(51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청(KR) (12) 등록특허공보(B1) C12Q 1/68 (2006.01) (21) 출원번호 10-2008-0117508 (22) 출원일자 2008년11월25일 심사청구일자 2008년12월15일 (65) 공개번호 10-2010-0058919 (43) 공개일자 2010년06월04일 (56) 선행기술조사문헌 KR100619189 B1* *는 심사관에 의하여 인용된 문헌 (45) 공고일자 2012년01월05일 (11) 등록번호 10-1101880 (24) 등록일자 2011년12월27일 (73) 특허권자 문우철 서울특별시 강남구 압구정로 201, 25동 401호 (압 구정동, 현대아파트) 굿젠 주식회사 서울특별시 구로구 디지털로30길 28, 마리오디지 털타워 1110-1118 (구로동, 마리오 타워) (72) 발명자 문우철 서울특별시 강남구 압구정로29길 71, 현대아파트 25동 401호 (압구정동, 점포5동) 오명열 경기도 수원시 영통구 원천동 85-31 (뒷면에 계속) (74) 대리인 정삼영 전체 청구항 수 : 총 17 항 심사관 : 전명숙 (54) 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석용의 DNA 칩, 키트, 및 이것을 이용한 탐지 및 유전자형의 분석방법 (57) 요 약 본 발명은 14종의 성교전파성질환(STD) 원인 및 관련균의 감염여부와, 또한 이들 균의 유전자형(genotype)과 테 트라사이클린계 및 베타-락탐계 항생제 내성의 유전자형을 신속정확하게 분석할 수 있는 신규의 DNA 칩, 키트 및 분석방법에 관한 것이다. 구체적으로는, N. gonorrhoeae, C. trachomatis, U. urealyticum, M. genitalium, M. hominis, Herpes simplex virus type 1, Herpes simplex virus type 2, human papilloma virus, H. ducreyi, T. pallidum, T. vaginalis의 11종의 STD 원인균과 3종의 STD 관련균인 G. vaginalis, C. albicans, 대장균을 포함하여 총 14종의 균과, 테트라사이클린계 및 베타-락탐계 항생제 내성의 유전자에 특이한 신규의 올리고뉴클 레오티드 프라이머(primer) 및 프로브(probe)와, 이를 이용한 다중 중합효소연쇄반응 방법(multiplex polymerase chain reaction, M-PCR), DNA 칩 및 키트에 관한 것으로, 본 발명에 의하면 STD 진단에 있어 민감도, 특이도, 재현성, 정확도가 모두 뛰어나며, 다수의 검체에서 14종의 STD 원인 및 관련균을 모두 신속하게 자동분석할 수 있을 뿐 아니라, 치료 항생제 선택에도 도움이 되는 우수한 효과가 있다. 대 표 도 - 도1a - 1 -
(72) 발명자 박용우 경상남도 진주시 이현동 이현웰가 114동 1503호 구본동 경기도 양주시 백석읍 방성리 78-5 - 2 -
특허청구의 범위 청구항 1 서열번호 37 내지 66의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는, 성교전파성질환(sexually transmitted disease; STD) 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석용 DNA 칩. 청구항 2 제 1 항에 있어서, 상기 서열번호 66의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브는 인체형 베타글로빈 유전 자와 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석용 DNA 칩. 청구항 3 제 1 항에 있어서, 상기 서열번호 66의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브는, 5' 말단이 Cy5로 표지된 서열번호 67의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 성교전파성질 환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석용 DNA 칩. 청구항 4 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 칩은 프로브를 집적할 수 있는 집적부위(well)가 8개로 구획되어 있는 것을 특징으 로 하는, 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석용 DNA 칩. 청구항 5 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 DNA 칩, 성교전파성질환 원인균 유래의 DNA를 증폭하기 위한 프라 이머세트, 및 상기 DNA 칩과 상보적으로 결합하는 증폭된 DNA를 검출하기 위한 표지수단을 포함하는, 성교전파 성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석용 키트. 청구항 6 제 5 항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 가드네렐라 바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 유레아플라 스마 유레아라이티쿰(Ureaplasma urealyticum) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서 열을 갖는 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 7 및 서열번호 8 의 염기서열을 갖는 클라마이디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 임균(Neisseria gonorrhoeae) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 11 및 서 열번호 12의 염기서열을 갖는 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서 열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열을 갖는 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열을 갖는 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 17 및 서열번호 18의 염기서열을 갖는 대장균(coliform bacteria) 핵산 증폭용 프라이 머세트, 서열번호 19 및 서열번호 20의 염기서열을 갖는 헤모필러스 듀클레이(Haemophilus ducreyi) 핵산 증폭 용 프라이머세트, 서열번호 21 및 서열번호 22의 염기서열을 갖는 헤르페스심플렉스바이러스(herpes simplex virus) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 23 및 서열번호 24의 염기서열을 갖는 트리포네마 팔리둠 (Treponema pallidum) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 25 및 서열번호 26의 염기서열을 갖는 인유두종바이 러스(human papillomavirus; HPV) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 27 및 서열번호 28의 염기서열을 갖는 SHV 유전자(beta-lactamase SHV-12 gene) 증폭용 프라이머세트, 서열번호 29 및 서열번호 30의 염기서열을 갖 는 TEM 유전자(CMT-type beta lactamase gene) 증폭용 프라이머세트, 서열번호 31 및 서열번호 32의 염기서열 을 갖는 TetM 유전자(tetracycline resistant gene M) 증폭용 프라이머세트, 서열번호 33 및 서열번호 34의 염 기서열을 갖는 AmpC 유전자(cephalosporinase gene) 증폭용 프라이머세트, 또는 서열번호 35 및 서열번호 36의 염기서열을 갖는 TetC 유전자(tetracycline resistant gene C) 증폭용 프라이머세트인 것을 특징으로 하는, 성 교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석용 키트. 청구항 7-3 -
제 5 항에 있어서, 상기 표지수단은 Cy5, Cy3, 바이오틴 결합물질, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스레드로 이루 어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는, 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석용 키트. 청구항 8 제 7 항에 있어서, 상기 표지수단이 Cy5일 때 표지된 dctp와 표지되지 않은 dctp 간의 몰농도비를 1:12.5로 하 여 반응시키는 것을 특징으로 하는, 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석용 키트. 청구항 9 다음의 단계를 포함하는, 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석방법: (a) 성교전파성질환 원인균의 핵산 증폭용 프라이머를 이용하여 상기 핵산을 단일(single) 또는 다중 (multiplex) PCR 증폭방법에 의해 증폭하는 단계; (b) 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 DNA 칩에 상기 증폭된 핵산을 하이브리드시키는 단계; 및 (c) 상기 하이브리드에 의해 얻어진 혼성화물을 검출하는 단계. 청구항 10 제 9 항에 있어서, 상기 단일 또는 다중 PCR 증폭방법은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 가드네렐 라 바지날리스 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 유레아플라스마 유레아 라이티쿰 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 마이코플라즈마 호미니스 핵 산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 클라미디아 트라코마티스 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 임균 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열을 갖는 트리코모나스 바지날리스 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열을 갖는 마이코플라즈마 제니탈리움 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 15 및 서열번호 16의 염 기서열을 갖는 캔디다 알비칸스 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 17 및 서열번호 18의 염기서열을 갖는 대 장균 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 19 및 서열번호 20의 염기서열을 갖는 헤모필러스 듀크레이 핵산 증 폭용 프라이머세트, 서열번호 21 및 서열번호 22의 염기서열을 갖는 헤르페스심플렉스바이러스 핵산 증폭용 프 라이머세트, 서열번호 23 및 서열번호 24의 염기서열을 갖는 트리포네마 팔리둠 핵산 증폭용 프라이머세트, 서 열번호 25 및 서열번호 26의 염기서열을 갖는 인유두종바이러스 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 27 및 서 열번호 28의 염기서열을 갖는 SHV 유전자(beta-lactamase SHV-12 gene) 증폭용 프라이머세트, 서열번호 29 및 서열번호 30의 염기서열을 갖는 TEM 유전자(CMT-type beta lactamase gene) 증폭용 프라이머세트, 서열번호 31 및 서열번호 32의 염기서열을 갖는 TetM 유전자(tetracycline resistant gene M) 증폭용 프라이머세트, 서 열번호 33 및 서열번호 34의 염기서열을 갖는 AmpC 유전자(cephalosporinase gene) 증폭용 프라이머세트, 및 서 열번호 35 및 서열번호 36의 염기서열을 갖는 TetC 유전자(tetracycline resistant gene C) 증폭용 프라이머세 트로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머세트를 이용하는 것을 특징으로 하는, 성교전파성질환 원 인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석방법. 청구항 11 제 10 항에 있어서, 상기 단일 또는 다중 PCR 증폭방법은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 성교전 파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석방법: (a) 상기 프라이머세트를 주형 DNA, Taq DNA 중합효소, dntp, 증류수 및 PCR 버퍼와 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합물을 95 에서 10분간 예비변성시키는 단계; (c) 상기 예비변성된 산물을 94 에서 30초간 변성시키고, 58 에서 30초간 프라이머 어닐링시키고, 72 에서 30초간 연장시키는 것을 총 40회 반복하는 단계; 및 (d) 상기 연장된 산물을 72 에서 5분간 최종연장시키는 단계. - 4 -
