노스 (arabinose) 및자일로스 (xylose) 로구성된군으로부터선택된하나이상의성분을유효성분으로함유하는허혈성질환및퇴행성뇌질환의예방및치료용건강기능식품을제공한다. 본원에서정의되는허혈성질환은심근경색, 뇌경색, 허혈성급성신부전증, 허혈성급성간부전증, 당뇨성족부궤양, 당뇨성신증, 외과수술부작용에기인한허혈성질환또는기관조직손상, 바람직하게는심근경색, 뇌경색등을포함한다. 본원에서정의되는외과수술부작용에기인한허혈성질환은허혈성심부전, 허혈성신부전, 허혈성간부전또는허혈성뇌졸중, 바람직하게는허혈성심부전, 허혈성뇌졸중등을포함한다. 본원에서정의되는기관조직손상은허혈후재관류를동반하는장기수술또는이식, 외상성절단사지재접합으로인한것임을특징으로한다. 상기장기는신장, 간장, 췌장, 폐또는심장등을포함한다. 본원에서정의되는퇴행성뇌질환은알츠하이머형치매, 뇌혈관성치매, 파킨슨병, 근위축성측상경화증, 헌팅턴병, 피크 (Pick) 병, 크로이츠펠트-야콥 (Creutzfeldt-Jakob) 병또는척수손상, 바람직하게는알츠하이머형치매, 뇌혈관성치매, 파킨슨병등을포함한다. 본발명에서정의되는 전분 은소맥 (Triticum aestivum L.), 부소맥, 호밀 (Secale cereale L.), 쌀, 보리 (Horden vulgare var. hexastichon ASCH.), 맥아, 귀리 (Avena sativa), 옥수수 (Zea mays L.), 수수 (Sorghum bicolor MOENCH), 율무 (Coix lacryma-jobi var. mayuen STAPF), 기장 (Panicum miliaceum L.), 조 (Setaria italica Beauv.) 또는감자로부터분리정제된전분, 바람직하게는소맥 (Triticum aestivum L.), 호밀 (Secale cereale L.), 보리 (Horden vulgare var. hexastichon ASCH.), 귀리 (Avena sativa), 옥수수 (Zea mays L.), 쌀또는감자로부터분리정제된전분, 보다바람직하게는, 소맥으로부터분리정제된전분, 옥수수로부터분리정제된전분, 쌀로부터분리정제된전분또는감자로부터분리정제된수용성전분, 가장바람직하게는, 분자량 1,000,000 내지 10,000,000에해당하는소맥으로부터분리정제된전분, 옥수수로부터분리정제된전분, 쌀로부터분리정제된전분또는감자로부터분리정제된수용성전분임을특징으로한다. 본발명에서 식이섬유 은소맥 (Triticum aestivum L.), 부소맥, 호밀 (Secale cereale L.), 쌀, 보리 (Horden vulgare var. hexastichon ASCH.), 맥아, 귀리 (Avena sativa), 옥수수 (Zea mays L.), 수수 (Sorghum bicolor MOENCH), 율무 (Coix lacryma-jobi var. mayuen STAPF), 기장 (Panicum miliaceum L.), 조 (Setaria italica Beauv.) 또는감자로부터분리정제된총식이섬유, 바람직하게는소맥 (Triticum aestivum L.), 호밀 (Secale cereale L.), 보리 (Horden vulgare var. hexastichon ASCH.), 귀리 (Avena sativa), 옥수수 (Zea mays L.) 또는현미로부터분리정제된총식이섬유를포함하며, 보다바람직하게는소맥 (Triticum aestivum L.) 으로부터분리정제되고아라비노자일란 (arabinoxylan), 베타글루칸 (β-glucan) 및아라비노갈락탄 (arabinogalactan) 의상대적중량비가전체의 5~20: 1 : 1~10 을포함하며, 보다더바람직하게는소맥 (Triticum aestivum L.) 으로부터분리정제되고약 50,000 내지 400,000달톤범위의아라비노자일란 (arabinoxylan) 및베타-글루칸 (β-glucan) 으로구성되는총식이섬유를포함한다. 본발명에서 아라비노스 와 자일로스 는각각 L형과 D형을포함하며, 보다바람직하게는자연에서생성되 - 8 -
는즉, 아라비노스 (arabinose) 는 L 형, 자일로스 (xylose) 는 D 형을포함한다. <71> <72> <73> <74> <75> <76> 이하, 본발명을상세히설명한다. 본발명의전분은하기와같이수득될수있다. 건조후, 잘게부순벼과식물의열매, 바람직하게는소맥, 부소맥, 호밀, 현미, 보리, 맥아, 귀리, 옥수수, 수수, 율무, 기장또는조의열매, 더욱바람직하게는소맥열매를잘게부순후, 열매의수분함량이 10 내지 100%, 바람직하게는 50 내지 70% 범위가되도록물을넣어반죽을만든후, 이반죽을나일론망사등의망사체를이용하여넣어흐르는물로반죽하면서전분이흘러나오도록하고, 흘러나온전분을원심분리하여가라앉은침전물을수득하고, 물에부유시켜 1 내지 7회, 바람직하게는 3 내지 5회원심분리하여순수한전분을수득할수있다. 또한본발명의식이섬유는하기와같이수득될수있다. 건조후, 잘게부순벼과식물의열매, 바람직하게는소맥, 부소맥, 호밀, 현미, 보리, 맥아, 귀리, 옥수수, 수수, 율무, 기장또는조의열매, 더욱바람직하게는소맥, 현미또는옥수수열매각각을잘게부순후, 각중량의약 1 내지 15배의부피, 바람직하게는약 5 내지 10배분량의물, 에탄올, 메탄올등과같은 C 1 내지 C 4 의 저급알콜또는이들의혼합용매, 바람직하게는물, 또는약 1: 0.1 내지 1: 10의혼합비를갖는이들의혼합용매, 보다바람직하게는물또는약 1: 0.1 내지 1: 10의혼합비를갖는물및에탄올혼합용매을가하고 20 내지 100, 바람직하게는 25 내지 100 의추출온도에서약 0.5시간내지 2일, 바람직하게는 1시간내지 1일동안냉침추출, 열수추출, 초음파추출, 환류냉각추출, 약탕기추출법등의추출방법으로, 바람직하게는약탕기추출법으로약 1회내지 12회, 바람직하게는 3회내지 4회반복하여추출한후에여과하고, 여과한추출물을진공회전농축기로 20 내지 100, 바람직하게는 40 내지 70 에서감압농축한후추출된잔사를진공동결건조기로건조하여벼과식물조추출물을수득하고, 상기조추출물에대해우선건조후당함량이 50% 이상이면에탄올을사용하여당을제거하는데, 바람직하게는 85% 에탄올을사용하여침전시킨물질을건조하고시료에대해 10 내지 70배, 바람직하게는 30 내지 50배의비율로완충용액에잘녹이고, 50 내지 120, 바람직하게는 70 내지 90 에서 10 내지 60분, 바람직하게는 25 내지 45분간알파-아밀라아제를처리하고, 30 내지 90, 바람직하게는 50 내지 70 에서프로테아제 (protease) 를처리함으로단백질을제거하고아세트산을이용하여 ph 4.1 내지 4.5 바람직하게는 ph 4.2 내지 4.4로조절하고 20 내지 100, 바람직하게는 50 내지 70 에서아밀로글루코시다제 (amyloglucosidase) 를처리한후에전체용액부피의약 1 내지 7배, 바람직하게는 3 내지 5배의부피의에탄올로침전시키고건조시키는단계를통하여본발명의식이섬유를수득할수있다. <77> <78> <79> <80> <81> <82> 본발명은상기제조방법으로수득된본발명의전분또는식이섬유를유효성분으로함유하는허혈성질환또는퇴행성뇌질환의예방및치료용약학조성물을제공한다. 