J. Exp. Biomed. Sci. 11 (2005) 311 318 Spatio-Temporal Expression Pattern of Grp78, a Putative Hoxc8 Downstream Target Gene, During Murine Embryogenesis Jin Joo Kang, Yunjeong Kwon, Eun Young Lee, Hyoung Woo Park, Hye-Won Yang and Myoung Hee Kim Department of Anatomy, Embryology Lab., Brain Korea 21 Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, Seoul 120-752, Korea Grp78, discovered as one of the putative target genes of Hoxc8, is a highly conserved stress protein and functions as a molecular chaperone in the endoplasmic reticulum (ER). In order to see the stage-specific expression pattern of Grp78 during development, mouse embryos from day 7.5 to 17.5 p.c. were isolated, and RT-PCR as well as in situ hybridization was performed. When RT-PCR was performed using Grp78 specific primers, periodic expression pattern was detected. And also a region-specific expression pattern was detected with a strong expression in the trunk part of day 11.5 p.c. embryo, like that of Hoxc8. When in situ hybridization was performed, Grp78 was revealed to be expressed in the endoderm, somite, neuroepithelium cells of neural tube in early embryos. In the case of late embryos, Grp78 expression was detected in the liver, segmental bronchus within cranial lobe of lung, ossification center within the cartilage primordium of rib and vertebra, submandibular gland, as well as metanephros. These expression patterns are very much similar to those of Hoxc8. Since Hoxc8 has been reported to regulate apoptosis during organogenesis, it might be possible that the apoptotic function could have been conveyed through the expression of Grp78, implying that the Grp78 is one of the Hoxc8 downstream target genes. Key Words: Expression pattern, Embryogenesis, Grp78 서 초기배자에서형태가만들어지기위해서는수많은유전자들이관여하며, 이들유전자들은진화를거치면서도매우잘보존되어있다. 이중에서도초파리에서처음발견된 Hox 유전자는척추동물과무척추동물의초기배발생과정중특정한시기에그리고배자의특정한위치에서발현하여 (Kim and Kessel, 1993; Duboule, 1994; Sharkey et al., 1997) 몸의전 후축을따라형태를형성하는데관여하는 master regulator 유전자로보고되고있다 (Hombria et al., 2003). Hox 유전자가어떤유전자들을조절하여형태형성에관여하게되는지에대해서는자세하게밝혀져있는바가없으나최근 proteomics 기법을이용하여 Hox 유전자중하나인 Hoxc8이 Grp78의발현을조절한다는것이보고되었다 (Kwon et al., 2003). * 논문접수 : 2005년 8월 29일수정재접수 : 2005년 9월 13일 교신저자 : 김명희, ( 우 ) 120-752 서울특별시서대문구신촌동 134, 연세대학교의과대학해부학교실 Tel: 02-2228-1647, Fax: 02-365-0700 e-mail: mhkim1@yumc.yonsei.ac.kr 론 GRP (glucose-regulated protein) 단백질은처음닭의배자 fibroblast를포도당이없는배지에서키웠을때강하게발현되어지는단백질로서보고되었으며 (Lee, 2001), 그후 glycosylation에영향을미치는물질이나세포내의 Ca 2+ level 저해등의조건아래에서 GRP가유도된다고알려졌다. 