청구항 12 제 9 항에 있어서, 상기 다중 PCR 증폭방법은 서열번호 1과 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서열 번호 3과 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 5와 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머세 트, 서열번호 7과 서열번호 8의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 9와 서열번호 10의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 11과 서열번호 12의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 13과 서열번호 14의 염기 서열을 갖는 프라이머세트, 및 서열번호 15와 서열번호 16의 염기서열을 갖는 프라이머세트 간의 몰농도비가 1:1:1:1:1:1:1:1인 것을 특징으로 하는, 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자 형의 분석방법. 청구항 13 제 9 항에 있어서, 상기 다중 PCR 증폭방법은 서열번호 17과 서열번호 18의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서 열번호 19와 서열번호 20의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 21과 서열번호 22의 염기서열을 갖는 프라 이머세트, 서열번호 23과 서열번호 24의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 및 서열번호 25와 서열번호 26의 염기 서열을 갖는 프라이머세트 간의 몰농도비가 1:1:1:1:1인 것을 특징으로 하는, 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석방법. 청구항 14 제 9 항에 있어서, 상기 다중 PCR 증폭방법은 서열번호 27과 서열번호 28의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서 열번호 29와 서열번호 30의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 31과 서열번호 32의 염기서열을 갖는 프라 이머세트, 서열번호 33과 서열번호 34의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 및 서열번호 35와 서열번호 36의 염기 서열을 갖는 프라이머세트 간의 몰농도비가 1:1:1:1:1인 것을 특징으로 하는, 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석방법. 청구항 15 제 12 항에 있어서, 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 419bp, 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 373bp, 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 333bp, 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 321bp, 서열번호 9와 서열번호 10의 프라이 머세트에 의한 PCR 산물이 284bp, 서열번호 11과 서열번호 12의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 262bp, 서열번 호 13과 서열번호 14의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 207bp, 서열번호 15와 서열번호 16의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 148bp의 크기인 것을 특징으로 하는, 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석방법. 청구항 16 제 13 항에 있어서, 서열번호 17과 서열번호 18의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 467bp, 서열번호 19와 서열 번호 20의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 439bp, 서열번호 21과 서열번호 22의 프라이머세트에 의한 PCR 산물 이 350bp, 서열번호 23과 서열번호 24의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 260bp, 서열번호 25와 서열번호 26의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 191bp의 크기인 것을 특징으로 하는, 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석방법. 청구항 17 제 14 항에 있어서, 서열번호 27과 서열번호 28의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 679bp, 서열번호 29와 서열 번호 30의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 412bp, 서열번호 31과 서열번호 32의 프라이머세트에 의한 PCR 산물 이 291bp, 서열번호 33과 서열번호 34의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 208bp, 서열번호 35와 서열번호 36의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 152bp의 크기인 것을 특징으로 하는, 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석방법. 명 세 서 - 5 -
발명의 상세한 설명 [0001] 기 술 분 야 본 발명은 성교전파성질환(sexually transmitted diseases; STD) 원인균 가운데 역학적으로 가장 발병률이 높고 중요한 11종의 균으로서, 임균(Neisseria gonorrhoeae), 클라마이디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 유레아플라스마 유레아라이티쿰(Ureaplasma urealyticum), 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium), 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis), 매독의 원인균인 트리포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 연성하감(chancroid)의 원인균인 헤모피루스 듀클레이(Haemophilus ducreyi), 음부포진(genital herpes)의 원인균인 헤르페스심플렉스바이러스 1 형과 2형(genital herpes; herpes simplex virus type 1 and 2), 인유두종바이러스(human papillomavirus, HPV), 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis)와, 3종 의 관련균으로서 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis), 대장균 (coliform bacteria)의 존재 여부 및 그 유전자형의 분석과, 테트라사이클린계 및 베타-락탐계 항생제에 대한 내성(antibiotic resistance)을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는, 성교전파성질환(sexually transmitted disease; STD) 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석용 DNA 칩, 키트, 및 이들을 이용 한 탐지 또는 분석방법에 관한 것으로, 본 발명에 의하면 DNA 시료 내에서 상기 14종의 균의 존재여부 뿐 아니 라 그 유전자형, 그리고 항생제 내성을 동시에 신속정확하게 분석할 수 있다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] 배 경 기 술 세균감염은 아직도 인체 질환 중 가장 중요한 질환 중의 하나이다. 세균의 진단 시에는 그 원인균을 정확하고 신속하게 파악해야 할 뿐 아니라, 그 원인균의 항생제에 대한 감수성과 내성을 파악하는 것이 중요하다. 이때의 원인균 진단은 단순한 균의 속과 종 뿐 아니라 아종(subtype) 내지 균주(strain)까지 파악하는 것이 중요하다. 상기한 상세한 정보는 감염의 근원과 원인을 파악하며, 병태를 파악하고, 경과와 예후를 예측하며, 치료제의 선 택과 치료방침의 결정, 백신의 개발 및 투여에 필수적이다. 전통적으로 감염질환의 진단을 위해서는 도말 및 염색에 의한 현미경적 검사, 세균 배양 및 항생제 감수성 검사, 항원항체검사, 면역학적 검사법 등의 여러 방법이 사용되고 있다. 그러나 실제 이러한 전통적 진단법은 많은 한계가 있는 것이 사실이다. 기존 방법을 이용할 경우, 상당수의 세균은 검색이 불가능하거나 어렵고, 시 간과 비용 및 인력이 너무 많이 소요되며, 한 번에 처리할 수 있는 검체 수에 한계가 있고, 흔히 한 번의 검사 로 한 가지 밖에 검사를 못 하고, 판독이 자동화가 되어 있지 않아서 임상 적용에 어려움이 많다. 또한 살아 있 는 균을 대상으로 하므로, 검사할 때 까지 균을 살려야 하며, 이에 따라 검체 처리와 이송에 어려움이 따르며, 그 비용도 만만치 않다. 따라서, 근자에 와서는 감염질환의 진단에 분자유전학적 분석방법이 사용되기 시작하였으며, 이것이 기존 진단 법을 급속하게 대체해 나가는 추세이다. 특히 최근에 와서 다수 검체의 자동 분석이 가능한 DNA 마이크로어레이 또는 DNA 칩이 각광을 받고 있다. 유전자 분석을 이용한 감염진단은 기존의 감염진단법에 비해 장점이 많고, 기 존 방법의 문제점을 해결할 수 있어서 보조 검사법 내지 대체 검사법으로 이용이 증가하고 있다. 유전자 진단법 은 DNA 및 RNA 염기서열의 분석을 통해 대상 세균의 주형과 아형도 명확하게 알 수 있으며, 검체 처리와 이송에 까다로움이 없이 죽은 세균도 검색이 가능하고, PCR 증폭을 통해 표적 유전자를 증폭시켜 검색하므로, 민감도가 높을 뿐 아니라 극소량의 검체만 있어도 진단이 가능하다. 또한, 민감도 뿐 아니라 특이도와 재현성 등 모두 부 분에서 우수하다. 대부분의 경우 24시간 이내에 신속하고 정확하게 결과를 알 수 있으며, 인력과 비용도 더 절 감된다. 아울러 DNA 칩을 이용하면 다수의 검체를 신속하게 다량으로 검색할 수 있어서 바쁜 병원업무중에도 임 상 진료에 큰 도움이 된다. 현재 미국 FDA에서 공인을 받은, 클라마이디아 트라코마티스, 임균, 헤르페스심플렉스바이러스 및 인체 면역결 핍바이러스 등을 검색하는 PCR 및 리얼타임(real time) PCR 키트가 시판되고 있다. 그러나 아직까지 상업화된 DNA 칩은 소수이며, 감염질환의 원인균을 신속하고 정확하게 파악할 수 있을 뿐 아니라, 항생제 내성까지 검사 하여 임상 진단에 크게 도움을 줄 수 있는 DNA 칩은 더욱 보기 드물다. 특히 본 발명에서와 같은, STD의 주 원 인균 및 관련균의 진단과 함께 그 항생제 내성까지 모두 검색할 수 있는 STD 칩은 아직 상업화가 되어 있지 않 다(Andrea Ferreria-Gonzalez, Angela M Calieno; Tiez Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Biology, 4th Edition, Elsevier Saunders, 2006. p.1555-1588). STD(sexually transmitted diseases)는 성행위로 인해 전파되는 질병을 통틀어 이르는 말이다. STD의 중요성은 - 6 -
매우 큰데, 인체의 10대 감염 질환 중 5개가 STD이고, 무엇보다 인체 감염 질환 중 가장 흔하고 역사가 오래된 질환이기 때문이다. 미국의 경우 매년 1500명 이상이 STD에 새로 감염이 되며, 6,500만명 이상이 바이러스성 STD에 이환되어 있다고 보고되고 있다. 근자에는 특히 클라마이디아 트라코마티스와 헤르페스심플렉스바이러스, 인유두종바이러스의 3가지가 증가되는 추세이며, 가장 흔한 3대 STD로 지적되고 있다. STD는 높은 유병률에도 불구하고 흔히 증상이 없어서 모르고 지내는 경우가 많고, 진행되면 불임이나 전립선염, 부고환염, 면역결핍, 암 등의 합병증을 야기할 수 있다. STD, 특히 바이러스성 STD는 유효한 치료법이 없는 경우가 많다. 이 때문에 STD는 정확한 진단과 예방이 무엇보다 중요하다. 아울러 무증상의 환자를 찾아서 치료하고 감염확산을 방지하는 것도 중요하다(Tara Frenkl, Jeanette Potts, Campbell-Walsh Urology, 9th edition, Saunders, 2007, p. 371-385). [0007] [0008] [0009] [0010] STD의 대표적인 원인균에는 박테리아인 임균과 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 마 이코플라스마 제니탈리움, 마이코플라스마 호미니스, 트리포네마 팔리둠, 헤모필루스 듀클레이, 바이러스인 헤 르페스심플렉스바이러스, 인유두종바이러스(HPV), 인체 면역결핍형 바이러스(HIV), 간염바이러스, 그리고 원충 인 트리코모나스 바지날리스 등이 있다. 한편 STD는 크게 3가지 형태가 있다. 첫째, 남자는 요도염이나 전립선염, 부고환염으로, 여자는 자궁경부염이나 질염, 골반염증성질환(pelvic inflammatory disease)으로 나타나는 형태로서, 이의 원인균으로 임균과 클라마이 디아 트라코마티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움, 마이코플라스마 호미니스, 트 리코모나스 바지날리스 및 헤르페스심플렉스바이러스가 포함된다. 둘째, 외성기에 궤양으로 나타나는 형태로서, 이의 원인균으로 매독균(트레포네마 팔리둠), 헤르페스심플렉스바이러스, 헤모필루스 듀클레이가 있다. 셋째, 외성기에 사마귀(wart)나 자궁경부, 홍문, 음경 등에 암을 야기하는 형태로서, HPV가 이에 해당된다. 