상기와같이본발명의전분, 식이섬유, 아라비노자일란, 베타-글루칸, 아라비노스및자일로스는통상적인모든추출, 분리, 정제방법에의해수득되거나, 시판되는시약을사용할수도있다. 본발명의전분및식이섬유는독성및부작용이거의없으므로예방목적으로장기간복용시에도안심하고사용할수있다. 본발명의전분또는식이섬유를포함하는약학조성물은약학적조성물의제조에통상적으로사용하는적절한담체, 부형제및희석제를더포함할수있다. 본발명의전분또는식이섬유를포함하는조성물에포함될수있는담체, 부형제및희석제로는락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트및광물유를들수있다. 본발명에따른전분또는식이섬유를포함하는약학조성물은, 각각통상의방법에따라산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸등의경구형제형, 외용제, 좌제및멸균주사용액의형태로제형화하여사용될수있다. 제제화할경우에는보통사용하는충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제등의희석제또는부형제를사용하여조제된다. 경구투여를위한고형제제에는정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이포함되며, 이러한고형제제는상기조성물에적어도하나이상의부형제예를들면, 전분, 칼슘카보네이트 - 9 -
(calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는락토오스 (lactose), 젤라틴, 카르복시메틸셀룰로스 (carboxymethyl cellulose) 등을섞어조제된다. 또한단순한부형제이외에마그네슘스테아레이트, 탈크같은윤활제들도사용된다. 경구를위한액상제제로는현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이해당되는데흔히사용되는단순희석제인물, 리퀴드파라핀이외에여러가지부형제, 예를들면습윤제, 감미제, 방향제, 보존제등이포함될수있다. 비경구투여를위한제제에는멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가포함된다. 비수성용제, 현탁제로는프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과같은식물성기름, 에틸올레이트와같은주사가능한에스테르등이사용될수있다. 좌제의기제로는위텝솔 (witepsol), 마크로골 (macrogol), 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴등이사용될수있다. <83> <84> <85> <86> <87> <88> <89> <90> <91> 본발명의조성물은경구, 경피, 피하, 정맥또는근육을포함한여러경로를통해투여될수있다. 본발명의전분또는식이섬유의바람직한투여량은환자의상태및체중, 질병의정도, 약물형태, 투여경로및기간에따라달라질수있으나, 전분은 0.1 내지 1000 mg/ kg의양을 1일 1회내지수회투여할수있고, 식이섬유는 0.01 내지 100 mg/ kg의양을 1일 1회내지수회투여할수있다. 따라서상기투여량은어떠한면으로든본발명의범위를한정하는것은아니며, 투여는하루에한번투여할수도있고, 수회나누어투여할수도있다. 본발명은전분또는식이섬유를유효성분으로함유하는허혈성질환및퇴행성뇌질환의예방및치료용건강기능식품을제공한다. 본원에서정의되는 " 건강기능식품 " 은건강기능식품에관한법률제6727호에따른인체에유용한기능성을가진원료나성분을사용하여제조및가공한식품을의미하며, " 기능성 " 이라함은인체의구조및기능에대하여영양소를조절하거나생리학적작용등과같은보건용도에유용한효과를얻을목적으로섭취하는것을의미한다. 본발명의허혈성질환및퇴행성뇌질환의예방및개선을위한건강기능식품은, 조성물총중량에대하여상기전분또는식이섬유를 0.01 내지 95 %, 바람직하게는 1 내지 80 % 중량백분율로포함한다. 또한, 허혈성질환및퇴행성뇌질환의예방및개선을위한목적으로산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽등의약학투여형태또는건강음료등의형태인건강기능식품으로제조및가공이가능하다. 본발명의건강기능성음료조성물은지시된비율로필수성분으로서상기전분을함유하는외에는다른성분에는특별한제한이없으며통상의음료와같이여러가지향미제또는천연탄수화물등을추가성분으로서함유할수있다. 상술한천연탄수화물의예는모노사카라이드, 예를들어, 포도당, 과당등 ; 디사카라이드, 예를들어말토스, 슈크로스등 ; 및폴리사카라이드, 예를들어덱스트린, 시클로덱스트린등과같은통상적인당, 및자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨등의당알콜이다. 상술한것이외의향미제로서천연향미제 ( 타우마틴, 스테비아추출물 ( 예를들어레바우디오시드 A, 글리시르히진등 ) 및합성향미제 ( 사카린, 아스파르탐등 ) 를유리하게사용할수있다. 상기천연탄수화물의비율은본발명의조성물 100 ml당일반적으로약 1~ 20 g, 바람직하게는약 5~ 12 g이다. 상기외에본발명의조성물은여러가지영양제, 비타민, 광물 ( 전해질 ), 합성풍미제및천연풍미제등의풍미제, 착색제및중진제 ( 치즈, 초콜릿등 ), 펙트산및그의염, 알긴산및그의염, 유기산, 보호성콜로이드증점제, ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에사용되는탄산화제등을함유할수있다. 그밖에본발명의조성물들은천연과일쥬스및과일쥬스음료및야채음료의제조를위한과육을함유할수있다. 이러한성분은독립적으로또는조합하여사용할수있다. 이러한첨가제의비율은그렇게중요하진않지만본발명의조성물 100 중량부당 0 내지약 20 중량부의범위에서선택되는것이일반적이다. 또한, 본발명의전분및식이섬유는허혈성질환및퇴행성뇌질환의예방효과를목적으로식품또는음료에첨가될수있다. 이때, 식품또는음료중의상기전분또는식이섬유의양은전체식품중량의 0.01 내지 15 중량 % 로가할수있으며, 건강음료조성물은 100 ml를기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의비율로가할수있다. <92> 효과 본발명의전분및식이섬유는저산소조건, 베타 - 아밀로이드및하이드록시도파민 (6-hydroxydopamine) 처리 하에서배양된세포에처리하였을때세포생존능을개선하는효과를가지며또한심근경색, 뇌경색, 건망증유 - 10 -