또한 GRPs는극심하게 glucose가없는상태, 저산소증, 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 에서칼슘이고갈되었을때와같은여러종류의스트레스상태에서전사조절이야기되어진다는사실이 in vitro cell culture 실험에서밝혀졌으며 (Mote et al., 1998; Barnes et al., 2000), 이후 Grp 유전자의 promoter 에다수의 endoplasmic reticulum stress elements (ERSEs) 가존재하고있다는것이보고되었다 (Lee, 2001). 현재약 10여종의 GRPs (Grp78, Grp94, Grp170, Erp72, PDI, Grp58/alias Erp57, calreticulin 등 ) 가보고되었으며, 그중하나인 Grp78은 ER 내부에존재하는 chaperone으로알려져있다. 이것은또 lymphoid 세포에서 immunoglobulin heavy chain과결합하기때문에 immunoglobulin heavy-chain-binding protein(bip) 이라고도불리우며, heat-shock-protein 70 (Hsp70) family에속하는단백질로서 Hsp70과는약 61% 의 homology 를가지고있으나 stress protein family의구성원일뿐그기능은다르다고도보고되고있다. 또 Grp78은대장균의 Dnak - 311 -
와유사한서열및기능을갖고있으므로 DnaK-type molecular chaperone protein이라고도하며 ER 내에서 Ca 2+ 의항상성을조절하므로 ER luminal Ca 2+ storage protein이라고도한다 (Chang et al., 1989; Barnes and Smoak, 2000; Rao et al., 2002). 현재까지보고된 Grp78의기능은 molecular chaperone으로서 ER 내에서새로이합성되는단백질의 folding과 assembly 를도와주며, 서로 aggregation하는것을방지해주는역할을한다고알려져있다. ER로부터운송되어지는 misfolding 및 under-glycosylated 단백질과좀더안정된복합체를만들고, ER 내에서 Ca 2+ 항상성을조절하며또산화적인스트레스에대항하여세포의 apoptotic pathway에관여한다고도보고되고있다 (Tillman et al., 1995; Little et al., 1996; Watson et al., 2003). Hoxc8에의해조절을받는유전자로분석된 Grp78의발생과정동안의발현양상에대해서는생쥐발생과정중초기 2-cell 시기에서부터 blastocyst stage로진행되는동안 Grp78의발현이증가한다는보고외에는잘알려져있지않다. 이외에 whole embryo culture 실험을통해발생 9.5일째의생쥐배자에저혈당스트레스를유발시키면심장 (heart), 신경관 (neural tube), 장내배엽 (gut endoderm), somites, 외배엽 (surface ectoderm) 에서발현한다는보고가있으나정상배자발생과정중체계적인발현패턴에대해서는잘알려져있지않은실정이다 (Barnes and Smoak, 2000; Lee, 2001). 따라서본연구에서는생쥐배자발생과정중 Grp78의시 공간적인발현패턴을 RT-PCR 그리고 whole mount/cold in situ hybridization를통해관찰하고, Hoxc8 발현과의연관성을고찰해보고자한다. 재료및방법 1. 배자준비교배를위해 ICR 생쥐 (Samtako, Osan, Korea) 를이용하였다. 생쥐는저녁에암컷 3~4마리와수컷 1마리를한우리에합사시키고, 다음날오전 10시전에암컷에서질전 (vaginal plug) 이관찰되면, 이때를발생 0.5일로정의하였다. 발생 8.5일부터 17.5일까지의배자준비를위해날짜에맞게임신한암컷을경추탈골시켜 sacrifice 한다음 1 PBS를이용하여배자를적출하였다. 2. RNA 분리적출한배자는액체질소에넣어얼리거나바로 Gunidium Isothiocyanate Technique (GIT) 방법을이용하여 RNA를추출하였다. 조직을 tube에넣고 denaturing 용액 (4 M guanidinium thiocyanate, 25 mm sodium citrate/2h 2 O 0.5% (w/v) sodium lauryl sarcosinate, 0.1 M β-mercaptoethanol) 을배자무게 100 mg에 3 ml씩을첨가시킨후, pestle로잘게파쇄시켰다. 배자를 15 ml 튜브로옮긴후, 2 M NaOAC를 140 µl 넣고잠깐동안섞어준다음 chloroform-isoamylalcohol (49:1) 588 µl 를첨가하고 15초간강하게혼합한후얼음에 15분간방치하였다. 4 3,500 rpm으로 30분간원심분리한후상층액을취해새로운 1.5 ml 용량의 microtube로옮긴후, 상층액에동량의 chloroform-isoamylalcohol (49:1) 을다시혼합하고같은방법으로원심분리한다음상층액을취하였다. 여기에동량의 isopropanol을첨가하여 -70 freezer에서 1시간이상반응시킨다음, 4 12,000 rpm으로 20분간원심분리하여 RNA를침전시켰다. 