Journal of Life Science 2015 Vol. 25. No. 10. 1110~1114 ISSN (Print) 1225-9918 ISSN (Online) 2287-3406 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2015.25.10.1110 Physiological Functions of Lactic Acid Bacteria Fermented Broth Containing Fagopyrum esculentum and Saccharina japonica Sung-Jong Jeon 1,2 *, Ae-Ryoung Kim 1 and Jong-Hwan Lee 1,2 1 Department of Biotechnology & Bioengineering, Dong-Eui University, Busan 47340, Korea 2 Department of Smart-Biohealth, Dong-Eui University, Busan 47340, Korea Received June 26, 2015 /Revised August 31, 2015 /Accepted September 22, 2015 In this study, we investigated the potential of Lactobacillus brevis AR1 fermented broth containing various grains (Fagopyrum esculentum, Scotch oat, Sesamum indicum, Glycine max Merr, Castanea crenata, Oryza sativa L., Hordeum vulgare L., Perilla frutescens var. japonica Hara, or Triticum aestivum L.) or Saccharina japonica as a source of collagen synthesis in cosmetic products. The treatment of Lb. brevis AR1 fermented broths containing F. esculentum or S. japonica water extracts was markedly increased the synthesis of collagen in fibroblasts. The collagen synthesis capacity of the S. japonica fermentation product was higher than that of β-glucan, which was used as a positive control. Under controlled conditions in broths containing F. esculentum or the S. japonica extracts with 4% monosodium glutamate (MSG), Lb. brevis AR1 produced γ-aminobutyric acid (GABA) at a concentration of 180 mm, with an 84.5% GABA conversion rate after 72 h. Both the F. esculentum and S. japonica fermentation broths produced by Lb. brevis AR1 reduced inflammatory responses on mouse skin and did not show cell cytotoxicity in fibroblasts. These results suggest that both the F. esculentum and S. japonica fermentation products of Lb. brevis AR1 could be used as functional materials in cosmetic products to combat wrinkles and skin inflammation. Key words : Fagopyrum esculentum, GABA, lactic acid bacteria, Saccharina japonica 서 GABA (γ-aminobutyric acid) 는비단백질구성아미노산으 로서사람과동물에있어중추신경계의주된흥분억제성신 경전달물질이며, 뇌기능촉진, 신경안정, 혈압강하, 이뇨작용, 간기능개선, 비만방지, 알콜대사촉진, 소취작용등매우다양 한생리기능을갖는것으로알려져있다 [1, 12, 15, 18]. 미국 및일본에서는뇌혈류개선용의약품으로승인되어 GABA 성 분을주로의약용으로이용하고있으나, 한국에서는최근식 품, 식품첨가물및화장품소재로이용하려는시도가다양하 게이루어지고있으며, 특히인간의구강점막섬유아세포 (buccal mucosa fibroblast) 에서 collagen 합성을촉진하는것 으로보고된바있어주름개선을위한화장품소재로의사용 이점점증대되고있다 [13, 14, 16]. 한편, 피부주름의발생원인 중하나는 collagen 의결핍으로알려져있는데, collagen 은피 부진피를구성하는주요단백질로서피부구조와탄력을유지 하는역할을하며, 나이가들면서생성의감소를보이며분해 *Corresponding author *Tel : +82-51-890-2278, Fax : +82-51-890-2632 *E-mail : jeon.sj@deu.ac.kr This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 론 도증가되어피부진피층의함몰을유도하고피부의주름을생성하는것으로알려져있다. 