발동물모델에서기억력감퇴의완화및혈관성치매유발동물모델에서도치매의완화효과를가지므로허혈성 질환및퇴행성뇌질환의치료를위한의약및건강기능식품에사용될수있다. <93> <94> <95> <96> <97> <98> <99> <100> <101> <102> <103> <104> <105> 발명의실시를위한구체적인내용이하, 본발명을하기의실시예및실험예에의해상세히설명한다. 단, 하기실시예및실험예는본발명을예시하는것일뿐, 본발명의내용이하기실시예및실험예에의해한정되는것은아니다. 참고예 1. 시료준비옥수수로부터분리정제된전분 ( 제품번호 S4180 ; 이후 SC로명명함 ), 쌀로부터분리정제된전분 ( 제품번호 S7260 ; 이후 SR로명명함 ), 감자로부터분리정제된수용성전분 ( 제품번호 S9765 ; 이후 SS로명명함 ) 은모두시그마사 (Sigma, USA) 로부터구입하여사용하였고, 식이섬유의대표적구성성분인아라비노자일란 (arabinoxylan) 은중간점성 (medium viscosity) 을가진것 ( 제품번호 P-WAXYM : from wheat, viscosity : 25 cst, MW :270,000 daltons.), 베타-글루칸 (β-glucan) 도중간점성을가진것 (medium viscosity) ( 제품번호 P-BGBM : from barley viscosity : 28 cst, MW :260,000 daltons ) 을메가자임사 ( Megazyme ) 에서구입하여사용하였다. 또한아라비노자일란의대표적인구성물질인아라비노스 (arabinose) ( 제품번호 A3256 : L(+) form, MW 150.13) 는시그마사 (Sigma, USA) 에서구입하여사용하였고자일로스 (xylose) ( 제품번호 95729 : D(+) form, MW 150.13 ) 는플루카사 ( Fluka, Germany ) 에서구입하여사용하였다. 참고예 2. 실험동물의준비실험동물은체중 250-300 g의스프라그-다우리 (Sprague-Dawley) 계수컷랫트 ( 효창사이언스사 ) 를사용하였고, 대구카톨릭의대동물사육실에서일정한조건 ( 온도 : 21± 2, 명암 : 12시간명암주기 ) 에서, 사료와음수의자유로운섭취가가능하도록실험시작전까지물과먹이를충분히제공하여, 실험시작전에실험동물을 10분동안사전취급 (handling) 하였다. 실시예 1. 벼과식물조추출물의제조시중에서구입한소맥을시료로하여깨끗이수세하고, 재래식약탕기추출법에따라서소맥 100g에물 2 l를가하고 2시간동안전기약탕기 ( 대웅약탕기 DWP-2000, 대웅 ) 에서 2회반복하여추출한후, 여과하였다. 여과하여얻은추출물 2 l를냉동건조하여소맥물추출물 22 g을수득하였다 ( 이하 HY6228로명명함 ). 한편, 현미및옥수수에대해서도상기소맥추출물제조방법과동일한방법을적용하여 100 g 당각각 20 g 및 9 g을수득하였다 ( 이하 HY6228A, HY6228F로명명함 ). 또한, 상기 HY6228 내에존재하는작은분자량 (M.W.6-8,000) 의물질을제거하기위해 HY6228 10g을 100ml증류수에현탁하여투석막 (dialysis membrane; Spectra/Por 1-132675, Spectrumlabs) 에넣고 500mL의증류수상에서 4 냉장고에서 24시간동안교반시켜주면서 3일동안 500ml의증류수를 3번교체하여투석막안의용액을동결건조한후고분자량물질함유소맥물추출물 6.66g을수득하였다 ( 이하 HY6228d로명명함 ). 실시예 2. 벼과식물식이섬유의제조벼과식물중실시예 1에서수득한소맥의조추출물을이용하여총식이섬유 (total dietary fiber, TDF) 를문헌 (Lee SC et al., J. Assoc. Off. Anal. Chem., 75, pp395-416, 1992; Prosky L et al., J. Assoc. Off. Anal. Chem., 71, pp1017-1023) 에기재된방법을적용한메가자임 (Megazyme) 회사의방법 (TDFR 06/01) 으로제조하였다. 실시예 1에서얻어진 HY6228 10 g를 500ml병에넣고, 여기에 400 ml의 MES/TRIS 완충액 ( 각각 0.05M, ph8.0, 24 ) 을넣어잘섞어준후 70μl α-아밀라아제 (Termamyl 23 mg / ml, 930 U/ mg, Denmark) 를넣어 80 진탕항온수조에서 35분동안반응시켰다. 반응후, 실온에서 60 로냉각시킨다음 1000 μl프로테아제 (~350U/ ml, Megazyme cat. no. E-BSPRT) 를넣어 60 진탕항온수조에서 30분동안반응시켰다. 그후 3M 아세트산으로 ph를 4.3으로맞추고 2000μl의아밀로글루코시다제 (amyloglucosidase, 3,300U/ ml Megazyme cat. no. E- AMGDF) 를넣어 60 의진탕항온수조에서 30분동안반응시켰다. 60 로미리예열한 95% EtOH 1600ml을넣어잘섞은다음상온에서 60분간정치시켰다. 이것을원심분리하여얻어진침전물을수거하여건조한결과 2.3 g 의총식이섬유 (TDF) 가얻어졌다. 실시예 3. 아라비노자일란 (arabinoxylan) 과베타-글루칸 (β-glucan) 등을포함하는식이섬유 (TDF) 를구성하는 - 11 -
당의조성에관한분석실험 <106> <107> 하기의실시예에서사용하는식이섬유 (TDF) 를구성하는아라비노자일란 (arabinoxylan: arabinose와 xylose) 과베타-글루칸의조성을알기위해아라비노스 (arabinose), 자일로스 (xylose), 글루코스 (glucose) 및갈락토스 (galactose) 의분석을세종대학교탄수화물소재연구소 (http://www.carbo.or.kr) 에의뢰하여실험하였다. 우선, 식이섬유 (TDF) 를 2 mg / ml농도로만든후트리플루오루아세틱산 (trifluoroacetic acid) 으로 100 에서 4 시간동안산가수분해한후, 이중 10 μl ( 총 0.2 μg) 을 CarboPac TM PA1 칼럼 (HPAEC-PAD system, Dionex, USA) 에주입하여 18 mm NaOH로 1.0 ml /min의유량으로용출 (elution) 시켰다 (Houben R et al., J. Cereal Sci., 26, pp37-46, 1997). 그결과도 1과같은결과를얻었으며, 표준품과비교한결과용출되어나오는순서대로아라비노스 (Ara), 갈락토스 (Gal), 포도당 (Glc) 및자일로스 (Xyl) 가관찰되었다. 이것의면적으로부터각각성분의용량을계산한결과각각 69.5 pmol (10.4 ng), 27.0 pmol (4.9 ng), 652.7 pmol (117.5 ng) 및 81.6 pmol (12.2 ng) 이었다. 