넷째, 전 신 감염을 일으키는 형태로서 HIV 감염과 바이러스 감염이 이에 해당된다. 이와 함께 정확한 의미에서 STD는 아 니나 STD와 유사하게 질염 등의 병태를 나타내므로, 감별해야 할 균으로서 대장균, 가드네렐라 바지날리스와 진 균인 캔디다 알비칸스가 있다. 이들 균은 STD의 검사시 포함되어야 할 것들이다. 본 출원인(주식회사 굿젠)은 약 7년간 연인원 약 50만명의 사람에서 STD의 원인균을 다양한 유전자 분석법으로 검사하는 연구 및 사업을 해오고 있다. 최근 1년간 101,578명의 검사 결과를 분석한 통계를 하기 표 1에 나타내 었다. [표 1] 최근 1년간 본 출원인의 유전자검사 센터에서 101,578명의 STD 유전자 검사 결과 [0011] 대상 균주 양성 판정건수 % Neisseria gonorrhoeae 821 1.65 Chlamydia trachomatis 3,925 7.88 Ureaplasma urealyticum 4,943 9.93 Mycoplasma genitalium 2,053 4.12 Mycoplasma hominis 3,733 6.89 Trichomonas vaginalis 676 1.36 Gardnerella vaginalis 6,572 13.20 Candida albicans 422 0.85 Treponema pallidum 38 0.08 HSV type I 50 0.1 HSV type II 230 0.46 HPV 26,337 52.89 합계 49,800 100 [0012] [0013] [0014] 이러한 경험을 바탕으로, 본 발명자들은 STD의 진료에 다음과 같이 해결되지 않은 문제점이 많음을 발견하였다. 첫째, 다른 질환과 달리 무증상으로 잠복되어 증세가 악화되는 경우가 많고, 치료 후에도 재감염이 용이하다. 실제 클라마이디아 트라코마티스이나 유레아플라스마, 마이코플라스마 등 비임균성 요도염 감염 같은 경우에는 대다수가 증상이 없어서 모르고 지낸다. 따라서 STD의 원인균을 조기에 검출하여 무증상의 보균자도 효과적으로 선별(screening)할 수 있는 방법의 개발이 중요하다. 둘째, 실제로 진단이 용이하지 않다. 대다수의 STD 원인균은 배양이 잘 되지 않으며, 면역학적 방법으로도 검색 - 7 -
이 어려우며, 또한 검색되더라도 시간과 비용이 너무 많이 소요되어 임상에서는 실제로 적용하지 못하고 의사의 경험과 직감에 따라 진단을 내려 치료를 하는 경우가 많다. 따라서 정확하고 신속하며, 저비용으로 STD를 진단 할 수 있는 새로운 방법이 절실하다. [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] 셋째, 흔히 STD는 복합감염의 형태로 나타난다. 예컨대 임균감염시 본 발명의 도 1에 나타낸 바와 같이, 성관계 후 임균과 클라마이디아 트라코마티스와 헤르페스심플렉스에 동시에 복합감염되는 경우가 적지 않다. 따라서 이 러한 복합감염을 정확하게 모두 진단할 수 있는 방법의 개발이 절실하다. 넷째, 항생제 내성이다. 특히 임균 및 클라마이디아 등 중요 STD균의 경우, 항생제 남용에 따라 베타 락탐계 항 생제 내성, 테트라사이클린계 내성이 흔히 나타난다. 이는 곧 치료 실패와 합병증, 감염 확산, 경제적 손실로 나타나서, 임상 진료에서 큰 문제가 되고 있다. 따라서 이러한 항생제 내성을 정확하고 신속하게 분석하여, 적 절한 항생제를 선택할 수 있는 것이 중요하다. 이러한 문제 때문에, STD의 진료에는 어려움이 많고, 이를 해결해 줄 수 있는 새로운 방법의 개발이 절실한 바, 본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위해 고안되었다. STD의 종류 중 임상에서 가장 흔히 발견되는 형태가 남녀의 요도와 여성의 자궁경부, 질, 난관 등에 침범하여 염증을 야기하는 것이다. 이는 크게 임균과 비임균성으로 나뉘며, 후자에는 클라마이디아 트라코마티스, 유레아 플라스마 유레아라이티쿰, 마이코코플라스마 제니탈리움 및 마이코플라스마 호미니스가 주요 원인균으로 지적되 고 있다. 이들 세균은 모두 공통적으로 남성에서 요도염의 중요 원인이 되며 부고환염과 전립선염 등의 합병증 을 유발할 수 있으며, 불임의 중요한 원인이 된다. 또한 여성에서는 요도염과 질염, 자궁경부염과 골반염증성질 환의 주 원인이 되며, 나팔관 폐쇄를 일으킴으로써 불임과 이소성 임신(ectopic pregnancy) 등의 합병증을 유발 할 수 있다. 구미의 경우 오늘날 클라마이디아 감염이 가장 흔하며, 국내에서도 최근에는 임질은 줄어드는 대신 클라마이디아 감염과 비임균성 요도염이 늘어나는 추세이다. 이는 본 출원인의 경험에 따른 통계(상기 표 1 참 조)와도 일치한다. 환자에서 일단 요도염이 발견되면, 그것이 임균성인지 비임균성인지를 먼저 감별해야 하는데, 그 이유는 치료 방법과 경과가 서로 다르기 때문이다. 그러나 근래에는 항생제의 오남용에 따른 세균의 변이와 혼합감염의 증가 로 인해 양자 간의 구별이 애매한 경향이 많고, 정확한 진단을 위해서는 본 발명에서와 같은 분자유전자적 검사 법이 필요하다. 임균성 요도염을 일으키는 임균(N, gonorrhoeae)은 나이세리아(Neisseria) 속에 속한다. 임균의 진단은 일차적 으로 그람염색(Gram stain)에 의한다. 그람염색으로 특징적인 세포내 그람음성 쌍구균의 존재를 확인하는 것은 간편하고 정확도가 비교적 높아서 널리 사용되는 방법이다. 그러나 무증상이거나 증상이 미미한 임균성 요도염 에서는, 그람염색에 의할 경우 판단이 애매하거나 위음성(false negative)으로 나오는 경우가 많다. 따라서, 그 람염색법을 보완하기 위해 임균배양을 시도하는 경향이 있으나, 검사결과를 알기까지 많은 시간과 비용이 소모 되는 단점이 있다. 이외에도 효소면역검사법(enzyme immunoassay: EIA)과 면역형광검사법(immunofluorescence technique)은 임균 감염질환 진단에 있어 새로운 항원 확인방법으로 이용되고 있으며, 배양검사에 비해 신속하게 결과를 얻을 수 있고, 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 더 높은 것으로 보고되고 있으나, 고비용이라는 단점이 있 다. 비임균성 요도염은 최근 임균성 요도염이 감소하는데 반하여 역으로 발병률이 증가하고 있다. 비임균성 요도염 은 단일 질환이 아니라, 여러 가지 미생물에 의해 일어날 수 있는 일종의 증후군(syndrome)이다. 비임균성 요도 염의 원인 미생물로서 가장 중요한 것이 클라마이디아 트라코마티스(Chlamydia, trachomatis)이다. 클라마이디 아 트라코마티스는 세포내 기생성(intracellular parasitism)의 생존 주기(life cycle)를 가지는 미생물로서, 게놈에 DNA와 RNA를 모두 갖고 있으며, 모두 15가지의 혈청형이 있는데 이중 비임균성 요도염을 일으키는 것은 D-K형이다. 이에 의해 발병할 수 있는 인체 질환으로는, 트라코마와 호흡기감염, 요도염과 자궁경부염, 부고환 염, 골반염증성질환을 포함한 STD가 있다. 최근에는 클라마이디아가 심근염을 일으킨다는 보고도 있다. 클라마이디아 트라코마티스의 확인 방법으로는(1) 감염부위에서 채취된 가검물을 배양, 분리 확인하는 방법,(2) 감염부위의 상피세포를 직접 도말 염색하여 균을 확인하는 방법,(3) 환자의 혈청에서 항체를 분리확인하는 형광 항체법이 사용되어 왔으며, 최근에는(4) 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)과 하이브리다이제 이션(hybridization) 등의 분자유전학적 기법이 선호된다. 그러나, 상기 방법(1)은 검체를 배양분리하는 데에 장시간이 소요되고 진단 민감도가 낮다는 점 등으로 인해 임상 진단 목적으로는 적합하지 못하며, 방법(2)는 감 - 8 -
염부위의 상피세포를 직접 도말 염색하여 균을 확인하는 간편성은 좋으나 진단 민감도가 낮으며, 방법(3)은 단 클론항체에 형광물질인 FITC(fluorescein isothiocynate)가 부착된 시약을 이용하여 민감도는 비교적 높으나 고 비용과 전용장비를 요한다는 단점이 있어서 그 사용이 제한적이다. [0024] [0025] [0026] [0027] 인간과 각종 포유류 동물에 광범위하게 존재하는 마이코플라스마와 유레아플라스마속에 속하며 비뇨생식기에 감 염을 유발할 수 있는 유레아플라스마 유레아라이티쿰과 마이코플라스마 제니탈리움은 배양하기가 기술적으로 매 우 어렵고, 염색이나 면역학적 방법으로도 발견하기가 어렵다. 이에 따라 PCR에 의한 분자유전학적 검사법으로 진단하려는 것이 최근의 추세이다. 이 경우 각 균의 종에 특이한 유전자의 DNA의 염기서열을 PCR로 증폭한 후, 이를 시퀀싱 반응이나 하이브리다이제이션 등으로 확인하는 방법이 주로 이용된다. 현재까지 확인된 13종의 마 이코플라스마와 2종의 유레아플라스마는 16S 리보솜 RNA(16S rrna)의 V3의 5'방향 측 인접 부위(flanking region)와 V6의 3'방향측 인접부위의 염기 서열이 서로 일치한다. 이에 대해 V4와 V5 부위의 약 250개의 염기 서열이나 16S-23S 리보솜 RNA 사이부위의 염기서열은 각 종 별로 차이가 있다. 따라서 이를 검사하는 방법이 유 효하며, 또는 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 경우 이에 특유한 유레아제 서브유닛(urease subunit)의 염기서 열을 분석하는 방법도 사용가능 하다(Jensen JS 등 J Clin Microbiol 2003;41:261-6; Yoshida T 등 J Clin Microbiol 2002;40:105-110). 성감염 중 또 하나 흔한 형태는 외성기에 궤양을 일으키는 질환들이다. 대표적인 원인으로 음부포진(genital herpes), 매독(syphilis), 연성하감(chancroid), 성병림프육아종(lymphogranuloma venereum, LGV) 등이 있다. 이들은 순서대로 헤르페스심플렉스 바이러스 1형과 2형(herpes simplex virus type 1 and type 2; HSV-1, HSV- 2), 트리포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 헤모필루스 듀크레이(Haemophilus ducreyi), 클라마이디아 트라 코마티스(Chlamydia trachomatis)에 의해 발병한다(Tara Frenkl, Jeanette Potts, Campbell-Walsh Urology, 9th edition, Saunders, 2007, p. 371-385). 본 발명자들은 이들 외성기 궤양원인균을 동시에 다중 PCR로 증폭 한 후, 다시 DNA 칩위에서 역교잡반응(reverse hybridization)으로 분석하는 새로운 유전자진단 키트를 개발하 였다. 헤르페스심플렉스바이러스는 외성기궤양의 원인 중 대다수를 차지한다. 헤르페스심플렉스바이러스에는 1형과 2 형이 있는 바, 특히 2형이 음부포진의 대다수를 차지한다. 그러나 최근에는 구강성교의 영향에 따라 헤르페스심 플렉스바이러스 1형에 의한 음부포진도 증가하고 있다. 발명가들의 통계를 보아도 성기 궤양으로 의뢰된 환자 중 60.9%에서 성감염이 확인 된 바, 그 중 79.9%가 제 2형의 헤르페스심플렉스바이러스, 17.4%가 제 1형의 헤르 페스심플렉스바이러스에 의해 발병함이 확인되었다. 헤르페스심플렉스바이러스는 신경을 침범하여 잠복하고 있 다가 체내 면역기전이 약해지면 발병하여 성기에 물집과 궤양을 일으키는 것이 보통이며, 많은 사람들이 감염 사실을 모르고 지낸다. 실제 헤르페스심플렉스감염은 단일 STD중 가장 흔한 질환으로 지적되고 있으며, 미국의 경우 약 4500만명이 헤르페스심플렉스바이러스 감염에 이환되어 있으며, 매년 100만 명의 신환이 발병하는 것으 로 추산되고 있다(미 질병관리본부 webpage. CDC Fact Sheet: Genital Herpes). 헤르페스심플렉스바이러스 감 염은 과거 배양검사로 진단을 해왔으나, 민감도가 낮으며, 결과가 나오는 데에 시간과 비용이 많이 소요되는 등 애로점이 많아서 실제 임상에서는 검사 없이 경험적으로 진단하여 치료하는 경우가 많다. 그러나 최선의 치료를 위해서는 정확한 진단이 필수적이며, 제 1형과 2형의 감염을 감별하는 것도 중요하다. 1형의 헤르페스심플렉스 바이러스 감염의 경우 감염 첫해에 단지 평균 1회만 재발하며, 이후에는 재발이 드문 양호한 경과를 보이는 데 반해, 2형의 헤르페스심플렉스바이러스 감염의 경우에는 재발이 잦으며, 첫해에만 평균 4회나 재발한다. 따라서 2형 헤르페스심플렉스바이러스 감염의 경우에는 더 적극적인 치료와 면밀한 추적조사가 필수적이다(Tara Frenkl, Jeanette Potts, Campbell-Walsh Urology, 9th edition, Saunders, 2007, p. 371-385). 헤르페스심 플렉스바이러스 감염의 검사 중 미국 식약청의 승인을 받은 검사에는 항체검사인 Herpes-Select ELISA, Herpes- Select Immunoblot, Capita ELISA 등이 있다. 최근에 와서는 식약청 승인 없이 PCR이나 Light Cycler Assay 등 의 간단한 유전자검사법이 사용되고 있으나, 아직 1형과 2형의 헤르페스심플렉스바이러스 감염을 정확하게 감별 하는 상업화된 유전자분석법은 찾기 힘들다(Andrea Ferreria-Gonzalez, Angela M Calieno; Tiez Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Biology, 4th Edition, Elsevier Saunders, 2006. p.1555-1588). 이에 본 발명에서는 헤르페스심플렉스바이러스 감염의 유무 뿐 아니라 그 아형, 즉 1형인지 2형인지도 정확하게 감별하 기 위해 먼저 PCR로 증폭한 후 그 산물을 다시 DNA 칩 위에서 역교잡반응으로 분석하는 새로운 키트를 개발하였 다. 이러한 방법은 PCR후 전기영동만으로 파악하는 것보다 더 민감하고 특이성이 높다는 장점이 있다(Olive DM, Bean P. Journal of Clinical Microbiology. June 1999. p.1661-1669.). 매독은 인류 역사상 가장 오래된 STD로서, 페니실린의 대두에 따라 격감하였으나, 최근에는 구미의 백인 남성층 에서 다시 발병률이 증가한다는 보고가 있다(미국 질병관리본부, CDC Fact Sheet, Syphilis, 2006; Tara - 9 -
