Ann Clin Microbiol Vol. 19, No. 1, March, 2016 http://dx.doi.org/10.5145/acm.2016.19.1.1 pissn 2288-0585 eissn 2288-6850 Microbial Contamination and Evaluation of Inoculum Volume in Umbilical Cord Blood Culture Da Hae Shim, Hee Jung Kim, Hye Kyung Hong Biomedical Research Institute, MEDIPOST Co., Ltd., Seongnam, Korea Background: Microbial screening tests of umbilical cord blood (UCB) are essential for stem cell transplantation. We analyzed the microbial contamination rate and distribution of isolated microorganisms over 10 years of samples from the MEDIPOST Cord Blood Bank. In addition, we studied the influence of inoculum volume microorganism culture and compared the yield and speed of microorganism detection. Methods: Microbial screening tests were performed using a manual method, which includes using an inoculum of 2 ml of plasma, a byproduct of UCB processing from pediatric culture bottles. When positive blood culture was detected, each set was once again inoculated with 2 ml and 4 ml of plasma. Results: From 2004 to 2013, a total of 133,610 UCB units were screened, of which 1,311 (0.9%) tested positive for contamination. The most frequently identified microorganism was Escherichia coli (34.6%), followed by Bacillus spp. (12.8%), Enterococcus faecalis (5.3%) and Klebsiella pneumoniae (4.4%). The total yield rate increased by 0.2% over this time period, although the yield rate of Bacillus spp. increased by 8.3%. Conclusion: The results of this study could be used in many ways with both domestic and international data regarding cord blood contamination. Also, other microbiology laboratories using culture conditions similar to ours could refer this study when preparing guidelines. Finally, by detecting low levels of bacteria, we have contributed to cord blood safety. (Ann Clin Microbiol 2016;19:1-6) Key Words: Bacillus, Cord blood, Inoculum volume, Microbial contamination, Safety INTRODUCTION 1988년 Fanconi 빈혈환자에게세계최초성공적인제대혈조혈모세포이식이후, 제대혈은난치성혈액질환및유전성질환치료의중요한자원으로활용되어왔다 [1]. 조혈모세포이식을위한제대혈의효율적인관리를위하여국외 AABB의가이드라인에서는미생물 surveillance를권고하고있으며 [2], 2005년보건복지부에서제대혈에관한제반업무에대한표준업무지침을발표, 2011년제대혈관리및연구에관한법률을시행하였다 [3]. 법률에의하면제대혈은행은보건복지부령으로정하는바에따라제대혈및제대혈제제의적격여부를검사하여야한다고명시되어있고, 제대혈을보관하기위한적격검사로는제대혈유핵세포수및세포생존도검사, 세균배양검사및감염질환검사등이있다 [4]. 제대혈은행에서의세균배양검사는임상적인진단을위한동정보다는채취및배양시오염된균을검출하는데의의가있 다. 