그런데소맥에서의갈락토스는아라비노갈락탄 (arabinogalactan) 으로부터오고아라비노갈락탄내에서의아라비노스양은갈락토스의 0.7배에해당하므로 (Virkki L et al, Carbohydr. Res., 343, pp521-529, 2008) 측정된아라비노스값 (10.4 ng) 에서아라비노갈락탄에서온아라비노스값 (3.4 ng) 을빼면아라비노자일란으로부터온아라비노스는 7 ng이된다. 따라서, ara/xyl ( 중량비 ) = 0.58로문헌에보고된값 (Ordaz-Ortiz JJ, et al., J. Ceral Sci., 42, pp119-125, 2005) 과일치하였으며, 0.2 μg (200 ng) 의식이섬유 (TDF) 에들어있는아라비노자일란의양은 19.2 ng (9.6%, 중량비 ) 이되며, 아라비노갈락탄은 8.3 ng (4.1%, 중량비 ) 이된다. <108> <109> 한편, 식이섬유 (TDF) 에들어있는포도당은베타-글루칸뿐만아니라셀룰로스및저항성전분 (resistant starch) 등으로부터올수있으므로식이섬유 (TDF) 에들어있는베타-글루칸의양을 McCleary method인 mixedlinkage β-glucan assay kit를사용하여따로측정하였다 [Mixed linkage beta-glucan assay procedure (McCleary method), Megazyme K-BGLU 04/06]. 이방법에서는베타-글루칸만을분해하는효소인리체나제 (lichenase) 를이용하여일부분해한후이것을베타-글루코시다제 (β-glucosidase) 를이용하여완전분해한다. 이때생성된포도당의양은글루코스옥시다제 / 페로시다제 (glucose oxidase/peroxidase) 시약을이용하여생긴색깔을 510 nm에서측정하여얻는다. 그결과 TDF에들어있는베타-글루칸은약 1.1% ( 중량비 ) 였다. 상기의실험결과를요약하면, 본연구에서사용된식이섬유 (TDF) 에는아라비노자일란 (ara/xyl=0.58), 베타-글루칸, 및아라비노갈락탄은각각 9.6%, 1.1% 및 4.1% ( 중량비 ) 가들어있으며, 베타-글루칸이외의포도당은 115.3 ng (57.7%, 중량비 ) 이들어있다. <110> <111> <112> 실시예 4. 벼과식물전분의제조벼과식물중소맥으로부터의전분 (SW) 의분리는문헌 (Van Der Borght et al., J. Cereal Sci., 41, pp221-237, 2005) 에기재된방법을이용하여제조하였다. 50g의밀가루에물을첨가하여 50% 의수분함량이되도록반죽을만든후, 이것을나일론망사 (nylon bolting cloth, 50 μm) 에넣었다. 이것을흐르는물에주물러서천사이로희고흐린물이나오지않을때까지얻어진것을원심분리하여그침전물을전분 (SW) 으로확보하였다. <113> <114> <115> <116> 실험예 1. 저산소조건하에서전분의세포생존능개선활성측정 (in vitro) 벼과식물조추출물또는이로부터분리된전분과식이섬유가저산소조건에서세포의생존에미치는영향을조사하기위하여하기와같이실험을수행하였으며, 세포생존을개선시키는정도를문헌에기재된 MTT 어세이법 (Hoffman RM, In Cell Biology (Celis JE (Ed.), Academic Press, New York, Vol. 1, pp369-370, 1994) 을변형하여측정하였다. 인간간암세포주 (human hepatoma cell line) 인 HepG2 (ATCC HB 8065, 미국 ) 를항생제로는페니실린지 (penicillin G sodium, 100 Units/l, Invitrogen, USA) 및스트렙토마이신 (streptomycin sulfate, 100 mg/l, Invitrogen, USA) 과혈청으로는 10 % 우태아혈청 (fetal bovine serum, Invitrogen. USA) 이첨가된이글최소배지 (EMEM, Eagle's minimum essential midium; Invitrogen, 미국 ) 를사용하여 12웰플레이트 (12wellplate) 에서 2 10 5 세포수 /800 μl배지로배양하였다. 세포들을 37 및 5 % CO 2-95% 대기상태에서 48시간동안 - 12 -
배양하고새로운배양배지로교체한후, 상기실시예의조추출물, 전분들및식이섬유를 100% 디메틸술폭시화물 (DMSO; dimethyl sulfoxide) 에 50 mg / ml농도로녹인후, 최종농도를 100, 200, 400 및 800 μg / ml ( 총식이섬유인 TDF는 100, 1000 μg / ml ) 로하여배양배지에첨가한실험군및아무것도첨가하지않은음성대조군 (negative control) 을저산소 ( 산소농도 1 %) 조건에서각각 2일동안배양하면서하기의 MTT 어세이를수행하여그결과를도 2a 및도 2b에나타냈다. <117> <118> 도 2a 에나타난바와같이, SR, HY6228A, SW 및 HY6228d 는 200 μg / ml이상농도에서, HY6228, SC 및 HY6228F 는 400 μg / ml이상농도에서, SS 는 800 μg / ml이상농도에서각각세포생존능개선효과를나타내었다. 또한, 도 2b 에나타난바와같이, HY6228 은 1000 μg / ml의농도에서세포생존능개선효과가확실히나타났다. <119> <120> <121> <122> <123> 상기와같이, 벼과식물인소맥, 현미 ( 쌀 ) 및옥수수조추출물뿐만아니라이로부터분리된전분또한저산소조건에서세포생존을개선시키는효과를나타내었다. 그러나총식이섬유는저산소조건에서세포생존을개선시키지못하였다. 선행연구 ( 대한민국특허등록번호제10-0723950호및국제출원번호 PCT/KR2006/000027) 에의하면, 저산소조건에서세포생존을개선시키는소맥조추출물이뇌경색등의허혈성질환뿐만아니라알츠하이머병등퇴행성뇌질환에대한치료효과를나타내었으므로, 선행연구의조추출물과비교하여그이상의탁월한세포생존능개선효과를나타내는본발명의벼과식물유래전분또한동일질환의치료에효과를나타낼것으로예상할수있다. 실험예 2. 베타-아밀로이드 (β-amyloid) 존재하에서전분및식이섬유의세포생존능개선활성측정 (in vitro) 벼과식물조추출물또는이로부터분리된전분및식이섬유가알츠하이머병을유발하는베타-아밀로이드를첨가한조건하에서세포의생존에미치는영향을조사하기위하여하기와같이실험을수행하였으며, 세포생존을개선시키는정도를문헌에기재된 MTT 어세이법 (Hoffman RM, In Cell Biology (Celis JE (Ed.), Academic Press, New York, Vol. 1, pp369-370, 1994) 을변형하여측정하였다. 