이러한주름개선을위해기존에사용되는소재인 retinol과 adenosine 등은 collagen의합성을증가시키고, 표피각화과정을정상화시켜피부재생에관여하는물질로많이사용되고있지만빛과열에불안정하고피부에자극이있는것으로알려져있다 [10]. Lactobacillus sakei B2-16 균주를사용하여미강, 쌀눈및대두추출물을주원료로발효하는경우에 5~10%(w/v) 의 monosodium glutamate (MSG) 가 90% 이상 GABA로전환된곡물발효소재를얻을수있는것으로보고되었다 [8]. 이와같이각종기능성성분을갖는곡류및해산물을이용하여유산균을발효하였을때, GABA와같은기능성성분뿐만아니라곡물및해산물에서유래하는각종영양성분이함유된발효물을얻을수있으며, 이것은다양한생리적기능을가질수있음을의미한다. 본연구에서는다양한곡류 ( 메밀, 귀리, 참깨, 검은콩, 율피, 현미, 보리, 들깨, 밀 ) 및다시마를배지성분으로사용하여유산균을배양하였고, 이중에서메밀및다시마를포함하는배양물이 fibroblast의 collagen 합성을촉진하는것으로확인하였다. 메밀은 12 15% 단백질이함유되어있고, 다른곡류작물에서부족한필수아미노산인 lysine을많이함유 (5 7%) 하고있으며, 지방, 철, 인, 아연등무기질과비타민 B1과 B2도비교적많이함유하고있다. 다시마는칼륨, 나트륨, 칼슘, 마그네슘등신체의생리대사에관여하는무기질을다량함유
Journal of Life Science 2015, Vol. 25. No. 10 1111 하며갑상선호르몬의주성분인요오드를 4,000 ppm 이상함유하고있을뿐만아니라인체의소화효소에의해분해되지않는알긴산을풍부하게함유하고있다 [3, 6]. 본연구에서는메밀및다시마를포함하는배양물들을화장품소재로사용하기위하여 GABA 함량, 항염증및세포안정성효과와같은생리적기능을조사하였다. 재료및방법 전에세포의접착을위해서 1 ml의세포배양물을분주하여 12시간배양한후, 각종곡물및다시마함유유산균배양물을각각 0.5% 처리한후 24시간배양하였다. 대조구로는순수유산균배양물만을사용하였다. 배양후상등액 800 μl를얻은후 12,000 rpm에서원심분리한후상등액을회수하였다. 회수한상등액은 Sircol collagen assay kit에서제공하는방법대로반응한후분광광도계로 540 nm에서흡광도를측정하여정량하였다. 사용균주유산균배양에사용한균주는본연구실에서분리한 Lactobacillus brevis AR1을사용하였고, 전배양에는 4% MSG가첨가된 MRS 배지 (pancreatic digest of gelatin 10 g, beef extract 8 g, dextrose 20 g, dipotassium phosphate 2 g, polysorbate 80 1 g, sodium acetate 5 g, ammonium citrate 2 g, magnesium sulfate 0.2 g, manganese sulfate 0.05 g, 1 L -1 ) 를이용하여 30 에서 48시간배양한후본배양에사용하였다. 곡물및다시마추출물의제조각종곡물 ( 메밀, 귀리, 참깨, 검은콩, 율피, 현미, 보리, 들깨, 밀 ) 및다시마는수세및분쇄공정을거쳐적당한크기로분쇄한다음, 각시료 100 g에증류수를 5배가하고 60 에서 12 시간동안추출한후, 원심분리 (6,000 rpm, 15분 ) 하고상등액을분리하여곡물및다시마추출물을제조하였다. 곡물및다시마함유유산균배양물의제조상기에서제조한곡물또는다시마추출물각각 500 ml에 SY 배지 (4% sucrose, 1% yeast extract, 4% MSG) 를혼합한후, 80 에서 1시간가열하여살균처리하였다. 2일간전배양한 Lb. brevis AR1을혼합배지 500 ml에 1%(v/v) 농도로접종하고 120 rpm으로교반하면서 30 에서 68시간배양함으로서곡물추출물또는다시마추출물을함유하는유산균배양물을수득하였다. 수득한곡물또는다시마를함유하는유산균배양물을원심분리 (8,000 rpm, 10분 ) 하여상등액을분리한후 pore size 1.0 μm의 filter paper를사용하여상등액을여과한다음, 균체및불용성성분이제거된유산균배양물을회수하였다. Collagen 합성량측정곡물및다시마함유유산균배양물의 collagen 합성촉진효능을알아보기위하여 Sircol collagen assay kit (Biocolor, UK) 을사용하였다. Collagen 합성량측정을위해서한국세포주은행에서분양받은 fibroblast NIH 3T3 세포주를사용하였고, 10% fetal bovine serum (FBS) 가함유된 Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM) 에서배양하면서, 24-well plate 에각각 4 10 4 개의세포를분주하였다. 