제대혈의오염은채취시소독의불충분으로인한오염, 분만방법의차이에따른소화기계및비뇨기계정상균총의오염및배양시환경균에의한오염이있을수있다 [3,5]. 세균배양성적을좌우하는인자에는총혈액량, 혈액대배지비율, 분리균주에따른배지및배양조건, 항균제사용여부, 세균배양검사를실시하는기관의특성에따른분리균주의양상 [6] 등이있다. 외국의한연구에서병당접종량이증가할수록양성률은증가하므로 [6] 접종량을증가시켜기존접종량과의배양성적및배양기간을비교평가하고여러배양조건을고려하여혈액배양지침을재정비하고자하였다. 또한접종량의증량이기존접종량의세균배양에미치는영향에대하여알아보았다. 더불어 10년간의제대혈은행에서의오염률을알아보고, 분리되는균주의양상을분석하였다. Received 27 January, 2015, Revised 15 December, 2015, Accepted 17 February, 2016 Correspondence: Hee Jung Kim, Hye Kyung Hong, Biomedical Research Institute, MEDIPOST Co., Ltd., 21, Daewangpangyo-ro, 644beon-gil, Bundang-gu, Seongnam 13494, Korea. (Tel) 82-2-3465-6696, (Fax) 82-2-587-6869, (E-mail) simma88@medi-post.co.kr c The Korean Society of Clinical Microbiology. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 1
2 Ann Clin Microbiol 2016;19(1):1-6 MATERIALS AND METHODS 1. 단일기관에서의제대혈미생물오염에관한후향적분석 2004년부터 2013년까지메디포스트제대혈은행에입고된제대혈중세균배양검사가시행된 133,610건에대하여후향적분석을하였다. 배양검사는제대혈농축과정의부산물인혈장 [2] 을가지고시행하였다. 수기용소아용혈액배양병 (Hanil komed, Seongnam, Korea) 을사용하였으며, 혈장을 1쌍의산소성 (20 ml, Trypticase Soy broth, Hanil komed) 및통성무산소성소아배양병 (20 ml, Thioglycollate broth, Hanil komed) 에제조사의권장량에따라각 2 ml [7,8] 씩접종하였다. 접종한소아배양병은 37 o C Low temperature incubator에서 7일간배양하였다. 가스생성, 세균덩어리의생김, 혈장의응고, 혼탁등매일균의생성여부를육안적으로확인하였고, 검사의정확도를위하여실험기간동안 1명의검사자가일정시간에관찰하였다. 배양병에서균증식의유무를확인한후 7일동안증식이없으면 Chocolate Agar에계대배양한다음 37 o C CO 2 Incubator에서 48시간배양하여음성으로판독하였다. 7일배양이전육안적으로확인하여배양병에증식이있을경우 Chocolate agar, BAP (Blood Agar Plate), MacConkey agar에계대배양한다음 37 o C CO 2 Incubator에 48시간배양하였으며, 집락이형성되면 Vitek 2 system (biomériux, Marcy l Etoile, France) 을이용하여동정하였다. 2. 혈액배양검사접종량증량실험접종혈액량증량에따른세균배양평가를위하여 2013년 1 월부터 2013년 7월 8일까지접수되어세균배양검사가시행된 8,127건을대상으로실험을진행하였다. 실험은 7일배양이전에배양병에서균증식을보이는경우 4 o C 냉장실에보관되어있던혈장을채취하여 2쌍의소아배양병 ( 산소성, 무산소성 ) 에각 2 ml, 4 ml씩접종하였다. 접종한소아배양병은 37 o C Low temperature incubator에서 7일간배양하고, 7일이전에육안으로확인하여균의증식이있는경우두쌍의소아배양병 ( 산소성, 무산소성 ) 에서각각의배양기간을기록하고, 계대배양하여배지를관찰, Vitek 2 system (biomériux) 을이용하여동정하였다. 3. 접종량증량전후의미생물배양평가를위한후향적분석접종량증량전후의미생물배양평가를위하여 2012년 1월부터 12월까지접종량증량전 (2 ml 접종 ) 15,639건과 2013년 8월부터 2014년 7월까지접종량증량후 (4 ml 접종 ) 14,162 건에대하여후향적분석을하였다. 미생물배양방법은방법 1. 에설명된방법과동일하다. RESULTS 1. 