인간신경아세포종세포주 (human neuroblastoma cell line) 인 SH-SY5Y (ATCC CRL-2266, 미국 ) 를항생제로는페니실린지 (penicillin G sodium, 100 Units/l, Invitrogen, USA) 및스트렙토마이신 (streptomycin sulfate, 100 mg/l, Invitrogen, USA) 과혈청으로는 10 % 우태아혈청 (fetal bovine serum, Invitrogen. USA) 이첨가된 Dulbecco s modified eagle medium (DMEM)/F12 90% 배지 (Invitrogen, 미국 ) 를사용하여 48웰플레이트 (48well-plate) 에서 4 10 4 세포수 /300 μl배지로배양하였다. 세포들을 37 및 5 % CO 2-95% 대기상태에 서 48시간동안배양하고새로운배양배지로교체한후, 베타-아밀로이드 (β-amyloid, Sigma, 미국 ) 만을최종농도가 0, 2.5, 7.5 및 25 μm이되도록첨가한군 (Aβ 25-35 alone), 또는상기와동일한농도의베타-아밀로이드에 100% 디메틸술폭시화물 (DMSO; dimethyl sulfoxide) 에 50 mg/ ml농도로녹인전분, 총식이섬유또는조추출물들을최종농도가 125 μg / ml ( 전분, 총식이섬유 ) 또는 250 μg / ml ( 조추출물 ) 이되도록첨가한군 (Aβ 25-35 + SS 또는 SW) 으로나누어각각 1일동안배양하였다. 배양후, 상기세포들에 MTT 용액을최종농도 1 mg / ml로가하고 2시간동안배양한다음 DMSO로용해시켜리더 (microplate reader, FLUOstar OPTIMA, BMG LABTECH, Germany ) 를이용하여 540 nm에서흡광도를측정하여결과를하기도 3a 내지 3e에나타내었다. <124> <125> <126> 도 3a 및 3b에나타난바와같이, 0-25μM 농도의베타-아밀로이드에 SW ( 도 3a 참조 ) 또는 SS ( 도 3b 참조 ) 를각각 125 μg / ml씩첨가한경우, 2.5μM 농도이상의베타-아밀로이드존재하에서벼과식물로부터분리정제된전분은베타아밀로이드에의한독성을유의하게감소시켰다 [p<0.05 (*) 또는 0.01 (**)]. 상기결과로벼과식물추출물또는벼과식물유래전분들은 25μM의베타-아밀로이드농도에서세포생존개선효과가가장탁월하였으므로, 베타-아밀로이드농도를 25μM로고정해두고소맥조추출물인 HY6228 (250 μg / ml ) 및 SS, SC, SR, SW (125 μg / ml ) 을각각첨가하여배양한후그결과를도 3c에나타내었다. 또한베타-아밀로이드농도를 25μM로고정해두고소맥에서유래한식이섬유 (500,1000 μg / ml ) 를각각첨가하여배양한후그결과를도 3d 에나타내었다. 또한베타-아밀로이드농도를 15μM로고정해두고식이섬유에서유래한아라비노자일란 (arabinoxylan) (AX) (500 μg / ml ), 아리비노스 (arabinose) (Ara) (250 μg / ml ), 자일로스 (xylose) (Xyl) (250 μg / ml ) 및베타글루칸 (β-glucan) (b-glu) (20 μg / ml ) 을각각첨가하여배양한후그결과를도 3e 에나타내었다. - 13 -
<127> <128> <129> <130> <131> <132> 실험결과, 도 3c에나타난바와같이, 베타-아밀로이드만첨가한경우에비해벼과식물로부터분리정제된전분들을함께첨가한군은모두세포생존을유의하게개선시켰으며 ( 도 3c 참조 ), 도 3d에나타난바와같이, 베타-아밀로이드만첨가한경우에비해소맥에서유래한총식이섬유를첨가한군은세포생존을개선시켰다 ( 도 3d), 또한, 도 3e에나타난바와같이, 베타-아밀로이드만첨가한경우에는세포생존이 60.4% 로감소하였으나, 아라비노자일란, 아라비노스, 자일로스및베타글루칸을첨가한경우에는세포생존이각각 75.5%, 71.1%, 72.1% 및 70% 로세포생존을유의 (p<0.05) 하게개선시켰다 ( 도 3e). 상기결과로벼과식물로부터분리정제된전분및식이섬유는벼과식물조추출물과마찬가지로베타-아밀로이드에의한세포독성을낮추어세포생존능개선효과를나타내는것을알수있으며, 이로부터벼과식물로부터분리정제된전분및식이섬유가베타-아밀로이드의축적에의해발생하는질환인알츠하이머병의치료에도효과를나타낼수있다는것을알수있다. 실험예 3. 하이드록시도파민 (6-hydroxydopamine) 존재하에서조추출물 (HY6228) 의세포생존능개선활성측정 (in vitro) 벼과식물조추출물이파킨슨병을유발할수있는하이드록시도파민을첨가한조건하에서세포의생존에미치는영향을참고문헌 (Guo S et al., Free Radic. Biol. Med., 39(5), pp682-695, 2005) 에서와같은방법을이용하여조사하기위하여하기와같이실험을수행하였으며, 세포생존을개선시키는정도는문헌에기재된 MTT 어세이법 (Hoffman RM, In Cell Biology (Celis JE (Ed.), Academic Press, New York, Vol. 1, pp369-370, 1994) 을변형하여측정하였다. 인간신경아세포종세포주 (human neuroblastoma cell line) 인 SH-SY5Y (ATCC CRL-2266, 미국 ) 를항생제로는페니실린지 (penicillin G sodium, 100 Units/l, Invitrogen, USA) 및스트렙토마이신 (streptomycin sulfate, 100 mg/l, Invitrogen, USA) 과혈청으로는 10 % 우태아혈청 (fetal bovine serum, Invitrogen. USA) 이첨가된 Dulbecco s modified eagle medium (DMEM)/F12 90% 배지 (Invitrogen, 미국 ) 를사용하여 48웰플레이트 (48well-plate) 에서 6 10 4 세포수 /300 μl배지로배양하였다. 세포들을 37 및 5 % CO 2-95% 대기상태에 서배양한이튿날 6-hydroxydopamine (6-OHDA : Sigma-Aldrich Co., 미국 ) 를 250 μm의농도로처리하여 24시간동안배양 (HY6228은 0.25, 0.5, 1 mg / ml의농도로만들어 6-OHDA를첨가하기 30분전에처리하였다 ) 한후, 상기세포들에 MTT 용액을최종농도 1 mg / ml로가하고 2시간동안배양한다음 DMSO로용해시켜리더 (microplate reader, FLUOstar OPTIMA, BMG LABTECH, Germany) 를이용하여 540 nm에서흡광도를측정하여결과를하기도 4에나타내었다. <133> <134> <135> <136> <137> <138> 도 4에나타난바와같이, HY6228을 1 mg / ml로첨가한경우 HY6228을첨가하지않은경우에비해세포생존을유의하게개선시켰다 [p<0.01]. 