70% ethanol로세척한후건조시킨다음 DEPC 처리한증류수에 RNA를녹이고, UV-spectrophotometer (Amersham Biosciences, UK) 를이용하여정량하였다. 3. RT-PCR (Revers Transcription-PCR) RT 반응은 2 µg의 RNA를 200 ng의 oligo dt, H 2 O를 14 µl 까지넣고 70 에서 5분간열을준후, 바로얼음에넣어두고 dntp (2.5 mm each) 5 µl, RNase inhibitor (0.5 unit/µl) 0.5 µl, MMLV-RT (moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, 200 unit/µl, Promega) 0.5 µl, MMLV-RT 10 Buffer 5 µl 혼합액을 11 µl씩첨가시켜 37 에서 1시간동안수행하여 1st strand cdna를합성하였다. 이중일부를취하여 PCR 반응 (94 30 sec, 55 30 sec, 72 1 min을 25회반복 ) 을수행하였으며, 이때사용한 primer는다음과같다 : Grp78 (forward, 5'-CTCGAATTCCAAAGATTCAG; reverse, 5'-TACCAAGTGT- AAGGGGACAC) β-actin (forward, 5'-CATGTTTGAGACCTT- CAACACCCC; reverse, 5'-GCCATCTCCTGCTCGAAGTCTAG), Hoxc8 (forward, 5'-CACGTCCAAGACTTCTTCCACCACGGC'; reverse, 5'-CACTTCATCCTTCGATTCTGGAACC). 4. Grp78 subcloning 및 RNA probe 제작 Sense와 antisense RNA probe를제작하기위해 Grp78 PCR product를 pgem T-vector에클론하였다. 그다음제한효소 sphi과 sali을처리하여 Grp78를분리한다음 Jetsorb gel extraction kit (GENOMED, U.S.) 를사용하여 elution하였다. 이것을다시 multicloning site의양끝에각각 T7과 SP6 promoters 가지고있는 pgem-7zf와 pgem-3zf의 sphi과 XhoI 그리고 sphi과 sali자리에각각삽입하여 pgem7-grp78과 pgem3-grp78을얻었다. Antisense와 sense RNA probe를합성하게위해 pgem7- grp78과 pgem3-grp78를제한효소 BamHI로잘라서 linear 로만든다음, T7 RNA polymerase를이용하여 digoxygenine labeled UTP가포함되어있는 nucleotide 혼합액을첨가하고 37 에서 2시간동안 in vitro transcription 반응을수행하였다. - 312 -
합성된 sense 및 antisense RNA probe은 4 M LiCl과 100% EtOH로침전하여정제한다음 UV-spectrophotometer (Amersham Biosciences, UK) 를이용하여정량한다음 whole mount 및 tissue sections의 in situ hybridization에사용하였다. 5. Whole mount in situ hybridization 배자는크기에따라 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS, 4 에서 1~12시간고정시키고 PBT, 25%, 50%, 70% MetOH/ PBT로 5분씩 4 에서씻어준다음, 100% methanol에담가서사용할때까지 -20 에보관하거나바로 in situ hybridization에사용하였다. 먼저배자를 75%, 50%, 25% MetOH/PBT 와 PBT로 rehydration 시킨다음, 6% H 2 O 2 / PBT로 1시간동안 bleach하고다시 10 µg/ml proteinase K/PBT를배자의크기에따라 2~15분간처리하였다. 그다음, 2 mg/ml glycine 을넣어 proteinase K를불활성화시키고 0.2% glutaraldehyde/ 4% paraformaldehyde/pbt를첨가하여재고정한다음 PBT 로씻어주고배자를 prehybridization solution (50% formamide, 5 SSC, ph 4.5, 50 µg/ml yeast trna, 1% SDS, 50 µg/ml heparin) 에넣어 1시간동안 70 에서반응시켰다. 여기에 1 µg/ml digoxygenine-labeled RNA probe를포함하는 hybridization solution을첨가하여 70 에서밤새반응시키고다음날 posthybridization wash 과정으로 solution I (50% formamide, 5 SSC, ph 4.5, 1% SDS) 으로 30분간 70 에서 2번세척하였다. 다시 solution I과 solution II (0.5 M NaCl, 10 mm Tris- HCl, ph 7.5, 0.1% tween 20) 를동량씩혼합하여 10분간 70 에서씻어준다음 solution II만으로 5분씩 3번실온에서세척하였다. 