단일기관에서의제대혈미생물오염에관한후향적분석 2004 년부터 2013 년까지후향적분석을한총 133,610 건에서 Table 1. Microorganism isolated from blood culture positive umbilical cord blood units Potential contaminant source Frequency (%) Skin flora 4.71 Coagulase negative staphylococci 1.62 Corynebacterium spp. 1.4 Staphylococcus aureus 0.52 Staphlyococcus spp. 1.03 Propionibactetium acnes 0.07 Micrococcus luteus 0.07 Intestinal flora 59.69 Escherichia coli 34.64 Citrobacter spp. 1.77 Enterobacter spp. 1.18 Enterococcus faecalis 5.31 Enterococcus faecium 2.87 Enterococcus spp. 2.28 Klebsiella pneumoniae 4.42 Klebsiella oxytoca 0.59 Lactobacillus spp. 2.21 Streptococcus agalactiae 2.21 Viridans streptococcus group 0.37 Lactococcus spp. 0.59 Mogarnella morganii 0.07 Pediococcus pentosaceus 0.15 Proteus mirabilis 0.15 Proteus vulgaris 0.07 Serratia marcescens 0.52 Candida albicans 0.29 Environmental contaminants 31.38 Bacillus spp. 12.83 Leuconostoc spp. 0.59 Burkholderia cepacia 3.17 Achromobacter spp. 3.61 Acaligenes spp. 2.8 Stenotrophomonas maltophilia 1.69 Pseudomonas spp. 1.25 Acinetobacter spp. 1.39 Chryseobacterium spp. 0.59 Streptococcus spp. 1.92 Kocuria rosea 0.37 Sphingomonas paucimobilis 0.29 Flavobacterium spp. 0.29 Morganella morganii 0.22 Aeromonas hydrophilia 0.15 Ochrobactrum anthropi 0.15 Elizabethkingia meningoseptica 0.07 Unidentified organism 2.80
Da Hae Shim, et al. : Microbial Contamination and Evaluation of Inoculum Volume in Umbilical Cord Blood Culture 3 미생물오염건수는 1,311건으로미생물오염률은 0.98% 였다. 정확하게동정이되지않은 38건을제외하고총 88종의균이동정되었으며, 총 46개의 unit에서두개의균주가분리되어균주의총개수는 1,357개였다. Escherichia coli가 470개 (34.64%) 로가장많았고, Bacillus spp. 174개 (12.83%), Enterococcus faecalis 72개 (5.31%), Klebsiella pneumoniae 60개 (4.42%) 순으로많았다. 정확히동정이되지않은 38개의균이 2.8% 를차지했고, 동정된균은일반적인상재부위에따라피부군에 64개 (4.71%) 비뇨생식기및소화기군에 818개 (59.69%), 환경군에 437개 (31.38%) 를차지했다 (Table 1). 이분포의연도별변화를보면비뇨생식기및소화기군은 2007년이후로점차감소하고, 2010년부터는환경균의검출이증가하는추세를보였다 (Fig. 1). 연도별주요검출상위 3개균의변화를분석한결과 2004년 부터 2012년까지비뇨생식기및소화기군중 E. coli가가장많이검출되었고, 2010년부터는 Bacillus spp. 의오염률이증가하여 2013년도에는 Bacillus spp. (65건) 가 E. coli (37건) 보다 28 건많이검출되었다. 2. 혈액배양검사접종량증량실험접종량에따른배양성적과배양기간단축실험총 8,127건에서총 47개의균이검출되었고, 오염건수는총 46건으로 1건에서 2개의균이중복되어검출되었다. Bacillus spp. 가 35개로 74.5% 를차지하여가장많았고, E. coli와 Burkholderia cepacia 가각 2개로 4.3% 씩차지하였다. Corynebacterium spp., Achromobacter xylosoxidans, E. facalis, K. pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococcus mitis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus thoraltensis가각각 1개씩검출되었다 (Table 2). 