유산균배양물의처리 GABA 함량분석메밀또는다시마추출물을함유하는배지에서유산균을배양할때 GABA의생성여부를알아보기위하여원심분리하여균체를제거한후 GABA 함량을분석하였다. GABA 함량은 HPLC (Waters) 를이용하여다음과같은방법으로분석하였다. GABA는 phenylisothiocyanate (PITC) 를사용하는 AccQ-Tag로형광유도체화하였고, 유도체화된시료는 0.45 μm filter로여과한후, Nova-Pak C18 HPLC column (150 3.9 mm, Waters) 을사용하여분석하였다. Column에서유도체를용출시키기위해서 AccQ-Tag Eluent A (0.14 M sodium acetate, 10 mm EDTA, ph 6.4) 와 Eluant B (60% acetonitrile, 10 mm EDTA) 를사용하여 binary non-linear gradient 방식으로분당 1 ml의유속으로흘렸다. GABA의함량은표준품 GABA 및 L-glutamate 분석결과와비교하여산출하였다. 피부염증반응시험메밀및다시마함유유산균배양물의피부염증완화효과를알아보기위하여, Sheu [17] 등의방법에따라다음과같이수행하였다. 실험대상으로는 CD-1 mouse (male & female, 4-6 weeks, Hyochang science, Korea) ( 승인번호 : DEU-R2013-002) 를사용하고, 자극물질로는 0.05%(w/v, in acetone) 12-O-tetradecanoylphorbol-13- acetate (TPA) 액 10 μl를실험동물양귀의안쪽과바깥쪽에처리하였다. 처리물질로인해귀가두꺼워지면서염증반응이일어난이후에, 염증을완화시키는것으로알려진 1 mm clofibrate와메밀유산균배양물또는다시마유산균배양물을각각 5% 농도로염증유발후 45분및 2시간째에귀의양쪽면에 cm 2 당 20 μl를처리하였다. 자세한세포학적소견을얻기위하여 4% formaldehyde에고정하고, hematoxylin and eosin (H&E) 염색법 [9] 으로염색한다음, 조직슬라이드를 100배확대한사진으로염증완화를확인하였다. 세포안정성시험세포를이용한유산균배양물의안정성시험은 EZ-cytox cell viability assay kit (Daeillab service, Korea) 를사용하여수행하였다. 한국세포주은행에서분양받은 fibroblast NIH 3T3 세포주를사용하였고, 10% FBS가함유된 DMEM에서배
1112 생명과학회지 2015, Vol. 25. No. 10 양하였으며 37, 5% CO 2 항온기에서배양한후, 메밀및다시마함유유산균배양물을적당농도로희석하여첨가하고다시 24시간동안배양하였다. 여기에 assay agent를 10 μl 첨가하고 37, 5% CO 2 항온기에서 2시간배양한후 450 nm에서 ELISA reader로흡광도를측정하였다. 결과및고찰 곡물및다시마함유유산균배양물의 collagen 합성능다양한곡물 ( 메밀, 귀리, 참깨, 검은콩, 율피, 현미, 보리, 들깨, 밀 ) 및다시마를이용하여유산균을배양하고그배양물을 fibroblast NIH 3T3 세포주에처리하여 collagen 합성능을시험하였다. 그결과메밀과다시마의유산균배양물을처리한 fibroblast 배양액에서대조구인유산균배양물에비해약 2.5 배이상많은양의 collagen이검출되었다 (Fig. 1). 따라서다양한곡물과다시마를포함하는유산균배양물중에서메밀및다시마의유산균배양물이 fibroblast의 collagen 합성에대해매우우수한효과를가지는것으로확인하였다. 이들결과를바탕으로메밀및다시마함유유산균배양물의농도변화에따른 fibroblast의 collagen 합성능에대한영향을조사하였다. 각세포처리구에 positive control로써 collagen 합성효과가우수한것으로알려진 genistein (Sigma, USA) [4] 과 β-glucan (Sigma) [5] 을각각다양한농도로처리하였고, 메밀유산균배양물및다시마유산균배양물을각각 0.01%, 0.1%, 0.5% 로처리하여 24시간배양한후배양상등액에대하여 collagen 함량을조사하였다. 그결과, Fig. 2에서나타낸바와같이다시마함유유산균배양물을 0.5% 처리한경우, positive control로 Fig. 2. Effect of various concentrations of Lb. brevis AR1 fermented broth containing F. esculentum and S. japonica on the collagen synthesis in fibroblasts. 사용한 10 μm genistein 및 0.5% β-glucan을처리하였을때보다합성되는 collagen 함량이더많았고, 메밀함유유산균배양물을 0.5% 처리한경우에도 β-glucan과유사한정도의 collagen이합성되는것으로확인되었다. 메밀에포함되어있는 rutin은인간 fibroblast에서 collagen 합성을촉진하는효과가있는것으로알려져있어 [19], 본연구에서메밀함유유산균배양물이 fibroblast의 collagen 합성을촉진한결과와일치하였다. 또한, 다시마의한성분인 phytoestrogen은에스트로겐과유사한효과를가지고있어피부, 골및연골조직에서 collagen 함량을증가시키는것으로보고되었다 [11]. 이것은본연구의다시마함유유산균배양물이 fibroblast의 collagen 합성을촉진한결과와비슷한양상을나타내었다. Fig. 1. Effect of the Lb. brevis AR1 fermented broth containing various grains and Saccharina japonica on the collagen synthesis in fibroblasts. Control is the only fermented broth. 