그다음배자를 100 µg/ml RNaseA를포함하고있는 solution II에넣어 37 에서 30분간 2번반복해준후 TBST로다시세척하고, blocking solution (FBS 1 ml, 10% blocking powder 1 ml, Malate Buffer 3 ml) 을첨가하고 90분간 preblocking을진행한다음 anti-digoxygenine antibody (1:1,000) 를첨가하여서실온에서밤새반응시켰다. 다음날, TBST로 1시간씩 5번, NTMT로 30분씩 2번세척하고, 다시 NTMT 로밤새세척하였다. 다음날 4.5 µl/ml NBT와 3.5 µl/ml BCIP 를첨가한 NTMT에배자를옮기고어두운곳에서발색반응을시켰다. 3시간이후부터원하는발색이관찰되면 PBT 로 2~3번씻어주어발색반응을정지시켰다. 6. Cold in situ hybridization 배자는 PBS로한번세척한후 4% paraformaldehyde (PFA)/ PBS로 4 에서하룻밤고정시키고다음날 30% sucrose/pbs, 4 에하루더놓아두었다. 그다음 tissue tek (Miles, Elkhard, IN) 에배자를넣고, tissue freezing medium (TRIANGLE Biomedical Science, Durhm, NC) 으로덮은다음 -70 에저장하였다. 얼어있는배자를 10~12 µm 두께로잘라코팅이되어 있는슬라이드에붙인다음 4% paraformaldehyde/pbs에서 20분간고정시키고, PBS에서 3분씩 3번을씻어주었다. 그리고 10 µg/ml proteinase K/PBS를 4분간처리하고, 4% paraformaldehyde/pbs에서다시 5분간고정시킨다음 PBS로세척하였다. Acetylation (295 ml H 2 O, 4 ml triethanolamine, 0.525 ml HCl, 0.75 ml acetic anhydride) 반응을한다음 PBS로세척하고 500 µl prehybridization solution을각각의배자절편위에떨어뜨린다음슬라이드를 humidified chamber (5 SSC, 50% formamide 용액을적신종이를깔아서준비 ) 에올려놓고 2시간동안실온에방치하였다. 다시여기에 RNA probe 200~400 ng/ml를포함하고있는 hybridization solution을첨가한다음 coverslip을덮고 72 에서밤새반응시켰다. 다음날 coverslip을제거하고, 0.2 SSC (72 ) 에서 3시간그리고다시 0.2 SSC에서 5분간실온에두었다. 그리고 levamisole (240 mg/l) 를포함하고있는 buffer B1 (0.1 M Tris, ph 7.5, 0.15 M NaCl) 에서 5분간 ( 실온 ), blocking solution ( 실온 ) 에서 1시간, 다시 anti-digoxygenine antibody (1:5,000) 를첨가한다음 4 에서하룻밤반응시켰다. 다음날 buffer B1으로 3번세척한다음 levamisole (240 mg/l) 이포함된 buffer B3 (0.1 M Tris, ph 9.5, 0.1 M NaCl, 50 mm MgCl 2 ) 에서 10분간방치한후 buffer B4 (240 mg/l levamisole을포함하고있는 buffer B3, 4.5 µl/ml NBT, 3.5 µl/ml BCIP) 를첨가하고 parafilm으로덮은후어두운곳에서반응시켰다. 발색이관찰되면 PBS로세척하고말린다음 universal mount (Huntsville, AL, USA) 를첨가하고현미경을이용하여관찰하였다. 결과 Grp78이 Hoxc8의 downstream target genes으로추정되었으므로본연구에서는 Hoxc8의위치특이적발현이가장잘보고된 11.5일째되는생쥐배자를이용하여배자를전후축을따라 7부분 (H1, H2, M1, M2, M3, M4, T) 으로절단한다음각부분으로부터총 RNA를분리하고 RT-PCR 기법을이용하여 Grp78과 Hoxc8의발현패턴을분석하였다. 그결과, Grp78은 forelimb을포함하는흉부 M2 부위에서강하게발현하는것이관찰되었다. Hoxc8의경우 M2뿐만아니라 M3 에서도강하게발현하였으며, 이외의다른부위에서도약하긴하나발현이관찰되었다 (Fig. 1). 그다음발생시기에따른 Grp78의발현양상을분석하기위하여낭배형성초기배자인 7.5일배자부터기관형성이거의다끝나는 17.5일까지의배자를각각분리하고이배자로부터총 RNA를분리한다음 RT-PCR 을수행하였다. Fig. 2에서와같이 Grp78은 7.5, 8.5, 10.5, 11.5, 14.5, 그리고 15.5 일째배자에서강한발현이관찰되었으며특이하게도발생시기에따라 periodic한발현양상을관찰되었다. 이에반하 - 313 -