3. 접종량증량전후의미생물배양비교평가를위한후향적분석 Fig. 1. Proportion of origin of contaminated microorganism according to 10 years. Abbreviations: GI, gastrointestinal; EN, environment; Un, unidentified. 증량전후의미생물배양평가를위한후향적분석에서접종량증량전 (2 ml 접종 ) 총 15,639 건중 118건이, 접종량증량후 (4 ml) 총 14,162 건중 132건이검출되어오염률은각 0.74%, 0.93% 였다. 그중 Bacillus spp. 는접종량증량전 (2 ml) 118건중 34건이, 증량후 (4 ml) 132건중 49건이검출되어전체검출된미생물중각 28.8%, 37.1% 를차지하였다. 병당접종혈액량의증량으로전체세균배양성적은증량후 0.94% 로증량전 (0.74%) 에비하여 0.2% 증가하였고, Bacillus spp. 의배양성적은증량후 37.1% 로증량전 (28.8%) 에비해 8.3% 증가하였다. 이로보아접종혈액량의증량은전체배양보다 Baciillus spp. 의배양에큰영향을미쳤다. 또한전체배양에서 4일이내로검출된균이증량전오염률 (88.14%) 에비하여 Table 2. Comparison of speed of detection of bacteria from cord blood culture bottles inoculated with 2 and 4 ml of blood Microorganism Speed of detection 4 ml bottle rather than 2 ml bottle (N) Same day 1 day earlier 2 day earlier 3 day earlier 2 ml bottle only (N) 4 ml bottle only (N) Total (N) Escherichia coli 2 2 Bacillus spp. 12 4 1 5 13 (1)* 35 Burkholderia cepacia spp. 2 2 Corynebacterium spp. 1 1 Achromobacter xylosoxidans 1 1 Enterococcus faecalis 1 1 Klebsiella pneumoniae 1 1 Stenotrophomonas maltophilia 1 1 Streptococcus mitis 1 1 Streptococcus pneumoniae. 1 1 Streptococcus thoraltensis 1 (1)* 1 Total (N) 22 4 1 1 5 13 47 *Bacillus spp. and Streptococcus thoraltensis duplicate detection.
4 Ann Clin Microbiol 2016;19(1):1-6 Table 3. Speed of detection of bacteria and Bacillus spp. in accordance with increased inoculum volume before and after Incubation time 2 ml bottle (N/%) Total bacteria 4 ml bottle (N/%) 2 ml bottle (N/%) Bacillus spp. 4 ml bottle (N/%) 1 day 66 (55.93) 69 (52.27) 3 (8.82) 2 day 14 (11.86) 17 (12.88) 11 (32.35) 12 (24.49) 3 day 15 (12.71) 29 (21.97) 12 (35.29) 26 (53.06) 4 day 9 (7.63) 9 (6.82) 3 (8.82) 8 (16.33) 5 day 5 (4.24) 2 (1.52) 1 (2.94) 1 (2.04) 6 day 6 (5.08) 1 (0.76) 3 (8.82) 7 day 3 (2.54) 5 (3.79) 1 (2.94) 2 (4.05) Total (N) 118 132 34 49 접종량증량후에는 93.94% 로 5.8% 증가하였으나 Bacillus spp. 는 4일이내로검출된균이접종량증량전오염률 (85.29%) 에비하여증량후에는 93.88% 로 8.59% 증가하였다 (Table 3). 그러므로접종량증량에따른배양기간단축효과는전체배양보다는 Bacillus spp. 의배양에서두드러졌다. DISCUSSION 먼저보고된국외연구에따르면미생물오염률은기관에따라 0-48% 까지다양하게보고되고있다. Sydney cord blood bank (SCBB) 의오염률은 5.4% [2], 국내서울특별시제대혈은행의오염률은 3.19% [3] 임을고려할때, 본연구의미생물오염률은 0.98% 로현저히낮았으며, 연도및검사시행건수와는유의한관계를보이지않았다. SCBB와서울특별시제대혈은행의검출균의분포를비교해볼때메디포스트제대혈은행은피부군이 4.71%, 소화기군및비뇨기군이 59.69%, 환경군이 31.38% 이고, SCBB는피부군이 38.4% 로가장높은비율을차지하고, 소화기군이 33.9%, 환경군이 6.5%, 비뇨기군이 1.8% 를차지하였다. 