Frenkl, Jeanette Potts, Campbell-Walsh Urology, 9th edition, Saunders, 2007, p. 371-385). 매독의 진단 에는 실제 해결되지 않은 문제가 많다. 매독은 전통적으로 혈청검사 후에 암시야(dark field) 현미경하에 스피 로헤타균인 트리포네마 팔리둠을 관찰하는 방법이 주로 사용되어 왔다. 그러나 본 암시야 관찰법은 경험을 요하 며, 발병초기에는 진단 민감도가 낮아서 한계가 있다. 항체검사도 매독의 경성하감(chancre)이 발생한 후 1-3주 가 지날 때까지는 음성으로 나타난다. 소위 황금 표준적 방법(gold standard test)인 가토감염검사(rabbit infectivity test)는 정확하긴 하나 동물실험을 요하고 시간과 비용이 소용된다는 문제가 있다. 이 때문에 최근 에는 조기진단이 가능하도록 PCR과 역전사(reverse transcription) PCR이 시도되고 있다. PCR 시에 여타 스피로 헤타균과의 정확한 감별을 위해 트리포네마 팔리둠의 47kDa 유전자와 16s-rRNA, DNA polymerase I, rpf-1, rmp A, rmp B, BMP 유전자를 증폭하는 방법이 사용된다. 그러나 아직 각각의 유의성은 명확히 밝혀져 있지 않고, 아 직 상업화된 유전자검사 키트도 나와 있지 않다(Liu H, Rodes B, Chen CY, Steiner B. Journal of Clinical Micxrobiology. May 2001. p.1941-1946). 이에 본 발명에서는 매독감염을 더 조기에 정확하게 감별하려는 목적 하에, 트리포네마 팔리둠의 카복시펩티다제(carboxypeptidase) 유전자를 증폭하는 새로운 PCR법을 개발한 후, 그 산물을 DNA 칩위에서 역교잡반응으로 재확인하여, PCR만 하는 것 보다 민감도와 특이도가 더 개선된 방법을 개발하였다. [0028] [0029] [0030] 연성하감은 구미에서 최근 발병빈도가 감소하고 있으며, 국내거주 한국인에게는 보기 힘든 STD이다. 그 원인균 인 헤모필루스 듀크레이는 통상 궤양부위 그람도말염색으로 검사하나, 그 효용성에는 한계가 있으며, 배양하기 매우 어려운 균이다. 이 때문에 PCR방법이 새로운 표준적 진단법으로 대두되고 있다. 그러나 아직 미국 식약청 의 공인을 받은 검사는 없다. 일단 연성하감이 확인이 되면 매독과 HIV의 검사도 함께 하도록 권장되고 있다(미 국 질병관리본부, CDC Fact Sheet, Chancroid, 2006; Tara Frenkl, Jeanette Potts, Campbell-Walsh Urology, 9th edition, Saunders, 2007, p. 371-385). 본 발명에서는 연성하감의 원인균인 헤모필루스 듀크레 이의 16s-rRNA 유전자를 PCR로 증폭하여 그 산물을 DNA 칩위에서 역교잡반응으로 재확인하는 새로운 방법을 개 발하여, 그 진단 민감도와 특이도가 개선될 수 있도록 하였다. 오늘날 인간의 외성기를 침범하는 STD중 가장 중요하고 흔한 2대 질환은 앞에 기술한 음부포진과 HPV 감염이다. 미국의 경우 약 2500만 명이 HPV감염에 이환이 되어 있으며, 매년 600여만 명이 새로 감염되고, 성인 남성과 여 성 중 약 절반은 평생에 한번 이상 감염되는 것으로 추산되고 있다(CDC Fact Sheet, USA, 2006). 본 발명자들의 경험에 의하면 STD중 가장 흔히 발견되는 것이 HPV 감염이었다(상기 표 1 참조). HPV에는 약 100여 가지 종이 있으며, 약 40종이 외성기나 홍문의 점막을 침범하는 홍문외성기형(anogenital type) 또는 점막형(mucosal type)이다. HPV에는 그 병태에 따라 2가지 형이 있다. 하나는 소위 저위험형(low risk type)의 HPV로, 이는 사 마귀, 곤지름, 또는 콘딜로마(condyloma accuminatum)를 일으킨다. 다른 하나는 고위험형(high risk type)의 HPV로, 이는 자궁경부나 음경, 홍문 등에 암전구병변과 암의 발병을 유발할 수 있다. HPV 감염의 진단에는 크게 3가지 목적과 방법이 있다. 첫째는 HPV에 의한 STD 감염여부를 파악하는 것이며, 여기에는 통상 PCR 후 전기영 동이나 교잡반응으로 확인하는 방법이 이용된다. 둘째는 HPV의 유무를 파악하는 데에서 나아가 이환된 HPV의 위 험도를 파악함으로서 자궁경부암을 선별(screening) 하려는 목적 하에 시도된다. 이에는 미 식약청의 승인을 받 은 소위 Hybrid Capture Assay(Digene Corporation, USA)가 가장 널리 사용된다. 셋째는 HPV의 유무에서 나아 가 이환된 HPV의 정확한 아형 내지 유전자형을 파악하는 방법(genotyping test)이다. 이는 STD의 감염 진단 뿐 아니라 자궁경부암의 선별, 나아가 최근에 대두되는 HPV 백신의 적용 여부를 파악하는 데에 까지 널리 이용될 수 있다. PCR 후 염기서열분석으로 확인하는 것이 표준적인 유전자형 분석방법이나, 이는 시간과 비용이 많이 소요되며, 노동집약적이어서 한번에 소수의 검체 밖에 검사할 수 없다는 단점이 있다(Olive DM, Bean P. Journal of Clinical Microbiology. June 1999. p.1661-1669.). 이 때문에 최근에는 PCR 후에 DNA 칩위에서 다 수의 프로브와 역교잡반응을 하여 유전자형을 검사하는 방법이 주로 이용된다. 본 발명자들은 종래에 이러한 HPV genotyping DNA 칩을 개발하여 특허를 획득한 후 제품화에 성공, 대한민국 식약청 및 CE의 승인을 받고 시 판중이다. 이에 본 발명에서는 이를 이용하여 HPV의 L1 유전자를 PCR로 증폭하여 그 산물을 다시 DNA 칩위에서 역교잡반응으로 재확인하는 약식의 DNA 칩 방법을 적용하였다. 트리코모나스 바지날리스는 인체에만 기생하는 원충으로 성관계를 통해 전파되어 남녀의 요도와 여성의 질을 침 범하여 염증(Trichomoniasis)을 일으키는 대표적인 STD이다. 실제 흔한 STD로서, 매년 전 세계적으로 1억 7400 만명이 새로 감염되며, 미국의 경우 매년 신규 발병례가 600만으로 추산되고 있다(WHO, 1999; Tara Frenkl, Jeanette Potts, Campbell-Walsh Urology, 9th edition, Saunders, 2007, p. 371-385). 남성의 경우 다수가 증상이 없어서 모르고 지내며, 여성의 경우에도 절반은 증상이 없다. 통상 병원에 증상이 있어서 환자가 찾아 오면 신체검사나 현미경관찰(wet smear)으로 진단을 하게 된다. 그러나 무증상의 보균자를 찾는 방법의 개발이 필요한 상태이며, 이런 점에서 본 발명자들은 소변이나 질도말, 요도도말에서 신속하고 정확하게 트리코모나스 - 10 -
를 진단할 수 있는 DNA 칩 키트를 개발하였다. [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] 엄밀한 의미에서 STD는 아니나, STD와 유사하게 질염 및 하부요로 감염을 일으키고, STD와 감별진단이 필요하며, 본 발명의 검사에 포함되어야 할 세균으로서, 캔디다 알비칸스와 가드네렐라 바지날리스, 그리고 대 장균이 있다. 음순 및 질의 염증(vulvovaginitis)의 가장 흔한 원인균은 캔디다 알비칸스이다. 이는 정상적으로도 질과 음경 피부에 존재할 수 있고, 또한 성관계에 의해 전파될 수도 있다. 진단은 질분비물의 도말 염색 검사(wet smear, gram stain)에 의하며, 질의 ph는 정상인 것이 특징이고, 재발이 잦다는 문제가 있다. 이의 유전자진단 키트는 아직 상업화되어 있지 않다. 본 발명에서는 STD와의 감별을 위해 DNA 칩 키트에 포함시켰다. 여성에서 정상 질의 기생세균을 대신하여 자리 잡고, 세균성질염(bacterial vaginosis)을 일으켜서 고통을 주는 중요 원인균으로 가드네렐라 바지날리스가 있다. 진단은 수산칼륨과 함께 질분비물의 도말 염색 검사(Whiff test)에 의하며, 질의 ph가 상승되는 것이 특징이다. 최근에는 상업화된 DNA 프로브 키트가 나와 있으나, 아직 DNA 칩은 없다. STD와의 감별을 위해 역시 본 발명의 DNA 칩 키트에 포함시켰다. 대장균은 여성에서 방광염과 남성에서 전립선염의 주 원인균이다. 이는 질염 및 골반염증성 질환으로서의 STD, 그리고 남성에서 요도염 형태의 STD와 감별하는 데에 중요하다. 대장균은 통상 소변의 배양검사로 확진이 되나, 48-72시간 이상의 장시간 소요된다는 단점이 있다. 대장균을 분석하는 DNA 칩은 아직 상업화되어 있지 않다. 본 발명에서는, STD와의 신속한 감별 진단을 위해 DNA 칩 키트에 포함시켰다. STD의 진료에 있어서 또 하나 심각한 문제점은 항생제 내성이다. 대표적인 STD 세균인 임균의 경우, 통상 베타 락탐계(페니실린계) 항생제인 페니실린, 암피실린, 세팔로스포린, 그리고 테트라사이클린계 항생제인 옥시테트 라사이클린, 그리고 퀴놀론계 항규제가 선택되는 바, 최근 이들 항생제에 저항하는 임균이 급증하고 있는 실정 이다. 마찬가지로 클라마이디아 감염의 경우에도, 테트라사이클린계 항생제나 퀴놀론계 항생제가 선택되는 추세 이나, 이 역시 내성균이 급증하는 추세이다. 따라서 이러한 내성을 동시에 정확하게 분석할 수 있는 유전자진단 법, 특히 DNA 칩이 필요하나 찾기 힘들다. 이러한 유전자 진단법이 임상에서 실제로 진단에 도움이 되기 위해서는 갖추어야 할 조건이 많다. 우선 진단의 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity) 및 재현성(reproducibility)이 모두 100%에 가깝도록 우수해야 한 다. 아울러 검사의 방법이 용이하고 해석이 쉽고 간편해야 하며, 신속하게 결과를 얻을 수 있어야 한다. 또한 특별한 고가의 장비가 없어도 검사할 수 있어야 하며, 검사가 자동화되어 있어서 다수의 검체를 신속하게 검사 할 수 있어야 하고, 검사 비용도 저렴해야 한다. 이를 위해 PCR은 가급적 대상 세균 여러개를 하나의 튜브 내에 서 한번의 PCR 반응으로 증폭하여 검사할 수 있는 멀티플렉스형의 PCR일 필요가 있다. 아울러 PCR시 각 대상 세 균이 균주 수준까지 정확히 식별될 수 있도록 검사대상 유전자와 염기서열 부위가 적절하게 선택되어야 하고, 이에 맞추어 최적의 PCR 조건이 수립되어야 한다. 그러나 지금까지 STD의 주요 원인균과 관련균 14가지를 동시 에 검색할 수 있는 DNA 칩, 다중 PCR에 대한 보고는 없었으며, 더욱이 이러한 PCR 키트는 아직 상업화되어 있지 않다. 또한, PCR은 단지 표적 핵산의 증폭수단이지, 그것만으로 세균진단을 확진할 수 없다는 것이다. PCR 후에는 증 폭된 산물이 원하는 세균의 DNA인지를 정확하게 확인하는 절차가 반드시 필요하다. 아울러 가급적이면 세균의 유전자형을 정확하게 판독하여 항생제 내성이나 생물학적 침해도, 예후 등을 정확하게 예측할 수 있는 검사 또 한 필요하다. 이를 위해서는 각종의 STD 원인균을 동시에 정확하고 신속하게 분석하고 여타 질환과 감별하며, 나아가 항생제 내성 등의 정보도 함께 알 수 있는 DNA 칩의 개발이 시급하다. 이에 따라, 본 발명에서는 상기한 14종의 STD균의 속과 종 뿐 아니라 아종까지 모두 정확하게 탐지할 수 있고, 나아가 테트라사이클린계 및 베타-락탐계 항생제의 내성도 분석할 수 있는, 성교전파성질환 원인균의 탐지 또는 유전자형 분석용의 DNA 칩, 키트, 및 이를 이용한 탐지 또는 분석방법을 개발하였으며, 실제 진단에 이용할 수 있도록 하였다. 한편, 종래에 본 발명자들은 임균, 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰 및 마이코코플 라스마 제니탈리움의 존재 유무를 동시에 분석할 수 있으며, 이들 균의 테트라사이클린 항생제에 대한 내성도 분석할 수 있는 다중 PCR과 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이를 개발하여 특허(특허등록 제619189호)를 획득 하여 상품화에 성공한 바 있다. 본 발명은 여기서 더 나아가 추가로 마이코플라스마 제니탈리움, 마이코플라스마 호미니스, 매독균인 트리포네 마 팔리둠, 연성하감의 헤모피루스 듀클레이, 음부포진의 원인인 헤르페스심플렉스바이러스 1 형과 2형, HPV, - 11 -