A H2 H1 M1 T M2 M4 M3 B Fig. 2. Temporal expression pattern of Grp78 in mouse embryo 7.5~17.5 day p.c. RT-PCR pattern of Hoxc8 and Grp78 in mouse embryo. β-actin was used for the internal control. The amount of mrna expression was normalized with that of β-actin. Fig. 1. Spatial expression pattern of Grp78 in mouse embryo at day 11.5 p.c. (A) lines indicate the dissected regions at embryo at day 11.5 p.c. (B) RT-PCR pattern of Hoxc8 and Grp78 along the A-P axis; H1 (head 1), H2, M1 (middle1), M2, M3, M4, and T (tail). β-actin was used for the internal control. 여 Hoxc8은 8.5일배자에서부터 17.5일까지거의모든배자에서발현되는것을관찰할수있었다. 배자발달시기에따라기관의분화정도와배자의발달상태즉형태가달라지므로 Grp78이특정발달시기에있는배자의어느위치그리고어느기관에서발현하는지를형태학적으로분석하기위해유전자의발현패턴을 in situ hybridization 방법을통해분석하였다. 낭배형성초기 7.0일째배자에서는내배엽에서관찰되었으며 (Fig. 3A-D), 8.0일과 9.0일째배자의경우신경관 (neural tube) 의신경상피세포 (neuroepithelium cell) 에서발현하였다 (Fig. 3E-I, L). 9.0일째배자에서는체절 (somite) 에서도 Grp78이강하게발현되었다 (Fig. 3I-K). 기관형성이활발한중기배자인 10.5일과 11.5 일배자에서는공통적으로간으로될 hepatic primordium과신경관의신경상피세포에서발현되는것을관찰할수있었다 (Fig. 3M-T). 특히, 11.5일배자의 whole mount in situ hybridization 방법으로분석한경우에도간에서매우강하게발현 되는것을확인할수있었다 (Fig. 3q). 후기 14.5일및 15.5 일배자에서는공통적으로늑골 (rib) 이되는연골부위 (cartilage primordium) 와폐의 cranial lobe 부분의통로주위에서발현되는것을관찰할수있었다 (Fig. 3U-Z, 3a, b). 15.5일배자에서는특히턱밑샘 (submandibular gland) 과신장이되는후신 (metanephros) 에서 Grp78이강하게발현하는것이관찰되었다 (Fig. 3c, d). 고찰 Hox 유전자는발생과정중시 공간특이적으로발현하여개체의형태를만드는데관여하는전사조절인자로서다수의 downstream target genes의발현을조절하는 master control gene으로알려져있다 (Jave-Suarez et al., 2002; Villaescusa et al., 2004; Kwon et al., 2005). 그러나현재까지직접적으로 Hox 단백질의조절을받는 downstream target gene에대해서는 Hoxa7이 keratinocyte transglutaminase type 1을조절하여 keratinocyte의분화에관여한다는것 (La Celle et al., 2001) 과 Hoxa5가 progesterone receptor gene의활성을조절한다는것, 또 Hoxc8이 osteopontin gene을억제하는데관여한다는연구 (Raman et al., 2000) 등외에는보고된것이그리많지않은실정이다. 본연구에서는프로테옴분석을통해 Hoxc8의 downstream target genes (Kwon et al., 2003) 중의하나로분석된 Grp78이생쥐의배자발생과정중어느시기에그리고어느위치에 - 314 -
A B C D D G E F G endoderm H Future brain Future brain H L I J K L Somite Future brain Somite K M O N P Hepatic primordium Neuroepithelium cells O N.T. P R Q S T Neuroepithelium cells Liver S q T U V Cartilage primordium of rib Z Cartilage primordium of rib W Lung X a Lung b Cartilage primordium of vertebra X V Liver W Y Cartilage primordium of rib c b a Z Liver d c Submandibular gland d Metanephros Fig. 3. Expression pattern of Grp78 during murine embryonic development. Cold in situ hybridization was performed. (A, C, D) sagittal (B) frontal section of day 7.0 p.c. embryo; (E, F) frontal section of day 8.0 p.c. embryo; (G, H) neuroepithelium cells; (I, K, L) sagittal and (J) cross section of day 9.0 p.c. embryo; (M, N) sagittal section of day 10.5 p.c. (Q, R) sagittal section of day 11.5 p.c., inset in (Q) whole mount in situ hybridization; (O, S) hepatic primodium, (P, T) neuroepithelium cells of neural tube; (U) sagittal section of day 14.5 p.c. (paraffin section), (Y) sagittal section of day 15.5 p.c.. (V, Z) cartilage primordium of rib, (W, a) lung- segmental bronchus within cranial lobe, (X) cartilage primordium of vertebra, (b) cartilage primordium of ventral part of shaft, (c) submandibular gland and (d) metanephros. - 315 -