상기결과로벼과식물조추출물은하이드록시도파민에의한세포독성을낮추어세포생존능개선효과를나타내는것을알수있으며, 이로부터벼과식물조추출물은파킨슨병의치료에도효과를나타낼수있다는것을알수있다. 실험예 4. 경구투여시, 전분및식이섬유의심근경색에대한효과시험 (in vivo) 전분및식이섬유의심근경색에대한치료효과를검증하기위해서문헌 (Haisong J et al., Circulation, 97, pp892-899, 1998) 에기재된실험을변형하여상기참고예 1에서준비한랫트로하기와같이심근경색모델을만들어전분및식이섬유의경구투여시, 그효과를측정하였다. 상기참고예 1의랫트에 10 mg / kg의케타민 (ketamine, 유한, 대한민국 ) 과 5 mg / kg의자이라진 (xylazine, Sigma, 미국 ) 을투여하여마취를유도하고기도에삽관한후전신마취시켰다. 그후, 흉골을절제하여흉부를연다음, 심장을도출시키고 5-0 prolene 봉합실을좌관상동맥 (LAD) 의윗부분을통과시켜서 PE 50을이용하여올가미모양으로만들어혈관을폐색시켜허혈상태를 30분동안유지하고다시죄었던 PE 50 을느슨하게함으로 3시간동안재관류를실시하였다. 심근경색부위의조사는에반스블루다이 (EVANS blue dye, Sigma, 미국 ) 와 TTC (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, Sigma, 미국 ) 염색을통하여일정군의경색부위크기를측정하여전분및식이섬유의효과를다음과같이관찰하였다. 먼저허혈-재관류가끝난후바로다시 PE 50 을죄어서허혈상태와동일한상태로만들어준 - 14 -
후 1% 에반스블루다이용액을 2 ml정도정맥투여하여랫트전체를순환시켜주고그후심장을적출하여우심실및우심방을제거하고 2-3 mm 의두께로자른뒤단면적의사진을찍어영상분석시스템 (Quantity One 4.2, Bio-Rad, 미국 ) 으로다이가염색된곳과염색되지않은곳의면적을측정하여혈액이지나가지않은지역 (Area At Risk, AAR /LV%) 의면적을구하였다. 그후다시그심장조각들을 37 에서 1% TTC 용액으로 15분동안염색시킨후 10% 포르말린용액에고정하여다음날다시단면적을측정하여전체면적에대한조직이죽은흰지역의면적, 즉경색부위의면적 (Infarcted Area, IA/LV%) 을구하였다. 그리고 AAR에대한 IA의비로대조군과실험군을비교하였다. <139> <140> <141> <142> <143> <144> 상기실시예 1의 HY6228과실시예 2의소맥에서분리정제된전분과식이섬유, 식이섬유의대표적인구성성분들의심근경색모델만들기 3일전부터가루로된사료와섞여먹이고심근경색모델을만든후에괴사부위의면적을조사하였다. 이때독성을나타내지않는안전량및효과를나타내는용량인적정투여량결정을위하여, 상기실험예 1의결과를바탕으로가능한최소량을시작점으로잡아단계별로상승시키는방법을이용하였다. 이를위해용량증가는 2배수증가법을채택하였으며, 100 mg / kg로시작할경우 200 mg / kg, 400 mg / kg등으로증가시켰다. 좌관상동맥을묶어허혈을유발하기 3일전에 400 mg / kg /day 의 HY6228과전분을, 10 mg/kg/day의식이섬유와식이섬유의대표적인구성성분들인아라비노자일란, 베타-글루칸, 아라비노스및자일로스를사료 20g와각각섞어자유롭게먹이고, 심근경색을유발시키고손상면적을측정하여 IA(%AAR) 의값을계산하여전분및식이섬유의효과를비교하였다. 상기실험을수행한결과, 시료를투여하지않은랫트 ( 57 마리, 대조군, Control) 는 IA( %AAR ) 가 51.8 % 인데비해소맥조추출물을투여한랫트 ( 9 마리, 실험군, HY6228) 는 42.3 %, 전분을투여한랫트 ( 8 마리, 실험군, SW) 는 40.6 % 에불과하였다. 이는괴사부위의부피가각각 18.3 %, 21.6% 정도 (p<0.05) 감소한것으로써, 전분을경구투여했을경우, 소맥조추출물만큼심근경색에탁월한효과가있음을확인할수있었다 ( 도 5a 참조 ). 또한소맥에서분리정제된식이섬유를투여한랫트 (9마리, 실험군, TDF) 의 IA(% AAR) 가 40.2% 로역시괴사부위의부피가대조군대비 22.4% (p<0.05) 감소한것으로써, 식이섬유를경구투여했을경우도소맥조추출물만큼심근경색에탁월한효과가있음을확인할수있었다 ( 도 5b 참조 ). 또한시료를투여하지않은랫트 ( 29 마리, 대조군, Control) 는 IA( %AAR ) 가 50.6 % 인데비해베타-글루칸 (β - glucan) 을투여한랫트 ( 11 마리, 실험군, b-glu 10 ) 는 43.8 %, 아라비노자일란 (arabinoxylan) 을투여한랫트 ( 6 마리, 실험군, AX 10) 는 42.3 %, 아라비노스 (arabinose) 를투여한랫트 ( 11 마리, 실험군, ara 10) 는 43.4 %, 자일로스 (xylose) 를투여한랫트 ( 6 마리, 실험군, xyl 10) 는 42.1 % 에불과하였다. 이는괴사부위의부피가각각 13.4 %, 16.4%, 14.2%, 16.8% 정도 (p<0.05) 감소한것으로써, 식이섬유의대표적인구성성분들을경구투여했을경우, 소맥조추출물만큼심근경색에탁월한효과가있음을확인할수있었다 ( 도 5c 참조 ) 실험예 5. 경구투여시, 전분및식이섬유의뇌경색에대한효과시험 (in vivo) 전분과식이섬유의뇌경색에대한치료효과를검증하기위하여문헌 (Han HS et al., J. Neurosci., 22, pp3921-3928, 2002) 에기재된실험을변형하여상기참고예 1의랫트로뇌경색모델을만들어하기와같이동물실험을수행하였다. 상기참고예 1의랫트를엔플루란 (enflurane, 중외제약, 대한민국 ) 으로흡입마취시킨후하지동맥에서혈압측정및혈액채취경로를확보하고경부를절개하여경동맥을노출시킨후, 경동맥과외경동맥을결찰하고내경동맥으로 3-0 나일론봉합사를넣어중간대뇌동맥 (middle cerebral artery) 을막아서뇌경색모델을만들었다. 중간대뇌동맥을막아허혈을유발하기 7일전부터수술전 24시간전까지상기실시예 1의 HY6228을, 실시예 3 의전분을 7일동안매일 400 mg / kg (0.5 ml ) 을경구로투여하였으며, 허혈유발후 2 시간동안허혈상태로방치한뒤봉합사를제거하고동물을회복시켰다. 또한실시예 2의총식이섬유를 7일동안매일 50 mg / kg (0.5 ml ) 을경구로투여하였다. 22 시간경과후실험동물을안락사시켜뇌조직을적출하여 TTC 용액에넣어염색한후, 뇌반구에대한손상정도를영상분석시스템으로측정하여하기수학식 1과같은방법으로허혈지수 (ischemic index) 를계산하여약물의효과를비교하였다. <145> <146> 수학식 1 허혈지수 (%) = A/B 100 A: 뇌반구 ( 半球 ) 중손상부위의부피 ( mm 3 ), - 15 -