트리코모나스 바지날리스의 7개 STD 원인균과 함께, STD와 감별해야할 세균인 캔디다 알비칸스, 가드네렐라 바 지날리스 및 대장균의 존재 유무와, 또한 테트라사이클린 및 베타 락탐계 항생제에 대한 내성을 신속하고 정확 하게 분석할 수 있는 유전자 분석형 DNA 칩과 다중(multiplex) PCR 분석키트를 추가로 개발한 것이다. 발명의 내용 [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] 해결 하고자하는 과제 본 발명의 목적은, STD의 중요 원인 및 관련균인 임균, 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라즈마 유레아라이 티쿰, 마이코플라스마 제니탈룸, 마이코플라스마 호미니스, 트리포네마 팔리둠, 헤모필러스 듀클레이, 헤르페 스심플렉스바이러스 1 형과 2형, HPV, 트리코모나스 바지날리스, 캔디다 알비칸스, 가드네렐라 바지날리스 및 대장균의 존재 여부 뿐 아니라, 테트라사이클린계 항생제와 페니실린, 암피실린, 세팔로스포린 등의 베타 락탐 계 항생제에 대한 내성을 각각 신속하고 정확하게 진단할 수 있는, 유전자 분석용 DNA 칩, 키트 및 이의 방법을 제공하고, 이를 실제 임상 진단에 응용하는 데 있다. 본 발명에 의하면, 대표적인 STD 원인 및 관련균을 모두 신속정확하게 자동분석할 수 있을 뿐 아니라, 치료 항생제 선택에도 도움이 된다. 본 발명이 해결하고자 하는 과제 및 목적을 더욱 구체적으로 살펴보면 다음과 같다. 첫째, STD의 중요 원인 및 관련균인 임균, 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라즈마 유레아라이티쿰, 마이코 플라스마 제니탈룸, 마이코플라스마 호미니스, 트리포네마팔리둠, 헤모필러스 듀클레이, 헤르페스심플렉스바이 러스 1 형과 2형, HPV, 트리코모나스 바지날리스, 캔디다 알비칸스, 가드네렐라 바지날리스, 대장균의 게놈 또 는 크립틱 플라스미드의 유전자와, STD균의 테트라사이클린계 및 베타 락탐계 항생제의 내성에 관여하는 유전자 를, 소수의 PCR 반응으로 동시에 증폭하여 분석할 수 있는 다중 PCR의 방법을 제공하는 것이다. 둘째, 상기 14종의 균의 유전자와 테트라사이클린계 및 베타 락탐계 항생제 내성 유전자와 인체형 베타글로불빈 의 유전자를 다중 PCR로 증폭하기 위한 효과적인 프라이머를 제공하는 것이다. 세째, 상기 14종의 균에 특이적인 각 유전자와 대조 유전자 및 항생제 내성 유전자를 더욱 정확하게 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하는 것이다. 네째, 상기 프로브가 집적되어 있는, 상기 14종의 균과 항생제 내성 유전자의 탐지 및 유전자형 분석용 DNA 칩 을 제공하는 것이다. 다섯째, 상기 프로브를 포함하는, 상기 14종의 균과 항생제 내성 유전자의 탐지 및 유전자형 분석용 키트를 제 공하는 것이다. 여섯째, 상기 프로브를 이용한, 상기 14종의 균과 항생제 내성 유전자의 탐지 및 유전자형 분석방법을 제공하는 것이다. [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] 과제 해결수단 본 발명의 성교전파성질환(sexually transmitted disease; STD) 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석용의 DNA 칩은, 서열번호 37 내지 66의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 서열번호 66의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브는 인체형 베타글로빈 유전자와 상보적으로 결합한다. 본 발명의 DNA 칩에 있어서, 상기 서열번호 66의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브는, 5' 말단이 Cy5 로 표지된 서열번호 67의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합한다. 본 발명의 DNA 칩에 있어서, 프로브를 집적할 수 있는 집적부위(well)가 8개로 구획되어 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 성교전파성질환(sexually transmitted disease; STD) 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석용 키트는, 상기 DNA 칩, 성교전파성질환 원인균 유래의 DNA를 증폭하기 위한 프라이머세트, 및 상기 DNA 칩과 상보적으로 결합하는 증폭된 DNA를 검출하기 위한 표지수단을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 키트에 있어서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 유레아플라스마 유레아라 이티쿰(Ureaplasma urealyticum) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 마이 코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 - 12 -
갖는 클라마이디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 임균(Neisseria gonorrhoeae) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열을 갖는 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열을 갖는 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열을 갖는 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 17 및 서열번호 18의 염기서열을 갖는 대장균(coliform bacteria) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번 호 19 및 서열번호 20의 염기서열을 갖는 헤모필러스 듀클레이(Haemophilus ducreyi) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 21 및 서열번호 22의 염기서열을 갖는 헤르페스심플렉스바이러스(herpes simplex virus) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 23 및 서열번호 24의 염기서열을 갖는 트리포네마 팔리둠 (Treponema pallidum) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 25 및 서열번호 26의 염기서열을 갖는 인유두종바이 러스(human papillomavirus; HPV) 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 27 및 서열번호 28의 염기서열을 갖는 SHV 유전자(beta-lactamase SHV-12 gene) 증폭용 프라이머세트, 서열번호 29 및 서열번호 30의 염기서열을 갖 는 TEM 유전자(CMT-type beta lactamase gene) 증폭용 프라이머세트, 서열번호 31 및 서열번호 32의 염기서열 을 갖는 TetM 유전자(tetracycline resistant gene M) 증폭용 프라이머세트, 서열번호 33 및 서열번호 34의 염 기서열을 갖는 AmpC 유전자(cephalosporinase gene) 증폭용 프라이머세트, 또는 서열번호 35 및 서열번호 36의 염기서열을 갖는 TetC 유전자(tetracycline resistant gene C) 증폭용 프라이머세트를 포함하는 것이 바람직하 다. [0054] [0055] [0056] [0057] [0058] 본 발명의 키트에 있어서, 표지수단은 Cy5, Cy3, 바이오틴 결합물질, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈 렌황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스레드로 이 루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명의 키트에 있어서, 표지수단이 Cy5일 때 표지된 dctp와 표지되지 않은 dctp 간의 몰농도비를 1:12.5로 하여 반응시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석방법은, (a) 성교전파 성질환 원인균의 핵산 증폭용 프라이머를 이용하여 상기 DNA를 단일(single) 또는 다중(multiplex) PCR 증폭방 법에 의해 증폭하는 단계; (b) 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 DNA 칩에 상기 증폭된 DNA를 하이브 리드시키는 단계; 및 (c) 상기 하이브리드에 의해 얻어진 혼성화물을 검출하는 단계를 포함하는 것이 바람직하 다. 본 발명의 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석방법에 있어서, 단일 또는 다중 PCR 증폭방법은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 가드네렐라 바지날리스 핵산 증폭용 프 라이머세트, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 유레아플라스마 유레아라이티쿰 핵산 증폭용 프라이 머세트, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 마이코플라즈마 호미니스 핵산 증폭용 프라이머세트, 서 열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 클라미디아 트라코마티스 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 임균 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열을 갖 는 트리코모나스 바지날리스 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열을 갖는 마이코 플라즈마 제니탈리움 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열을 갖는 캔디다 알비칸 스 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 17 및 서열번호 18의 염기서열을 갖는 대장균 핵산 증폭용 프라이머세 트, 서열번호 19 및 서열번호 20의 염기서열을 갖는 헤모필러스 듀크레이 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 21 및 서열번호 22의 염기서열을 갖는 헤르페스심플렉스바이러스 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 23 및 서열번호 24의 염기서열을 갖는 트리포네마 팔리둠 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 25 및 서열번호 26의 염기서열을 갖는 인유두종바이러스 핵산 증폭용 프라이머세트, 서열번호 27 및 서열번호 28의 염기서열을 갖는 SHV 유전자(beta-lactamase SHV-12 gene) 증폭용 프라이머세트, 서열번호 29 및 서열번호 30의 염기서열을 갖 는 TEM 유전자(CMT-type beta lactamase gene) 증폭용 프라이머세트, 서열번호 31 및 서열번호 32의 염기서열 을 갖는 TetM 유전자(tetracycline resistant gene M) 증폭용 프라이머세트, 서열번호 33 및 서열번호 34의 염 기서열을 갖는 AmpC 유전자(cephalosporinase gene) 증폭용 프라이머세트, 및 서열번호 35 및 서열번호 36의 염 기서열을 갖는 TetC 유전자(tetracycline resistant gene C) 증폭용 프라이머세트로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머세트를 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석방법에 있어서, 단일 또는 다중 PCR 증폭방법은 (a) 상기 프라이머세트를 주형 DNA, Taq DNA 중합효소, dntp, 증류수 및 PCR 버퍼와 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합물을 95 에서 10분간 예비변성시키는 단계; (c) 상기 예비변성된 산물을 94 에 - 13 -
서 30초간 변성시키고, 58 에서 30초간 프라이머 어닐링시키고, 72 에서 30초간 연장시키는 것을 총 40회 반 복하는 단계; 및 (d) 상기 연장된 산물을 72 에서 5분간 최종연장시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] 본 발명의 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석방법에 있어서, 다중 PCR 증폭방법은 서열번호 1과 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 3과 서열번호 4의 염기서 열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 5와 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 7과 서열번호 8 의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 9와 서열번호 10의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 11과 서열번호 12의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 13과 서열번호 14의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 및 서열번호 15와 서열번호 16의 염기서열을 갖는 프라이머세트 간의 몰농도비가 1:1:1:1:1:1:1:1인 것이 바람직하 다. 본 발명의 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석방법에 있어서,다중 PCR 증폭방법은 서열번호 17과 서열번호 18의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 19와 서열번호 20의 염 기서열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 21과 서열번호 22의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 23과 서열 번호 24의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 및 서열번호 25와 서열번호 26의 염기서열을 갖는 프라이머세트 간의 몰농도비가 1:1:1:1:1인 것이 바람직하다. 