서발현하는지를분석하고 Hoxc8 발현패턴과의연관성을고찰하고자하였다. Hoxc8의위치특이적발현이가장잘분석된 11.5일째되는생쥐배자를이용하여전후축을따라 Grp78과 Hoxc8의발현을비교하였을때 Grp78은 forelimb 을포함하는흉부 M2 부위에서강하게발현되었으며 Hoxc8 의경우는 M2뿐만아니라 M3에서도강하게발현하였다 (Fig. 1). 또, 발생시기에따라서는특이하게도 periodic하게 Grp78의발현즉, 8.5, 10.5, 11.5, 14.5, 그리고 15.5일째배자에서발현이관찰되었다 (Fig. 2). 이에반해 Hoxc8의경우 8.5일배자부터모든단계의배자에서발현하였다. 흥미있는점은 7.5일째배자만제외하고 Hoxc8이과발현되는시기와 Grp78의발현이관찰되는배자의 stage가일치하는데이것은아마도 Grp78의발현을위해서는 Hoxc8이적정량발현하여야만하는것으로유추된다. 이런현상은 Fig. 1에서도관찰되는데, M2보다적게 Hoxc8이발현한 M3에서는 Grp78의발현이관찰되지않았으며이는 Grp78의발현을위해 Hoxc- 8의양이매우 critical 할수도있을것으로생각된다. 그러나 7.5일째배자의경우 Hoxc8의발현없이도높은발현이관찰되는데, 이는아마도 Grp78의발현을위한또다른기작이있을것으로생각된다. 배자의 implantation과 early development는 ER stress를유발하는것으로알려져있는데, Grp- 78의 upstream regulatory region에여러개의 ER stress regulatory element를포함하고있으므로 Hoxc8의발현과는무관한 mechanism에의해유도되어졌을것으로생각된다. 발생과정중신경관 (neural tube) 에서는 Grp78의발현이 8.5일과 9.5일부터 neuroepithelium에서관찰되었으며이는 8.5일에서는신경외배엽 (neuroectoderm) 에서그리고 9.5 일이후부터는신경관에서발현하는 Hoxc8의경우 (Kwon et al., 2005) 와일치하였다. 특히 Hoxc8은강하게발현되는 C(cervical) 5 -T(thoracic) 1 의 neuronal segment는 forelimb로뻗어나가는운동신경 (motor neuron) 이존재하는것으로알려져있는데 (Tiret et al., 1998) 흥미롭게도 Grp78 또한이부위에서강하게발현되었다. Hoxc8 유전자가적중된생쥐의경우, 운동신경에서 apoptosis가증가하였으며이는 Hoxc8이운동신경의 survival에관여할것이라고생각되며 (Tiret et al., 1998), Grp78 또한 C 5 -T 1 에서의강한발현을고려해볼때, Hoxc8이 Grp78를조절하여운동신경의 apoptosis를억제하고, cell survival에도움을주어척수 (spinal cord) 형성에중요한역할을수행할것으로유추된다. 척추와늑골은발생초기체절즉 somite라고불리는 paraxial mesoderm으로부터분화하는데신경관과척색 (notochord) 에접하여위치하는세포들이척추 (vertebra) 그리고 intervertebral disc로분화하고발생후기세포들이더이동하여늑골 (rib) 로분화한다 (Dubrulle and Pourquie, 2004). Grp78 의경우발생 9.5일에는체절 (somite) 에서그리고 14.5일이 후부터는척추와늑골이될연골부분 (cartilage primordium) 에서발현이관찰되었는데 (Fig. 3), 후에늑골이될연골부위에 Hoxc8을과발현시키면 proliferating chondrocytes가축적되고 maturation이억제된다는보고 (Yueh et al., 1998) 로미루어볼때, 아마도 Hoxc8이 cell survival과 cancer cell에서 proliferation에관여한다고알려진 (Lee, 2001) Grp78의발현을유도하여 proliferating chondrocytes의축적에영향을주었을것으로생각된다. 신장은 caudal intermediate mesoderm으로부터분화하는데 Grp78이 15.5일째배자에서후신 (metanephros) 의 branch가형성되는부분에서발현하였다 (Fig. 3d). 흰쥐의 metanephric kidney 발생시 mesenchymal-epithelial conversion에 Grp78이관여한다 (Plisov et al., 2000) 고알려져있으며또 TGF-β family인 BMP4, BMP7, TGF-β2 등이발현되어신장의발생을조절하는것으로알려져있다 (Plisov et al., 2000). Hoxc8 역시발생과정중 mesonephric과 metanephric kidney에서발현되며 BMP4 signalling에작용하여세포의분화와증식을조절한다는연구결과로 (Shi et al., 1999) 미루어볼때 Hoxc8 과 Grp78이 BMP4 신호를받아신장의발생을조절할수도있음을시사한다. 