메밀및다시마함유유산균배양물의 GABA 함량메밀또는다시마가포함된배지에서유산균을배양할때균체의생장곡선에따른 GABA 생산량의변화를조사하였다. Fig. 3의결과에서유산균은다시마보다메밀추출물함유배지에서더빨리성장하는것으로나타났다. GABA 생산량에있어서는메밀과다시마의함유배지모두대수증식기말기에접어드는 42시간이후부터 GABA를생산하기시작하여정지기인 72시간만에 4% MSG (213 mm) 가약 180 mm로전환되어 84.5% 의 GABA 전환율을나타내었다. 이것은 Lb. paracasei NFRI 7415 균주의 GABA 전환율인 60.4%[7] 와 Lb. brevis GABA 057 균주의 GABA 전환율인 41.7%[2] 보다훨씬높은 GABA 전환율을나타내어본연구에사용한 Lb. brevis AR1은 GABA 생산에있어매우우수한성질을나타내었다. GABA가인간의구강점막섬유아세포에서 collagen 합성을촉진하는것으로보고된바 [16] 있지만아직정확한작용기전은밝혀진것이없기때문에이부분에대해서는앞으로연구가더필요할것으로생각된다.
Journal of Life Science 2015, Vol. 25. No. 10 1113 Fig. 3. Time profiles on the cell growth and GABA production of Lb. brevis AR1 in culture media containing F. esculentum or S. japonica with 4% MSG. Lb. brevis AR1 was cultivated for 72 hr at 30., Cell growth in culture media containing F. esculentum;, Cell growth in culture media containing S. japonica;, GABA production in culture media containing F. esculentum;, GABA production in culture media containing S. japonica. 메밀및다시마함유유산균배양물의피부항염증효과 메밀및다시마함유유산균배양물의피부항염증효과를알아보기위하여, 재료및방법에서나타낸바와같이 CD-1 mouse를대상으로피부염증반응을실험하였다. 그결과, TPA만을처리한 negative control에서는조직이상당히비대해져있음을확인할수있었고 (Fig. 4A), positive control인 clofibrate 처리군에서는염증이완화된것을확인하였다 (Fig. Fig. 5. Cell cytotoxicity of Lb. brevis AR1 fermented broth containing F. esculentum or S. japonica., F. esculentum;, S. japonica. 4B). 다시마함유유산균배양물의처리군에서는 clofibrate 처리군과유사한정도로염증이완화되었고 (Fig. 4C), 메밀함유유산균배양물의처리군에서는다시마함유유산균배양물보다는부족하지만 negative control 보다는염증완화효과가있는것으로확인되었다 (Fig. 4D). Kang 등은유산균을이용하여제조한다시마발효분말이세포내 nitric oxide의생성능을억제하여항염증활성을가지는것으로보고한바있어 [4] 본연구의다시마함유유산균배양물이피부에서항염증효과를나타낸것과유사한결과로확인되었다. 메밀및다시마함유유산균배양물의세포안정성메밀및다시마함유유산균배양물의세포독성을조사하기위하여 fibroblast에배양물을첨가하고 24시간배양한후세포생존율을조사하였다. 그결과세포배양액에서메밀또는다시마함유유산균배양물의농도가증가함에따라세포생존율은조금감소되었지만 10% 의시료를첨가한세포배양액중에서도 85% 이상의우수한세포생존율을나타내었다 (Fig. 5). 따라서메밀또는다시마함유유산균배양물은세포에대한독성이없는것으로확인되어화장품소재로사용될수있음을알수있었다. 감사의글 Fig. 4. Effect of anti-inflammatory of Lb. brevis AR1 fermented broth containing F. esculentum or S. japonica. A, Treatment of TPA on mouse skin; B, Treatment of TPA and clofibrate on mouse skin; C, Treatment of TPA and the fermented broth of S. japonica on mouse skin; D, Treatment of TPA and and the fermented broth of F. esculentum on mouse skin. 이논문은 2015학년도동의대학교교내연구비에의해연구되었음 (2015AA149). References 1. Bazemore, A. W., Elliott, K. A. C. and Florey, E. 1957. Isolation of factor I. J. Neurochem. 1, 334-339. 2. Choi, S. I., Lee, J. W., Park, S. M., Lee, M. Y., Ji, G. E., Park,
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