본 발명의 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석방법에 있어서,다중 PCR 증폭방법은 서열번호 27과 서열번호 28의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 29와 서열번호 30의 염 기서열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 31과 서열번호 32의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 서열번호 33과 서열 번호 34의 염기서열을 갖는 프라이머세트, 및 서열번호 35와 서열번호 36의 염기서열을 갖는 프라이머세트 간의 몰농도비가 1:1:1:1:1인 것이 바람직하다. 본 발명의 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석방법에 있어서,서열번 호 1과 서열번호 2의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 419bp, 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 373bp, 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 333bp, 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 321bp, 서열번호 9와 서열번호 10의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 284bp, 서열번호 11과 서열번호 12의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 262bp, 서열번호 13과 서열번호 14의 프 라이머세트에 의한 PCR 산물이 207bp, 서열번호 15와 서열번호 16의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 148bp의 크기인 것이 바람직하다. 본 발명의 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석방법에 있어서,서열번 호 17과 서열번호 18의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 467bp, 서열번호 19와 서열번호 20의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 439bp, 서열번호 21과 서열번호 22의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 350bp, 서열번호 23과 서열번호 24의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 260bp, 서열번호 25와 서열번호 26의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 191bp의 크기인 것이 바람직하다. 본 발명의 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석방법에 있어서,서열번 호 27과 서열번호 28의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 679bp, 서열번호 29와 서열번호 30의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 412bp, 서열번호 31과 서열번호 32의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 291bp, 서열번호 33과 서열번호 34의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 208bp, 서열번호 35와 서열번호 36의 프라이머세트에 의한 PCR 산물이 152bp의 크기인 것이 바람직하다. 본 발명자들은 검사하려는 14종의 균의 유전자와 5종의 항생제 내성 유전자 및 인체형 베타글로빈 유전자에 대 해 각각 검사할 유전자와 그 부위를 결정하고 이를 증폭하는 데 필요한 PCR 프라이머를 고안하고(실시예 1), 대 조군 균주와 각 균주의 표적 유전자의 DNA 클론을 확보하고(실시예 2), 임상검체의 채취 및 저장법을 수립하고 (실시예 3), 검체로부터의 DNA 분리 방법을 수립하고(실시예 4), 세균의 표적유전자에 대한 단일 PCR의 조건을 수립하고(실시예 5), 임상 검체에서 단일 PCR 및 시퀀싱을 수행하여 그 결과를 데이터베이스화하고(실시예 6과 7), 14종의 균과 5종의 항생제 내성 유전자, 그리고 인체형 베타글로빈 유전자에 대한 다중 PCR의 조건을 수립 하고(실시예 8), 인체 검체에서 상기 멀티플렉스 분석을 수행함으로써 그 분석방법의 적정성을 판단하고(실시예 9), 상기 14개 균과 5개 항생제내성 유전자, 그리고 인체형 베타글로빈 유전자의 하이브리다이제이션 분석을 위 한 프로브의 디자인과 이를 이용한 DNA 칩을 제작하고(실시예 10과 11), 표준물질을 상기 DNA 칩을 이용하여 분 석한 후 그 분석조건을 수립하고(실시예 12), 상기 DNA 칩을 이용하여 임상검체를 분석하여 상기 14종의 균의 감염여부 진단 뿐 아니라 감염된 균들의 유전자형을 판별하고 항생제 내성도 파악할 수 있음을 확인(실시예 1 3)하고, 본 발명을 완성하게 되었다. - 14 -
[0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] 본 발명의 DNA 칩에 의하면, 표적 세균의 유전자 별로 5 내지 7개의 프로브를 사용할 수 있는 바, 표적 유전자 별로 하나의 프로브를 사용하여 검색할 때 초래될 수 있는 가음성과 가양성을 피하며, 진단 민감도와 특이도를 극대화할 수 있다. 본 발명의 DNA 칩에 의하면, 인체형 베타글로빈, 액틴 또는 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 유전자를 기준마커로 추가 포함할 수 있으며, 상기 기준마커가 베타글로빈인 경우에는 바람직하게는 서열 66에 나타난 염기서열을 가진다. 기준 마커를 사용함으로써 DNA 칩에서의 하이브리드화 반응, 이전 과정인 DNA 분리 과정 및 PCR 증폭과정이 적합했는지를 검증하고 가음성을 파악할 수 있다. 본 발명의 DNA 칩에 의하면, 베타락탐계와 테트라사이클린계 항생제 내성 유전자를 함께 분석하여 STD의 치료에 가장 널리 사용되는 항생제에 대한 내성을 미리 정확하게 파악하여 치료 방침 결정과 치유에 도움을 줄 수 있다. 상기 베타락탐계와 테트라사이클린계 항생제 유전자의 프로브는 바람직하게는 서열번호 56 내지 65의 염 기서열을 갖는다. 본 발명의 DNA 칩의 제조방법은, STD 원인균의 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열의 5'말단에 아민이 결합된 DNA 프로브를 제조하는 공정; 제조된 DNA 프로브를 알데히드가 결합된 고체의 표면에 결합시키는 공정; 및 상기 DNA 프로브가 결합된 고체 표면에 존재하는 아민과 결합하지 않은 알데히드를 환원시키는 공정을 포함 한다. 상기 고체의 표면에서 프로브 DNA와 알데히드의 결합은 아민과 알데히드의 시프염기반응을 통해 수행될 수 있으며, 상기 고체는 유리, 실리콘 이산화물, 플라스틱 또는 세라믹으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 DNA 칩을 포함하는 키트는, 서열번호 1 내지 서열번호 36의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 STD 원인균의 증폭용 프라이머와 표지수단을 포함할 수 있고, 인체형 베타글로빈 프라이머를 더 포함할 수 있다. 상기 표지수단은 공지된 여러가지 표지물을 사용할 수 있으며, 예를 들면, Cy5, Cy3, 바이오틴 결합물질, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이 트(TMRITC), x-로다민 또는 텍사스레드를 사용할 수 있다. Cy5를 이용하여 표지할 경우, 표지된 반응물을 검출 할 때 추가적인 반응없이 직접 콘포칼 레이저 스캐너와 같은 분석기를 이용하여 형광신호를 분석 할 수 있어 효 율적이며 민감한 결과를 얻을 수 있다. [0072] 효 과 본 발명에 따른 DNA 칩과 키트를 이용하면, STD의 원인 및 관련균 가운데 가장 중요한 14종의 균인 임균, 클라 마이디아 트라코마티스, 유레아플라즈마 유레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움, 마이코플라스마 호미니스, 트레포네마 팔리둠, 헤모필러스 듀클레이, 헤르페스심플렉스바이러스 1 형과 2형, HPV, 트리코모나스 바지날리스, 캔디다 알비칸스, 가드네렐라 바지날리스, 대장균의 감염 여부와, 테트라사이클린계 및 베타 락탐 계 항생제에 대한 내성을 정확하고 신속하게 동시에 검색할 수 있다. 또한 본 발명에 의하면, STD 진단의 민감 도나 특이도, 재현성이 모두 100%에 가까울 정도로 뛰어나며, 복합감염도 정확히 진단할 수 있으며, 검사의 방 법이 간편하며, 결과 해석도 용이하고, 짧은 시간 내에 다수의 검체를 신속하고 정확하게 자동 분석할 수 있다 는 점에서 기존의 방법보다 우수하며, 경제적이다. 따라서, 본 발명은 STD의 1차 검색이나 확진과 항생제 선택 및 치료방침 결정, 치료 후 추적조사 등을 위해 널리 사용될 수 있으며, 기존의 배양이나 염색, 면역학적 검사, 그리고 PCR, 하이브리드 캡쳐 분석법(hybrid capture assay) 등의 상업화된 DNA 칩 및 키트를 대체할 수 있는 바, 의학산업상 매우 유용하다. [0073] [0074] [0075] [0076] 발명의 실시를 위한 구체적인 내용 이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입 증하기 위한 실시예일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정된 것은 아니다. 실시예 1: PCR 프라이머의 고안 핵산 증폭, 특히, PCR 증폭에서의 성공은 프라이머가 자신의 타겟 서열에만 어닐링하는 특이성에 의존하기 때문 에, 프라이머가 그의 완전한 상보체에만 어닐링하는지 또는 하나 이상의 미스매치(mismatch) 뉴클레오티드 서열 을 갖는 서열에도 어닐링하는지 여부는 어닐링 온도에 따라 결정된다. 일반적으로, 어닐링 온도가 높으면, 완전한 매치(match) 주형에 대한 프라이머의 특정 어닐링 가능성이 더욱 높 아지고, 이에 타겟 서열만 증폭될 가능성이 더욱 높아진다. 어닐링 온도가 낮으면, 주형과 프라이머간의 보다 - 15 -
많은 미스매치에 대하여 내성(tolerance)이 발생하고, 결국 비-타겟 서열에 대한 증폭이 증가한다. 어닐링 온도 를 조절하면, 주형과 프라이머 사이의 페어링 특이성을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 하나의 프라이머만 존재 하는 대조군에서 생성물이 발생한다면, 이러한 결과는 상기 단일 프라이머가 주형의 하나 이상의 부위에 어닐링 한다는 것을 의미한다. 이러한 경우, 어닐링 온도를 상승시키는 것이 바람직하다. 프라이머의 어닐링 특이성에 대한 어닐링 온도의 상기 효과를 고려하면, 어닐링 온도에 따라 프라이머 어닐링을 조절할 수 있어, 프라이머 디자인에 무관하게 프라이머의 어닐링 특이성을 개선시킬 수 있는 어닐링 조절 프라이머 시스템에 대한 강한 요 구가 있음을 알 수 있다. [0077] [0078] 따라서, 검사하려는 14개 원인균의 유전자 및 항생제 내성 유전자별로 검사할 유전자 부위를 결정하고, 이를 PCR로 증폭하는 데 필요한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 조합을 고안하였다. 그 방법은 다음과 같으며, 각각 의 프라이머의 특성은 하기 표 2에 정리하였다. [표 2] PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 [0079] [0080] (염기서열중 M은 A 또는 C; W는 A 또는 T; Y는 C 또는 T를 의미한다) [0081] [0082] 검사할 유전자 부위는 세균의 계통(phylogeny) 파악에 가장 널리 사용되는 16S rrna나 23S rrna, 또는 양자의 중간 및 경계부위에서 1차적으로 선택하였다(Olsen GJ 등 Ribosomal RNA: a key to phylogeny. FASEB 1993;7:113-123; Lane DJB 등, Proc Natl Acad Sci USA. 1985;92:6955-9). 이 때 PCR 증폭부위의 기준으로서, 5' 말단에는 모든 세균 및 동일 속의 세균에 동일한 염기서열의, 소위 보존 적 부위(highly conserved region)를 두어 표적 세균의 종(genus)에 특유한 염기서열을 기본으로 하였다. 만약 16S rrna나 23S rrna, 16S-23S 사이 부위에 적절한 염기 서열이 없을 경우에는 여타 부위에서 표적 세균에 특유 - 16 -