서울특별시제대혈은행은소화기군및비뇨기군이 55.8% 로가장높은비율을차지했으며, 피부군이 11.0%, 환경군이 5.5% 를차지하였다 [2,3]. 본제대혈은행에서는 Bacillus spp. 로동정한균을서울특별시제대혈은행에서동정되지않은 Gram positive bacilli로동정한것으로유추해본다면국내제대혈은행은소화기군및비뇨기군이가장많고, 환경군, 피부군순으로검출균의분포가비슷한양상을가졌으나 SCBB는피부군이가장많은비율을차지하는것으로보아검출군의분포는국내외가다름을알수있었다. 위의검출분포에서국내제대혈은행은피부군이 11.0% ( 서울특별시제대혈은행 ), 4.71% ( 메디포스트제대혈은행 ) 로낮은비율을차지하는데비해국외제대혈은행은피부군이차지하 는비율이 38.4% 로국내와는차이를보였다 [2,3]. 피부군중 coagulase negative Staphylococcus spp. 와 Propionibacterium spp. 는조혈모세포이식에서꾸준히관찰되는균으로채취혹은가공과정에서오염되었을것이라고추측한다 [5]. 본제대혈은행에서의 coagulase negative Staphylococcus spp. 와 Propionibacterium spp. 의비율은각 1.62%, 0.07% 로매우낮으므로채취와가공중작업자에의한오염은적은것으로볼수있다. 또한가지배양방법차이의측면에서혈액배양의방법을살펴보면, SCBB와서울특별시제대혈은행은자동혈액배양기를사용하였다. 본제대혈은행은수기법으로실시하여검출률에차이가있을것이라생각하였으나수기법과자동화장비를비교한국내논문에서수기법이자동화방법에비해많은시간과노력이드나두방법간총균주의검출률에유의한차이는없었다 [9]. 혈액배양의성적을좌우하는주요인자에는총혈액량, 혈액대배지비율, 분리균주에따른배지및배양조건을들수있다. 이외에세균배양검사가시행되는기관특성에따른분리균주의양상도혈액배양에영향을미치는인자이다. 특히총혈액량은접종되는총균수를, 혈액대배지비율은항균농도를좌우할수있는주요인자이다 [6]. 그러나제대혈은행의검체는갓태어난신생아의탯줄에서채취한제대혈로항균제의사용여부와는무관하므로접종량을증가시켜도항균제에균이희석될우려는없다. 또한전혈을검체로사용하는경우의적정접종량은혈액대배지의비율을 1:10-1:5로하며, 보통 1:10으로권장하고있다. 이는전혈에포함된백혈구및항균제에의하여세균이사멸할수있기때문이며희석이많이되도록적은량을권장한다 [8]. 본제대혈은행에서는농축과정의부산물인혈장을사용하며, 원심분리하여혈구성분을제거한것으로백혈구의탐식을배제할수있으나혈구제거를위한처치과정중세균도함께제거되었을가능성이있으며균의제거여부를알수없는것이이실험의한계이다. 세균배양검사방법의차이로오염률을비교한국외제대혈
Da Hae Shim, et al. : Microbial Contamination and Evaluation of Inoculum Volume in Umbilical Cord Blood Culture 5 은행에서는성인배양병에 10 ml의혈장을접종하였다가소아배양병에최종산물 ( 농축백혈구풍부혈장 ) 1 ml를접종하였을때검출률이 5.6% 에서 1.6% 로감소하였다. 이논문에서는소아배양병을사용한것이세균검출률을감소시켰다 [5]. 그럼에도불구하고소아배양병을사용하는본제대혈은행에서는접종량의증량으로낮은수준 (low level) 에있던세균을증식하여배양성적이향상된것으로보인다. 또한이실험의목적중하나인배양기간단축에대한효과는크지않았으나, 환경군검출비율이비교적높은제대혈은행에서 Bacillus spp. 배양성적의향상은접종량증량에의미가크며, 접종가능한범위내에서접종량의증량을적절하다고판단된다. 마지막으로 Table 2의배양기간이같았던 22건의검체를자동혈액배양기기를이용하여세균배양검사를진행하였다면, 검출시간을분단위로기록하여배양기간단축의의미있는효과가컸을것으로생각한다. 제대혈의혈장을사용하고, 검체량의한계로인하여소아배양병을사용하는검사실에서가능한범위내의접종량의증량은낮은수준에있던세균을증식시킬수있는것으로보인다. 보관된제대혈은난치성혈액질환이나유전성질환치료를위하여환자에게직접적으로이식되는제제로세균배양검사의민감도증가시킴으로환자의생명과직결되는제대혈안전성확립에기여할수있으며, 본제대혈은행과세균배양조건이비슷한검사실에서지침을마련하고자할때저자의연구가도움이되었으면한다. REFERENCES 1. Lee YH. Cord blood-current status and perspective. Korean J Hematol 2007;42:181-96. 