<147> B: 뇌반구의전체부피 ( mm 3 ). <148> <149> <150> <151> <152> <153> <154> <155> <156> <157> <158> <159> 상기실험을수행한결과, 시료를투여하지않은랫트 (12마리, 대조군, Control) 는허혈지수가 93 % 인데비해, 전분을투여한랫트 (6마리, 실험군, SW) 는 74.5 % 로, 괴사부위의부피가 19.7 % 정도 (p<0.05) 감소한것으로나타나전분도뇌경색모델에서효과가있음을확인할수있었다 ( 도 6 참조 ). 실험예 6. 경구투여시, 소맥에서분리정제된전분및식이섬유의스코폴라민에의해유도된치매에대한효과시험 (in vivo) 전분및식이섬유를아세틸콜린수용체의길항제로작용함으로써기억력을억제하는스코폴라민에의해유도된치매모델 (Lindner MD et al., Psychopharmacol. 188, pp629-640, 2006) 에대한치료효과를검증하기위하여문헌 (Fan et al., Neurosci. Lett. 374, pp222-226, 2005) 에기재된실험을변형하여상기참고예 1의랫트로치매유발모델을만들어하기와같이동물실험을수행하였다. 시료를강제경구투여로총 12일간먹였으며, 시료를먹이기시작한 8일째부터랫트에복강으로매일 0.5 mg / kg의스코폴라민 (scopolamine) 을 5일동안주사하였다. 물미로실험또한시료를먹이기시작한 8일째부터매일시행하여총 5일간시행되었다. 실제기억력상실정도는물-미로검사 (water-maze test) 로확인되었다. 물- 미로검사는플랫폼 ( 지름 10 cm, 높이 25 cm) 이설치된원통의물탱크 ( 지름 180 cm, 높이 50 cm) 와랫트의움직임을기록하는비디오추적장치 (video-tracking system; Ethovision, Noldus, Netherlands) 를사용하여시행하였다. 이때물의온도는 22-23, 물의높이는플랫폼위 2 cm까지로하였다. 실제실험은실험용랫트가플랫폼까지찾아가서플랫폼에서 30초이상머무르면찾아갈때까지걸린시간을탈출잠복기 (escape latenc y) 로하였으며, 이를하루 3회실시하여나온평균값을평균탈출잠복기 (mean escape latency) 로하였다. 이때평균탈출잠복기가 90초를초과하는경우에는 90초로동일한값을취하였고, 5일조사기간동안에랫트한마리당총 15회의실험을실시하였다. 치매유발전, 상기실시예 1의 HY6228과실시예 3의전분을각각 200 mg / kg의용량으로, 또실시예 2의식이섬유를 50 mg / kg의용량으로경구투여하거나 ( 실험군 ) 또는생리식염수 ( 대조군 ) 를투여한다음 8일째 0.5 mg / kg의스코폴라민 (scopolamine) 을 5일동안주사하면서물-미로테스트 (water-maze test) 를실시하였다. 상기실험을수행한결과, 실험군은손상을주지않은랫트 (3마리, 겉보기군, Normal) 에비해플랫폼을찾아가는시간이조금더걸리긴하나시료를경구투여하지않고건망증을유발시킨랫트 (5마리, 대조군, SC ) 에비해전분을경구투여하고건망증을유발시킨랫트 (4마리, 실험군, SC + SW) 는실험기간인 6일간중 4, 5일째에각각플랫폼을찾아가는시간이현저하게감소하였다 (p<0.05) ( 도 7a 참조 ). 또한식이섬유를경구투여하고건망증을유발시킨랫트 (7마리, 실험군, SC + TDF ) 도시료를경구투여하지않고건망증을유발시킨랫드 ( 4 마리, 대조군, SC ) 에비해실험기간인 5일중 4, 5일째에각각플랫폼을찾아가는시간이현저하게감소하였다 (p<0.05) ( 도 7b 참조 ). 이러한결과는전분및식이섬유가기억력의감소를억제하여건망증증상을완화시킬수있다는것을나타낸다. 실험예 7. 경구투여시, 소맥에서분리정제된전분및식이섬유의혈관성치매에대한효과시험 (in vivo) 전분및식이섬유를치매에대한치료효과를검증하기위하여문헌 (Cho KO et al., J. Neurosci. Res., 83, pp285-291, 2006) 에기재된실험을변형하여상기참고예 1의랫트로혈관성치매유발모델을만들어하기와같이동물실험을수행하였다. 상기참고예 1의랫트를엔플루란 (enflurane, 중외제약, 대한민국 ) 으로흡입마취시킨후, 두총경동맥 (common carotid artery) 을수술로노출시켜봉합실로묶는 BCCAO (bilateral common carotid artery occlusion) 방법으로전체뇌에공급되는혈류량을 4주동안감소시켰다. 상기실험예 6에서시행된것과같은물-미로실험은이후 5일간시행되었다. 총경동맥을묶어 4주간방치하였을때묶은 7일후부터 1주일간 HY6228 (200 mg/kg), 전분 (SW) (200 mg/kg), 식이섬유분획 (TDF) (50 mg/kg) 및아라비노자일란을 (50 mg/kg) 먹인경우플랫폼을찾아가는시간 ( 평균탈출잠복기 ; Mean Escape Latency) 을측정하였다. HY6228에대한실험결과미로실험을시행한첫날은평균탈출잠복기가손상만입힌대조군과비슷하였으나 3일후부터는정상적인쥐와비슷하였다 ( 도 8a). 이러한결과, HY6228을먹인쥐들이첫날에는기억력이떨어져적응력이떨어지다가시간이지남에따라재빨 - 16 -
리적응력을키우는것을알수있다. 즉, HY6228이혈관성치매의치료에도효과가있다는것을나타낸다. 또한 HY6228의구성성분인전분 (SW) 과식이섬유 (TDF) 를비교할경우두경우모두평균탈출잠복기가감소하였다 ( 도 8b). 마지막으로, 식이섬유의구성요소중의하나인아라비노자일란을비교할경우평균탈출잠복기가혈관성치매 (vascular dementia) 만유발한경우에비해아라비노자일란을투여한경우에평균탈출잠복기가감소하였다 ( 도 8c). 이러한결과는전분 (SW), 식이섬유 (TDF) 및아라비노자일란 (Arabinoxylan) 모두가혈관성치매의치료에효과가있다는것을나타낸다. <160> <161> <162> <163> <164> <165> 실험예 8. 독성실험상기실시예 2의 SW를 320± 20 g의스프라그다우리계 (Spague-Dawley) 수컷랫트 5마리에게주입하여변화를관찰하였다. 500 mg/kg의 SW를복강내로주사하여 24시간후몸무게를측정하였더니유의할정도의무게변화는없었다. 또한별다른행동양상의변화도관찰되지않았고배를절개해봤을때복수도차지않았다. 또한, 5 g/ kg의 SW를랫트 2마리에경구투여하여 24시간후몸무게를측정했을때에도유의할정도의무게변화는없었으며별다른행동양상의변화도관찰되지않았고배를절개해봤을때복수도차지않았다. 본발명의전분및식이섬유을함유하는약학조성물의제제예를설명하나, 본발명은이를한정하고자함이아닌단지구체적으로설명하고자함이다. 제제예 1. 