한편신장의형태형성을위해서는 extracellular matrix molecule 즉 matrix metalloproteinase, matrix molecules, growth factor, growth factor receptor들이요구되는데이들은모두 secretory 혹은막단백질들로서 ER 내에서합성되며이와함께 ER protein bioassembly activity를갖고있는 Grp78같은 chaperone 단백질이많이요구될것으로생각된다. 흥미롭게도 13.5일째흰쥐배자의 ureteric bud (UB) branch에서 metalloprotease와 growth factor receptor 의발현이증가되었으며, 이와함께 Grp78도발현이증가되었다고보고 (Meyer et al., 2004) 뿐만아니라 Hoxc8의경우도 mouse 배자에서 UB branch 근처의 mesenchymal cell에서발현된다는보고로미루어 (Patterson and Potter., 2004) 신장형성에있어서 Hoxc8에의한 Grp78의발현이신장형태형성에기여하였을것으로유추된다. 폐의경우, Grp78은 cranial lobe의가지에서발현되는것이관찰되었다 (Fig. 3U, Y, a). 폐또한신장과같이많은가지를가진기관으로서형태형성에있어 FGF나 BMP4와같은 secretory protein이중요한역할을한다고알려져있다 (Wang et al., 2005). 따라서폐에서도 Grp78이 ER 내에서단백질의합성, folding, assembly 등이용이하도록도와줄것으로생각된다. 또한, 폐가발생하는과정중여러단계에서 apoptosis 가일어난다고알려져있는데태아에서는 epithelium이나 mesenchyma에서상대적으로적게일어난다고알려져있다 (Wang et al., 2005). 사람의경우성인의폐와는달리태아의폐에서 Hoxc8이발현하는데 (Golpon et al., 2001), 태아의폐에서 apoptosis 가적게일어나는것은아마도 Grp78이 Hoxc8-316 -
의조절을받아 anti-apoptotic pathway에관여하여궁극적으로폐의형태를구축하는데관여하였을것으로생각된다. 간은다양한종류의분비단백질과막단백질들이만들어지는장기로 (Little et al., 1996) chaperone 단백질들이많이필요할것으로생각되며, 따라서 Grp78의발현이증가되었다고생각되어진다. 그러나현재까지 Hoxc8이간에서발현된다는보고는없는것으로보아간에서 Grp78의발현을위한또다른기작이있을것으로유추된다. 한편턱밑샘 (submandibular gland) 에서는중심에있던세포들이하나의층이될때까지 apoptosis가일어난다고알려져있다. 그리고이때 p53/caspase3-mediated apoptosis는 terminal bud formation에그리고 caspase8/caspase3-mediated apoptosis는 ductal lumen formation에관여한다고보고되어있지만 apoptotic stop signal에대해서는알려진것이없다 (Jaskoll et al., 2001). Grp78은 caspase activity를억제하여 apoptotic signal를저해한다고알려져있으므로 (Rao et al., 2002) 턱밑샘형성시 apoptotic stop signal에 Grp78이관여할수도있을것으로생각된다. 이상의결과로미루어보아 Grp78이초기발생동안신경관과체절에서발현되고, organogenesis 과정중후신, 폐, 척추와늑골이될연골부분등에서발현하였다. 이런발현패턴은 Hoxc8의발현양상과유사한것으로 Grp78이 Hoxc8 target genes 중의하나일가능성이높은것으로유추되며발생과정중 Hox 유전자의조절을받아세포의증식과 apoptosis 등의기작을유도하여배자의형태를형성하는데관여할것으로사료된다. 감사의글본연구는 2004년도학술진흥재단의기초과학연구지원사업연구비 (KRF-2004-015-E00012) 의지원에의해이루어졌으며강진주, 이은영학생은 BK21 장학금수혜자로이에감사드립니다. REFERENCES Barnes JA, Smoak IW. Glucose-regulated protein 78 (GRP78) is elevated in embryonic mouse heart and induced following hypoglycemic stress. Anat Embryol. 2000. 202: 67-74. Chang SC, Erwin AE, Lee AS. Glucose-regulated protein (GRP94 and GRP78) genes share common regulatory domains and are coordinately regulated by common trans-acting factors. Mol Cell Biol. 1989. 