2. Clark P, Trickett A, Stark D, Vowels M. Factors affecting microbial contamination rate of cord blood collected for transplantation. Transfusion 2012;52:1770-7. 3. Park JS, Shin S, Yoon JH, Roh EY, Chang JY, Kim EC. Microbial contamination of donated umbilical cord blood. Ann Clin Microbiol 2013;16:39-44. 4. Umbilical Cord Blood Management and Research Act. Korea Ministry of Health and Welfare, 2011. http://law.go.kr/ [Online] (last visited on 30 November 2015). 5. Kamble R, Pant S, Selby GB, Kharfan-Dabaja MA, Sethi S, Kratochvil K, et al. Microbial contamination of hematopoietic progenitor cell grafts-incidence, clinical outcome, and cost-effectiveness: an analysis of 735 grafts. Transfusion 2005;45:874-8. 6. Weinstein MP, Mirrett S, Wilson ML, Reimer LG, Reller LB. Controlled evaluation of 5 versus 10 milliliters of blood cultured in aerobic BacT/Alert blood culture bottles. J Clin Microbiol 1994;32:2103-6. 7. Park DS, Lee YJ, Yoo SJ, Cho JH. Evaluation of positive rate of aerobic BacT/Alert blood culture bottles by antibiotic usage and inoculated blood volume. Korean J Clin Pathol 2001;21:343-9. 8. Winn WC, Koneman EW, et al. eds. Koneman s color atlas and textbook of diagnostic microbiology. 5th ed. Philadelphia, PA: Lippincott; 1997. 9. Shin BM and Paik SO. Comparison of vital automated blood culture system and mannual blood culture method. Korean J Clin Microbiol 1998;1:97-103.
6 Ann Clin Microbiol 2016;19(1):1-6 = 국문초록 = 제대혈에서미생물오염률및접종량평가 메디포스트생명과학연구소심다해, 김희정, 홍혜경 배경 : 세균배양검사는조혈모세포이식을위해보관되는제대혈의필수검사이다. 이에본연구에서는 10년간의메디포스트제대혈은행에서미생물오염률및동정된균의분포에대하여분석하였다. 또한접종량의증량이세균배양에미치는영향에대하여알아보고자하였다. 방법 : 세균배양검사는제대혈농축과정의부산물인혈장을소아배양병에 2 ml씩접종하여수기법으로진행하였다. 육안적으로확인하여증식이보이는경우, 혈장을각 2 ml, 4 ml를채취하여 2쌍의소아배양병에재접종하였다. 결과 : 2004년부터 2013년까지총 133,610건에서미생물오염건수는 1,311건으로미생물오염률은 0.93% 였다. 장내세균인 Escherichia coli가 34.6% 로가장높은비율을차지했으며, 환경군인 Bacillus spp. (12.8%), Enterococcus faecalis (5.3%), Klebsiella pneumoniae (4.4%) 순으로많이배양되었다. 접종량증량전에비하여오염률은 0.2% 증가하였고, Bacillus spp. 의오염률은 8.3% 증가하였다. 결론 : 제대혈오염에관하여기존발표된국내외의자료와함께여러방면으로활용할수있을것이다. 또한본제대혈은행과세균배양조건이비슷한검사실에서접종혈액량지침을마련하고자할때참고할수있을것이며, 낮은수준 (low level) 에있던세균을검출해냄으로써제대혈안전성확립에기여하였다. [Ann Clin Microbiol 2016;19:1-6] 교신저자 : 김희정, 홍혜경, 13494, 경기도성남시분당구대왕판교로 644 번길 21 메디포스트 ( 주 ) 생명공학연구소 Tel: 02-3465-6696, Fax: 02-587-6869 E-mail: simma88@medi-post.co.kr