한 고유의 유전자와 고유의 염기서열을 선택하여 분석할 수 있다. 예컨대, 임균의 경우 Neisseria gonorrhoeae 와 Neisseria meningitidis의 16S rrna의 유사성은 98% 이상이어서 임상검체에서 16S rrna 유전자에 특이한 프 라이머를 사용하여 Neisseria gonorrhoeae만을 검색하는 PCR 반응을 수행하는 것은 매우 어려운 일이다. 실제 본 발명자들이 Neisseria gonorrhoeae의 감염이 의심되는 많은 임상 검체를 대상으로 PCR 반응을 수행하여 DNA 염기서열을 분석한 결과, 전체 검체의 약 8%는 Neisseria gonorrhoeae이 아닌 Neisseria meningitidis균이 검 색되었다. 이에 본 발명에서는 위양성을 검색할 가능성이 있는 Neisseria gonorrhoeae의 16S rrna에 특이적으로 반응하는 프라이머 대신, Neisseria gonorrhoeae의 크립틱 플라스미드(cryptic plasmid) pjd1에 특이적으로 반 응하는 프라이머를 사용하였다. [0083] [0084] [0085] Ureaplasma urealyticum과 Ureaplasma parvum의 16S rrna는 99% 이상의 상동성을 나타낸다. 임균의 경우와 같 이 Ureaplasma urealyticum의 16S rrna에 특이적으로 반응하는 프라이머를 사용하였을 경우, Ureaplasma urealyticum을 Ureaplasma parvum와 구분하여 선택적으로 검색하기 어렵기 때문에, 본 발명에서는 두 균종간의 구분이 가능한 UreB 유전자에 특이적으로 반응하는 프라이머를 사용하였다. Chlamydia trachomatis는 같은 속의 Chlamydia muridarum, Chlamydia suis, Chlamydophila caviae의 16S rrna 와 각각 98%, 97% 그리고 95%의 상동성을 나타낸다. Chlamydia trachomatis를 특이적으로 검색하기 위하여 본 발명에서는 Chlamydia trachomatis의 크립틱 플라스미드인 puch1에 특이적으로 반응하는 프라이머를 제작하였다. Mycoplasma hominis와 Mycoplasma genitalium의 16S rrna 상동성은, 같은 Mycoplasma속 중에서도 다소 떨어지 는 75% 수준이지만, 보존지역에 특이적으로 반응하는 프라이머를 사용하였을 경우, M. hominis와 M. genitalium 는 구별 검색이 가능하지만 다른 Mycoplasma속과 Ureaplasma속을 검색할 우려가 있기 때문에, M. hominis와 M. genitalium의 균종을 보다 정확히 검색하기 위하여 16S rrna의 보존지역이 아닌 비보존지역에서 각 균종에 특이적으로 반응하는 프라이머를 사용하였다. [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] [0091] 실시예 2: 대조군 균주와 검체 및 그 클론의 확보 검사하려는 14개 원인균 및 항생제 내성 유전자별로 표준적인 양성 대조군 균주 및 DNA를 미국의 ATCC사 (Manassas, VA20108, USA.)로 부터 구입하였으며, 이와 함께 기존에 각 세균의 감염이 확인된 검체 및 항생제 내성 유전자를 내재한 항생제 내성 검체를 얻었다. 이들로부터 DNA를 분리한 후 각각 원인균 별로 검사하고자 하는 표적 유전자 부위를 PCR로 증폭한 후, 클로닝과 시퀀싱 반응으로 확인하여 각각에 대한 플라스미드 클론을 확보하였다. 클로닝 실험 방법은 다음과 같이 공지의 방법을 이용하였으며, PCR의 방법은 이후의 실시예와 중복되므로 여기 서는 기술을 생략한다. 1) PCR로 증폭된 14개의 STD 원인균의 각 유전자와 인체형 베타글로빈 유전자의 PCR 산물을 아가로스 젤에서 Gel recovery kit(zymo Research, USA)를 이용하여 분리한 후, 그 농도를 분광광도계나 아가로스 젤의 밀도측 정분석(densitometry)으로 측정하였다. 2) 냉동 보관되어 있던 pgem-t Easy Vector(Promega, A1360, USA)와 2x Rapid Ligation Buffer를 녹여 손끝으 로 튜브를 살짝 흔들어 섞어준 후, 가볍게 원심분리를 하여 클로닝하고자 하는 삽입 DNA와 함께 하기 표 3의 조 성으로 라이게이션 반응(ligation reaction)을 0.5ml 튜브에서 실시하였다. [표 3] 라이게이션 반응 조성 [0092] 성분 표준반응용액 양성대조군 배경대조군 2x Rapid Ligation Buffer, 5 μl 5 μl 5 μl T4 DNA 리가아제(ligase) pgem-t Easy Vector(50 ng/μl) 1 μl 1 μl 1 μl PCR 산물 X μl * - - 삽입 DNA - 2 μl - T4 DNA 리가아제(3 Wess units/) 1 μl 1 μl 1 μl 최종부피(탈이온수 첨가로 조절) 10 μl 10 μl 10 μl - 17 -
* PCR 산물과 벡터가 3:1의 비율이 되도록 조절한다. 즉 3.0kb 크기의 벡터 50ng에 0.25kb와 0.45kb의 삽입 DNA를 라이게이션할 경우 12.4ng과 22.5ng씩 반응시킨다. [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] [0098] [0099] [0100] 3) 각 반응액을 피펫으로 잘 섞어 준 후, 실온에서 한 시간 정도 라이게이션 반응을 한다. 다수의 형질전환 산 물(transformants)이 필요할 경우에는 4 에서 하룻밤 동안 반응할 수도 있다. 4) 라이게이션된 샘플은 영하 70 에 보관된 JM109 숙주세포(competent cell)(=1x10 8 cfu/μg DNA) 50μl를 이용 하여 형질전환(transformation)을 시도하였다. 5) 우선 1.5ml 튜브에 앞에서 얻은 라이게이션 반응 산물(ligate) 2μl를 넣고, 직전에 해동한 숙주세포 (competent cell) 50μl를 다시 넣어 잘 섞어 준 후, 얼음조(ice bath)에서 20분간 반응을 시켰다. 6) 세포를 42 항온수조에 넣어 45-50초간 열충격(heat shock)을 주고, 즉시 다시 얼음 속에 넣어 2분간 방치 하였다. 7) 여기에 실온으로 맞춰진 SOC 배지 950μl를 넣어, 37 진탕기(shaking incubator) 내에서 약 1시간 반 동안 배양을 하였다. 8) 배양액 중 약 100μl를 암피실린, IPTG, X-Gal이 함유된 LB 플레이트에 도포한 후, 플레이트를 뒤집어서 37 로 맞춘 배양기 내에서 16-24 시간동안 배양을 한 후, 콜로니수를 측정(colony counting)하고, 백색의 콜로니 (white colony)만을 선택해서 3ml LB/암피실린 배양액에서 배양한 후 DNA 미니프렙 (mini prep.) 방법으로 플 라스미드 DNA를 분리 정제하였다. 이후 PCR 및 제한효소(restriction enzyme) 절단반응을 이용하여 삽입 DNA가 제대로 들어갔는지를 확인하였고, 이렇게 얻어진 클론의 염기서열을 자동염기서열 분석기를 이용하여 분석하였 다. 양성 대조군 균주와 확보한 플라스미드 클론의 특징은 하기 표 4에 정리하였다. [표 4] 양성 대조군 균주 및 플라스미드 클론 [0101] 표적 세균 양성 대조군 (ATCC No.) 클론의 종류 N. gonorrhoeae 53420D Plasmid pjd1 C. trachomatis VR-879 Cryptic plasmid U. urealyticum 27618 ureb gene M. genitalium 33530D 16S rrna gene T. vaginalis 30001D repeated DNA target H. ducreyi 700724-D 16S rrna gene M. hominis 23114D 16S rrna-rrna operon G. vaginalis 49145D 16s-23s rrna T. pallidum 632625 carboxypeptidase gene HSV VR-733 TM (HSV1)/ VR-540 TM (HSV2) C. albicans 102312D-5 18S rrna gene Human Papilloma Virus HPV 6(45150) HPV 11(45151) HPV 16(45113) HPV 18(45152) secreted portion of glycoprotein G-2(US4) HPV whole genome [0102] [0103] 실시예 3: 임상 검체의 채취 인체에서 요도나 자궁경부, 구강의 분비물(discharge) 및 세포를 면봉이나 세포솔로 채취하여 얻은 스왑 검체, - 18 -
소변, 요도 세척액, 전립선액 등의 다양한 검체를 채취한 후 운반하고 검사할 때 까지 저장하는 적정 방법을 수 립하였다. 여기에서 남성 소변의 채취는 전통적인 3배 검사(3-glass test)에 따라 VB(voided bladder)1과 VB2, VB3 및 전립선분비액(expressed prostatic secretion, EPS)으로 나누어서 채취하였다. VB1은 배뇨할 때 맨 처 음에 나오는 10-20ml의 소변, 즉 첫줄기 소변(early stream urine)을 가리킨다. VB2는 배뇨의 중간에 나오는 중간줄기 소변(mid-stream urine)을 가리킨다. 전립선분비액은 전립선마사지를 한 후에 요도로 나오는 분비액을 가리킨다. VB3는 전립선마사지를 한 후 배뇨하게 하여 가장 처음에 나오는 소변 10-20ml을 가리킨다. 여기에서 VB1은 요도의 검체, VB2는 방광의 검체, VB3는 전립선의 검체를 대변한다. [0104] [0105] [0106] [0107] 검체 채취방법과 여기에 사용되는 도구, 그리고 검체의 운반 및 보관 방법은 다음과 같다. 본 STD검사에 있어서 표준 검체는 남성의 경우 요도 스왑 검체와 첫줄기 소변(VB1) 검체로 하였고, 필요에 따라 요도분비물이나 전립 선마사지 후 소변(VB3)를 추가하였다. 이에 대해 여성의 경우에는 자궁경부의 스왑 내지 스크레이프(scrape) 검 체를 표준검체로 하였으며, 여기에 필요에 따라 질(vagina)의 스왑이나 분비물, 소변을 추가하였다. 여기에 동 성연애자나 직업 여성의 경우에는 추가로 직장 및 항문과 구강에서도 검체를 얻을 수 있다. 남성에서 요도의 스왑 검체를 얻을 때는 끝에 면이나 솔이 붙은 멸균된 면봉을 요도구의 2-3cm 안쪽으로 삽입해 서 좌우로 돌려서 요도 내 분비물 및 세포가 잘 집적(collect)되게 하여 채취하였다. 아울러 여성에서 자궁경부 의 스왑 검체를 얻을 때는 끝에 솔이 붙은 멸균된 면봉을 자궁경부 내부에 삽입해서 좌우로 돌려서 분비물 및 세포가 잘 집적되게 하여 채취하였다. 여기에서 스왑 채취용 도구로는 COPAN사(COPAN innovation, USA)의 면봉 이나 상아메디칼(서울, 대한민국)의 Pap-brush, 또는 이에 준하는 제품을 사용한다. 이후 멸균된 검체보관용액 이 들어있고, 나사 형 뚜껑(screw cap)이 있는 튜브 내에 면봉의 면부분이나 솔부분을 넣어서 이동 및 보관시켰 다. 소변이나 스왑 검체 등 채취된 검체는 가급적 채취 후 48시간 이내에 분석실로 운반되어야 하며, 운송 중에는 가급적 냉장 온도를 유지해야 한다. 이렇게 해야 유전자증폭이 까다로운 세균의 분리가 용이하며, 성장이 빠른 세균의 경우, 과성장을 억제할 수 있기 때문이다. 검체 채취용기 내에는 멸균 상태의 검체 보관용액을 미리 채워 놓게 된다. 그 조성은 37% 내지 40% 포름알데히 드 100ml에 메탄올 15ml, 6.5g의 Na 2 HPO 4, 4.0g의 NaH 2 PO 4 를 혼합한 후 3차 멸균 증류수를 첨가하여 최종 용적 1 리터로 하였다. [0108] 소변 검체의 경우, 멸균된 톱니 형 뚜껑이 있는 용적 30ml의 튜브에 상기한 방법대로 채취한 신선 소변 10ml 내 지 20ml을 넣고 이동하여 4 에 보관해 두었다가 검사한다. 또는 원심분리하여 세포 침전층을 얻어서 -70 에 보관시켜 두었다가 나중에 DNA를 분리하도록 하였다. [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] [0114] 실시예 4: DNA 분리 상기 실시예 3의 다양한 인체 검체로부터 상업화된 키트를 이용하여 다음과 같이 DNA를 분리 및 정제하였다. <소변 검체> 50ml 코니컬 튜브에 소변을 넣고 3,000rpm 에서 30분간 원심분리를 한 후 상등액을 버리고, 펠렛에 200 내지 500μl의 PBS로 풀어준 후 1.5ml 미세원심분리기에서 2분간 원심분리하여 다음 과정을 진행하였다. <질 스왑, 요도 바르보타지(barbotage), 요도 스왑, 전립선분비액, 요도 분비물 또는 정액 검체> 1.5ml 튜브에 채취한 샘플 0.8ml을 옮겨 미세원심분리기에 넣고, 12,000rpm에서 2분간 원심분리하여 세포를 가 라앉힌다. 상층액을 제거하고 500μl 1x PBS를 첨가하였다. Vortex를 이용하여 세포를 용액과 잘 섞어 준다. 12,000rpm에서 2분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 200μl의 Buffer TL를 첨가하였다. 20μl의 Protease K를 첨가한 후, 볼텍스(vortex)를 이용하여 잘 혼합하였다. 항온조 56 에서 30분간 정치 반응하였다. 반응이 끝난 튜브는 8,000rpm 이상에서 10초 정도 spin down하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 모은다. 400μl Buffer TB 를 첨가하고 잘 혼합하여 준다. 8,000rpm이상에서 10초 정도 스핀다운(spin down)하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 모은다. 스핀칼럼을 콜렉션 튜브에 장착한 후, 위의 반응액을 스핀칼럼에 넣는다. 8,000rpm에서 1분간 원심분리 하였다. 칼럼을 통과한 여과액은 버리고 다시 콜렉션 튜브를 장착하였다. 700μl의 버퍼 BW를 첨가하고 8,000rpm에서 1분간 원심분리하였다. 칼럼을 통과한 여과액은 버리고 다시 콜렉션 튜브를 장착하였다. 500μl의 버퍼 NW를 첨가하고 12,000rpm에서 3분간 원심분리하였다. 칼럼을 통과한 여과액은 버리고 새로운 1.5ml 튜브를 - 19 -