산제의제조 <166> <167> <168> 실시예 2 의 TDF 유당 탈크 300 mg 100 mg 10 mg <169> <170> 상기의성분들을혼합하고기밀포에충진하여산제를제조한다. 제제예 2. 정제의제조 <171> <172> <173> <174> 실시예 3의 SW 옥수수전분유당스테아린산마그네슘 50 mg 100 mg 100 mg 2 mg <175> <176> 상기의성분들을혼합한후통상의정제의제조방법에따라서타정하여정제를제조한다. 제제예 3. 캅셀제의제조 <177> <178> <179> <180> 실시예 3의 SC 옥수수전분유당스테아린산마그네슘 50 mg 100 mg 100 mg 2 mg <181> <182> 통상의캡슐제제조방법에따라상기의성분을혼합하고젤라틴캡슐에충전하여캡슐제를제조한다. 제제예 4. 주사제의제조 <183> <184> <185> 실시예 3 의 SR 주사용멸균증류수 ph 조절제 50 mg 적량 적량 <186> <187> 통상의주사제의제조방법에따라 1 앰플당 (2 ml ) 상기의성분함량으로제조한다. 제제예 5. 액제의제조 - 17 -
<188> <189> <190> <191> 실시예 2의 TDF 이성화당만니톨정제수 100 mg 10 g 5 g 적량 <192> <193> 통상의액제의제조방법에따라정제수에각각의성분을가하여용해시키고레몬향을적량가한다음상기의성분을혼합한다음정제수를가하여전체를정제수를가하여전체 100ml로조절한후갈색병에충진하여멸균시켜액제를제조한다. 제제예 6. 건강식품의제조 <194> 실시예 3 의 SW 1000 mg <195> 비타민혼합물적량 <196> <197> <198> <199> <200> <201> <202> <203> <204> <205> 비타민 A 아세테이트비타민 E 비타민 B 1 비타민 B 2 비타민 B 6 비타민 B 12 비타민 C 비오틴니코틴산아미드엽산 70 μg 1.0 mg 0.13 mg 0.15 mg 0.5 mg 0.2 μg 10 mg 10 μg 1.7 mg 50 μg <206> <207> 판토텐산칼슘 0.5 mg 무기질혼합물적량 <208> <209> <210> <211> <212> <213> <214> <215> 황산제1철산화아연탄산마그네슘제1인산칼륨제2인산칼슘구연산칼륨탄산칼슘염화마그네슘 1.75 mg 0.82 mg 25.3 mg 15 mg 55 mg 90 mg 100 mg 24.8 mg <216> <217> 상기의비타민및미네랄혼합물의조성비는비교적건강식품에적합한성분을바람직한제제예 6으로혼합조성하였지만, 그배합비를임의로변형실시하여도무방하며, 통상의건강식품제조방법에따라상기의성분을혼합한다음, 과립을제조하고, 통상의방법에따라건강식품조성물제조에사용할수있다. 제제예 7. 건강음료의제조 <218> 실시예 2 의 TDF 1000 mg <219> 구연산 1000 mg - 18 -
<220> <221> 올리고당 매실농축액 100 g 2 g <222> 타우린 1 g <223> 정제수를가하여전체 900 ml <224> <225> 통상의건강음료제조방법에따라상기의성분을혼합한다음, 약 1시간동안 85 에서교반가열한후, 만들어진용액을여과하여멸균된 2l 용기에취득하여밀봉멸균한뒤냉장보관한다음본발명의건강음료조성물제조에사용한다. 상기조성비는비교적기호음료에적합한성분을바람직한실시예로혼합조성하였지만수요계층이나, 수요국가, 사용용도등지역적, 민족적기호도에따라서그배합비를임의로변형실시하여도무방하다. <226> <227> <228> <229> <230> <231> <232> <233> <234> <235> <236> <237> <238> <239> <240> <241> 도면의간단한설명도 1는아라비노자일란 (arabinoxylan) 과베타-글루칸 (β-glucan) 등을포함하는식이섬유 (TDF) 를구성하는당의조성에관한분석실험결과를나타낸도이고, 도 2a은저산소조건하에서배양배지에농도를달리한벼과식물 ( 소맥, 현미및옥수수 ) 의조추출물및상기벼과식물로부터분리정제된전분의첨가에따른 HepG2 세포의생존율개선결과를나타낸도이며, 도 2b는저산소조건하에서배양배지에농도를달리한소맥의조추출물로부터분리정제된총식이섬유의첨가에따른 HepG2 세포의생존율개선결과를나타낸도이고, 도 3a는다양한농도의베타-아밀로이드농도조건하에서소맥으로부터분리정제된전분의첨가에따른 SH- SY5Y 세포의생존율개선을나타낸도이며, 도 3b는다양한농도의베타-아밀로이드농도조건하에서수용성전분의첨가에따른 SH-SY5Y 세포의생존율개선을나타낸도이고, 도 3c는 25 μm의베타-아밀로이드농도조건하에서소맥조추출물 (HY6228) 또는벼과식물로부터분리정제된전분 (SC: 옥수수 ; SR: 쌀 ; SS: 수용성 ; SW: 소맥 ) 의첨가에따른 SH-SY5Y 세포의생존율개선을나타낸도이며, 도 3d는 10 μm의베타-아밀로이드농도조건하에서소맥으로부터분리정제된총식이섬유의첨가에따른 SH- SY5Y 세포의생존율개선을나타낸도이고, 도 3e는 15 μm의베타-아밀로이드농도조건하에서식이섬유를구성하는아리비노자일란과베타-글루칸및아라비노자일란을구성하는아라비노스, 자일로스첨가에따른 SH-SY5Y 세포의생존율개선을나타낸도이며, 도 4는 250 μm의하이드록시도파민농도조건하에서소맥조추출물 (HY6228) 의첨가에따른 SH-SY5Y 세포의생존율개선을나타낸도이고, 도 5a는심근경색동물모델에경구투여시에소맥에서분리정제된전분의뇌경색억제효과를나타낸도이며, 도 5b는심근경색동물모델에경구투여시에소맥에서분리정제된총식이섬유의뇌경색억제효과를나타낸도이고, 도 5c는심근경색동물모델에경구투여시에식이섬유를구성하는아리비노자일란과베타-글루칸및아라비노자일란을구성하는아라비노스, 자일로스의심근경색억제효과를나타낸도이며, 도 6는뇌경색동물모델에경구투여시에소맥에서분리정제된전분의뇌경색억제효과를나타낸도이고, 도 7a는물-미로검사에서건망증유발동물모델에경구투여시에소맥에서분리정제된전분의기억력감퇴억제효과를나타낸도이며, 도 7b는물-미로검사에서건망증유발동물모델에경구투여시에소맥에서분리정제된총식이섬유의기억력감퇴억제효과를나타낸도이고, 도 8a는물-미로검사에서혈관성치매동물모델에경구투여시에소맥조추출물 (HY6228) 의치매억제효과를나타낸도이며, - 19 -
<242> <243> 도 8b는물-미로검사에서혈관성치매동물모델에경구투여시에소맥에서분리정제된총식이섬유 (TDF) 와전분의치매억제효과를나타낸도이고, 도 8c는물-미로검사에서혈관성치매동물모델에경구투여시에아라비노자일란의치매억제효과를나타낸도이다. 도면 도면 1 도면 2a - 20 -
도면 2b 도면 3a - 21 -
도면 3b 도면 3c - 22 -
도면 3d 도면 3e - 23 -
도면 4 도면 5a - 24 -
도면 5b 도면 5c - 25 -
도면 6 도면 7a - 26 -
도면 7b 도면 8a - 27 -
도면 8b 도면 8c - 28 -