9: 2153-2162. Duboule D. Guidebook to the Homeobox genes. Oxford University Press Inc., New York, 1994. Dubrulle J, Pourquie O. Coupling segmentation to axis formation. Development 2004. 131: 5783-5793. Golpon HA, Geraci MW, Moore MD, Miller HL, Miller GJ, Tuder RM, et al. HOX genes in human lung: altered expression in primary pulmonary hypertension and emphysema. Am J Pathol. 2001. 158: 955-966. Hombria JC, Lovegrove B. Beyond Homeosis-Hox function in morphogenesis and organogenesis. Differentiation 2003. 71: 461-476. Jaskoll T, Chen H, Min Zhou Y, Wu D, Melnick M. Developmental expression of survivin during embryonic submandibular salivary gland development. BMC Dev Biol. 2001. 3: 1-5. Jave-Suarez LF, Winter H, Langbein L, Rogers MA, Schweizer J. HOXC13 is involved in the regulation of human hair keratin gene expression. J Biol Chem. 2002. 277: 3718-3726. Kim MH, Kessel M. Homeobox genes as regulators of vertebrate development. AgBiotech News Info. 1993. 5: 301-308. Kwon Y, Ko JH, Kim B, Kim MH. Analysis plausible downstream target genes of Hoxc8 in F9 teratocarcinoma cells. Mol Biol Rep. 2003. 30: 141-148. Kwon Y, Shin J, Park HW, Kim MH. Dynamic expression pattern of Hoxc8 during mouse early embryogenesis. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 2005. 283: 187-192. La Celle PT, Polakowska RR. Human Homeobox HOXA7 Regulates Keratinocyte Transglutaminase Type 1 and inhibits Differentiation. J Biol Chem. 2001. 276: 32844-32853. Lee AS. The glucose-regulated proteins: stress induction and clinical applications. Trends Biochem Sci. 2001. 26: 504-510. Little E, Tocco G, Baudry M, Lee AS, Schreiber SS. Induction of glucose-regulated protein (glucose-regulated protein 78/BiP and glucose-regulated protein 94) and heat shock protein 70 transcripts in the immature rat brain following status epilepticus. Neuroscience 1996. 75: 209-219. Meyer TN, Schwesinger C, Bush KT, Stuart RO, Rose DW, Shah MM, Vaughn DA, Steer DL, Nigam SK. Spatiotemporal regulation of morphogenetic molecules during in vitro branching of the isolated ureteric bud: toward a model of branching through budding in the developing kidney. Dev Biol. 2004. 275: 44-67. Mote PL, Tillman JB, Spindler SR. Glucose regulation of GRP78 gene expression. Mech Ageing Dev. 1998. 104: 149-158. Patterson LT, Potter SS. Atlas of Hox gene expression in the developing kidney. Dev Dyn. 2004. 229: 771-779. Plisov SY, Ivanov SV, Yoshino K, Dove LF, Plisova TM, Higinbotham KG, Karavanova I, Lerman M, Perantoni AO. - 317 -
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