장착하였다. 200μl의 Buffer AE 나 정제수를 칼럼의 중앙에 첨가하고, 2분간 실온에 방치하였다. 8,000rpm에서 1분간 원심분리하였다. 추출된 게놈 DNA는 곧바로 PCR에 사용 또는 장기간 보존 시에는 -20 에 보관할 수 있다. 추출된 게놈 DNA는 0.8% 아가로즈 겔에 전기 영동하여 UV하에서 확인가능하다. DNA 농도를 20ng/μl 정도 로 얻었을 경우, 그 중 3μl를 PCR 반응에 이용하고, 3% 아가로즈 겔 상에서 DNA 밴드가 보이지 않을 경우에는 6μl를 이용하였다. [0115] [0116] [0117] [0118] [0119] [0120] 실시예 5: 단일 PCR의 조건 수립을 위한 PCR 멸균된 3차 증류수, 실시예 3의 검체 보관용액, 그리고 감염의 증후가 없는 정상 성인 남성의 신선 소변(VB1)에 실시예 2에서 확보한 각 세균 별로 검사할 표적 유전자의 플라스미드 클론을 10개, 100개, 1,000개, 10,000개 씩의 다양한 수의 카피(copy)로 혼합하여 인공적 검체를 만든 후 각각의 균 별로 표적 유전자에 대해 단일 (single) PCR을 여러 차례 반복수행하여 단일 PCR의 적정 조건을 수립하였다. PCR시에는 반드시 내부참조 유전 자인 인체형 베타글로빈 유전자의 PCR도 함께 수행하였다. 아울러 나중의 다중 PCR을 감안하여 각 PCR 산물의 크기가 서로 뚜렷하게 차이가 나도록 고안하였으며, 이에 대해 어닐링 온도는 서로 크게 차이가 나지 않도록 고 려하였다. 본 발명에서 고안한 프라이머를 사용할 경우, 검체 용액 1ml당 10개 내지 100개 이상의 카피(copy) 수의 플라스 미드 클론이 포함되어 있으면 항상 검색이 가능하다. PCR을 한 후 그 산물을 3% 아가로즈 겔에서 전기영동을 하 여 확인한 결과를 도 1 내지 도 5에 예시하였다. 본 발명의 PCR 방법에서 반응액의 조성과 조건을 하기 표 5에 정리하였다. [표 5] 14개 원인균의 유전자 단일 PCR 조성 및 조건 PCR 조성 ddh 2 O 8 μl 2x MM Premix 15 μl 정방향 & 역방향 프라이머 (5 pmole/μl) 각각 2 μl, 2 μl 주형 DNA (최소 20ng) 3 μl 최종부피 30 μl PCR 조건 예비변성 94 /10 min 1 Cycle (Predenaturation) 변성 (Denaturation) 94 /30 sec 40 Cycles 어닐링 (Annealing) 58 /30 sec 연장 (Extention) 72 /30 sec 최종연장 72 /5 min 1 Cycle (Final Extention) [0121] [0122] 실시예 6: 임상검체에 대한 단일 PCR STD의 이환이 의심되어 국내 병원의 비뇨기과 및 산부인과 외래로 내원한 541명의 성인 남녀 환자들과 성감염의 증후가 없는 성인 남녀 103명에서 실시예 3의 방법으로 첫줄기 소변(VB1)이나 요도, 자궁경부의 스왑 등으로 얻 은 다양한 검체를 채취하여, 실시예 4의 방법으로 DNA를 분리하고 실시예 5의 방법에 따라 단일 PCR을 수행하였 다. [0123] [0124] [0125] 실시예 7: 임상검체의 PCR 산물의 시퀀싱 상기 실시예 6의 PCR 산물은 ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit version 1.1(Perkin Elmer Biosystems, USA)를 이용하여 시퀀싱반응을 수행한 후, ABI 3130xl 자동염기서열분석기 (Perkin Elmer, USA)로 염기서열을 분석하였다. 이는 다음의 순서로 이루어졌다. (1) 각 검체로부터 얻은 PCR 산물을 시퀀싱반응의 주물로 이용하기 위해, 가장 적합한 농도로 맞춘다. 예컨대 - 20 -
100-200bp 길이라면 1-3ng/μl가 필요하고, 200-500bp길이라면 3-10ng/μl정도가 필요하다. [0126] [0127] [0128] [0129] [0130] [0131] (2) 두께가 얇은(thin wall) 미세원심분리기 튜브에 각 PCR 산물 1μl과 프라이머 2pmol, Dye terminator ready reaction mix 8μl를 넣고, 최종 10μl가 되도록 멸균 증류수를 넣어 가볍게 잘 혼합한다. (3) 상기 (2)의 혼합물을 96 에서 10초, 50 에서 5초, 그리고 60 에서 4분간씩, 총 25주기 만큼 진앰프 2700(PE Biosystems, USA)을 사용하여 사이클 시퀀싱(cycle sequencing) 반응을 수행한다. (4) 1.5ml 마이크로 튜브에 PPT 용액(Absolute EtOH 250ml, 3M NaOAc 10ml, DW 50ml) 62μl를 분주하여 놓고, 여기에 얻어진 PCR 반응물을 넣어 볼텍스로 잘 섞어준 후, -20 에서 15분 간 방치한 후, 14 의 13,000rpm에서 5분간 원심분리를 수행하여 형광 표지된 DNA만을 침전시킨다. 상층액을 조심스럽게 제거한 후, 세정액(70% EtOH) 170μl을 첨가한 후 다시 원심분리를 하여 상층액을 제거, 염을 제거한 다음 60 힛블럭(Heat block)을 이용하여 약 3분간 말린다. (5) 상기 (4)에서 얻어진 DNA에 Hi-Di 10.1μl을 첨가하여 볼텍스로 30 내지 60초간 섞어준다. 이 가운데 10μl 를 새로운 0.2ml 스트립(strip) PCR 튜브에 넣어, 95 에서 2분, 4 에서 3분 정도 반응을 하여 준비한다. (6) ABI 3130xl 서열분석기(sequencer)을 이용하여 캐스팅한 플레이트의 각 웰에 상기 (5)의 변성 DNA 검체를 넣고, 2-4시간 동안 전기영동을 수행한 후 염기서열을 분석한다. 본 시퀀싱 분석으로 STD의 14개 원인균 및 항생제 내성 유전자의 검색을 위한 단일 PCR의 적정성 여부를 확인하 였으며, 이들 검사결과에서 한국인에서 STD의 14개 원인균의 분자역학과 유전자형에 대한 데이터베이스를 수립 하였다. 이렇게 하여 PCR과 시퀀싱으로 STD 감염의 유무와 원인균이 확인된 검체는 이후 다중 PCR과 DNA 칩의 가치 분석에 사용하였다. [0132] [0133] [0134] 실시예 8: 다중 PCR의 조건 수립 멸균된 3차 증류수, 실시예 3의 검체보관용액, 그리고 STD의 증후가 없는 정상 성인 남성의 신선 소변에 실시예 2에서 확보한 각 세균별 특이 유전자의 플라스미드 클론을 한 종류에서 네 종류까지 10개, 100개, 1,000개, 10,000개의 다양한 카피수로 혼합하여 인공적 검체를 만든 후, 여기에 14종의 균 및 항생제 내성 유전자별 표적 유전자의 프라이머를 함께 하나의 튜브 내에 넣고 한꺼번에 PCR을 시행하는 다중 PCR을 수행하였다. 다중 PCR에서 반응액의 조성과 반응조건은 하기 표 6-1, 6-2, 6-3과 6-4에 정리하였다. 본 다중 PCR 후 그 산물 은 1.5 내지 2.0% 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인하였다(도 21 내지 23). PCR 산물의 전기영동 이미지를 보 면 먼저 도 21은 Set A(8Plex)로서, 차례로 가드네렐라 바지날리스의 PCR 산물이 419bp, 유레아플라즈마 유레아 라이티쿰의 PCR 산물이 373bp, 마이코플라스마 호미니스의 PCR 산물이 333bp, 클라마이디아 트라코마티스의 PCR 산물이 321bp, 임균의 PCR 산물이 284bp, 트리코모나스 바지날리스의 PCR 산물이 262bp, 마이코플라스마 제니탈 리움의 PCR 산물이 207bp, 캔디다 알비칸스의 PCR 산물이 148bp임을 알 수 있다. 또한, 도 22는 Set B(5Plex) 로서, 대장균 16s RNA의 PCR 산물이 467bp, 헤모필러스 듀크레이의 PCR 산물이 439bp, 헤르페스심플렉스바이러 스의 PCR 산물이 350bp, 트레포네마 팔리둠의 PCR 산물이 260bp, 인유두종바이러스의 PCR 산물이 191bp임을 알 수 있다. 본 발명에 의하면 14개 원인균 유전자의 DNA가 다양하게 혼합된 모든 경우에 한번의 다중 PCR로 정확 하게 검색이 가능하였다. 또한, 도 23은 Set C(5Plex)로서, SHV 증폭용 프라이머세트의 PCR 산물이 679bp, TEM 증폭용 프라이머세트의 PCR 산물이 412bp, TetM 증폭용 프라이머세트의 PCR 산물이 291bp, AmpC 증폭용 프라이 머세트의 PCR 산물이 208bp, TetC 증폭용 프라이머세트의 PCR 산물이 152bp임을 알 수 있다. 본 발명에 의하면 항생제 내성 유전자의 DNA가 다양하게 혼합된 모든 경우에 한번의 다중 PCR로 정확하게 검색이 가능하였다. 이 때 검체 1ml당 10개 내지 100개의 카피의 서로 다른 세균 유전자의 플라스미드 클론이 포함되어 있으면 항상 식 별이 가능하였다. [0135] [표 6-1] Set A의 다중 PCR 조건 [0136] PCR 성분 Set A (8Plex) 증류수 A set 프라이머, 정방향/역방향 혼합물 2x MM Premix* 3 μl 4 μl 15 μl - 21 -
0.05nM Cy5-dCTP** 주형 DNA (> 20ng) 최종부피 예비변성 PCR 조건 95 /10 min 1 Cycle (Predenaturation) 변성 (Denaturation) 94 /30 sec 40 Cycles 어닐링 (Annealing) 58 /30 sec 연장 (Extention) 72 /30 sec 최종연장 72 /5 min 1 Cycle 2 μl 6 μl 30 μl (Final Extention) * 2x MM Premix의 조성은, 열에 안정한 DNA 중합효소 1unit에 dntps 200μM, MgCl 2 1.5mM으로 하고, 여기에 증류수를 가해 최종부피를 15ml으로 하였다. ** Cy5-dCTP: unlabeled dctp의 비율은 1:12.5 비율로 하였다. [0137] [0138] [표 6-2] Set B의 다중 PCR 조건 PCR 성분 Set B (5Plex) 증류수 B set 프라이머, 정방향/역방향 혼합물 2x MM Premix* 0.05nM Cy5-dCTP** 주형 DNA (> 20ng) 최종부피 PCR 조건 예비변성 95 /10 min 1 Cycle (Predenaturation) 변성 (Denaturation) 94 /30 sec 40 Cycles 어닐링 (Annealing) 58 /30 sec 연장 (Extention) 72 /30 sec 최종연장 72 /5 min 1 Cycle 3 μl 4 μl 15 μl 2 μl 6 μl 30 μl (Final Extention) * 2x MM Premix의 조성은, 열에 안정한 DNA 중합효소 1unit에 dntps 200μM, MgCl 2 1.5mM으로 하고, 여기에 증류수를 가해 최종부피를 15ml으로 하였다. ** Cy5-dCTP: unlabeled dctp의 비율은 1:12.5 비율로 하였다. [0139] [표 6-3] Set C의 다중 PCR 조건 [0140] PCR 성분 Set C (5Plex) 증류수 C set 프라이머, 정방향/역방향 혼합물 2x MM Premix* 0.05nM Cy5-dCTP** 주형 DNA (> 20ng) 최종부피 PCR 조건 예비변성 95 /10 min 1 Cycle (Predenaturation) 변성 (Denaturation) 94 /30 sec 40 Cycles 어닐링 (Annealing) 58 /30 sec 연장 (Extention) 72 /30 sec 3 μl 4 μl 15 μl 2 μl 6 μl 30 μl - 22 -
최종연장 72 /5 min 1 Cycle (Final Extention) * 2x MM Premix의 조성은, 열에 안정한 DNA 중합효소 1unit에 dntps 200μM, MgCl 2 1.5mM으로 하고, 여기에 증류수를 가해 최종부피를 15ml으로 하였다. ** Cy5-dCTP: unlabeled dctp의 비율은 1:12.5 비율로 하였다. [0141] [0142] [표 6-4] Set A, B 및 C 프라이머의 혼합 조성비 Set A 프라이머 혼합 조성비 8 Plex UU NG GV MH CT TV MG CA 평균농도 최종농도(nM) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Set B 프라이머 혼합 조성비 5 Plex 16s RNA HD TP HSV HPV 평균농도 최종농도(nM) 100 100 100 100 100 100 Set C 프라이머 혼합 조성비 Antibiotics TetM TetC TEM AmpC SHV 평균농도 최종농도(nM) 100 100 100 100 100 100 [0143] (1,200 테스트 생산 기준으로 볼 때, 450μl씩 10 바이얼에 각각 분주하여 제조한다.) [0144] [0145] [0146] [0147] 실시예 9: 임상검체에 대한 다중 PCR 상기 실시예 7에서 단일 PCR 및 시퀀싱 분석으로 STD 감염의 유무와 원인균이 미리 확인된 바 있는 검체 DNA를 대상으로, 상기 실시예 8에서 수립된 방법대로 다중 PCR을 수행하였다. 검사 대상에 포함시킨 DNA 검체로는 단일 PCR 방법과 시퀀싱 방법으로 이미 검사하여 확인된 임균 감염 검체 50 례, 클라마이디아 감염 검체 50례, 유레아플라스마 감염 검체 50례, 마이코플라스마 감염 검체 50례, 마이코플 라스마 호미니스 감염 검체 50례, 캔디다 알비칸스 감염 검체 50례, 매독 감염 검체 50례, 헤모필러스 듀크레이 감염 검체 1례, 트리코모나스 바지날리스 감염 검체 50례, 가드넬라 바지날리스 감염 검체 50례, 헤르피스 바이 러스 감염 검체 50례, 인유두종 바이러스 감염 검체 50례, STD 원인균의 감염이 없는 검체 50례와 세균성 전립 선염으로 확인되었으나 14가지 STD 원인균에는 음성을 나타낸 검체 50례를 위양성(false positive)을 증명하기 위해 포함하였다. 감염 검체 200례 중에는 복합감염 검체도 40례 포함시켰다. 또한 본 다중 PCR의 검사결과를 본 발명의 칩뿐 아니라 시퀀싱의 그것과 비교 분석하여 STD 원인균 진단의 민감도와 특이도를 조사하였다. 이로 서 본 발명인 다중 PCR과 칩이 임상에서 STD의 원인균을 선별하고 1차 검색하는 데 사용할 수 있을 지를 분석하 였다. 이 때 얻어진 임상 검체를 본 발명의 칩을 이용하여 유전자형 분석(genotyping)한 결과의 예를 도 42 내 지 44에 나타내었다. 따라서, 단일 PCR후 시퀀싱 분석의 결과를 기준으로 할 때 다중 PCR의 민감도는 94 내지 100%, 평균 98.3%이었으며, 특이도는 96%로 나타났다. 또한, 복합감염의 진단 민감도가 97.5%로 단일 감염보다 낮게 나타났다. STD의 14개 원인균에 대한 다중 PCR 및 시퀀싱 분석 결과를 하기 표 7-1에 나타내었다. - 23 -